Способ видовой идентификации Л-форм микобактерий Советский патент 1991 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к прямому определению видовой принадлежности (идентификации) Л-форм микобактерий, и может быть использовано для диагностики Л-форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, а также атипичных Л-форм микоб- рактерий,

Известен способ определения видовой принадлежности Л-форм микобактерий, заключающийся в следующем. Из патологического материала животного или человека после предварительной обработки материала серной кипотой проводят культураль- ный посев на полужидкую питательную

среду (модификация основы полужидкой - казеиновой среды Школьниковой). которая содержит, г/л: фосфорнокислый однозамещенный калий 1,5; фосфорнокислый двуза- мещенный натрий 2,5; сернокислый магний 0,5; лимоннокислый натрий 1,5; лимоннокислое аммиачное железо 0,05; аспарагин 1,0; глицерин 30 мл; агар-агар 3,0; дистиллированная вода остальное, и добавки к 1 л среды: сахароза 286,0; сыворотка крови крупного рогатого скота 143 мл; стрептомицин 1-5 тыс.ед.; пенициллин 1-5 тыс. ед.; раствор Люголя 5 мл.

На указанной полужидкой среде культивируют посевной материал при в течеО 00 VI О

о ел

нио 1-1,5 мес и после предварительного тестирования Л-форм микобактерий методом фазово-контрастной микроскопии проводят реверсию полученной культуры Л-форм микобактерий методом культу- рального пассажа (3-5 и более, каждый последующий пассаж проводят на свежеприготовленную питательную среду, длительность одного пассажа 1-1,5 мес), параллельно проводят пассажи также на морских свинках (3-5 и более, на каждый пассаж используют трех животных, длительность одного пассажа 3 мес). Получают в среднем через 9-12 мес из исходной культуры микобактерий в Л-форме их ревертанты в бактериальной форме, определяют видовую принадлежность ревертантов с помощью применения общепринятых культуральных, тинкториальных и биохимических методов исследования, после чего проводят учет результата - определение видовой принадлежности изучаемых Л-форм микобактерий по полученной видовой принадлежности их бактериальных ревертантов.

Однако реализация известного способа требует затраты длительного времени от начала способа до получения результата.

Цель изобретения -ускорение способа.

П р и м е р 1. Обрабатывают патолого- анатомический материал от подопытного теленка, производят посев гомогенизированного материала (смешанного с физиологическим раствором в соотношении 1/3) по 0,2 мл в приготовленные емкости с 50 мл предлагаемой питательной среды следующего состава, мас.%: Л-аспарагин 0,41; лимоннокислый натрий 0,35; сернокислый магний 0,05; лимоннокислое аммиачное железо 0,005; фосфорнокислый однозамещен- ный калий 0,026; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25; глицерин 7,44; бромтимоловый синий 0,003 в 1 мл 0,1 н. стандартного раствора едкого натрия (рН 7,6); сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культивируют посевной материал при 37°С в течение 1 мес, проводят тестирование Л-форм микобактерий в нативных мазках методом фазово-контрастной микроскопии, которое показывает на; ичие Л-культуры микобактерий и ее чистоту (отсутствие бактериальных форм микобактерий показали также общепринятые контроли). Далее изолируют Л-культуру микобактерий из жидкой среды центрифугированием при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин, биомассу Л-форм трехкратно отмывают физиологическим раствором в соотношении 1/50, центрифугируя при 2,5 тыс. об/мин по 10 мин. Из полученного осадка культуральной биомассы (0,45 г) выделяют ДНК Л-форм микобактерий, после чего проводят реакцию перекрестной ДНК-ДНК гибридизации. Конечный результат реакции перекрестной ДНК-ДНК гибридизации показывает, что ДНК исследуемых Л-форм микобактерий гомологична ДНК М. bovls.

Таким образом, изучаемая Л-культура принадлежит к виду М. bovls.

