Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме изучения инфекционных вирусных заболеваний, и касается поиска новых направлений в специфической диагностике экзантемных заболеваний.
Экзантемные инфекции - инфекции, протекающие с высыпаниями на коже и слизистых оболочках (экзантемами и энантемами), распространяющиеся воздушно-капельным путем. Наиболее значимы из этих инфекций корь, краснуха, скарлатина, парвовирус В19. При этом по клиническому проявлению и характеру высыпаний не всегда возможно определить инфекционный патоген. Дифференциальный диагноз заболевания парвовирусом В19 необходим для ведения случаев инфицирования, а также для мероприятий по контролю общественного здравоохранения, особенно в случаях вспышек экзантемных заболеваний, в качестве причины которых подозревается корь или краснуха.
Парвовирус человека В19 (В19) - широко распространенный вирус, поражающий как здоровых, так и иммунокомпрометированных людей. Парвовирус В19 ассоциирован с целым рядом заболеваний, включая инфекционную эритему у детей, острую или хроническую артропатию у взрослых, преходящий апластический кризис у пациентов с хронической гемолитической анемией, стойкую анемию у пациентов с иммунодефицитом / ослабленным иммунитетом, отек плода у беременных и самопроизвольный выкидыш [Jain A., Kant R. Genotypes of erythrovirus B19, their geographical distribution & circulation in cases with various clinical manifestations. Indian J Med Res. 2018 Mar; 147(3):239-247. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_1816_16.]. Так, например, у детей с гематологическими злокачественными новообразованиями показана высокая частоту В19-инфекции с поздним кратковременным серологическим ответом и сохранением ДНК в течение длительного времени [Jain A., Jain P., Kumar A., Prakash S., Khan D.N., Kant R. Incidence and progression of Parvovirus B19 infection and molecular changes in circulating B19V strains in children with haematological malignancy: A follow up study. Infect Genet Evol. 2018 Jan; 57:177-184. doi: 10.1016/j.meegid.2017.11.021.]. Существуют также данные о связи парвовируса В19 с развитием гепатита [Bihari С., Rastogi A., Saxena Р., Rangegowda D., Chowdhury A., Gupta N., Sarin S.K. Parvovirus b19 associated hepatitis. Hepat Res Treat. 2013; 2013: 472027. doi: 10.1155/2013/472027]. Инфекция B19 распространена во всем мире, демонстрируя региональные эпидемиологические различия. Тем не менее, во всех популяциях соблюдается общность встречаемости серологических маркеров в зависимости от возраста пациентов: от 2% до 20% у детей младше 5 лет, 15-40% у детей и подростков от 5 до 18 лет и от 40% до 80% у взрослого населения [Gallinella G., Venturoli S., Manaresi E., et. al. B19 virus genome diversity: epidemiological and clinical correlations // J. Clin. Virol. 2003. vol. 28(1). P. 1-13.]. По некоторым данным, полученным из разных стран, среди пожилых людей более 85% имеют серологические признаки взаимодействия с инфекцией [Broliden K., Tolfvenstam Т., Norbeck О. Clinical aspects of parvovirus B19 infection // J. Intern. Med. 2006. vol. 260(4). P. 285-304.]. При этом распространенность маркеров В19 варьирует в зависимости от использованного метода диагностики и от анализируемой популяции. Следует отметить, что более низкие вирусные нагрузки могут наблюдаться у пациентов с антителами IgM и IgG против В19, тогда как самые высокие вирусные нагрузки могут оказаться у больных без антител против парвовируса В19 [Rezaei, F., Sarshari, В., Ghavami, N., Meysami, P., Shadab, A., Salimi, H., & Mokhtari-Azad, T. (2015). Prevalence and genotypic characterization of Human Parvovirus В19 in children with measles- and rubella-like illness in Iran. Journal of Medical Virology, 88(6), 947-953. doi:10.1002/jmv.24425].
