СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МОЧЕВИНЫ И КОМПОЗИЦИИ НА ИХ ОСНОВЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ АТФАЗЫ SMARCA2/BRM Российский патент 2023 года по МПК C07D417/12 A61K31/4439 A61P35/00 A61P35/02 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 30 ноября 2016 г., имеет название PAT057524-US-PSP_SL.txt, и ее размер составляет 31078 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям, содержащим такие соединения, и к их применению для лечения BRM-опосредованных и/или BRG1-опосредованных нарушений или заболеваний, которые включают виды рака с мутацией в BRG1/SMARCA4.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Мультибелковые комплексы SWI/SNF млекопитающих (mSWI/SNF) контролируют структуру хроматина путем АТФ-зависимого ремоделирования нуклеосом и, тем самым, контролируют множество ключевых клеточных процессов. Несколько субъединиц комплексов mSWI/SNF играют роль супрессоров опухолей, и недавние геномные исследования выявили часто возникающие мутации в нескольких таких субъединицах с общей частотой мутаций, которая составляет примерно 20% среди всех видов рака. Каталитическая субъединица SWI/SNF BRG1, также известная как SMARCA4, часто подвергается мутации при видах аденокарциномы легкого и других видах рака.

BRM (также известный как SMARCA2) представляет собой паралог BRG1 (или BRM/SWI2-родственный ген 1, также известный как SMARCA4), и эти два белка функционируют как взаимоисключающие АТФ-зависимые субъединицы внутри комплекса SWI/SNF ремоделирования хроматина у млекопитающих. Для клеток требуется или BRM, или BRG1, чтобы собрать каталитически активный комплекс SWI/SNF. Различные варианты комплекса SWI/SNF были охарактеризованы отличающимся составом субъединиц, но только одна каталитическая субъединица (BRM или BRG1) присутствует в каждом комплексе.

Было показано, что BRG1 функционирует как супрессор опухолей и подвергается значительному числу мутаций при видах рака у человека. Доказательство наличия функции супрессии опухоли у BRG1 было продемонстрировано с помощью повторной экспрессии BRG1 дикого типа в клеточных линиях с мутацией в BRG1, что приводило к дифференциации и остановке клеточного цикла. У мышей с аллелями Brg1+/- развивается карцинома молочной железы с частотой возникновения 10% за один год. Мутации с потерей функции в BRG1 были идентифицированы в ~30% утвердившихся линий немелкоклеточного рака легкого, и сайленсинг BRG1 выявлен во множестве других раковых клеточных линий и образцов опухолей, включая виды рака легкого, поджелудочной железы и яичника, виды меланомы и виды детской рабдоидной саркомы. Важно, что недавние результаты из проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA) позволили идентифицировать мутации BRG1 как ген, подверженный существенному количеству мутаций в образцах опухолей, отобранных у пациентов с аденокарциномой легкого, с частотой появления в ~10% из всех образцов опухолей (величина, подобная другим в надлежащей степени охарактеризованным онкогенам и супрессорам опухолей, таким как EGFR и LKB1). В проекте TCGA подобным образом идентифицировали мутации BRM и делеции при различных видах рака, включая виды рака легкого.

Понимание терапевтического нацеливания на виды рака с мутацией в SWI/SNF исходит из исследований, показывающих, что остаточные комплексы SWI/SNF играют роль в выживании видов рака с мутациями в SWI/SNF. В частности, было открыто синтетическое летальное взаимодействие между BRM и BRG1, двумя АТФазами комплекса, вследствие которого потеря одной из них приводит к зависимости от другой. Например, истощение по BRM, как было показано, способствовало подавлению роста раковых клеток с мутацией по BRG1. Кроме того, в других исследованиях было показано, что опухолевые клетки с дефицитом SNF5 (SNF5 представляет собой субъединицу комплекса SWI/SNF) являются зависимыми от BRG1. Наконец, сообщалось, что некоторые виды рака, у которых нет мутаций в SWI/SNF, также являются чувствительными к ингибированию BRG1, такие как острый миелоидный лейкоз (AML). Следовательно, ингибирование некоторых субъединиц SWI/SNF, включая BRG1 и BRM, обеспечивает возможности для развития новых терапевтических средств для лечения заболеваний человека, в том числе видов рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Остается необходимость в новых средствах лечения и видах терапии для опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний. В настоящем изобретении предусмотрены соединения, их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтические композиции на их основе и их комбинации, где соединения представляют собой ингибиторы BRM и/или BRG1. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ лечения опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ингибитора BRM и/или BRG1 (например, соединений по настоящему изобретению).

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где R¹ - R⁶ определены в данном документе.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая комбинация, которая содержит терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и одно или несколько терапевтически активных средств.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний, который предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны различные (перечисленные) варианты осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что признаки, описанные в каждом варианте осуществления, можно объединять с другими описанными признаками с получением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Вариант осуществления 1: соединение формулы (I):

или его фармацевтически приемлемая соль, где: R¹ выбран из водорода, амино и гидрокси-замещенного C_1-2алкила; R² представляет собой водород; R³ выбран из C_1-2алкила и галоген-замещенного C_1-2алкила; R⁴ представляет собой водород; R⁵ выбран из водорода и галогена; и R⁶ выбран из водорода и галогена.

Вариант осуществления 2: Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантом осуществления 1, где: R¹ выбран из водорода, амино и гидроксиметила; R² представляет собой водород; R³ выбран из метила, дифторметила и трифторметила; R⁴ представляет собой водород; R⁵ выбран из водорода, хлора и фтора; и R⁶ выбран из водорода и фтора.

Вариант осуществления 3: соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантом осуществления 1, выбранные из:

Вариант осуществления 4: фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-3 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Вариант осуществления 5: фармацевтическая комбинация, содержащая терапевтически эффективное количество соединения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли и одно или несколько терапевтически активных средств.

Вариант осуществления 6: фармацевтическая комбинация в соответствии с вариантом осуществления 5, где указанные одно или несколько терапевтически активных средств независимо выбраны из противораковых средств, противоаллергических средств, противорвотных средств, обезболивающих средств, иммуномодуляторов и цитопротекторных средств.

