Способ производства питательных сред, применяемых для культивирования плесневых грибов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства питательных сред для культивирования, идентификации и подсчета дрожжей и плесневых грибов.

Культивирование, идентификация и подсчет микроорганизмов является важным технологическим процессом в промышленной и экспериментальной микробиологии. Для культивирования, идентификации и подсчета микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты – питательные среды. Подбор питательных сред в соответствии с пищевыми и другими физиологическими потребностями микроорганизма является основой успешного культивирования, обеспечивающего и поддержание активности штаммов, и их качество, что нередко определяет результаты всего исследования. Исходя из вышеизложенного, изыскание новых, экологически чистых и экономически оправданных источников сырья, а также путей повышения его биологической полноценности с целью разработки высококачественных питательных сред, актуальной и своевременной задачей является создание оптимальных условий для жизнедеятельности микроорганизмов.

Проблема создания новых экологически чистых питательных сред из экономически оправданных источников сырья может быть решена в результате использования одного из побочных продуктов производства картофельного крахмала – картофельного сока.

Картофельный сок содержит сухие вещества (не менее 1,5 %), из которых не менее 22 % составляют белки. Значение рН сока составляет 5,6–6,2. Высокая кислотность клеточного сока обусловлена наличием в клубнях значительного количества органических кислот. Среди них преобладают лимонная, яблочная, щавелевая, пировиноградная, винная, янтарная и некоторые другие кислоты. Особенно много в клубнях лимонной кислоты (до 0,4–0,6%). При исследовании клеточного сока обнаружено не менее 12 свободных аминокислот, среди которых имеются жизненно необходимые: валин, лейцин, метионин, лизин, аргинин.

В свежем картофельном соке и мезге содержатся также витамины, такие как С, РР, В₉, каротин, пантотеновая кислота.

Широко представлены зольные элементы сока. Около 60% золы приходится на долю оксида калия. В золе сока содержатся практически все микроэлементы. Исследование углеводов клеточного сока показало, что они, в основном, представлены моносахарами: глюкозой, маннозой, фруктозой. Содержание редуцирующих сахаров зависит от сорта, степени зрелости клубней, условий выращивания и хранения (Дышлюк Л.С., Асякина Л.К., Карчин К.В., Зимина М.И. Изучение химического состава и показателей безопасности отходов картофелекрахмального производства. Современные проблемы науки и образования. 2014. №3. Интернет ресурс www. Science-education.ru. Сетевое издание «Современные проблемы науки и образования» ISSN 2070-7428).

Известен способ создания питательной основы для микробиологических сред, включающий обработку исходного сырья, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют предварительно подготовленный картофель или различные картофельные отходы, которые подвергают развариванию при избыточном давлении. Проводят двухстадийную обработку амилолитическими ферментами, причем на первой стадии осуществляют разжижение крахмала, а на второй – осахаривание с последующим фильтрованием, упариванием и подкислением органическими кислотами. Патент BY №16895, С1, 2013. Предложенный способ является сложным для практического применения и энергетически затратным, т.к. требует применения ферментов и сгущения продукта в выпарных аппаратах.

Другим вариантом использования побочных продуктов переработки картофеля в качестве компонента питательной среды для микробиологических производств является использование картофельного отвара (SU 969717 A1. 1984). Для приготовления отвара 400 г тщательно вымытого, неочищенного, нарезанного кусочками картофеля варят в 1 л воды в течение 20 мин. После фильтрации отвар доводят до 1 л кипяченой водой и используют для приготовления среды. В отваре расплавляют при подогревании 15–20 г агара, среду разливают в колбы и стерилизуют при 1,3 атм. в течение 25–35 мин. Перед использованием для посевов к среде добавляют 12,5–20 мл 40 %-ного стерильного раствора глюкозы. рH среды доводят до показателя 3,7 добавлением 20%-ного водного раствора стерильной лимонной кислоты в количестве 15–20 мл, содержащем 3,5 г сухой лимонной кислоты на 1 л среды. На подготовленную таким образом питательную среду высевают исследуемую микрофлору.

Картофельный отвар широко применяется в практике создания средств для микробиологических производств (R. E. Beever, E. G. Bollard. The Nature of the Stimulation of Fungal Growth by Potato Extract. The Journal of General and Applied Microbiology. 1970. Vol.60, Iss. 2. https://doi.org/10.1099/00221287-60-2-273).