Вирусный геном парвовируса В19 состоит из 5596 нуклеотидов с идентичными последовательностями инвертированных концевых повторов длиной 365 нуклеотидов на каждом конце. На основании филогенетического анализа фрагмента уникального участка NS1/VP1, кодирующего, в том числе, неструктурный белок 1 (NS1) и капсидный вирусный белок 1 (VP1), разделяют три генотипа (1, 2 и 3) B19V, нуклеотидная последовательность которых отличается на 13-14%. Генотипы 1 и 3 подразделяют на субгенотипы 1а и 1b и 3а и 3b, соответственно [Servant A., Laperche S., Lallemand F., et al. Genetic diversity within human erythroviruses: identification of three genotypes // J. Virol. 2002. vol. 76. P. 9124-9134., Toan N.L., Duechting A., Kremsner P.G., et al. Phylogenetic analysis of human parvovirus B19, indicating two subgroups of genotype 1 in Vietnamese patients // J. Gen. Virol. 2006. vol. 87. P. 2941-2949.]. Несколько лет назад было предложено разделить субгенотип 1А на подгруппы 1А1 и 1А2 [Molenaar-de Backer M.W., Lukashov V.V., van Binnendijk R.S., et al. Global co-existence of two evolutionary lineages of parvovirus B19 1a, different in genome-wide synonymous positions // PLoS One. 2012. vol. 7(8). P. e43206.]. При этом, хотя явных различий в клиническом исходе при инфицировании разными генотипами не выявлено [Servant A., Laperche S., Lallemand F., et al. Genetic diversity within human erythroviruses: identification of three genotypes // J. Virol. 2002. vol. 76. P. 9124-9134.], в литературе представлены доказательства того, что некоторые осложнения могут быть связаны с определенными генотипами парвовируса В19 [Sanabani S., Neto W.K., Pereira J., et al. Sequence variability of human erythroviruses present in bone marrow of Brazilian patients with various parvovirus B19-related hematological symptoms // J. Clin. Microbiol. 2006. vol. 44. P. 604-606.].
Определение генотипов и субтипов парвовируса В19 важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, выявления путей распространения вируса, а также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии.
В то время как прямое секвенирование нуклеотидной последовательности является золотым стандартом для классификации генотипов и субтипов парвовируса В19, используемые для выявления вируса методики на основе технологии ПЦР недостаточно чувствительны для выявления вируса при низких концентрациях и/или основаны на выявлении коротких консервативных фрагментов нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять глубокое типирование вируса.
Известен метод выявления парвовируса В19 с оценкой вирусной нагрузки, основанный на полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, представленный в коммерческом наборе "АмплиСенс® Parvovirus В19 -FL" (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови совместно с ВКО и проведении амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (формат FRT). Данный метод позволяет выявить вирус при концентрациях свыше 360 МЕ/мл, линейный диапазон измерения набора реагентов 720-9000000 МЕ/мл.
Полученные в ходе амплификации фрагменты невозможно использовать для секвенирования и дальнейшего глубокого типирования вируса в связи с их небольшой протяженностью. Таким образом, данный метод не позволяет определить генотипы, выявить субтипы вируса и не может быть использован при более низкой вирусной нагрузке.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный нами ранее для выявления и глубокого типирования вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке [Пат. 2633755 Российская Федерация, МПК G01N 33/50 C12Q 1/70. Способ выявления в биологическом материале ДНК вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр / Останкова Ю.В., Семенов А.В., Тотолян А.А.; патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера». - №2016144898; заявл. 15.11.2016; опубл. 17.10.2017, Бюл. изобр. №29 - 11 с.]. Метод заключается в гнездовой ПЦР, при этом первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 
обратный праймер 
). На втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов геном ВГВ. В составе амплификационной смеси на каждом этапе неравномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов и высокая концентрация MgCl2, на первом этапе в смеси присутствуют формамид и глицерин в количестве 4% и 6% от конечного объема соответственно, а на втором этапе формамид и DMSO в количестве 4% и 10% от конечного объема соответственно.
Авторами предложен метод выявления парвовируса В19 методом «гнездовой» ПЦР с использованием на первом этапе асимметричной амплификации на олигонуклеотидах, фланкирующих геном вируса за исключением инвертированных концевых повторов, а на втором этапе нескольких пар праймеров, фланкирующих различные регионы генома вируса. В том числе фрагменты, включающие рекомендованный для гено- и субтипирования парвовируса В19 регион NS1/VP1 область 2120-3110 нт., согласно представленному в международной базе данных GenBank изоляту J35 (AY386330) [Zhi N., 
Brown K.Е., Tijssen P. Construction and sequencing of an infectious clone of the human parvovirus B19. Virology. 2004 Jan 5; 318(1):142-52. DOI: 10.1016/j.virol.2003.09.011].
Технический результат - повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать изоляты парвовируса В19 с высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей.
Сущность метода заключается в том, что на первом этапе проводится амплификация ДНК методом асимметричной полимеразной цепной реакции с использованием протяженных олигонуклеотидных праймеров с разной температурой плавления, комплементарных области наибольшего сходства геномов различных изолятов парвовируса В19. Для повышения чувствительности проводится вторая полимеразная цепная реакция с использованием продукта амплификации первой реакции и внутренних (вложенных, гнездовых) праймеров. При этом состав реакционного буфера изменяется на разных этапах.
На первом этапе используются протяженные олигонуклеотидные праймеры:
Прямой праймер:
Обратный праймер:
Состав амплификационной смеси на первом этапе:
4 пмоль/л прямого праймера, 30 пмоль/л обратного праймера, по 0,8 ммоль/л всех нуклеозидтрифосфатов, 8,2 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), глицерин 5% от конечного объема, 10 мкл раствора ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 50 мкл.
