Противоопухолевое средство в виде ультракоротких одноцепочечных полидезоксирибонуклеотидов Российский патент 2023 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и средствам лечения рака с помощью ультракоротких одноцепочечных полидезоксирибонуклеотидов, выделенных из клеток острого промиелоцитарного лейкоза HL-60, длиной цепи в 40-60 азотистых оснований, одними из основных мишеней которых являются ДНК-полимераза β и β-подобные ДНК-полимеразы (КФ 2.7.7.7). https://iubmb.qmul.ac.uk/enzyme/EC2/7/7/7.html

(КФ - классификационный номер фермента по международной иерархической классификации).

ДНК-полимераза β (Polβ) - металлофермент, относится к семейству X-полимераз и играющий ключевую роль в пути эксцизионной репарация оснований (BER). Так, например, клетки, лишенные функционального фермента, нежизнеспособны [Beard, W. A., & Wilson, S. H. (2006). Chemical reviews, 106(2), 361-382; Asagoshi, K., et al (2010). DNA repair, 9(2), 109-119]. В то же время Polβ часто гиперэкспрессируется в опухолевых клетках и мутирует в ≥40% раковых опухолей человека, причем уровень гиперэкспрессии обычно коррелирует с вероятностью фатального прогноза для онкологических больных [Martin, S. A., et al (2010) Clinical cancer research, 16(21), 5107-5113; Donigan, K. A., et al (2012) Journal of Biological Chemistry, 287(28), 23830-23839; Ali, R., et al (2021) Oncogene, 40(14), 2496-2508]. Важная роль процессов репарации ДНК для обеспечения выживания раковых клеток определяется высокой частотой ошибок репликации в клетках самых разнообразных опухолей. Все эти обстоятельства привлекают особое внимание к ДНК-полимеразе β и позволяют рассматривать данный фермент как потенциальную мишень для противоопухолевой терапии. В настоящее время открыты различные агенты, подавляющие активность Polβ, но обладающие существенными недостатками, такими как, например, высокая токсичность [Gavande, N. S., et al (2016) Pharmacology & therapeutics, 160, 65-83], низкая растворимость, мешающая проникновению в клетки [Yuhas S. C. et al. Journal of the American Chemical Society 2021, Т. 143, №.21.С. 8099-8107; Gening L. et al, Nucleic Acids Res 2006, 34:2579-2586], недостаточная эффективность [US 2010/0048682 A1].

Наиболее близким техническим решением, которое выбрано в качестве прототипа для предлагаемого изобретения, является ДНК-аптамер, ингибирующий ДНК-полимеразу Эта (Pol η) [RU2737285C1, 26.11.2020 ]. Заявлено, что данный ДНК-аптамер может служить средством для связывания и детекции Pol η человека. ДНК-аптамер может использоваться для создания аффинного хроматографического сорбента и очистки Pol η с помощью данного сорбента. ДНК-аптамер может служить реактивом для детекции и оценки количества Pol η в биологических образцах, а также могут быть использованы для ингибирования активности Pol η в клетках человека с целью повышения эффективности препаратов химиотерапии.

Исследованиями не установлено наличие у данного ДНК-аптамера прямого ингибирующего действия на опухолевый рост.

Предложенное изобретение решает техническую проблему расширения арсенала средств для противоопухолевой терапии, облегчения течения и лечения рака.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в создании противоопухолевого средства с выраженным ингибирующим действием по отношению к репарационному ферменту ДНК полимеразе β.

Технический результат достигается противоопухолевым средством, представляющим собой ультракороткие одноцепочечные полидезоксирибонуклеотиды, выделенные из клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, с длиной цепи в 40-60 азотистых оснований (оцДНК_40-60).

Изобретение поясняется следующими рисунками.

На фиг. 1 показан график каталитической активности ДНК полимеразы β в присутствии оцДНК_40-60 в зависимости от концентрации последней.

На фиг. 2 - график кинетики роста опухоли для карциномы легких Льюиса у мышей (модель LLC) при введении оцДНК_40-60.

На фиг. 3 - данные по индексу торможения роста опухоли для той же модели (LLC).

На фиг. 4 - график кинетики роста опухоли для меланомы у мышей (модель В16) при введении оцДНК_40-60.

На фиг. 5 - данные по индексу торможения роста опухоли для той же модели (В16).