Экстракт готовили из 400 г очищенных клубней на литр воды следующим образом: клубни очищали от кожуры, измельчали в трех четвертях конечного количества воды и кипятили при постоянном помешивании в течение 5 минут. Смесь замораживали при температуре –10° в течение ночи и после оттаивания фуговали на центрифуге. Фильтрат хранили в пластиковых бутылках при температуре –10°. При необходимости порции размораживали и фильтровали, чтобы получить слегка опалесцирующий экстракт. Были изучены различные составы сред с использованием картофельного отвара.

Недостатком метода применения картофельного отвара является необходимость варки картофеля и его реализации. Кроме того, определенные технические сложности представляет процесс замораживания картофельного отвара.

Проблема заключается в оптимизации процесса производства питательной среды.

Проблема решается заменой картофельного отвара на побочный продукт картофелекрахмального производства – картофельный сок, в составе которого значительно больше питательных веществ, способствующих метаболизму исследуемых микроорганизмов.

Способ осуществляют следующим образом. Картофельный сок доводят до pH 5,6±0,2 при 25°C, и в сухом или жидком состоянии тщательно смешивают с агаром и кристаллической глюкозой в соотношении 0,5-15 кг сухих веществ картофельного сока: 2-50 кг кристаллической глюкозы : 5-45 кг агара, предпочтительнее из расчета: 8 частей сухих веществ картофельного сока с кристаллической глюкозой : 5 частей агара. Полученную смесь высушивают при температуре 25–150°C. При применении сухого картофельного сока, проводят только смешивание в заданной пропорции.

Пример 1. Питательная среда для культивирования, идентификации и подсчета дрожжей и плесневых грибов.

Картофельный сок с содержанием сухих веществ 6,3% доводят до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивают с агаром в соотношении 200 мл картофельного сока: 47,25 г агара. Тщательно перемешивают для равномерного распределения картофельного сока по массе агара. Полученную смесь высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу. Высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм. В полученную измельченную массу добавляют кристаллическую глюкозу массой 63 г и тщательно перемешивают. Влажность готового продукта составила 12,9%.

Пример 2. Питательная среда для культивирования, идентификации и подсчета дрожжей и плесневых грибов.

Картофельный сок с содержанием сухих веществ 6,3% доводят до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивают с глюкозой и агаром в соотношении 300 мл картофельного сока : 94,50 г глюкозы : 70,88 г агара. Полученную массу тщательно перемешивают и высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу. Смесь периодически перемешивают во избежание карамелизации. Высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм. Получен порошкообразный продукт влажностью 11,6%.

Проведены исследования по апробации питательных сред, полученных по описаниям примеров 1 и 2 в сравнении с питательной средой из картофельного отвара (КСА), приготовленной вручную, и средой PDA. 200 г неочищенного картофеля, порезанного кусочками кипятили в 1000 мл воды 20 минут, затем фильтровали и добавляли 10 г сахарозы и питательной среды PDA (Sigma, USA), в которой в качестве компонента используется картофельный отвар. Результаты исследований показаны на фигуре.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что применение картофельного сока в качестве одного из компонентов питательной среды вместо картофельного отвара позволяет улучшить ее качество.

Пример 3. Питательная среда для культивирования дрожжей и плесневых грибов.

Питательная среда для культивирования дрожжей и плесневых грибов создается для выращивания биомассы микрофлоры в ферментерах.

Картофельный сок сгущают под разряжением 0,01–0,03 мПа в выпарном аппарате до концентрации 8,0 % СВ. В горячий картофельный сок вводят кристаллическую глюкозу из расчета 1 часть сухих веществ картофельного сока: 5 частей кристаллической глюкозы. Полученную жидкость охлаждают до 25 °C и доводят рН до значения 5,1±0,2 0,01N серной кислотой.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ производства питательной среды для культивирования плесневых грибов, предусматривающий использование в качестве одного из компонентов картофельного сока в жидком состоянии, доведении его до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивании в заданном соотношении с кристаллической глюкозой и агаром. Полученную смесь тщательно перемешивают, высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу, высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм. Изобретение обеспечивает расширение арсенала питательных сред для культивирования плесневых грибов с использованием побочного продукта картофелекрахмального производства. 1 ил., 3 пр.

Способ производства питательной среды, применяемой для культивирования плесневых грибов, предусматривающий использование в качестве одного из компонентов картофельного сока – побочного продукта производства картофельного крахмала в жидком состоянии, доведении его до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивании в соотношении: 0,5–15 кг сухих веществ картофельного сока : 2–50 кг кристаллической глюкозы : 5–45 кг агара; полученную смесь тщательно перемешивают, высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу, высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм.