ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования чумного микроба.

Известна питательная среда для культивирования чумного микроба, для приготовления которой очищенный, мелко нарезанный картофель заливают двойным количеством водопроводной воды, нагревают при 133°С в течение 10 минут, по охлаждении оставляют для просветления на 15 минут, затем верхний слой жидкости сливают и добавляют к нему 0,5% хлористого натрия и 1% пептона или перевара Хоттингера (Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз. 1950. Козлов Ю.А. 1950. с.106-107).

Недостатком данной среды является ее непрозрачность.

Наиболее близким к изобретению является патент RU 2260620 С2 (опубл. Бюл. №26 20.09.2005), совокупность признаков которого наиболее близка к совокупности существенных признаков предлагаемого изобретения, в котором описана питательная среда для культивирования чумного микроба, включающая, г/л: в качестве питательной основы ферментативный гидролизат бобов сои - 320-420, натрий хлористый - 4,0-6,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 3,0-5,0, натрий сернистокислый - 0,3-0,5, липоевую кислоту - 0,4-0,6, 20%-ный раствор гидроокиси натрия 2,5-3,5 и дистиллированную воду до 1 л.

Целью изобретения является получение качественной прозрачной питательной среды для культивирования чумного микроба на белковой основе только из растительного сырья - картофеля.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат картофеля и стимулирующую добавку натрий сернистокислый при следующем содержании ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат картофеля 310,0-410,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 Натрий сернистокислый 0,3-0,5 Агар микробиологический 10,0-14,0 Дистиллированная вода до 1 л

Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют картофель, содержащий в среднем 2% азотистых веществ, кроме того, картофель богат микроэлементами и витаминами.

Как правило, растительные продукты, в отличие от животных, содержат в своем составе больше углеводов, чем белков и жиров. Исключение составляют богатые белками растения. Так картофель содержит в среднем, г/л: белка 2,6; глюкозы 5,41; калия 0,7; натрия 1,01; кальция 0,02; железа 2,51, водорастворимые витамины (Козлов Ю.А., 1950). Из белковых веществ в картофеле при гидролизе образуются аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин, по количественному и качественному составу мало отличающиеся от аминокислот мясных гидролизатов. В клубнях картофеля содержится 12-20% крахмала, представляющего собой смесь амилозы 15-25% (с молекулярной массой от 100 000 до 600 000) и амилопектина 75-85% (вещества оболочки с молекулярной массой около 1000 000). Кроме этого, картофельные белки характеризуются повышенным содержанием углеводов, которые тесно связаны с углеводным обменом через цикл трикарбоновых кислот, поставляющих макроэргические связи (Y.P.Ypta, 1987).

Приготовление питательной основы предлагаемой питательной среды для выращивания микроорганизмов заключается в следующем.

Берут 1,0±0,05 кг клубней картофеля, моют его щеткой в проточной воде, чистят, режут на кусочки размером 2×2 см, ссыпают в эмалированную кастрюлю, заливают питьевой водой в количестве 3 л, варят в течение 5 мин, остужают до 46°С. Отвар картофеля сливают в пятилитровый стеклянный баллон. Добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота, пропущенную через мясорубку дважды из расчета 100 г/л, в баллон с отваром картофеля. Устанавливают рН до 8,2±0,1 фенолфталеином до слабо-розового цвета с помощью натрия углекислого в количестве 5,0 г/л. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, сверху пергаментом, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 37±1°С. Содержимое баллона в течение суток перемешивают через каждые 20±1 мин, в последующие сутки - через каждые 2 часа.

Динамику процесса гидролиза контролируют ежедневно путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижении аминного азота 0,3%-0,4%. После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают двое суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 5 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему баллона, закрывают стерильной резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°С.