Вариант осуществления 7: способ лечения BRM-опосредованного и/или BRG1-опосредованного нарушения или заболевания, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-27 или его фармацевтически приемлемой соли.

Вариант осуществления 8: способ в соответствии с вариантом осуществления 7, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRG1 и/или дефицитом BRM.

Вариант осуществления 9: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRG1 и/или мутацией BRM.

Вариант осуществления 10: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-9, где указанное нарушение или заболевание представляет собой солидную опухоль, лейкоз или лимфому.

Вариант осуществления 11: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-10, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы, увеальной меланомы, мелкоклеточной карциномы яичника (гиперкальциемического типа), рабдоидной опухоли яичника, плоскоклеточной карциномы кожи, глиомы, карциносаркомы матки, карциномы тела матки и эндометрия, серозной цистаденокарциномы яичников, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, первичной лимфомы центральной нервной системы, карциномы пищевода, рака мочевого пузыря, плазмацитоидного варианта рака мочевого пузыря, аденокарциномы желудка, аденокистозной карциномы, лимфосаркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, рака поджелудочной железы, колоректальной аденокарциномы, холангиокарциномы, саркомы, видов рака головы и шеи, видов рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластомы, T-клеточной лимфомы кожи, гепатоцеллюлярной карциномы печени, папиллярной почечно-клеточной карциномы почки, рака молочной железы, лимфомы из клеток мантийной зоны, карциномы желчного пузыря, видов рака половых клеток яичек, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, рака предстательной железы, детской саркомы Юинга, тимомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, непрозрачно-клеточной карциномы почки, феохромоцитомы и параганглиомы, видов рака щитовидной железы, злокачественной опухоли оболочек периферических нервов, нейроэндокринного рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы коры надпочечников, видов рака шейки матки и канала шейки матки, плоскоклеточной карциномы кожи, рака половых клеток яичек, глиобластомы, мультиформной глиобластомы, саркомы Юинга, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, нейробластомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, злокачественных рабдоидных опухолей, видов эпителиоидной саркомы, семейного шванноматоза, видов медуллярной карциномы почки, синовиальной саркомы и видов менингиомы.

Вариант осуществления 12: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-11, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы и увеальной меланомы.

Вариант осуществления 13: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRG1.

Вариант осуществления 14: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 или 13, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRG1.

Вариант осуществления 15: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8, 13 и 14, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы, увеальной меланомы, мелкоклеточной карциномы яичника, плоскоклеточной карциномы кожи, глиомы, карциносаркомы матки, карциномы тела матки и эндометрия, серозной цистаденокарциномы яичников, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, первичной лимфомы центральной нервной системы, карциномы пищевода, рака мочевого пузыря, плазмацитоидного варианта рака мочевого пузыря, аденокарциномы желудка, аденокистозной карциномы, лимфосаркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, рака поджелудочной железы, колоректальной аденокарциномы, холангиокарциномы, саркомы, видов рака головы и шеи, видов рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластомы, T-клеточной лимфомы кожи, гепатоцеллюлярной карциномы печени, папиллярной почечно-клеточной карциномы почки, рака молочной железы, лимфомы из клеток мантийной зоны, карциномы желчного пузыря, видов рака половых клеток яичек, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, рака предстательной железы, детской саркомы Юинга, тимомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, непрозрачно-клеточной карциномы почки, феохромоцитомы и параганглиомы и видов рака щитовидной железы.

Вариант осуществления 16: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 и 13-15, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы и увеальной меланомы.

Вариант осуществления 17: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRM.

Вариант осуществления 18: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 и 17, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRM.

Вариант осуществления 19: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 и 17-18, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественной опухоли оболочек периферических нервов, нейроэндокринного рака предстательной железы, рака молочной железы, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, аденокистозной карциномы, аденокарциномы желудка, видов карциномы молочной железы, серозной цистаденокарциномы яичников, карциносаркомы матки, карциномы пищевода, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, видов немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, карциномы коры надпочечников, меланомы кожи, саркомы, колоректальной аденокарциномы, видов рака шейки матки и канала шейки матки, гепатоцеллюлярной карциномы печени, плоскоклеточного рака кожи, рака половых клеток яичек, глиобластомы, мультиформной глиобластомы, холангиокарциномы, саркомы Юинга, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, нейробластомы, острого миелоидного лейкоза и диффузной B-крупноклеточной лимфомы.

Вариант осуществления 20: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-8 и 17-19, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы и увеальной меланомы.

Вариант осуществления 21: способ в соответствии с вариантом осуществления 7, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутациями в субъединицах SWI/SNF, отличных от BRM или BRG1.

Вариант осуществления 22: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 21, где указанное нарушение или заболевание представляет собой солидную опухоль, лейкоз или лимфому.

Вариант осуществления 23: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 21 и 22, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественных рабдоидных опухолей (характеризующихся дефицитом SNF5/SMARCB1), эпителиоидных сарком, семейного шванноматоза, видов медуллярной карциномы почки, видов саркомы Юинга, синовиальной саркомы, карциномы тела матки и эндометрия, аденокарциномы желудка, уротелиальной аденокарциномы мочевого пузыря, рака мочевого пузыря, аденокистозной карциномы, холангиокарциномы, десмопластической меланомы, плоскоклеточной карциномы кожи, рака поджелудочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы печени, меланомы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, видов рака молочной железы, колоректального рака, светлоклеточной карциномы яичника, нейробластомы, карциномы пищевода, видов рака легкого, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, мезотелиомы, аденокистозной карциномы молочной железы, аденокистозной карциномы, видов рака щитовидной железы, видов менингиомы, видов увеальной меланомы и видов острого миелоидного лейкоза.

Вариант осуществления 24: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 21, 22 и 23, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественных рабдоидных опухолей, видов рака молочной железы, видов рака поджелудочной железы, видов рака яичника, видов светлоклеточной карциномы яичника, видов рака мочевого пузыря, видов светлоклеточной карциномы почки, колоректального рака, видов рака желудка, рака печени, меланомы, глиомы, острого миелоидного лейкоза и видов рака легкого.

Вариант осуществления 25: соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-3 или его фармацевтически приемлемая соль для применения в качестве лекарственного препарата.

