Штамм дрожжей Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 - ассоциант для получения микробного белка Российский патент 2023 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы, которая используется как источник белка в белково-витаминных комплексах, предназначенных для балансирования кормов для аквакультуры, сельскохозяйственных и домашних животных.

В настоящее время разрабатываются методы получения высокобелковых кормов путем их промышленного биосинтеза с помощью низших автотрофных организмов - дрожжей и бактерий.

Известно использование штамма дрожжей Pichia kudriavzevii в целях производства биомассы [заявка Китая CN0111635866A, опубл. 08.09.2020 г.]. Известно получение биомассы из листьев маниоки из листьев маниоки с использованием штамма дрожжей Pichia kudriavzevii [https://doi.org/10.1002/jsfa.9517, опубл. 28.11.2018 г.].

Известен штамм дрожжей Pichia kudriavzevii Ден-5 10-2018, обладающий способностью продуцировать этанол и микробный белок, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4341. [патент РФ RU2702191, МПК: C12N1/16, С12Р7/06; опубл. 04.10.2019 г.].

В целях увеличения выхода кормовой биомассы известно использование в качестве компонента ассоциативной культуры штаммов гетеротрофных бактерий: штамм гетеротрофных бактерий Stenotrophomonas acidaminiphila GBS-15-2 [патент РФ RU2687136, МПК: C12N1/20, С12Р21/00, А23К10/10, C12R1/01; опубл. 07.05.2019 г.]; штамм гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii [патент РФ RU2687135, МПК: C12N1/20, С12Р21/00, опубл. 07.05.2019 г.]; штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia [патент РФ RU2687137, МПК: C12N1/20, С12Р21/00, опубл. 07.05.2019 г.].

Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении изобретения, состоит в повышение производительности и продуктивности производства кормовой биомассы.

Технический результат заключается в расширении арсенала средств для производства микробной белковой массы, выявлении нового штамма, который является ассоциантом метанолокисляющих дрожжей и повышает содержание белка в продукте при совместном культивировании.

Для достижения указанного технического результата предложено использование штамма метанолокисляющих дрожжей Pichia kudriavzevii BF 20-07Y, депонированного в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Y-4975, в качестве компонента ассоциативной культуры метанолокисляющих дрожжей для получения микробного белка. Обозначение штамма, присвоенное депозитором BF20-07Y.

Штамм выделен из дерново-подзолистой почвы (Московская область, Россия). Образец дерново-подзолистой почвы был использован для получения накопительной культуры метанолокисляющих дрожжей. После инкубирования в жидкой минеральной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода культуру пересевали, используя метод серийных разведений. После нескольких пассажей культуру высевали на агаризованную минеральную среду для получения изолированных колоний чистой культуры метилотрофных дрожжей. Полученный таким образом штамм Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 (BF20-07Y) был селекционирован в процессе длительного (более полугода) пассирования на жидких и агаризованных средах с метанолом.

Была произведена идентификация по физиологическим и биохимическим признакам.

Систематическое положение подтверждено результатами анализа ITS региона гена рРНК, а также расшифровкой генома. Работы проводились компанией SciBear OU (Tartu mnt 67/1-13b, Kesklinna linnaosa, Tallinn, 10115 Harju maakond, Reg. No. 16221849). Полученные последовательности были депонированы в NCBI под номером MZ831233.

Форма и размер клеток в суточной культуре на синтетической среде с метанолом: клетки овальной формы, отдельные, но преобладают почкующиеся. Размер клеток 2,5-3,0 × 3,0-3,7 мкм. На синтетической агаризованной среде с метанолом образует круглые со слегка волнистым краем, матовые, белого цвета колонии. Колонии формируются на 5-7 сутки, достигая 1-4 мм. На Сабуро агаре образуют круглые, матовые, с филенчатым краем, белые колонии, достигая 0,5-10,0 мм

Кроме метанола ассимилируют

1) спирты: этанол, маннит;

2) сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, маннозу, фруктозу, ксилозу;

Не усваивает азотнокислый калий, усваивает сернокислый аммоний.

Дрожжи также нуждаются в фосфоре и сере.

Металлы: магний, железо, кальций и цинк, также необходимы для хорошего роста дрожжей.

Нуждается для роста в автолизате или витаминах (биотин и тиамин).

Культура факультативно анаэробна.

Способна расти при температуре 37-42 °С (оптимум 40° С) и рН 3,0-5,8 (оптимум 4,5-5,5).

В клетках накапливаются жиры, гликоген и полифосфаты.

Нуждается для роста в автолизате или витаминах: биотин и тиамин.

В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты.

Активность (продуктивность) штамма составляет до 4,5 кг×м³/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: на жидкой минеральной среде с метанолом (1% об.) и значениях рН (4,0) при температуре 40 °С с добавлением дрожжевого автолизата в количестве 0,3%.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии; криоконсервация при -80°С в качестве криопротектора применяется 30 % раствор глицерина.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Вариант 1

Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 3,3; MgSO₄ × 7H₂O - 0,7; NaCl - 0,5; K₂HPO₄ -1,0; KH₂PO₄ - 0,13; дрожжевой автолизат - 3,0. Микроэлементы (мг/л): MnSO₄×5H₂O - 0,2; FeSO₄×7H₂O - 1; H₃BO₃ - 0,2; Na₂MoO₄×2H2O - 0,2; KI - 0,2. Метанол 10 мл/л, рН 4,8-5,2 (доводится 70 % раствором H₃PO₄), температура культивирования 40 °С.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для ферментации (10 г/л метанола):

H₃PO₄ (70 %) - 15,86 мл.

