СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАРВОВИРУСА ГУСЕЙ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и молекулярной биологии, может быть использовано для выявления ДНК парвовируса гусей, филогенетического анализа данного вируса, а также диагностики парвовирусного энтерита гусей. Изобретение может быть использовано специалистами научно-исследовательских учреждений, ветеринарных диагностических лабораторий, занимающихся изучением инфекционных болезней и их возбудителей.

Вирусный энтерит гусей - высоко контагиозная болезнь, сопровождающаяся высокой смертностью (до 95-100%) молодняка преимущественно в возрасте 6-12 дней. Болезнь регистрируют у всех пород гусей, мускусных уток, возможно, пекинских уток. Возбудителем является парвовирус из рода Dependovirus, имеющий антигенные отличия от парвовирусов других видов птиц и млекопитающих. Геном вируса представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 5 тысяч нуклеотидов, который содержит две открытые рамки считывания: левая рамка кодирует неструктурные, регуляторные белки NS1 и NS2, правая рамка кодирует структурные белки VP1, VP2 и VP3.

Получение олигонуклеотидных синтетических праймеров и применение их для постановки ПЦР позволит дополнить и усовершенствовать методы изучения парвовируса гусей и диагностики парвовирусного энтерита гусей - наиболее опасной, широко распространенной и экономически значимой проблемы в гусеводстве.

Уровень техники

Известен способ выявления парвовируса гусей и диагностики парвовирусного энтерита гусей путем инокуляции суспензии биоматериалов от больных птиц 7-9-дневным развивающимся гусиным эмбрионам или в культуры клеток гусиного происхождения. Для выделения вируса необходимы «слепые» пассажи в эмбрионах и/или культурах клеток. Идентификацию полученных изолятов проводят в реакции нейтрализации вируса специфической антисывороткой на развивающихся гусиных эмбрионах и/или культурах клеток гусиного происхождения. Способ занимает от 2-х недель до месяца.

Известен также способ идентификации парвовируса гусей путем электронной микроскопии. Способ пригоден для выявления и идентификации парвовируса гусей после накопления его в развивающихся гусиных эмбрионах и/или культурах клеток гусиного происхождения.

Кроме того, применяется способ ретроспективной диагностики парвовирусного энтерита гусей путем выявления специфических вируснейтрализующих антител у переболевших птиц. Способ может быть использован не ранее, чем через 14-30 дней после исчезновения клинических признаков болезни.

Описанные выше способы занимают продолжительное время. Кроме того, сезонность яйцекладки у гусей и отсутствие чувствительных перевиваемых культур клеток существенно ограничивают возможность проведения лабораторных исследований.

Наряду с представленными выше способами применяется детекция парвовируса гусей в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Известно, что для выявления ДНК парвовируса гусей ранее предлагали праймеры к различным областям генома. Timea Tatar-Kis et al ["Phylogenetic analysis of Hungarian goose parvovirus isolates and vaccine strains". Avian Pathology (2004) 33 (4), 438-444] разработали праймеры к гену VP1. Андрейчук Д.Б. и др ["Разработка ПЦР-РВ с внутренним контролем для выявления генома парвовируса гусей". 2016. Ветеринария. №10. С. 59-64] сообщили об использовании праймеров к гену NS. Kexiang Yu et al ["Identification of Goose-Origin Parvovirus as a Cause of Newly Emerging Beak and Dwarfism Syndrome in Duckling". Journal of Clinical Microbiology, 2016. Vol. 54. N. 8. P. 1999-2007] синтезировали и использовали в ПЦР праймеры к области гена VP3. Kang Ning et al ["Pathogenicity of Pekin duck- and goose-origin parvoviruses in Pekin ducklings". Veterinary Microbiology 210 (2017) 17-23] применили в ПЦР праймеры к области генов NS1 и VP1.

ПЦР, являясь высоко чувствительным, специфичным, всесезонным способом детекции вирусного генома, может быть использована в диагностических целях. Постановка реакции требует не более трех часов. Анализ структуры парвовируса гусей свидетельствовал о преимуществах амплификации высоко консервативного участка генома, кодирующего основной капсидный белок VP3. Анализ генома вируса показал целесообразность разработки олигонуклеотидных праймеров к указанному участку генома, отличающихся от предлагаемых Kexiang Yu et al [2016], что позволит повысить эффективность и специфичность ПЦР.

Технической проблемой является необходимость создания праймеров, повышающих специфичность ПЦР и расширить спектр праймеров, применяемых, для выявления различных областей генома парвовируса гусей.

Техническим результатом является создание синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных высоко консервативной области генома, кодирующей белок VP3 парвовируса гусей. Это позволяет повысить специфичность ПЦР и расширить спектр праймеров, применяемых, для выявления различных областей генома парвовируса гусей.