Другие признаки настоящего изобретения должны стать очевидными в ходе приведенных выше описаний иллюстративных вариантов осуществления, которые приведены для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для его ограничения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для целей толкования данного описания будут использоваться следующие определения, и при необходимости термины, используемые в единственном числе, будут также включать множественное число. Термины, используемые в описании, имеют следующие значения, если контекст явно не указывает на иное.

Все способы, описанные в данном документе, можно осуществлять в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное, или это иным образом явно не противоречит контексту. Представленное в данном документе использование всех возможных примеров или вводных слов перед примерным объектом (например, "такой как") предназначено исключительно для лучшего освещения настоящего изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, заявленного в остальной части.

Форму единственного числа и аналогичные формы, используемые в контексте настоящего изобретения (в частности, в контексте формулы изобретения), следует истолковывать как охватывающие как форму единственного числа, так и форму множественного числа, если в данном документе не указано иное, или нет явного противоречия с контекстом.

Используемые в данном документе термины "алкил" означают углеводородный радикал общей формулы C_nH_2n+1. Алкановый радикал может быть прямым или разветвленным. Например, термин "C₁-C₆-алкил" или "от C₁- до C₆-алкил" означает одновалентную, прямую или разветвленную алифатическую группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода (например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, неопентил, 3,3-диметилпропил, гексил, 2-метилпентил и т. п.). Если алкил замещен еще одним заместителями, то заместители могут быть замещены при любом атоме углерода алкила.

"Галоген" или "галогено" может представлять собой фтор, хлор, бром или йод (предпочтительные галогены в качестве заместителей представляют собой фтор и хлор).

"Галогеналкил" предназначен для включения насыщенных алифатических углеводородных групп как с разветвленной, так и с прямой цепью, содержащих определенное число атомов углерода, замещенных одним или несколькими атомами галогена. Таким образом, подразумевается, что термин "C₁-C₆галогеналкил" или "от C₁ до C₆галогеналкил" включает без ограничения фторметил, дифторметил, трифторметил, трихлорметил, пентафторэтил, пентахлорэтил, 2,2,2-трифторэтил, гептафторпропил и гептахлорпропил.

Используемый в данном документе термин "замещенный" означает, что по меньшей мере один атом водорода заменен группой, отличной от водорода, при условии, что сохраняются нормальные значения валентности, и что замещение приводит к образованию стабильного соединения. Если заместителем является кетогруппа (т. е. =O), то при атоме заменены 2 атома водорода. Кетозаместители не присутствуют при ароматических фрагментах.

Фраза "фармацевтически приемлемый" указывает на то, что вещество или композиция должны быть совместимы химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и/или с млекопитающим, подвергающимся лечению с помощью них.

Если не указано иное, выражение "соединения по настоящему изобретению" означает соединения формулы (I), а также изомеры, такие как стереоизомеры (включая диастереоизомеры, энантиомеры и рацематы), геометрические изомеры, конформационные изомеры (включая ротамеры и атропоизомеры), таутомеры, изотопно-меченные соединения (включая замещенные дейтерием) и образованные сами по себе фрагменты (например, полиморфы, сольваты и/или гидраты). Если присутствует фрагмент, способный к образованию соли, то также включены соли, в частности, фармацевтически приемлемые соли.

В зависимости от условий способа, конечные продукты по настоящему изобретению получены либо в свободной (нейтральной) форме, либо в форме соли. Как свободная форма, так и соли данных конечных продуктов охватываются объемом настоящего изобретения. Если требуется, одну форму соединения можно превращать в другую форму. Свободное основание или кислота могут быть превращены в соль; соль может быть превращена в свободное соединение или другую соль; смесь изомерных соединений по настоящему изобретению может быть разделена на отдельные изомеры.

Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые соли. Однако могут быть пригодными и другие соли, например, на стадиях выделения или очистки, которые можно использовать в ходе получения, и, таким образом, они охватываются объемом настоящего изобретения.

Используемые в данном документе "фармацевтически приемлемые соли" означают производные раскрытых соединений, где исходное соединение модифицировано путем образования его кислотных или основных солей. Например, фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения солевые формы: ацетат, аскорбат, адипат, аспартат, бензоат, безилат, бромид/гидробромид, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, камфорсульфонат, капрат, хлорид/гидрохлорид, хлортеофиллонат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, глутамат, глутарат, гликолят, гиппурат, гидройодид/йодид, изетионат, лактат, лактобионат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат/гидроксималонат, манделат, мезилат, метилсульфат, муцинат, нафтоат, напсилат, никотинат, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, фенилацетат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигалактуронат, пропионат, салицилаты, стеарат, сукцинат, сульфамат, сульфосалицилат, тартрат, тозилат, трифторацетат или ксинафоат.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с применением неорганических кислот и органических кислот. Неорганические кислоты, с помощью которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т. п. Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т. п.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы с помощью неорганических и органических оснований. Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, соли аммония и металлы из групп I - XII периодической таблицы элементов. В определенных вариантах осуществления соли получены из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; особенно подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Органические основания, с помощью которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, в том числе встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и т. п. Определенные органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглюмин, пиперазин и трометамин.

Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, содержащего основный или кислотный фрагмент, с помощью общепринятых химических способов. Как правило, такие соли могут быть получены путем осуществления реакции форм свободной кислоты или свободного основания таких соединений со стехиометрическим количеством соответствующих основания или кислоты в воде, или в органическом растворителе, или в их смеси; как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечни пригодных солей можно найти в Allen, L.V., Jr., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, London, UK (2012), раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки.

Соединения по настоящему изобретению, которые содержат группы, способные действовать в качестве доноров и/или акцепторов в отношении водородных связей, могут быть способны к образованию сокристаллов с подходящими средствами для образования сокристаллов. Такие сокристаллы можно получать из соединений по настоящему изобретению посредством известных процедур образования сокристаллов. Такие процедуры включают измельчение, нагревание, совместную сублимацию, совместное плавление или приведение в контакт в растворе соединений по настоящему изобретению со средством для образования сокристаллов в условиях кристаллизации и выделение сокристаллов, образованных таким образом. Подходящие средства для образования сокристаллов включают средства, описанные в WO 2004/078163. Следовательно, в настоящем изобретении дополнительно предусмотрены сокристаллы, содержащие соединение по настоящему изобретению.