K₂SO₄- 9,53 г.

MgSO₄ × 7H₂O - 7,8 г.

CaCl₂ × 2H₂O - 0,6 г.

КОН (85%) -2,6 г.

Биотин - 20 мкг.

Тиамин - 200 мкг.

FeSO₄×7H₂O - 650 мг.

CuSO₄×5H₂O - 60 мг.

MnSO₄×2H₂O - 30 мг.

ZnSO₄ × 7H₂O - 200 мг.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии нет;

б) фагоустойчив;

в) плазмиды не обнаружены;

г) профаги не обнаружены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным; не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Для заявляемого штамма характерны:

- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры;

- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Культивирование штамма Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 (BF20-07Y) проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,7 л при коэффициенте заполнения 0,1-0,2 в термостатируемом шейкере-инкубаторе при 40 °С. Культивирование осуществляют в течение 24 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 1,2 г/л. Полученную культуру используют в качестве посевного материала для последующего выращивания дрожжей в автоматизированном ферментационном комплексе.

Пример 2

Осуществляли выращивание культуры Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 (BF20-07Y) в непрерывном режиме в ферментере с рабочим объемом - 3,5 л с постоянной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (10 г/л метанола):

H₃PO₄ (70 %) - 15,86 мл.

K₂SO₄- 9,53 г.

MgSO₄ × 7H₂O - 7,8 г.

CaCl₂ × 2H₂O - 0,6 г.

КОН (85%) - 2,6 г.

Биотин - 20 мкг.

Тиамин - 200 мкг.

FeSO₄×7H₂O - 650 мг.

CuSO₄×5H₂O - 60 мг.

MnSO₄×2H₂O - 30 мг.

ZnSO₄ × 7H₂O - 200 мг.

Процесс выращивания осуществляли в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 38 °С до 42 °С и рН 4, 0-5,5. Средняя скорость подачи 50 % об метанола составляла 10 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,1ч^-1. Значение рН регулировали 1,5 % раствором аммиачной воды. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход воздуха на 1 л культуральной среды составляли 20 л/час.

В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием воды из разных источников, продуктивность культуры оставалась стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляла 7-10 г/л, с содержанием сырого протеина в биомассе 48-50 %.

Пример 3

Осуществляли выращивание культуры Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 (BF20-07Y) в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 5 л (рабочий объем - 3,5 л) с постоянной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (10 г/л метанола):

H₃PO₄ (70 %) - 15,86 мл.

K₂SO₄- 9,53 г.

MgSO₄ × 7H₂O - 7,8 г.

CaCl₂ × 2H₂O - 0,6 г.

КОН (85%) -2,6 г.

Биотин - 20 мкг.

Тиамин - 200 мкг.

FeSO₄×7H₂O - 650 мг.

CuSO₄×5H₂O - 60 мг.

MnSO₄×2H₂O - 30 мг.

ZnSO₄ × 7H₂O - 200 мг.

Процесс выращивания осуществляли в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 38 °С до 42 °С и рН 4,0-5,5. Скорость подачи метанола составляла 100 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН регулировали 1,5 % раствором аммиачной воды или раствором 70 % ортофосфорной кислоты. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход воздуха на 1 л культуральной среды составляли 60 л/час.

В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием воды из разных источников, продуктивность культуры оставалась стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляла 13-16 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 42-45 %.

Ассоциативную культуру, состоящую из метанолокисляющих дрожжей Ogataea parapolymorpha ВКПМ Y-5081 и Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 в непрерывном режиме в ферментере с объемом 5л (рабочий объем - 3,5 л) с непрерывной подачей растворов минеральных солей (как в предыдущем примере). Процесс выращивания осуществляли в нестерильных условиях, при соблюдении условий культивирования: температура 40 °С и рН 4,0. Средняя скорость подачи 50 % об. метанола составляла 10 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН регулировали 1,5 % раствором аммиачной воды. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход воздуха на 1 л культуральной среды составляли 20 л/час. Культуральную жидкость на выходе из ферментера отделяли от клеток в нестерильном режиме и возвращали в ферментационный процесс вместо воды, проводя корректировку подачи среды роста по солям. Доля Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 (BF20-07Y) при таком способе культивирования составляла 1-1,5 % от общего количества клеток. Концентрация биомассы на выходе из ферментера составляла 18-20 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе - 50-54 %.

Полученные данные свидетельствуют о том, что культивирование штамма Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 (BF20-07Y) в качестве ассоцианта позволяет повышать концентрацию биомассы на 25-40 % и содержание протеина на 20%.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм метанолокисляющих дрожжей Pichia kudriavzevii BF 20-07Y, депонированный в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Y-4975, в качестве компонента ассоциативной культуры метанолокисляющих дрожжей для получения микробного белка. Обозначение штамма, присвоенное депозитором, BF20-07Y. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для производства микробной белковой массы. Выявлен новый штамм, который является ассоциантом метанолокисляющих дрожжей и повышает содержание белка в продукте при совместном культивировании. 3 пр.

Штамм метанотрофных дрожжей Pichia kudriavzevii ВКПМ Y-4975 в качестве компонента ассоциативной культуры для получения микробного белка.