ПЦР проводят при следующих условиях:
после денатурации при 95°С в течение 5 минут устанавливали 45 циклов амплификации в режиме: 95°С - 30 сек, 57°С - 6 мин; после 20-го и 40-го циклов элонгация при 72°С - 6 мин; затем финальная элонгация при 72°С - 10 мин.
На втором этапе используют одну из пар праймеров:
Пара 1:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Пара 2:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Пара 3:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Пара 4:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Пара 5:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Пара 6:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Пара 7:
Прямой праймер 
Обратный праймер 
Состав амплификационной смеси на втором этапе:
20 пмоль/л каждого праймера, по 0,8 ммоль/л всех нуклеозидтрифосфатов, 7,5 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), DMSO 8% от конечного объема, формамид 4% от конечного объема, 10 мкл продукта амплификации первого этапа, вода без нуклеаз до конечного объема 50 мкл.
ПЦР проводят при следующих условиях:
после денатурации при 95°С в течение 5 минут устанавливали 40 циклов амплификации в режиме: 95°С - 30 сек, 56°С - 20 сек., 72°С - 1 мин 30 сек; затем финальная элонгация при 72°С - 7 мин.
Таким образом, предложенный метод отличается от прототипа тем, что на первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 
обратный праймер 
), на втором этапе используются праймеры к областям генома парвовируса В19, при этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе равномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов со сниженной концентрацией и высокая концентрация MgCl2, на первом этапе в смеси присутствует глицерин в количестве 5% от конечного объема, а на втором этапе формамид и DMSO в количестве 4% и 8% от конечного объема соответственно.
Аналитическую чувствительность метода проверяли методом поэтапного разведения.
Были выбраны 10 образцов плазмы крови, содержащие различные концентрации парвовируса В19. Вирусную нагрузку предварительно измеряли с помощью стандартизированного набора для количественного определения ДНК В19 в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». «АмплиСенс® Parvovirus B19-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва).
Каждый образец поэтапно разводили предварительно проанализированной плазмой крови без парвовируса В19 (чистой плазмой) следующим образом. Аликвоту образца объемом 100 мкл вносили в микропробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 100 мкл чистой плазмы, тщательно пипетировали и переносили 100 мкл полученного пула в новую микропробирку, куда снова добавляли 100 мкл чистой плазмы, пипетировали и 100 мкл нового пула переносили в третью пробирку итд. до десятикратного последовательного разведения (таб. 1).
После разведения осуществляли экстракцию ДНК из каждого пула разведения каждого образца с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Полученные образцы ДНК амплифицировали, согласно предложенному методу. Результаты выявления вируса в пулах разведения представлены в таблице 2.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен электрофорез продуктов амплификации второго этапа (праймеры 
) последовательных разведений образца №8, вирусная нагрузка 13*103 МЕ/мл. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 25 МЕ/мл) виден слабо, однако концентрации продукта достаточно для проведения секвенирующей реакции и получения нуклеотидной последовательности искомого фрагмента генома. На фиг. 2 представлен Черно-белый негатив фотографии 1. Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода.
Пример 1.
Больные с макуло-папулезной сыпью отрицательные по антителам IgM-корь и IgM-краснуха: 821 пациент. Антитела к парвовирусу В19 класса IgM и IgG выявлены в 139 (16,9%) случаях. ДНК вируса выявлена у 59 (42,4%) серопозитивных больных. Для оценки гетерогенности изолятов были выбраны образцы из географически удаленных регионов СЗФО, разного возраста, вне зависимости от пола. Филогенетический анализ позволил отнести изоляты к генотипу 1А. У всех изолятов в гене VP1 выявлена мутация, приводящая к аминокислотной замене K26E, не представленной среди изолятов B19V в международной базе GenBank.
Пример 2.
Были обследованы пациенты (n=54) клиники НИИ ДОГиТ им. P.M. Горбачевой с различными онкогематологическими заболеваниями и врожденными синдромами в возрасте от 0,6 до 19 лет (медиана - 7,2 года), которым была выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Образцы крови отбирались до начала режима кондиционирования перед алло-ТГСК, на 30-й (Д+30) и на 60-й (Д+60) день после алло-ТГСК. ДНК PVB19 низкой копийности до 2,73×102 копий/мл (на фоне противовирусной терапии) отмечались у 28% до алло-ТГСК, 29% и 30,4% на Д+30 и Д+60 после алло-ТГСК. Наличие в крови вирусной В19 ДНК к Д+30 после алло-ТГСК было ассоциировано с фебрильной нейтропенией (ФН) в эти сроки в 100% случаев (14/14), тогда как при отсутствии ДНК PVB19 ФН отмечалась у 68% больных (23/34; р=0,015).
Пример 3.