Любая формула, приведенная в данном документе, также подразумевает присутствие немеченных форм, а также меченных изотопом форм соединений. Меченные изотопом соединения характеризуются структурами, изображенными на формулах, приведенных в данном документе, за исключением того, что один или несколько атомов замещены атомом, характеризующимся выбранными атомной массой или массовым числом. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора, хлора и йода, такие как ²H, ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸F, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I соответственно. Настоящее изобретение включает различные меченные изотопом соединения, определенные в данном документе, например, соединения, в которых присутствуют радиоактивные изотопы, такие как ³H и ¹⁴C, или соединения, в которых присутствуют изотопы, не являющиеся радиоактивными, такие как ²H и ¹³C. Такие изотопно-меченные соединения являются пригодными в метаболических исследованиях (с применением ¹⁴C), в исследованиях кинетики реакций (например, с применением ²H или ³H), методиках выявления или визуализации, таких как позитронно-эмиссионная томография (PET) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), включая анализы распределения лекарственного средства или субстрата в тканях, или при лечении пациентов радиоактивными изотопами. В частности, меченное ¹⁸F соединение может быть особенно востребованным для исследований с помощью PET или SPECT.

Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, в частности, дейтерием (т. е. ²H или D), может обеспечивать определенные терапевтические преимущества, обусловленные более высокой метаболической стабильностью, например, увеличение периода полувыведения in vivo, или снижение требований в отношении дозировки, или улучшение в отношении терапевтического индекса. Следует понимать, что дейтерий в данном контексте рассматривается в качестве заместителя соединения по настоящему изобретению. Концентрация такого более тяжелого изотопа, в частности, дейтерия, может быть определена с помощью коэффициента обогащения изотопом. Используемый в данном документе термин "коэффициент изотопного обогащения" означает отношение содержания изотопа к распространенности в природе указанного изотопа. В случае если заместитель в соединении по настоящему изобретению представляет собой указанный дейтерий, такое соединение характеризуется коэффициентом изотопного обогащения для каждого обозначенного атома дейтерия, составляющим по меньшей мере 3500 (введение 52,5% дейтерия по каждому обозначенному атому дейтерия), по меньшей мере 4000 (введение 60% дейтерия), по меньшей мере 4500 (введение 67,5% дейтерия), по меньшей мере 5000 (введение 75% дейтерия), по меньшей мере 5500 (введение 82,5% дейтерия), по меньшей мере 6000 (введение 90% дейтерия), по меньшей мере 6333,3 (введение 95% дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (введение 97% дейтерия), по меньшей мере 6600 (введение 99% дейтерия) или по меньшей мере 6633,3 (введение 99,5% дейтерия).

Например, дейтерированное соединение по настоящему изобретению может представлять собой:

Меченные изотопами соединения по настоящему изобретению в общем можно получать с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, или с помощью способов, раскрытых на схемах или в примерах и способах получения, описанных ниже (или способа, аналогичного описанным в данном документе), с заменой подходящим или легко доступным, меченным изотопом реагентом обычно применяемого, не меченного изотопом реагента. Такие соединения характеризуются рядом потенциальных вариантов применения, например, в качестве стандартов и реагентов при определении способности потенциального фармацевтического соединения связываться с белками-мишенями или целевыми рецепторами или для визуализации связывания соединений по настоящему изобретению с биологическими рецепторами in vivo или in vitro.

Термин "сольват" означает физическое объединение соединения по настоящему изобретению с одной или несколькими молекулами органического или неорганического растворителя. Это физическое объединение включает образование водородных связей. В определенных случаях сольват можно выделять, например, в тех случаях, когда одна или несколько молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Молекулы растворителя в сольвате могут находиться в упорядоченном расположении и/или в неупорядоченном расположении. Сольват может содержать стехиометрическое или нестехиометрическое количество молекул растворителя. "Сольват" охватывает как сольваты в фазе раствора, так и поддающиеся выделению. Иллюстративные сольваты включают без ограничения гидраты, этанолаты, метанолаты и изопропанолаты. Способы сольватирования в целом являются известными из уровня техники.

Используемый в данном документе термин "полиморф(-ы)" означает кристаллическуй(-ие) форму(-ы), характеризующуюся(-иеся) одной и той же химической структурой/составом, но отличающуюся(-иеся) пространственным расположением молекул и/или ионов, образующих кристаллы. Соединения по настоящему изобретению можно получать в виде аморфных твердых веществ или кристаллических твердых веществ. Для получения соединений по настоящему изобретению в виде твердого вещества можно применять лиофилизацию.

"BRM" и "BRG1" означают два паралога субъединиц АТФазы в комплексе SWI/SNF, также известные как SMARCA2 и SMARCA4, соответственно. Если конкретно не указано иное, BRM, используемый в данном документе, означает BRM человека (Entrez Gene № 6595), последовательность белка которого в Swiss-Prot имеет номер доступа P51531.2; и BRG1, используемый в данном документе, означает BRG1 человека (Entrez Gene № 6597),последовательность белка которого в Swiss-Prot имеет номер доступа P51532.2. BRM, BRG1 и комплекс SWI/SNF описаны подробно в обзорах, таких как Wilson, BG, et al. Nat Rev Cancer. 2011 Jun 9;11(7):481-92. Геномная последовательность BRG1 (SMARCA4) характеризуется эталонной последовательностью в NCBI: NG_011556.1; ее mRNA являются результатом ряда сплайс-форм (т. е. вариантов транскриптов), которые включают идентификационные номера NM_001128844.1, NM_001128849.1, NM_001128845.1, NM_001128846.1, NM_001128847.1, NM_001128848.1 и NM_003072.3 в NCBI. Геномная последовательность BRM (SMARCA2) характеризуется эталонной последовательностью в NCBI: NC_000009.11; ее mRNA являются результатом двух сплайс-форм (т. е. вариантов транскриптов), которые включают идентификационные номера NM_003070.3 и NM_139045.2 в NCBI.