Питательную среду на основе картофельного ферментативного гидролизата для выращивания микроорганизмов готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из картофеля, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12%-360,0 мл; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0 г. Для осветления полученной жидкости используют активированный уголь марки «УО-А» в количестве 2% к объему среды, который ссыпают в эмалированную кастрюлю, доливают дистиллированную воду - до 1 л, среду тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до 56°С, затем устанавливают рН до 8,2±0,1 с помощью 20% раствора гидроокиси натрия в количестве 8,0 мл, кипятят в течение 5 мин. Фильтруют через полотно и 8-16 слоев фильтровальной бумаги, сбор фильтрата проводят в эмалированную кастрюлю. В готовый фильтрат светло-желтого цвета добавляют агар микробиологический - 12 г/л. Смесь доводят до 100°С и кипятят до полного расплавления агара в течение 10 мин. рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1, добавляют натрий сернистокислый в концентрации 0,4 г/л.

Приготовленную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Стерильную среду после расплавления в кипящей бане разливают в стерильные чашки Петри, просушивают в течение 30 мин и используют для посева.

В качестве примера испытывали культуры вакцинного штамма чумного микроба ЕВ и вирулентные №№ С-802; С-803; 461; С-740; С-739, выращенные на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2 при температуре 28°С в течение 24 ч. Из суточных агаровых культур тест-штаммов чумного микроба готовят взвесь в 0,9% растворе хлористого натрия густотой 1,0·10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича ОСО 422859-86 П-10 единиц и делают 10-кратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия до разведения 10^-7 (1.10² м.к./мл), тщательно перемешивая, меняя стерильную пипетку после каждого разведения. Культуру из разведения 10^-6 (1000 м.к./мл) и 10^-7 (100 м.к./мл) наносят по 0,1 мл на 3 свежеприготовленных и хорошо просушенных агаровых пластинки. Распределяют посеянную культуру по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Учет результатов скорости роста культуры в каждом разведении микробной взвеси производят через 48 ч инкубации при 28°С.

Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливо видимый рост культуры во всех засеянных чашках с плотной средой и формирование типичных, легко дифференцируемых при микроскопии колоний на чашках с плотной средой.

Оценку ростовых свойств питательной среды для культивирования чумного микроба проводят путем подсчета количества выросших колоний на пластинках агара.

Пример 1

Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат картофеля - 310,0; натрий хлористый - 4,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 3,0; натрий сернистокислый - 0,3; агар микробиологический - 10,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний, выросших на пластинках агара, для чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 50 и 5 диаметром 1,0 мм.

Пример 2

Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей г/л: ферментативный гидролизат картофеля - 360,0; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0; натрий сернистокислый - 0,4; агар микробиологический - 12,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний, выросших на пластинках агара, для чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 57 и 6 диаметром 1,5 мм.

Пример 3 Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат картофеля - 410,0; натрий хлористый - 6,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 5,0; натрий сернистокислый - 0,5; агар микробиологический - 14.0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 50 и 5 диаметром 1,0 мм.

Таким образом, заявленная питательная среда для культивирования чумного микроба (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата картофеля, вполне может заменить питательную среду на основе из говяжьего мяса.

Питательная среда для культивирования чумного микроба содержит в г/л: ферментативный гидролизат картофеля 310,0-410,0 в качестве основы питательной среды, натрий хлористый 4,0-6,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0, натрий сернистокислый 0,3-0,5, агар микробиологический 10,0-14,0, дистиллированную воду остальное. Это обеспечивает оптимальные условия роста чумного микроба за счет повышения качества и прозрачности питательной среды на белковой основе.

Питательная среда для культивирования чумного микроба, содержащая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорно-кислый двузамещенный, натрий сернисто-кислый и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит ферментативный гидролизат картофеля и дополнительно агар микробиологический при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
ферментативный гидролизат картофеля 310,0-410,0 натрий хлористый 4,0-6,0 натрий фосфорно-кислый двузамещенный 3,0-5,0 натрий сернисто-кислый 0,3-0,5 агар микробиологический 10,0-14,0 дистиллированная вода до 1 л