СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОБОСТРЕНИЯ ХОЛЕЦИСТИТА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике воспалительных заболеваний желчного пузыря.

Известны способы определения малонового диальдегида (МДА) (Минора Ишихара, 1978, И.Д.Стальная, Т.Г.Гаришвили, 1977, K.Yagi, 1976 и др.) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), включающие осаждение липидов, поддержание постоянной pH с помощью буфера, экстракцию органическим растворителем окрашенного продукта из водной фазы.

Наиболее близким техническим решением является способ диагностики холецистита (И. И. Гончарик, Ю.Х.Мараховский, Э.Д.Либерман, 1985). Способ осуществляют следующим образом.

1. К 1 мл желчи добавляют 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты.

2. После встряхивания (10 с) центрифугируют при 3000 об/м (30 мин).

3. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 0,1% серной кислоты и 0,3 мл 10% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты, содержимое тщательно встряхивают (20-30 с).

4. Центрифугируют при 3000 об/м (30 мин).

5. Надосадочную жидкость удаляют, осадок суспендируют в 4 мл дистиллированной воды с добавлением 1 мл 1% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты.

6. Суспензию инкубируют на кипящей водной бане в течение часа.

7. После охлаждения до комнатной температуры (18-25 град) добавляют к 5 мл суспензии 5 мл н-бутанола и интенсивно встряхивают (1 мин).

8. После отстаивания и кратковременного центрифугирования (5 мин) отбирают бутанольный слой.

9. Измеряют экстинцию бутанольной фазы на ФЭК с зеленым светофильтром.

10. Расчет проводят, используя в качестве стандарта окисленный кефалин.

К недостаткам прототипа можно отнести то, что не учитывается степень концентрации желчи, которая меняется в широких пределах и зависит от многих факторов. Кроме того, экстракция бутанолом не позволяет избежать влияния нелипидных компонентов, таких как сахара, сиаловые кислоты, связанный билирубин и др.

Задача изобретения - повышение точности метода.

Поставленная задача достигается тем, что проводят определение в хлороформ-метанольном экстракте желчи малонового диальдегида (нмоль/мл желчи) по реакции с тиобарбитуровой кислотой в кислой безводной среде и параллельно фосфолипидов (Ф) (мг/мл желчи) по модифицированной методике Stewart J.C.M., 1980, и при отношении МДА/Ф свыше 5,0 нмоль/мг диагностируют обострение холецистита.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Экстрагируют липиды хлороформ-метанольной смесью, часть экстракта растворяют в ледяной уксусной кислоте, добавляют ТБК, приготовленную на ледяной уксусной кислоте, и нагревают в кипящей водяной бане в течение часа. После охлаждения измеряют экстинцию при 532 нм. Расчет количества МДА проводят, используя коэффициент молярной экстинции. Параллельно определяют количество фосфолипидов в другой части экстракта по модифицированной методике Stewart J.C.M., 1980.

Рассчитывают диагностический коэффициент МДА/Ф по отношению количества малонового диальдегида к количеству фосфолипидов в 1 мл желчи.

Конкретный пример выполнения.

1. К 0,2 мл желчи приливают 5 мл хлороформ-метанольной смеси /2:1 по объему/ - встряхивают 2 мин.

2. Приливают 1 мл воды, встряхивают несколько раз, центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

3. Верхний водно-метанольный слой экстракта отсасывают, а к отобранным из нижней хлороформной фазы 0,5 мл экстракта вносят в опытную пробу 3,5 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл 0,6% ТБК, приготовленной на ледяной уксусной кислоте, в контрольную пробу к 0,5 мл хлороформного экстракта добавляют 4 мл ледяной уксусной кислоты.

4. Пробирки с пробой и контролем инкубируют в течение часа на кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры.

5. Измеряют экстинцию окрашенного раствора на спектрофотометре при длине волны 532 нм против контроля.

6. Расчет МДА проводят, используя коэффициент молярной экстинции, равный 1,56 • 100000 моль - 1 см - 1. Для упрощения процедуры расчета конечная формула имела следующий вид: количество МДА = экстинция • 1025,6 нмоль/мл желчи.

Параллельно определяют фосфолипиды по модифицированной методике Stewart J.C.M., 1980 (Лаб. дело, 1987, N 6)в хлороформном экстракте.

1. К 0,5 мл хлороформной части экстракта доливают 2,5 мл хлороформа и 2 мл ферротиоцианатного реактива (27,03 г гексагидрата хлорного железа + 30,40 г тиоцианата аммония), прогревают 30-60 с при 60^oC, встряхивают 1 мин. Холостая проба - 0,5 мл хлороформного экстракта + 2,05 мл хлороформа.

2. Центрифугируют, из органической фазы отбирают пробу и спектрофотометрируют при 470-490 нм в 10 мм кювете, если проба мутная - нагревают.

3. Построение калибровочной кривой проводят по фосфатидилхолину. Линейная зависимость между концентрацией липида и экстинцией в диапазоне 50-300 мкг фосфолипида.

Концентрации 100 мкг соответствует оптическая плотность 135 ед.

Исследуемым материалом служила желчь 25 больных холециститом в стадии обострения и ремиссии, полученная при операции холецистэктомии. Биохимические данные подтверждены морфологическими исследованиями.

Отношение МДА/Ф, характеризующее степень окисления фосфолипидов, свыше 5 нмоль/мг позволяет диагностировать обострение холецистита.

Преимуществом предложенного метода является относительная простота выполнения методики, минимальное количество реактивов и времени для их приготовления. Общее время проведения методики составляет максимально 1,5 ч (прототип свыше 2 ч).

Таким образом, проведение реакции ТБК с липидными компонентами желчи и растет количества МДА на единицу окисляющегося субстрата позволяет избежать концентрационного фактора желчи и влияния нелипидных компонентов (сахара, сиаловые кислоты) и тем самым повысить точность исследования по сравнению с прототипом.

В хлороформ-метанольном экстракте желчи больного определяют количество малонового диальдегида в нмоль/мл желчи по реакции с тиобарбитуровой кислотой в кислой безводной среде. Параллельно в указанном экстракте определяют количество фосфолипидов в мг/мл желчи. При отношении количества малонового диальдегида к количеству фосфолипидов свыше 5,0 нмоль/мг диагностируют обострение холецистита. Способ точен за счет исключения влияния на конечный результат концентрационного фактора печени и нелипидных компонентов. 1 табл.

Способ диагностики обострения холецистита путем исследования желчи, отличающийся тем, что в хлороформ-метанольном экстракте желчи определяют количество малонового диальдегида (МДА) в нмоль/мл желчи по реакции с тиобарбитуровой кислотой в кислой безводной среде и параллельно в указанном экстракте определяют количество фосфолипидов (Ф) в мг/мл желчи и при соотношении МДА/Ф свыше 5,0 нмоль/мг диагностируют обострение холецистита.