Термин "опосредованное BRM нарушение или заболевание" означает любое нарушение или заболевание, которое непосредственно или опосредованно регулируется с помощью BRM. Термин "опосредованное BRG1 нарушение или заболевание" означает любое нарушение или заболевание, которое непосредственно или опосредованно регулируется с помощью BRG1. Опосредованное BRM или опосредованное BRG1 нарушение или заболевание может характеризоваться дефицитом BRG1 и/или дефицитом BRM. Опосредованное BRM или опосредованное BRG1 нарушение или заболевание может характеризоваться мутациями в субъединицах SWI/SNF, отличных от BRM/SMARCA2 или BRG1/SMARCA4, например, мутациями в ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCB1/SNF5, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9, BRD7, SS18 и ACTB. Опосредованное BRM или опосредованное BRG1 нарушение или заболевание может характеризоваться зависимостью от BRM, BRG1 или других субъединиц SWI/SNF, описанных выше, где указанная зависимость не связана с мутациями в BRM, BRG1 или других субъединиц SWI/SNF.

Термины "с дефицитом BRG1" и "дефицит BRG1" означают клетки (в том числе без ограничения раковые клетки, клеточные линии, ткани, типы тканей, опухоли и т. д.), у которых имеется мутация или делеция гена BRG1, или имеется значительное снижение в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRG1 относительно таковых в контроле, например, в референтных, или нормальных, или отличных от раковых клетках. Снижение может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 20%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 50%. Мутации в гене BRG1, которые приводят к потере функции, могут представлять собой такие как нонсенс-мутации, вставки/делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, или миссенс-мутации. Клетки с дефицитом по BRG1 включают таковые, где ген BRG1 подвергся мутации или делеции.

Термины "с дефицитом BRM" и "дефицит BRM" означают клетки (в том числе без ограничения раковые клетки, клеточные линии, ткани, типы тканей, опухоли и т. д.), у которых имеется мутация с потерей функции ("LOF") или делеция гена BRM, или имеется значительное снижение в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRM относительно таковых в контроле, например, в референтных, или нормальных, или отличных от раковых клетках. Снижение может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 20%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 50%. Клетки с дефицитом BRM включают таковые, где ген BRM подвергся мутации или делеции.

Термин "нарушение или заболевание, связанное с дефицитом BRG1" или "нарушение или заболевание, характеризующееся дефицитом BRG1" означает нарушение или заболевание, при котором клетки являются дефицитными по BRG1. Например, при нарушении или заболевании, связанном с дефицитом BRG1, одна или несколько подверженных заболеванию клеток могут характеризоваться мутацией или делецией гена BRG1, или характеризоваться значительным снижением в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRG1. У пациента, подверженного нарушению или заболеванию, связанному с дефицитом BRG1, может быть случай, в котором некоторые подверженные заболеванию клетки (например, раковые клетки) могут быть дефицитными по BRG1, в то время как остальные не будут таковыми.

Термин "нарушение или заболевание, связанное с дефицитом BRM" или "нарушение или заболевание, характеризующееся дефицитом BRM" означает нарушение или заболевание, при котором клетки являются дефицитными по BRM. Например, при нарушении или заболевании, связанном с дефицитом BRM, одна или несколько подверженных заболеванию клеток могут характеризоваться мутацией или делецией гена BRM, или характеризоваться значительным снижением в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRM. У пациента, подверженного нарушению или заболеванию, связанному с дефицитом BRM, может быть случай, в котором некоторые подверженные заболеванию клетки (например, раковые клетки) могут быть дефицитными по BRM, в то время как остальные не будут таковыми.

Термин "злокачественное новообразование", также называемое раком, означает заболевания, при которых аномальные клетки бесконтрольно делятся и могут проникать в близлежащие ткани. Злокачественные клетки также могут распространяться в другие части организма через кровеносную и лимфатическую системы. Существует несколько основных типов злокачественных новообразований. Карцинома представляет собой злокачественное новообразование, которое начинается в коже или в тканях, которые выстилают или покрывают внутренние органы. Саркома представляет собой злокачественное новообразование, которое берет начало в кости, хряще, жировой ткани, мышечной ткани, кровеносных сосудах или в другой соединительной или поддерживающей ткани. Лейкоз представляет собой злокачественное новообразование, которое начинается в кроветворной ткани, такой как костный мозг, и обуславливает выработку и попадание в кровоток большого числа аномальных клеток крови. Лимфома и множественная миелома представляют собой злокачественные новообразования, которые берут начало в клетках иммунной системы. Виды рака центральной нервной системы представляют собой злокачественные новообразования, которые берут начало в тканях головного мозга и спинного мозга.

Термин "солидная опухоль" означает злокачественные новообразования/виды рака, образованные из аномальных тканевых масс, которые обычно не содержат кист или жидких участков. Солидные опухоли называют/классифицируют в соответствии с тканью/клетками происхождения. Примеры включают без ограничения виды саркомы и виды карциномы.

Термин "лейкоз" означает гематологические злокачественные новообразования/виды рака или злокачественные новообразования/виды рака клеток крови, которые берут начало в кроветворной ткани, такой как костный мозг. Примеры включают без ограничения острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелоидный лейкоз (CML), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).

Термин "лимфома" означает злокачественные новообразования/виды рака лимфатических клеток, которые берут начало в клетках иммунной системы. Примеры включают без ограничения неходжкинскую лимфому и множественную миелому.

Используемый в данном документе термин "пациент" охватывает все виды млекопитающих.

Используемый в данном документе термин "субъект" означает животное. Как правило, животное является млекопитающим. Субъект также означает, например, приматов (например, человека), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, рыб, птиц и т. п. В определенных вариантах осуществления субъектом является примат. В других вариантах осуществления субъектом является человек. Иллюстративные субъекты включают людей любого возраста с факторами риска развития онкологического заболевания.

При использовании в данном документе, субъект "нуждается" в лечении, если от такого лечения такой субъект (предпочтительно человек) получит пользу с биологической, медицинской точки зрения или с точки зрения качества его жизни.

Используемые в данном документе термины "подавлять", "подавление" или "подавляющий" означают снижение или ослабление данного состояния, симптома, или нарушения, или заболевания, либо значительное снижение исходной активности в отношении биологической активности или процесса.