Сущность изобретения заключается в том, что созданы синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высоко консервативному участку генома парвовируса гусей, кодирующего белок VP3, который является основным белком вирусного капсида, составляя до 80% его массы. Более того, белок VP3 имеется не у всех парвовирусов, что повышает специфичность выявления парвовируса гусей с помощью ПЦР. Предлагаемые синтетические олигонуклеотидные праймеры имеют следующий нуклеотидную последовательность:

5'-САА CCG СТТ CCA CTG CCA СТТ-3'

5'-GAG TTG ATG СТС АТС АТС CTG ТАА-3'

Существенным отличием заявляемых синтетических олигонуклеотидных праймеров от аналогов является то, что для выявления ДНК парвовируса гусей ранее предлагали праймеры к области генома, кодирующего белки NS1 и VP1 [Kang Ning, 2017], VP1 [Timea Tatar-Kis, 2004], NS [Андрейчук Д.Б., 2016], VP3 [Kexiang Yu, 2016]. Праймеры, предлагаемые Kexiang Yu к области генома, кодирующего белок VP3, имели альтернативный нуклеотидный состав от заявляемых.

Выявление ДНК парвовируса гусей проводят методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на флуоресцентных детектирующих термоциклерах. В результате амплификации с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров синтезируется фрагмент двухцепочечной ДНК в количестве, превышающем 10⁹ раз и выше по сравнению с количеством исходной матрицы ДНК. Результаты учитывают на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Для выбора праймеров проанализировали последовательности генома всех штаммов парвовируса гусей, представленных в базе данных GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]. С помощью программ BioEdit 7.1 и Oligo 6.65 были подобраны праймеры к консервативному участку генома, кодирующего белок VP3 (таблица 1).

Высокую специфичность праймеров подтвердили с помощью on-line ресурса BLAST (NCBI) [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. Данные праймеры предназначены для постановки ПЦР-РВ.

Пример 2. Постановка ПЦР включала выделение суммарной ДНК из 100 мкл исследуемого материала с помощью набора для выделения ДНК/РНК-С-Фактор (Вет-Фактор).

ПЦР-РВ проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала: 10 ммоль Tris-HCl (рН 9.0), 50 ммоль KCl, 0.1%Triton Х-100, 1.5 ммоль MgCl₂, 10 пмоль каждого праймера 1fwd и 1rev, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полмеразы и 10 мкл выделенной ДНК.

В каждой серии анализов использовали по 2 контрольных образца: отрицательный - деионизированная вода; положительный - искусственно синтезированный фрагмент ДНК парвовируса гусей с концентрацией 10³ молекул/мкл.

Пример 3. ПЦР в реальном времени проводили по протоколу, указанному в таблице 2.

Детекция флуоресценции осуществлялась на второй стадии при температуре 50°С. Продукты ПЦР гена VP3 детектировали в 5'-экзонуклеазной реакции с помощью TaqMan зонда, меченного FAM.

Последовательность зонда представлена ниже:

5'-FAM-CCT AGA GAC TGG С AG AGA СТТ АТС ААС-BHQ1-3'

Анализ результатов проводили по кривым накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM (470-525 нм) - продукт амплификации ДНК гена VP3. Данные интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Пример 4. Специфичность ПЦР на основе созданных синтетических олигонуклеотидных праймеров определяли в образцах культуральной вируссодержащей жидкости, аллантоисной жидкости инфицированных парвовирусом развивающихся эмбрионов гусей и органов павших гусят. В испытание включали штаммы парвовируса: ЛИ, ЛИв-22, Уфа, ДК. Кроме этого, в исследование включали парвовирус крупного рогатого скота, вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парвовирус собак, парвовирус свиней. Пробы внутренних органов гусят гомогенизировали, готовили 10%-ную суспензию, центрифугировали при 5 тыс об/мин в течение 15 мин. Выделение ДНК из образцов осуществляли с помощью набора ДНК/РНК-С-ФАКТОР (Вет-Фактор) в соответствии с инструкцией по применению. Выделенную ДНК использовали для постановки ПЦР как описано в примере 2. Результаты ПЦР с использованием созданных синтетических олигонуклеотидных праймеров были положительными в пробах всех штаммов парвовируса гусей, пробах органов гусят, инфицированных парвовирусом. Другие вирусы, образцы органов неинфицированных гусят и погибших по другим причинам, показали отрицательные результаты.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и молекулярной биологии. Изобретение может быть использовано специалистами научно-исследовательских учреждений, ветеринарных диагностических лабораторий, занимающихся изучением инфекционных болезней и их возбудителей. Предложен набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления парвовируса гусей в полимеразной цепной реакции. Праймеры комплементарны высоко консервативной области генома, кодирующей белок VP3 парвовируса гусей. Это позволяет повысить специфичность ПЦР и расширить спектр праймеров, применяемых для выявления различных областей генома парвовируса гусей. 2 табл., 4 пр.

Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления парвовируса гусей в полимеразной цепной реакции, комплементарных высоко консервативной области генома парвовируса гусей, кодирующей белок VP3, имеющих следующий нуклеотидный состав:

5'-САА CCG СТТ CCA CTG CCA СТТ-3'

5'-GAG TTG ATG СТС АТС АТС CTG ТАА-3'