Штамм Methylobacterium populi ВКПМ В-14346 - продуцент микробной белковой массы Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Данный продукт используется как источник белка в белково-витаминных комплексах, предназначенных для балансирования кормов для сельскохозяйственных животных.

Известен штамм бактерий Methylobacterium sp. ВКМ В-2029Д, разлагающий метанол и/или формальдегид, выделенный из промышленных сточных вод [RU 95106757, МПК: C12N1/20; C02F3/34; C12R1/01 опубл. 20.07.1996 г.]. Штамм использует в качестве единственного источника углерода метанол и /или формальдегид в количестве до 2% и не растет на богатых питательных средах.

Известно использование в способе получения биомассы с помощью микроорганизма Methylobacterium populi на субстрате, содержащем метанол [RU 2811519, МПК: C12N1/20; C02F3/34; C12R1/01 опубл. 15.01.2024 г.].

Известен штамм метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens ВКПМ В-14231 - продуцент микробной белковой массы [RU 2796376, МПК: C12N1/20; C12R1/01; опубл. 22.05.2023 г.]. Активность штамма составляет до 5,2 кг×м³/час. Концентрация биомассы на выходе из ферментера - 15-19 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 62-65%. Штамм устойчив к изменению условий культивирования.

Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении изобретения, состоит в создании нового высокопродуктивного штамма метанолокисляющих бактерий для производства кормовой биомассы с более высоким технологическим потенциалом.

Технический результат заключается в расширении арсенала средств для производства микробной белковой массы, создании нового высокопродуктивного штамма метанолокисляющих бактерий Methylobacterium populi, используемого для получения микробной белковой массы. Технический результат заключается также в повышении эффективности предлагаемого нового штамма для получения микробной белковой массы за счет оптимизации параметров роста, уменьшении расхода минеральных компонентов питания, повышении выхода микробной белковой массы, повышении устойчивости штамма к изменению условий культивирования без снижения продуктивности - устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры. Применение метанола имеет несколько преимуществ: метанол хорошо растворим в воде, доступен по сравнительно низкой цене.

Для достижения указанного технического результата предложено использование штамма метанолокисляющих бактерий Methylobacterium populi BF22-44М, депонированного в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14346, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы. Обозначение штамма, присвоенное депозитором BF22-44М.

Штамм Methylobacterium populi BF22-44М был выделен из образца поверхностного слоя донных осадков безымянного озера, Краснодарский край, Россия. Образец осадка был использован для получения накопительной культуры метанолокисляющих бактерий. После инкубирования в жидкой минеральной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода культуру пересевали, используя метод серийных разведений. После нескольких пассажей культуру высевали на агаризованную минеральную среду для получения изолированных колоний чистой культуры метилотрофных бактерий. Полученный таким образом штамм Methylobacterium populi BF22-44М был селекционирован в процессе длительного (более полугода) пассирования на жидких и агаризованных средах с метанолом.

Штамм бактерии Methylobacterium populi ВКПМ В-14346 идентифицирован по культурально-морфологическим, физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Систематическое положение подтверждено результатами анализа гена 16S рРНК. Полученная последовательность депонирована NCBI под номером OP420804.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии - не выявлены;

б) устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д. - не выявлены;

в) плазмиды - не выявлены;

г) профаги - не выявлены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Культура грамотрицательна. Грамотрицательные палочки 0,8-1,0×1,0-10,0 мм, часто разветвленные, что особенно характерно для старых клеток, встречаются одиночно или в розетках, подвижны за счет одного полярного или латерального жгутика.

Колонии на 5 сутки культивирования на минеральной агаризованной среде с метанолом (1% об.) при 30°С блестящие, гладкие, выпуклые, сферические, розовые или красные (за счет синтеза каротиноидного пигмента) диаметром 1-3 мм. Содержат терминально расположенные гранулы поли-β-гидроксибутирата.

Рост при температуре 15-37°С (оптимум 28-32°С) и рН 4,0-10,0 (оптимум 6,0-8,0).

Нитраты до нитритов не восстанавливает.

Индол и сероводород не образует.

Гидролиза желатина и крахмала не наблюдается.

Аммиак не производит.

Строгий аэроб, хемоорганотроф и факультативный метилотроф, ассимилирующий соединения C1 по сериновому пути.

В качестве источников углерода и энергии использует метанол, метиламин, формиат и формальдегид. Кроме того, штамм утилизирует метан.

Не утилизирует L-арабинозу, D-глюкозу, D-маннозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, D-сорбит, D-маннит, инозит, цитрат.

Тесты на оксидазу, каталазу и уреазу положительные.

Не нуждается в витаминах и других стимуляторах роста.

В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты.