Используемые в данном документе термины "лечить", "осуществлять лечение" или "лечение" любого заболевания/нарушения означают лечение заболевания/нарушения у млекопитающего, в частности человека, и включают: (a) снижение тяжести заболевании/нарушении, (т. е. замедление, или остановку, или уменьшение интенсивности развития заболевания/нарушения или по меньшей мере одного из его клинических симптомов); (b) облегчение или модулирование течения заболевания/нарушения, (т. е. обеспечение регрессии заболевания/нарушения либо физически, (например, путем стабилизации явного симптома), либо физиологически (например, путем стабилизации физического параметра), либо посредством обоих из них); (c) облегчение или снижение тяжести по меньшей мере одного физического параметра, включая параметры, которые не могут быть различимы субъектом; и/или (d) предупреждение или замедление начала, или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения у млекопитающего, в частности, если такое млекопитающее предрасположено к заболеванию или нарушению, но его наличие еще не было диагностировано.

Термин "терапевтически эффективное количество" соединения по настоящему изобретению означает количество соединения по настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, например, снижение или подавление активности фермента или белка, или снижать тяжесть симптомов, облегчать состояния, замедлять или сдерживать прогрессирование заболевания, или предупреждать развитие заболевания и т. д. В одном неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое при введении субъекту, является эффективным в отношении (1) по меньшей мере частичного облегчения, подавления, предупреждения и/или снижения тяжести состояния, или нарушения, или заболевания, опосредованного BRM и/или BRG1; или (2) снижения или подавления активности BRM и/или BRG1.

В другом неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или в ткань, или в неклеточный биологический материал, или в среду является эффективным в отношении по меньшей мере частичного снижения или подавления активности BRM и/или BRG1; или по меньшей мере частичного снижения или подавления экспрессии BRM и/или BRG1.

Эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как размер и вес субъекта, тип заболевания или конкретное соединение по настоящему изобретению. Специалист в данной области техники сможет изучить приведенные в данном документе факторы и принять решение в отношении эффективного количества соединения по настоящему изобретению без излишних экспериментов.

Схема приема может повлиять на то, что составляет эффективное количество. Соединение по настоящему изобретению можно вводить субъекту или до, или после начала опосредованного BRM и/или BRG1 состояния. Помимо этого, можно принимать несколько дробных доз, а также ступенчатые дозы, ежедневно или последовательно, или дозу можно вводить посредством инфузии непрерывно, или она может представлять собой болюсную инъекцию. Помимо этого, дозировки соединения(соединений) по настоящему изобретению можно пропорционально увеличивать или уменьшать в зависимости от требований терапевтической или профилактической ситуации.

ПОЛУЧЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ

Соединения по настоящему изобретению можно получать с помощью ряда способов, известных специалисту в области органического синтеза, с учетом способов, реакционных схем и примеров, представленных в данном документе. Соединения по настоящему изобретению можно синтезировать с применением способов, описанных ниже, вместе со способами синтеза, известными в области химии органического синтеза, или с помощью их вариаций, понятных специалистам в данной области техники. Предпочтительные способы включают без ограничения способы, описанные ниже. Реакции проводят в растворителе или в смеси растворителей, соответствующих применяемым реагентам и материалам и пригодных для выполняемых превращений. Специалистам в области органического синтеза будет понятно, что функциональная группа, присутствующая в молекуле, должна соответствовать предполагаемым превращениям. Иногда это потребует информированного решения об изменении порядка стадий синтеза или о выборе какой-либо конкретной схемы способа вместо другой с целью получения необходимого соединения по настоящему изобретению.

Исходные материалы обычно доступны из коммерческих источников, таких как Sigma-Aldrich или другие коммерческие поставщики, или их получают, как описано в настоящем изобретении, или их можно легко получать с применением способов, общеизвестных специалистам в данной области техники (например, получать с помощью способов, в общем описанных в Louis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, New York (1967-1999 ed.), Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, 2^nd-ed., Wiley-VCH Weinheim, Germany (1999) или Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, включая дополнения (также доступные с помощью онлайн-базы данных Beilstein)).

Для иллюстративных целей реакционные схемы, изображенные ниже, обеспечивают возможные пути синтеза соединений по настоящему изобретению, а также ключевых промежуточных соединений. Для более подробного описания отдельных стадий реакции см. раздел "Примеры" ниже. Специалистам в данной области техники будет понятно, что могут применяться другие пути синтеза для синтеза соединений по настоящему изобретению. Хотя конкретные исходные материалы и реагенты изображены на схемах и рассмотрены ниже, они могут быть легко заменены другими исходными материалами и реагентами для обеспечения разнообразия производных и/или условий реакции. Кроме того, многие из соединений, получаемых посредством описанных ниже способов, можно дополнительно модифицировать с учетом настоящего изобретения с применением общепринятых химических методик, общеизвестных специалистам в данной области техники.

При получении соединений по настоящему изобретению может потребоваться введение защитных групп для удаленной функциональной группы промежуточных соединений. Необходимость такого введения защитных групп будет варьироваться в зависимости от природы отдаленной функциональной группы и условий способов получения. Необходимость такого введения защитных групп легко определяется специалистом в данной области техники. Для общего описания защитных групп и их применения см. Greene, T.W. et al., Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., Wiley (2007). Защитные группы, используемые в ходе получения соединений по настоящему изобретению, такие как тритильная защитная группа, могут быть представлены в виде одного региоизомера, но также могут существовать в виде смеси региоизомеров.

