СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПСЕВДОСОСУДОВ, СФОРМИРОВАННЫХ МАКРОФАГАМИ, В МЕЛАНОМАХ ХОРИОИДЕИ В ПРОЦЕССЕ ПРИЖИЗНЕННОГО ПАТОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/577 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике в области онкологии, в частности к специальности Патологическая анатомия. Предлагаемый способ информативен и может быть применен для определения псевдососудов, сформированных макрофагами, в меланомах хориоидеи, выявленных при проведении иммуногистохимического метода (ИГХ) с использованием моноклональных антител и гистохимического исследования (PAS-реакция).

Данный способ позволяет достоверно определить псевдососуды в меланоме хориоидеи, сформированные макрофагами, и дифференцировать эти псевдососуды с истинными кровеносными сосудами опухоли и с псевдососудами, образованными опухолевыми клетками меланомы в процессе васкулярной мимикрии, что дает возможность в дальнейшем количественно рассчитать объемную плотность макрофагальных псевдососудов.

В меланоме хориоидеи система внутриопухолевого кровоснабжения формируется в процессе ангиогенеза и васкулогенной мимикрии. Наряду с истинными кровеносными сосудами с эндотелиальной выстилкой в ткани меланомы хориоидеи описан альтернативный вариант васкуляризации, представленный псведососудами, сформированными опухолевыми клетками. Мембраноподобные структуры псевдососудов определяются PAS-реакцией в процессе гистохимического окрашивания ткани. Известны способы оценки кровеносных сосудов в тканях, включающие ИГХ исследование образца ткани с использованием моноклональных антител к CD 34 (к эндотелиоцитам кровеносного сосуда) [Krause D.S. et al. CD 34: structure, biology and clinical utility. // Blood. - 1996. - vol. 87, №1. - p. 1-13; Нестерова E.C., Кравченко C.К., Гемджян Э.Г., Османов Е.А., Ковригина A.M. Оценка васкуляризации и микроокружения опухолевой ткани при фолликулярной лимфоме // Терапевтический архив. - 2013. - 7. - С. 57-64.; Щеголев А.И., Туманова У.Н., Дубова Е.А. Морфометрическая оценка степени васкуляризации очаговой узловой гиперплазии печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. - №8. - С. 235-239]. А также известен способ оценки степени васкуляризации ткани, в том числе опухолевой ткани, основанный на точном количественном измерении удельной плотности кровеносных сосудов, определяемых с помощью ИГХ и моноклональных антител к CD 34 [Патент №2366951 Российская Федерация, МПК G01N 33/483. Способ оценки степени васкуляризации: 2019140755: заявл. 31.03.2008: опубл. 10.09.2009 / Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Петров А.Н., Батева М.В.; заявитель ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи. - 6 с.]. Данные способы успешно применяются для морфологических исследований по специальности Патологическая анатомия, но имеют ограниченное применение, так как не позволяют оценить в меланомах хориоидеи псевдососуды, которые не являются истинными кровеносными сосудами, не имеют эндотелиоцитов в своей стенке и образованны макрофагами.

Данные способы взяты нами за прототип.

Ангиогенез злокачественной опухоли является важным процессом для ее роста и метастазирования. Васкулогенная мимикрия (ВМ) является ключевым альтернативным механизмом васкуляризации опухоли, при котором опухоли создают систему кровоснабжения. Данный механизм аутоваскуляризации опухоли тесно связан с прогрессированием заболевания и плохим прогнозом при злокачественных эпителиальных опухолях (например, при раке яичника, раке молочной железы) [Angiogenesis and vasculogenic mimicry as therapeutic targets in ovarian cancer / Dansaem Lim, Yeojin Do, Byung Su Kwon, Woochul Chang, Myeong-Sok Lee, Jongmin Kim, Jin Gu Cho //BMB Rep. - 2020. - 53 (6). - P. 291-298. doi: 10.5483/BMBRep.2020.53.6.060; Park Y., Kim J. Regulation of IL-6 signaling by miR-125a and let-7e in endothelial cells controls vasculogenic mimicry formation of breast cancer cells / BMB Rep. - 2019. - 52. - P. 214-219].

Доказано, что опухолевые клетки увеальной меланомы способны к васкулогенной мимикрии и межклеточному взаимодействию между собой с формированием псевдососудов [Effect of Genistein on vasculogenic mimicry formation by human uveal melanoma cells. Cong R, Sun Q, Yang L., Gu H, Zeng Y, Wang B.J. / Exp Clin Cancer Res. - 2009. - 7. - 28 (1). - P. 124. doi: 10.1186/1756-9966-28-124]. Подобные структуры могут функционировать по типу кровеносных сосудов с переносом по ним элементов крови, кислорода, питательных веществ к опухоли, обеспечивая рост и способность к метастазированию клеток меланомы [Maniotis A.J., Folberg R., Hess A. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry / Am J Pathol. - 1999. - 155. - P. 739-752].