Эндогенные ультракороткие одноцепочечные полидезоксирибо-нуклеотиды (оцДНК_40-60) были получены из клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 при инкубации вместе с магнитным изотопом магния (²⁵Mg²⁺) и была изучена ингибирующая активность оцДНК_40-60 по отношению к ДНК полимеразе β и противоопухолевая активность in vitro на клетках острого миелоидного лейкоза человека HL-60 в сравнении с влиянием на здоровые мышиные фибробласты, а также влияние оцДНК_40-60 in vivo на линиях мышей, которым перевивали клетки опухолей лимфоидного лейкоза (асцитная форма) P-388 и солидных опухолей - меланомы B16 и карциномы легких Льюиса (LLC). В результате проведенных исследований установлено, что оцДНК_40-60 проявляет выраженную противоопухолевую активность (in vitro и in vivo). В работе использовали здоровых половозрелых самцов мышей BDF1 ([C57BL/6N × DBA/2N]:F1), массой 18-20 г (разброс в группах животных по исходной массе тела не превышал ±10%). Контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях. Мышей содержали в клетках по 5 особей, вода и корм предоставлялась ad libitum. Все процедуры с животными проводились в строгом соответствии с утвержденными протоколами и рекомендациями по надлежащему использованию и уходу за лабораторными животными (Директива ECC 2010/63 / EU). Для экспериментов животные были рандомизировано распределены на группы по 10 животных. Экспериментаторы были ослеплены при проведении исследований и последующем анализе данных.

Изобретение охватывает все модификации и эквиваленты оцДНК_40-60, которые могут быть включены в настоящее изобретение согласно его формуле.

Использование оцДНК_40-60 может быть комбинировано с введением другого вещества или с терапией, пригодной для лечения рака, где терапия представляет собой радиационную терапию, иммунотерапию, химиотерапию, фотодинамическую терапию, хирургическое вмешательство или комбинированную терапию традиционными лекарственными средствами.

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими примерами.

Пример 1. Способ получения эндогенных оцДНК_40-60 из клеток HL-60

оцДНК_40-60 получали следующим способом. Клетки HL-60 культивировали в присутствии 20 мМ ²⁵MgCl₂. Затем клетки обрабатывали 0.3% трипсин-ЭДТА в течение часа и отмывали от изотопно-меченой среды. Для этого культуру осаждали центрифугированием (10 тыс. об., 15 мин., +4°С) и ресуспендировали в 20 объемах чистой культуральной среды. Процедуру отмывки повторяли трижды. Для получения образцов клеточных лизатов, отмытые от изотопной метки и осажденные центрифугированием клетки культуры HL-60 ресуспендировали в 10 объемах 15 mM трис-НСl (pH 7.80) / 15 mM MgCl₂ / 1.5 mM EDTA / 2.0% Triton X-100 и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. К полученным образцам добавляли сульфат аммония (70% от насыщенного раствора) и инкубировали в течение 12 часов при +4°С. Затем образцы центрифугировали (7000 об/мин, 22°C) и отбирали супернатанты. Последние обрабатывали экзонуклеазами lambda, III и S, а затем проводили каскадную ультрафильтрацию через мембраны K75/K25 SPM TechSep, с пределами молекулярной эксклюзии 75 - 25 кДа. Затем фракцию оцДНК с длиной цепи 40-60 а.о. очищали при помощи HPLC на колонке полиметил-амидопропил-метакриламидом PRP-X600 AE (Waters, США), как было описано ранее в Ermakov, K. V., Bukhvostov, A. A., Vedenkin, A. S., Stovbun, S. V., Dvornikov, A. S., & Kuznetsov, D. A. (2020). Ultrashort ssDNA in Retinoblastoma Patients Blood Plasma Detected by a Novel High Resolution HPCL Technique: a Preliminary Report. ACTA MEDICA, 62(4), 170-173. Длину цепей оцДНК в полученных образцах контролировали электрофоретически в 4.5% агарозном геле. Выделенную оцДНК осаждали добавлением 10-ти объемов ледяного этанола и хранили полученные осадки при +4 ^оС не более 3 месяцев.

Выделенная оцДНК имела следующий процентный состав: Аденин - 16,2%; Тимин - 18,9%; Гуанин - 33,4%; Цитозин - 30,2%.

Также, оцДНК_40-60 могут быть модифицированы для защиты от действия нуклеаз, кроме того могут включать флуоресцентные вещества, радиоактивные изотопы.

Пример 2. Оценка влияния оцДНК_40-60 на каталитическую активность изолированного фермента ДНК-полимеразы β (фиг.1)

Значения каталитической активности ДНК-полимеразы β выражали в количестве [³H]dTTP, включенного в зарождающиеся цепи ДНК за 1 мин инкубации в оптимальных условиях с поправкой на 1,0 мг чистого белка фермента ([³H]ДНК cpm/мг белка). В качестве контроля использовалась интактная ДНК-полимераза β без добавления реагентов в оптимальной инкубационной среде.

На фиг. 1 представлена сравнительная ингибирующая активность оцДНК_40-60 по отношению к интактной ДНК полимеразе β. оцДНК_40-60 достоверно подавляет каталитическую активность фермента.

Пример 3. Оценка противоопухолевых свойств оцДНК_40-60 in vitro (табл. 1)

Цитотоксический эффект оцДНК_40-60 оценивали с помощью МТТ-теста на линиях клеток острого миелоидного лейкоза человека HL-60 и нормальных мышиных фибробластах. В качестве положительного контроля были использованы - доксорубицин (цитостатический препарат), широко используемый в противоопухолевой терапии и полирибонуклеотид Poly(A)₅₀ не обладающей ингибирующей способностью по отношению к ДНК-полимеразе β_.