В период 2016-2018 гг. на наличие ДНК PVB19 исследованы образцы плазмы крови больных госпиталя префектуры Фрия Гвинейской Республики (ГР) с лабораторно подтвержденным диагнозом «малярия». Наиболее многочисленная группа в структуре больных малярией представлена детьми в возрасте до 5 лет (средний 3 года) (89, или 28,25±2,53%). Клиническое течение малярии у 316 обследованных пациентов оценивали как «неосложненное» и «осложненное». В целом, ДНК PVB19 DNA была выявлена в плазме крови 55 из 316 пациентов (17,41±2,13%). Но в группе больных с коинфицированием парвовирусом В19 и P. falciparum осложненное течение малярии наблюдали у 40 из 55 (72,73±2,75%) пациентов, и в 6 из 55 случаев (10,91±4,40%) регистрировали летальный исход. В группе пациентов с малярией без коинфицирования парвовирусом В19 осложнения наблюдались у 99 из 261 пациента (37,9±3,0%); из них 2 (0,77±0,54%) умерли.
Пример 4.
В качестве материала от условно здоровых лиц исследовали плазму крови доноров (n=400) в возрасте от 18 до 60 лет из Центра (крови и тканей) Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. У 130 (41,6%) доноров была обнаружена ДНК парвовируса В19, однако вирусная нагрузка выше 105 копий ДНК/мл была в 14 случаях (4,4%). Максимальная вирусная нагрузка составила 108 копий ДНК/мл (одна проба).
Также в течение 2015-2018 года было проведено более 650 исследований предложенным методом на основе технологии ПЦР. Выявлен высокий процент встречаемости парвовируса В19 среди доноров крови как в России, так и в странах Средней Азии.
Изобретение относится к медицинской биотехнологии и описывает способ выявления вируса парвовирус В19 при низкой вирусной нагрузке путем определения в пробе крови ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов. Выявление проводят в плазме и/или сыворотке крови, ротоглоточных смывах. Диагностика проводится в два этапа. На первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 5'-agccattttaagtgttttactataattttattggtcagtttt-3', обратный праймер 5'-tgttgttcatatctggttaaatacttaaattc-3'), на втором этапе используются праймеры к областям генома парвовируса В19, при этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе равномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов со сниженной концентрацией и высокая концентрация MgCl2, на первом этапе в смеси присутствует глицерин в количестве 5% от конечного объема, а на втором этапе - формамид и DMSO в количестве 4% и 8% от конечного объема соответственно. Способ обеспечивает повышение чувствительности и специфичности диагностики. 2 ил., 2 табл., 3 пр.
Способ выявления ДНК вируса парвовирус В19 в биологическом материале на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием амплифицированных фрагментов генома вируса, отличающийся тем, что на первом этапе применяется асимметричная ПЦР с протяженными олигонуклеотидными праймерами, а именно прямой праймер 5'-agccattttaagtgttttactataattttattggtcagtttt-3' и обратный праймер 5'-tgttgttcatatctggttaaatacttaaattc-3', продукты которой затем используют для второго этапа амплификации с одной из следующих пар вложенных праймеров: пара 1 прямой праймер 5'-tgttttactataattttattggtcagttttgt-3' обратный праймер 5'-aattagttgctttataaattgctagttttagt-3', пара 2 прямой праймер 5'-aacgataactggtggtgctc-3' обратный праймер 5'-ggccattgccaagtttgttt-3', пара 3 прямой праймер 5'-aattgttaaattgttactttgtc-3' обратный праймер 5'-aaactgggcttccgacaaat-3', пара 4 прямой праймер 5'-caattgtcacagacaccagta-3' обратный праймер 5'-acttagccagttggctatacct-3', пара 5 прямой праймер 5'-ttgggactttgtccccattg-3' обратный праймер 5'-caagtcacagagttggcact-3', пара 6 прямой праймер 5'-tttcaaggaagtttgccgga-3' обратный праймер 5'-tgggtcacctcctaatgtgt-3', пара 7 прямой праймер 5'-acacattaggaggtgaccca-3' обратный праймер 5'-ctggttaaatacttaaattc-3', причем амплификационная смесь для первого этапа содержит: 4 пмоль/л прямого праймера, 30 пмоль/л обратного праймера, по 0,8 ммоль/л всех нуклеозидтрифосфатов, 8,2 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), глицерин 5% от конечного объема, 10 мкл раствора ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 50 мкл, амплификационная смесь для второго этапа содержит: 20 пмоль/л каждого праймера, по 0,8 ммоль/л всех нуклеозидтрифосфатов, 7,5 ммоль/л MgCl2, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), DMSO 8% от конечного объема, формамид 4% от конечного объема, 10 мкл продукта амплификации первого этапа, вода без нуклеаз до конечного объема 50 мкл.