В некоторых работах авторы показали, что макрофаги могут формировать подобные пространства, по структуре напоминающие сосуды [Macrophages form functional vascular mimicry channels in vivo / Barnett F.H., Rosenfeld M., Wood M., Kiosses W.В., Yoshihiko Usui, Marchetti V., Edith Aguilar, Friedlander M. // Scientific Reports. - 2016. - V. 6. - P. 1-11]. Однако в увеальной меланоме макрофагальная ВМ (формирование макрофагами псевдососудистых структур) ранее описаны не были.

В основу предлагаемого нами способа положена задача, заключающаяся в определении псевдососудистых пространств в опухоли, образованных макрофагами. Данный способ подразумевает использование широко применяемого в патологической анатомии стандартного метода иммуногистохимического (ИГХ) исследования и гистохимического исследования (PAS-реакция).

Раскрытие предлагаемого способа

Предлагаемый способ включает в себя следующие этапы проведения:

1. Получают тканевой образец меланомы хориоидеи, фиксируют полученную ткань в 10% забуференом формалине в течение 24 часов.

2. Осуществляют механизированную проводку материала в гистологическом процессоре в соответствии с программой аппарата Sakura, Tissue-Tek Xpress х50.

3. Заливают тканевой материал в парафиновые блоки и нарезают гистологические срезы на микротоме, тканевые срезы толщиной до 4 мкм (для дальнейшего ИГХ - исследования и PAS-реакции).

4. Осуществляют постановку ИГХ-реакции в аппаратах:

А. В аппарате для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond - III) с принадлежностями 2020 и используют антитела к эндотелию кровеносных сосудов (CD31 (Clone JC70A), мышиное моноклональное антитело Ready-to-use (Ventana); к эндотелию кровеносных сосудов CD34 (Clone QBEnd 10), первичное антитело Ready-to-use (Ventana)); к эндотелию лимфатических сосудов Ready-to-use (Podoplanin (Clone D2-40), мышиное моноклональное антитело Ready-to-use (Ventana)).

Б. В иммуностейнере автоматическом Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH system и используют антитела к макрофагам (CD68 (Clone 514Н12) первичное антитело Ready-to-use (Bond)).

5. На других тканевых фрагментах проводят поставновку гистохимической реакции (PAS-реакция) на аппарате.

Этапы постановки ИГХ-реакции:

1. Приготовить парафиновые срезы ткани опухоли (меланомы хориоидеи) на стеклах, покрытых поли-L-лизином.

2. Поместить стекла со срезами в термостат на 24 часа при температуре 60,2 градусов по Цельсию.

3. Поместить стекла в аппараты: аппарат для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond - III) с принадлежностями 2020; в иммуностейнер автоматический Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH system.

4. Провести автоматизировано депарафинирование срезов ткани опухоли, предварительную обработку, нанесение первичных антител, инкубацию с антителами CD31 (Clone JC70A) (Ventana), CD34 (Clone QBEnd 10) (Ventana), Podoplanin (Clone D2-40) (Ventana), CD68 (Clone 514H12) (Bond), докрашивание гематоксилином в соответствии с инструкциями и протоколами работы с данными антителами аппаратов.

Принцип окрашивания при ИГХ-исследовании: В соответствии с инструкциями к аппаратам и антителам продукты реакции преципитируются с комплексом антиген-антитело, окрашивая его в коричневый цвет и его оттенки. Гематоксилин обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах. В результате окраски гематоксилином ядра клеток приобретают синий либо сине-фиолетовый цвет.

5. Стекла со срезами после протокола проводки в аппарате Ventana промыть в теплой мыльной воде. Провести дегидратацию тканевых срезов по протоколу изопропиловой проводки в аппарате карусельного типа Sakura, Tissue-Tek Xpress х50 в течении 1 минуты дважды в изопропиловом спирте (Изопреп (Biovitrum)), по 1 мин дважды в ксилоле (Xylen for histology). Провести автоматизированное покрытие тканевых срезов на стеклах под покровную пленку в аппарате Sakura, Tissue-Tek Film.

6. Стекла со срезами после протокола проводки в аппарате Bond поместить для автоматизированного покрытия тканевых срезов под покровную пленку в аппарат Sakura, Tissue-Tek Film.

7. Оценить приготовленные гистологические препараты с помощью световой микроскопии. При этом участки микропрепарата, содержащие иммунопозитивный компонент, окрашиваются в коричневый цвет и его оттенки, маркируют кровеносные сосуды (при проведении реакции с антителами к CD31, CD34), лимфатические сосуды (с антителами к Podoplanin), макрофаги (с антителами к CD68), а иммунонегативные - окрашиваются в сине-фиолетовый и оттенки синего или серого цветов [Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - 4-е изд., доп. И перераб./ Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2012. - 624 с.]. Использование конкретной комбинации маркеров обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение сосудистоподобных структур в меланоме хориоидеи, сформированных макрофагами. Таким образом, в ходе анализа ИГХ-микропрепаратов оценивается наличие и локализация макрофагов по интенсивной окраске данных клеток коричневым хромогеном.