П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 обрабатывают патолого-анатомический материал от другого подопытного теленка, проводят соответственный посев на предлагаемую среду следующего состава, мас.%: Л-аспарагин 0,48; лимоннокислый натрий 0,408; сернокислый магний 0,06; лимоннокислое аммиачное железо 0.006; фосфорно- кислый однозамещенный калий 0,03; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,288; глицерин 8,64; бромтимоловый синий 0,004 в 1 мл 0,1 н. стандартного раствора

едкого натрия (рН 7,4); сыворотка крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культивируют посевной материал в течение 1,2 мес, после тестирования центрифугируют с отмыванием осадка Лкультуры при 2,7 тыс. об/мин по 12 мин. Получают 0,7 г нативноЯ биомассы Л-форм микобактерий. Далее, выделив ДНК Л-форм микобактерий, проводят реакцию ДНК-ДНК перекрестной гибридизации, которая показывает, что ДНК исследуемой Л-культуры гомологична ДНК М. bovls, и учет результата. Изучаемая культура Л-форм микобактерий является Л-формой М.bovls.

П р и м е р 3. Аналогично приведенным примерам проводят посев патолого-анато- мического материала от третьего теленка (из соответствующего опыта) на предлагаемую среду следующего состава, мас.%:

Л-аспарагин 0,56; лимоннокислый натрий 0,475; сернокислый магний 0,07; лимоннокислое аммиачное железо 0,007; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,035; фосфорнокислый двузамещенный натрий

0 0,335; глицерин 10,28; бромтимоловый синий 0,005 в 1 мл 0,1 н. стандартного раствора едкого натрия (рН 7,2); сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культи5 вируют посевной материал в течение 1,5 мес, тестируют, центрифугируют при 3,0 тыс. об/мин по 15 мин. Получают 0,5 г нативной биомассы Л-форм микобактерий. Далее, выделив из нативной биомассы культуры ДНК Л-форм микобактерий, проводят реакцию

перекрестной ДНК-ДНК гибридизации и учет результата. Изучаемая культура Л- форм является Л-формой M.bovls.

Предлагаемый способ позволяет ускорить идентификацию Л-форм.

Формула изобретения

Способ видовой идентификации Л-форм микобактерий путем взятия материала от животных, обработки его серной кислотой, посева на питательную среду, содержащую Л-аспарагин, лимоннокислый натрий, сернокислый магний, лимоннокислое аммиачное железо, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, глицерин, индикатор, сыворотку крови крупного рогатого скота и дистиллированную воду, инкубирования посевов с последующим тестированием и учетом результа- тов, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, питательная среда в качестве индикатора содержит раствор бром- тимолового синего в 1 мл 0,1 н. раствора едкого натрия рН 7,2-7,6 при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:

Л-аспарагин0,41-0,56

Лимоннокислый натрий 0,35-0,475 Сернокислый магний 0,05-0,07 Лимоннокислое аммиачное железо0,005-0,007 Фосфорнокислый однозамещенный калий 0,026-0,035 Фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25-0.335 Глицерин 7,44-10.28 Бромтимоловый синий в 1 мл 0,1 н. раствора едкого натрия

рН 7,2-7,60,003-0,005

Сыворотка крови крупного рогатого скота10 Дистиллированная водаОстальное после инкубирования отделяют биомассу Л-форм центрифугированием, промывают физиологическим раствором в течение 10- 15 мин центрифугированием при 2,5-3,0 тыс. об/мин, а тестирование и учет результатов осуществляют с помощью реакции перекрестной ДНК-ДНК гибридизации по гомологичности ДНК Л-форм микобактерий определенному виду ДНК микобактерий.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к прямому определению видовой принадлежности (идентификации) Л-форм микобактерий, и может быть использовано для диагностики Л-форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, а также атипичных Л-форм микобактерий. Цель изобретения - ускорение способа. Для этого гомогенат исследуемого материала высевают на питательную среду, содержащую, мас.%: Л-аспарагин 0,41- 0,56; лимоннокислый натрий 0,35-0,475; сернокислый магний 0,05-0,07; лимоннокислое аммиачное железо 0,005-0,007; фос- форнокислый однозамещенный калий 0,026-0,035; фосфорнокислый двузамещен- ный натрий 0,25-0,335; глицерин 7,44- 10,28; бромтимоловый синий в 1 мл 0,1 н. раствора едкого натрия рН 7,2-7,6 0,003- 0,005; сыворотка крови крупного рогатого скота 10: дистиллированная вода остальное. После инкубирования отделяют биомассу Л- форм центрифугированием, промывают физиологическим раствором в течение 10-15 мин, центрифугируют при 2,5-3,0 тыс. об/мин. С выделенной ДНК Л-форм проводят реакцию перекрестной ДНК-ДНК гибридизации и по гомологичности ДНК Л-форм определенному виду ДНК микобактерий идентифицируют Л-формы. Ё