В клетках синтезируется убихинон (преимущественно Q10).

Активность (продуктивность) штамма составляет до 5,2 кг×м³/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: на жидкой минеральной среде с добавлением метанола в количестве 20 мл/л.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии; криоконсервация при - 80°С в качестве криопротектора применяется 30 % раствор глицерина.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Вариант 1

Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 0,5; MgSO₄ × 7H₂O - 0,2; NaCl - 0,1; CaCl₂ - 0,05; K₂HPO₄ - 1,2; KH₂PO₄ - 0,62. Микроэлементы (мг/л): MnSO₄×5H₂O - 0,2; FeSO₄×7H2O - 1; H₃BO₃ - 0,2; Na₂MoO₄×2H₂O -0,2; KI - 0,2. Метанол 10 мл/л, рН 6,8-7,0, температура культивирования 30°С.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для ферментации (г/л метанола):

H₃PO₄ (70%) - 40,6 мл;

KCl - 48,0 г;

MgSO₄ × 7H₂O - 12,7 г;

FeSO₄×7H₂O - 3,4 г;

CuSO₄×5H₂O - 0,28 г;

MnSO₄×5H₂O - 2,5 г;

ZnSO₄ × 7H₂O - 2,3 г;

CoCl₂ × 2H₂O - 0,00012 г;

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,002 г.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии нет;

б) фагоустойчив;

в) плазмиды не обнаружены;

г) профаги не обнаружены.

Для заявляемого штамма характерны:

- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры;

- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Культивирование штамма Methylobacterium populi BF22-44М проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,7 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в шейкере-инкубаторе при 30°С. Культивирование проводят в течение 24 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 1,5 г/л. Полученную культуру используют в качестве посевного материала для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 30 л (рабочий объем 20 л).

Пример 2

Осуществляют выращивание культуры Methylobacterium populi BF22-44М в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 20 л) с постоянной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (г/л метанола):

H₃PO₄ (70%) - 40,6 мл;

KCl - 48,0 г;

MgSO₄ × 7H₂O - 12,7 г;

FeSO₄×7H₂O - 3,4 г;

CuSO₄×5H₂O - 0,28 г;

MnSO₄×5H₂O - 2,5 г;

ZnSO₄ × 7H₂O - 2,3 г;

CoCl₂ × 2H₂O - 0,00012 г;

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,002 г.

Процесс выращивания осуществляют в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 28°С до 32°С и рН 6,0-8,0. Скорость подачи метанола составляет 100 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН регулируют 5% раствором аммиачной воды. Регулирование температуры процесса осуществляют подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход воздуха на 1 л культуральной среды составляет 60 л/час.

В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием воды из разных источников, продуктивность культуры остается стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляет 18-21 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 70-75%.

Пример 3

Осуществляют выращивание культуры Methylobacterium populi BF22-44М в непрерывном режиме в ферментере с турбинной мешалкой объемом 100 л (рабочий объем - 70 л) с непрерывной подачей растворов минеральных солей (как в предыдущем примере). Процесс выращивания осуществляют при температуре 30°С и рН среды 7,0. Значение рН поддерживают 10%-ным раствором аммиачной воды. В ферментер подают воздух в количестве 120 л/ч. Коэффициент скорости протока составляет 0,25 ч^-1. Культуральную жидкость на выходе из ферментера отделяют от клеток в нестерильном режиме и возвращают в ферментационный процесс вместо воды. Доля сопутствующей микрофлоры при таком способе культивирования остается неизменной и не превышает 20% от общего количества клеток. Концентрация биомассы на выходе из ферментера составляет 15,5 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе 70-75%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что культивирование штамма Methylobacterium populi BF22-44М позволяет получать сопоставимо стабильный выход биомассы с большим содержанием белка в минеральной среде указанного состава по сравнению с штаммом метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens ВКПМ В-14231 по патенту РФ RU2796376 при непрерывном протоке и в широком диапазоне условий культивирования (температура, рН, содержание солей).

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм метанолокисляющих бактерий Methylobacterium populi BF22-44М, депонированный в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14346, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы. Активность штамма составляет до 5,2 кг×м³/час. Концентрация биомассы на выходе из ферментера - 18-21 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 70-75%. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для производства микробной белковой массы. Создан новый высокопродуктивный штамм метанолокисляющих бактерий Methylobacterium populi, используемый для получения микробной белковой массы с возможностью утилизации в процессе культивирования опасного органического отхода (метанола) без ущерба для окружающей среды. Штамм устойчив к изменению условий культивирования. 3 пр.

Штамм метилотрофных бактерий Methylobacterium populi ВКПМ В-14346 - продуцент микробной белковой массы.