Этапы проведения PAS-реакции:

1. Приготовить парафиновые срезы ткани опухоли (меланомы хориоидеи) на стеклах.

2. Поместить стекла со срезами в термостат на 24 часа при температуре 60,2 градусов по Цельсию.

3. Поместить стекла в аппараты по протоколу окрашивания PAS-реакция, в аппарате карусельного типа Sakura. Провести дегидратацию тканевых срезов по протоколу изопропиловой проводки в аппарате карусельного типа Sakura, Tissue-Tek Xpress х50 в течении 1 минуты дважды в изопропиловом спирте (Изопреп (Biovitrum)), по 1 мин дважды в ксилоле (Xylen for histology). Провести автоматизированное покрытие тканевых срезов на стеклах под покровную пленку в аппарате Sakura, Tissue-Tek Film.

4. Оценить приготовленные гистологические препараты с помощью световой микроскопии. При этом участки микропрепарата, содержащие мембраноподобные структуры псевдососудов опухоли подтверждаются при PAS-реакции окрашиванием красно-розовым цветом.

Таким образом, в ходе анализа ИГХ-микропрепаратов и гистохимической окраской PAS-реакции оценивается наличие псевдососудистых пространств в опухоли, образованных макрофагами по их интенсивной окраске коричневым хромогеном.

При патологоанатомическом исследовании энуклеированных глаз никакие манипуляции с пациентами не проводятся.

Исходя из вышеперечисленного можно сделать вывод о том, что исследуемый способ информативен в отношении обнаружения и дифференцированного отличия макрофагальных псевдососудов в меланомах хориоидеи от истинных кровеносных сосудов или псевдососуды, сформированных в процессе васкулярной мимикрии опухоли. Данный способ может быть применен в работе врача-патологоанатома уже на этапе прижизненного патолого-анатомического исследования операционного материала энуклеированных глаз при данной опухоли.

Примеры использования способа на практике.

Определение в меланоме хориоидеи псевдососудов, сформированных макрофагами.

Гистологические препараты готовились по вышеописанной методике. В качестве объекта исследования может быть выбран любой орган.

Краткое описание чертежей.

Изобретение иллюстрируется фотографиями, где Фиг. 1. - микрофотография: псевдососудистое пространство в увеальной меланоме не экспрессирует маркер эндотелия кровеносных сосудов CD34 наряду с экспрессией данного маркера сосудом в ином поле зрения. Иммуногистохимический метод, увеличение 400.

Фиг. 2. - микрофотография: псевдососудистое пространство в увеальной меланоме не экспрессирует маркер эндотелия кровеносных сосудов CD31 наряду с экспрессией данного маркера сосудом в ином поле зрения. Иммуногистохимический метод, увеличение 400.

Фиг. 3. - микрофотография: псевдососудистое пространство в увеальной меланоме, сформированное макрофагами, экспрессирующими маркер CD 68. Иммуногистохимический метод, увеличение 400.

Фиг. 4. - микрофотография: псевдососудистое пространство в увеальной меланоме не экспрессирует маркеры эндотелия лимфатических сосудов (Podoplanin). Иммуногистохимический метод, увеличение 400.

Фиг. 5. - микрофотография: псевдососудистое пространство в увеальной меланоме, сформированное макрофагами, экспрессирующими маркер CD 68. Иммуногистохимический метод, увеличение 800.

Фиг. 6. - микрофотография: псевдососудистое пространство в увеальной меланоме, мембраноподобная структура стенки псевдососудистого пространства. Гистохимический метод, увеличение 400.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения псевдососудов, сформированных макрофагами, в меланомах хориоидеи в процессе прижизненного патолого-анатомического исследования. Проводят иммуногистохимическое исследование опухоли с использованием антител к CD 68 и гистохимическое исследование с использованием PAS-реакции. В случае выявления экспрессии CD 68 методом иммуногистохимического исследования и окрашивания участков микропрепарата красно-розовым цветом при PAS-реакции определяют псевдососуды, сформированные макрофагами, в меланомах хориоидеи. Способ позволяет достоверно определить псевдососуды в меланоме хориоидеи, сформированные макрофагами, и дифференцировать эти псевдососуды с истинными кровеносными сосудами опухоли и с псевдососудами, образованными опухолевыми клетками меланомы в процессе васкулярной мимикрии за счет выявления экспрессии CD 68 методом иммуногистохимического исследования и окрашивания участков микропрепарата красно-розовым цветом при PAS-реакции. 6 ил.

Способ определения псевдососудов, сформированных макрофагами, в меланомах хориоидеи в процессе прижизненного патолого-анатомического исследования, включающий иммуногистохимическое исследование опухоли с использованием антител к CD 68 и гистохимического исследования с использованием PAS-реакции, где в случае выявления экспрессии CD 68 методом иммуногистохимического исследования и окрашивания участков микропрепарата красно-розовым цветом при PAS-реакции определяют псевдососуды, сформированные макрофагами, в меланомах хориоидеи.