Питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens AP-33 Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/38 

Область техники: Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а также к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения высоко эффективных препаратов - средств защиты растений.

Известна питательная среда LB (являющаяся одной из основных для культивирования бактерий рода Pseudomonas) [1] состоящая, г/л:

Пептон - 10.0

Дрожжевой экстракт - 5.0

Натрий хлористый - 10.0

Вода водопроводная до 1 л.

Недостатком питательной среды является высокая стоимость, связанная с наличием в ее составе такого дорогостоящего ингредиента, каким является пептон.

Известна питательная среда Кинг В [2], принятая за прототип, также применяемая для культивирования бактерий рода Pseudomonas. В нее входят пептон, глицерин, различные минеральные соли, г/л:

Пептон - 20.0

Глицерин - 10.0

K₂НРO₄ - 1.5

MgSO₄⋅7H₂O - 1,5

Вода дистиллированная до 1 л.

Ее недостатком также является высокая стоимость, связанная с наличием в ее составе такого дорогостоящего ингредиента, каким является пептон. В процессе культивирования штамма Pseudomonas fluorescens АР-33 на среде Кинг В количество микроорганизмов составило 2×10⁹ КОЕ/ мл.

Целью настоящего исследования является создание недорогой универсальной питательной среды для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 с целью увеличения количества Pseudomonas fluorescens АР-33 выше 2×10⁹ КОЕ/ мл, увеличения срока хранения на жидкой питательной среде и увеличение срока хранения на твердой питательной среде.

Поставленная цель решается тем, что в среду для культивирования в качестве дополнительно вносят горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту [3], лапрол для жидкой питательной среды или агар для твердой питательной среды.

Сущность технического решения поясняется следующим.

Технология приготовления питательной среды. Для использования гороха шлифованного требуется его предварительная обработка. Горох шлифованный, в количестве 250 г/л промыть водопроводной водой, помесить во флакон емкостью 1 литр, и довести до литра дистиллированной водой. Закрыть флакон пробкой герметично. Затем автоклавировать в течение 1 часа при 2 Bar. После автоклавирования остудить до комнатной температуры и дважды процедить через два слоя марли. Полученный после обработки горох соединить с остальными компонентами среды и довести до 1 л дистиллированной водой. Значение рН должно соответствовать 7,5-7,6 ед. рН. Затем стерилизовать в автоклаве 40 минут 1,2-1,4 Bar. Полученная среда имеет светло-желтый цвет, «чистый» запах и незначительный осадок. Культивирование микроорганизмов производиться 20-24 часа, температура - 28±2°С, принудительная аэрация со скоростью вращения 250 об/мин. Для сохранения посевного материала на твердой питательной среда инкубирование производиться 24-48 ч, температура - 28±2°С в термостате. Затем хранение посевного материала Pseudomonas fluorescens АР-33 в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С.

Контроль за численностью микроорганизмов осуществляют стандартным методом десятикратных разведений.

Культивирование Pseudomonas fluorescens АР-33 в жидкой среде.

Пример 1.

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 содержащая в качестве питательной основы мелассу, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, сульфат магния семиводный, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту и лапрол в следующем соотношении компонентов, г/л (табл. 1).

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования бактерий позволяет получить количество микроорганизмов Pseudomonas fluorescens АР-33 1.0×10¹¹ KOE/см³, которая сохраняется в течение 45 дней, при хранении в жидкой среде.

Пример 2.

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования бактерий позволяет получить количество 1.6×10⁸ KOE/см³, которая сохраняется в течение 15 дней.

Пример 3.

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования бактерий позволяет получить количество микроорганизмов Pseudomonas fluorescens АР-33 - 8×10⁹ KOE/см³, которая сохраняется в течение 45 дней.

Однако, среда становиться менее прозрачной, процесс мойки биореактора занимает длительное время, т.к. необходимо очистить барботер и шланги от осадка. Таким образом, в результате сравнения эффективности использования сред с рецептурами из примеров 1, 2 и 3 выявлено, что самая высокое количество микроорганизмом Pseudomonas fluorescens АР-33, длительный срок хранения на жидкой среде и хорошее качество среды достигается при использовании рецептуры жидкой среды из примера 1 (табл. 4).

Культивирование Pseudomonas fluorescens АР-33 на твердой среде

Посев микроорганизмов на твердую среду осуществляется методом простого штриха или по методу Дригальского.

Пример 4.

Предлагаемая твердая питательная среда для культивирования бактерий позволяет сохранять Pseudomonas fluorescens АР-33 на питательном агаре в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С без пересева.

Пример 5.

Предлагаемая питательная среда для культивирования бактерий позволяет сохранять Pseudomonas fluorescens АР-33 на питательном агаре в течение 4 месяцев при температуре 4-8°С без пересева.

Пример 6.

Предлагаемая твердая питательная среда для культивирования бактерий позволяет сохранять Pseudomonas fluorescens АР-33 на питательном агаре в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С без пересева. Однако, среда не прозрачная, что создает сложности для просмотра колоний. Таким образом, в результате сравнений эффективности использования сред, с рецептурами из примеров 4, 5 и 6 выявлено, что самое длительное время микроорганизмы Pseudomonas fluorescens АР-33, сохраняются на среде из примера 4, которая характеризуется хорошим качеством (табл. 8).

Следовательно, использование предлагаемой универсальной питательной среды для культивирования бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33 позволяет:

- повысить количество Pseudomonas fluorescens АР-33 в процессе культивирования на жидкой среде до 1.0×10¹¹ (культивировании на среде Кинга дает количество 2×10⁹ KOE/ мл);

- сохранить количество Pseudomonas fluorescens АР-33 в жидкой среде течение 45 дней;

- сохранить количество Pseudomonas fluorescens АР-33 на твердой среде в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С;

- компоненты среды доступные и недорогие.

Литература

1. Дашкевич В.С, Дашкевич Н.Ю., Ашмарина Л.Ф., Шушаро А.И. Способ борьбы с возбудителями заболеваний растений // Патент РФ №2130265, заявлено 29.12.97; опубл. 20.05.99. Бюл.14.

2. King Е.О., Ward М.К., Raney D.Е. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab and Clin. Med. - 1954. - Vol. 44 (2). - P. 301-307.

3. Котляров В.В., Сединина Н.В. Использование янтарной кислоты в биотехнологическом процессе получения препаратов Pseudomonas fluorescens // Научный журнал КубГАУ. - 2014. - №101 (07). - С. 2327-2336.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 содержит мелассу, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, сульфат магния семиводный, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту, лапрол для жидкой среды и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов. В твердую питательную среду вносится агар в заданном количестве. Изобретение позволяет повысить выход биомассы Pseudomonas fluorescens АР-33. 8 табл., 6 пр.

Питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33, содержащая мелассу, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, сульфат магния семиводного и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что питательная среда дополнительно содержит горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту, лапрол для жидкой питательной среды или агар для твердой питательной среды при следующем соотношении компонентов, г/л:

Меласса 15 Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 0,5 Сульфат магния семиводный 0,2 Горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием 250 Янтарная кислота 0,05 Лапрол или агар соответственно 5 или 18 Дистиллированная вода До 1 л