Следующие сокращения, применяемые в данном документе ниже, имеют соответствующие значения:

(app) кажущийся; (br) широкий; (BSA) бычий сывороточный альбумин; (d) дублет; (dd) дублет дублетов; (DCM) дихлорметан; (DIPEA) диизопропилэтиламин; (DMF) N, N-диметилформамид; (DMSO) диметилсульфоксид; (ESI) ионизация электрораспылением; (Et) этил; (EtOAc) этилацетат; (ч.) час(ы); (HPLC) высокоэффективная жидкостная хроматография; (LAH) алюмогидрид лития; (LCMS) жидкостная хроматография и масс-спектрометрия; (LHMDS) гексаметилдисилазид лития; (MTBE) метил-трет-бутиловый эфир; (MeCN) ацетонитрил; (MeOH) метанол; (МГц) мегагерц; (MS) масс-спектрометрия; (m) мультиплет; (мг) миллиграмм; (мин.) минуты; (мл) миллилитр; (ммоль) миллимоль; (масса/заряд) соотношение массы к заряду; (ЯМР) ядерный магнитный резонанс; (Ph) фенил; (ppm) частиц на миллион; (q) квартет; (Rt) время удерживания; (к. т.) комнатная температура; (s) синглет; (t) триплет; (TBDMS) трет-бутилдиметилсилил; (трет) третичный; (TFA) трифторуксусная кислота; (THF) тетрагидрофуран; (TMAF) фторид тетраметиламмония; (TMS) триметилсилил.

Способы LC/MS, применяемые для определения характеристик в примерах

Данные по LC/MS получали с применением системы 1100 HPLC от Agilent с Micromass ZQ от Waters или ACQUITY UPLC от Qaters с детектором SQ от Waters или с детектором ACQUITY Qda 25 от Waters. Способы, применяемые для получения всех данных LCMS, описаны ниже.

Способ LCMS 1

Колонка Sunfire C18, 3,0 × 30 мм, 3,5 мкм

Температура колонки 40°C

Элюенты A: H₂O, содержащая 0,05% TFA, B: MeCN

Расход 2,0 мл/мин.

Градиент от 5% до 95% B за 1,7 мин., в течение 0,3 мин. 95% B

Способ LCMS 2

Колонка XBridge C18, 3,0 × 30 мм, 3,5 мкм

Температура колонки 40°C

Элюенты A: H₂O+5 мМ гидроксида аммония, B: MeCN

Расход 2,0 мл/мин.

Градиент от 5% до 95% B за 1,7 мин., в течение 0,3 мин. 95% B

Способ LCMS 3

Колонка AcQuity UPLC BEH C18, 2,1 × 30 мм, 1,7 мкм

Температура колонки 50°C

Элюенты A: 0,1% муравьиной кислоты в воде, B: 0,1% муравьиной кислоты в MeCN

Расход 1,0 мл/мин.

Градиент от 2% до 98% B за 1,5 мин., в течение 0,3 мин. 98% B

Способ LCMS 4

Колонка AcQuity UPLC BEH C18, 2,1 × 30 мм, 1,7 мкм

Температура колонки 50°C

Элюенты A: 5 мМ NH₄OH в воде , B: 5 мМ NH₄OH в MeCN

Расход 1,0 мл/мин.

Градиент от 1% до 30% B за 1,2 мин., от 30% до 98% B за 0,95 мин.

ЯМР, применяемый для определения характеристик в примерах

Спектры ¹H ЯМР получали на спектрометрах с преобразованием Фурье от Bruker при следующих значениях частоты: ¹H ЯМР: 400 МГц (Bruker). Спектральные данные приведены в формате: химический сдвиг (мультиплетность, число атомов водорода). Химические сдвиги указаны в ppm в сторону слабого поля от внутреннего стандарта в виде тетраметилсилана (единицы δ, тетраметилсилан=0 ppm) и/или относительно пиков растворителя, которые в спектрах ¹H ЯМР видны при 2,50 ppm для CD₃SOCD₃, 3,31 ppm для CD₃OD, 1,94 ppm для CD₃CN, 4,79 ppm для D₂O, 5,32 ppm для CD₂Cl₂ и 7,26 ppm для CDCl₃.

Способы, применяемые для очистки соединений из примеров

Очистку промежуточных соединений и конечных продуктов проводили с помощью либо хроматографии с нормальной фазой, либо хроматографии с обращенной фазой, либо сверхкритической флюидной хроматографии (SFC). Хроматографию с нормальной фазой проводили с применением предварительно заполненных картриджей SiO₂ (например, колонки RediSep® Rf от Teledyne Isco, Inc.) с градиентами элюирования подходящими системами растворителей (например, гептан и этилацетат; DCM и MeOH; или если не указано иное). Препаративную HPLC с обращенной фазой проводили с применением способов, описанных ниже.

(1) Основной способ: колонка XBridge 5 мкм, 5 мМ NH₄OH в ацетонитриле и воде.

(2) Способ с применением муравьиной кислоты: колонка XBridge 5 мкм; 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле и воде.

Описанные выше способы HPLC проводят при сфокусированном градиенте от 15% ацетонитрила до 40% ацетонитрила.

ОБЩИЕ СХЕМЫ СИНТЕЗА

На схемах 1 и 2 (показанных ниже) описаны возможные пути получения соединений по настоящему изобретению, которые включают соединения формулы (I), где R¹-R⁶ определены в "Кратком описании изобретения". Исходные материалы для приведенной ниже реакционной схемы являются коммерчески доступными, или их можно получать в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники, или с помощью способов, раскрытых в данном документе. Соединения формулы (I) можно получать по сути оптически чистыми в результате применения либо по сути оптически чистых исходных материалов, либо разделительной хроматографии, перекристаллизации или других методик разделения, общеизвестных в уровне техники. Более подробное описание см. в разделе «Примеры» ниже.

Схема 1

Стадия (a) включает осуществление реакции (не)замещенного фенилхлорформиата (например, R может представлять собой H или нитрогруппу) с (не)замещенным 4-аминопиридином в подходящем растворителе, таком как DCM или диоксан, в присутствии подходящего основания, такого как пиридин, при подходящей температуре, такой как к. т.

Стадия (b) включает осуществление реакции замещенного 5-амино-изотиазола (или замещенных 3-аминобензотиазолов) с промежуточным соединением на основе карбамата, полученным на стадии (a), в подходящем растворителе, таком как THF или диоксан, в присутствии подходящего основания, такого как диизопропилэтиламин, при подходящей температуре, такой как 60°C. В качестве альтернативы, замещенный 5-амино-изотиазол (или замещенные 3-аминобензотиазолы) можно сначала подвергать депротонированию с помощью подходящего основания, такого как LHMDS, затем вводить в реакцию с промежуточным соединением на основе карбамата, полученным на стадии (a). После образования мочевины группы R¹ - R⁶ можно подвергать дополнительным преобразованиям, которые требуются для получения требуемых продуктов.