В таблице 1 представлено цитотоксическое действие оцДНК_40-60 на клетки HL-60 и нормальные фибробласты мыши. Приведенные значения представляют собой среднюю долю погибших клеток ± стандартная ошибка среднего для шести независимых наблюдений.

Таблица 1 Эффектор Концентрация HL-60 Фибробласты оцДНК_40-60 0.3 μg/ml 4.5 ± 0.2 - 3.0 μg/ml 51.8 ± 0.5 - 30.0 μg/ml 62.4 ± 0.6 15.6 ± 0.6 Poly(A)₅₀ 30 μg/ml 3.8 ± 0.1 7.8 ± 1.1 Доксорубицин 0.1 μg/ml 63.4 ± 0.2 39.6 ± 1.5 H₂O - 2.1 ± 0.1 1.2 ± 0.1

Исследуемая оцДНК_40-60 показала достаточно высокую цитотоксичность по отношению к клеткам острого миелоидного лейкоза человека (HL-60) сопоставимую с доксорубицином. Цитотоксичность оцДНК_40-60 для нормальных клеток (фибробласты) была значительно (в четыре раза) ниже, чем для раковых клеток (HL-60).

Пример 4. Оценка противоопухолевых свойств in vivo (табл. 2, фиг. 2-5)

Эксперименты in vivo проводились с использованием нескольких классических моделей рака у мышей: асцитной форме лимфолейкоза P-388 и солидных моделях - меланомы B16 и карциномы легких Льюиса (LLC).

В таблице 2 показано влияние оцДНК_40-60 на среднюю продолжительность жизни мышей с различными онкозаболеваниями- меланомой B16, карциномой легких Льюиса и лимфоидной лейкемией P-388. СПЖ - средняя продолжительность жизни (дни); УПЖ - увеличение продолжительности жизни (%).

Таблица 2 Эффектор C
(мг/кг) Режим введе-ния Модели рака P-388 LLC B16 СПЖ
(M±SE) УПЖ СПЖ
(M±SE) УПЖ СПЖ
(M±SE) УПЖ оцДНК_40-60 3 Еже-дневно
10 дней 17±1 91 38±3 12 - - 30 53±7 496 46±2 35 49±2 58 60 36±3 305 - - 56±4 81 30 Еже-дневно с 2 по 6 сутки 35±1 293 - - - - Одно-кратно на 5 сутки 21±1 136 - - - - Одно-кратно на 6 сутки 17±1 91 - - - - Контроль - - 8.9±0.1 - 34±2 - 31±2 -

В модели лейкемии P-388 средняя продолжительность жизни в контрольной группе составила 8,9±0,1 дня (табл. 2). В группе, получавшей 3 мг/кг оцДНК_40-60 абдоминально каждый день в течение 10 дней, наблюдалось увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) на 91%. Группы, получавшие оцДНК_40-60 в дозах 30 и 60 мг/кг, показали еще более значительное увеличение продолжительности жизни, составившее 496% и 305%, соответственно.

Однократное введение оцДНК_40-60 (30 мг/кг) на поздних стадиях развития лейкемии P-388 увеличивало продолжительность жизни экспериментальных мышей, причем эффект зависел от дня введения: 136% и 91% при применении препарата на 5 или 6 день, соответственно. По сравнению с полномасштабным графиком лечения, его сокращение с 10 до 5 дней (оцДНК_40-60, 30 мг/кг) вызвало некоторое снижение эффекта с 496 до 293% от УПЖ (табл. 2).

В модели LLC введение оцДНК_40-60 обеспечило незначительное увеличение продолжительности жизни мышей на 12 и 35% для доз 3 и 30 мг/кг, соответственно (табл. 2). В то же время, в тех же экспериментах замедление роста опухоли было более заметным и составило 35 и 85%, соответственно (фиг. 2, 3).

При меланоме B16 средняя продолжительность жизни мышей из контрольной группы составила 31±2 дня (табл. 2). В группах, получавших оцДНК_40-60 в дозе 30 и 60 мг/кг, увеличение продолжительности жизни составило 58% и 81%, соответственно. Максимальное торможение роста опухоли наблюдалось на 26-й день после инокуляции опухоли: оцДНК_40-60 в дозе 30 мг/кг оно составило 83%, в дозе 60 мг/кг - 98%, (фиг. 4, 5).

Изобретение относится к медицине, фармакологии, биотехнологии, а именно к средствам лечения рака. Противоопухолевое средство представляет собой ультракороткие одноцепочечные полидезоксирибонуклеотиды, выделенные из клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, с длиной цепи в 40–60 азотистых оснований оцДНК_40-60. Средство обладает выраженным ингибирующим действием по отношению к репарационному ферменту ДНК полимеразе β. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения, способствует облегчению течения и лечения рака. 5 ил., 2 табл., 4 пр.

Противоопухолевое средство, представляющее собой ультракороткие одноцепочечные полидезоксирибонуклеотиды, выделенные из клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, с длиной цепи в 40–60 азотистых оснований оцДНК_40-60.