Получение продукта мочевины включает осуществление реакции (не)замещенного 4-аминопиридина с трифосгеном, затем с замещенным 5-амино-изотиазолом в подходящем растворителе, таком как THF, в присутствии подходящего основания, такого как триэтиламин, при подходящей температуре, такой как к. т. После образования мочевины группы R¹ - R⁶ можно подвергать дополнительным преобразованиям, которые требуются для получения требуемых продуктов.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры были получены, выделены и охарактеризованы с применением способов, раскрытых в данном документе. Следующие примеры демонстрируют частичный объем настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Если не указано иное, исходные материалы являются общедоступными из неограничивающих коммерческих источников, таких как TCI Fine Chemicals (Япония), Aurora Fine Chemicals LLC (Сан-Диего, Калифорния), FCH Group (Украина), Aldrich Chemicals Co. (Милуоки, Висконсин), Acros Organics (Фэрлон, Нью-Джерси), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Корнуолл, Англия), Matrix Scientific (США), Enamine Ltd (Украина), Combi-Blocks, Inc. (Сан-Диего, США), Oakwood Products, Inc. (США), Apollo Scientific Ltd. (Великобритания).

Пример 1

1-(2-Хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина

К смеси 2-хлор-4-аминопиридина (1,57 г, 12,25 ммоль) и пиридина (1,38 мл, 17,05 ммоль) в DCM (100 мл) при 0°C добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (2,6 г, 12,89 ммоль). Смесь поддерживали при 0°C в течение 2 мин., затем нагревали до к. т. Еще через 20 мин. смесь концентрировали in vacuo с получением остатка, который поглощали в диоксан (80 мл). Быстро добавляли раствор 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (1,60 г, 10,66 ммоль) в диоксане (10 мл), затем DIPEA (6,51 мл, 37,3 ммоль). Смесь нагревали до 60°C. Через 3 ч. смесь охлаждали до к. т., затем добавляли воду и EtOAc. Органический слой несколько раз промывали водой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором. Органическую фазу высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением остатка, который очищали посредством флэш-хроматографии (EtOH/EtOAc/гептан). Частично очищенный остаток растирали в порошок с использованием простого эфира, и полученное твердое вещество поглощали в воду. С помощью лиофилизации удаляли остаточный простой эфир с получением указанного в заголовке соединения. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,08 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,26 (d, J=4 Гц, 1H), 7,68 (d, J=2 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=4, 2 Гц, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,97 (t, J=52 Гц, 1H). MS (ESI) масса/заряд 305,1 [M+H]⁺. LCMS: Rt=1,25 мин, масса/заряд 305,1 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,08 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,26 (d, J=4 Гц, 1H), 7,68 (d, J=2 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=4, 2 Гц, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,97 (t, J=52 Гц, 1H).

Пример 2

1-(2-Хлорпиридин-4-ил)-3-(3-метилизотиазол-5-ил)мочевина

Раствор 2-хлор-4-аминопиридина (101 мг, 0,786 ммоль) в THF (2 мл) медленно добавляли к раствору трифосгена (101 мг, 0,340 ммоль) в THF (2 мл) при к. т. Затем добавляли триэтиламин (0,11 мл, 0,790 ммоль). После перемешивания смеси при к. т. в течение 20 мин. добавляли смесь 3-метил-5-амино-изотиазола гидрохлорида (120 мг, 0,797 ммоль) и триэтиламина (0,12 мл, 0,863 ммоль) в THF (2 мл). Смесь перемешивали при к. т. в течение 18 ч. и разделяли между EtOAc и водным раствором KOH. Объединенный органический экстракт высушивали над MgSO₄ и концентрировали. Остаток очищали посредством HPLC (основной способ) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,85 мин, масса/заряд 269,0 (M+H) (LCMS способ 2). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 10,78 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 8,24 (d, J=4 Гц, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,43 (d, J=4 Гц, 1H), 6,73 (s, 1H), 2,30 (s, 3H).

Пример 3

1-(2-Хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(трифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина

К ледяной смеси 3-(трифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 2) (70 мг, 0,41 ммоль) и фенил(2-хлорпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 3) (104 мг, 0,41 ммоль) в DMF (1,2 мл) добавляли раствор LHMDS (1 М в THF, 0,41 мл, 0,41 ммоль). Обеспечивали нагревание смеси до к. т. и перемешивали ее в течение 16 ч. Смесь концентрировали in vacuo, затем очищали посредством HPLC (основной способ) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,38 мин, масса/заряд 323 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,21 (br s, 1H), 10,18 (br s, 1H), 8,23 (d, J=5,6 Гц, 1H), 7,69 (d, J=1,8 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=5,7, 1,9 Гц, 1H), 7,22 (s, 1H).

Пример 4

1-(5-Амино-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина

Смесь 1-(5-нитро-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (промежуточное соединение 5) (7,63 г, 21,82 ммоль), железа (4,87 г, 87 ммоль) и хлорида аммония (9,34 г, 175 ммоль) в этаноле (84 мл) и воде (25 мл) нагревали в течение 1 ч. при 50°C. Смесь фильтровали через целит, осадок на фильтре ополаскивали с помощью MeOH и фильтрат концентрировали in vacuo. Остаток поглощали в EtOAc и промывали солевым раствором. Органическую фракцию высушивали над сульфатом магния и концентрировали in vacuo с получением остатка, который очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с последующей очисткой, представляющей собой очистку с применением ISCO с обращенной фазой на колонке C18 с элюированием водой+0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрилом+0,1% муравьиной кислоты. LCMS: Rt=0,76 мин, масса/заряд=320,2 (M+H) (LCMS способ 2). ¹H ЯМР (400 МГц, Метанол-d₄) δ 7,88 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (t, J=54,9 Гц, 1H).

Пример 5

1-(2-Хлор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина

Стадия 1. Синтез 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины

LHMDS (1 М в THF, 9,2 мл, 9,2 ммоль) по каплям добавляли к раствору фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 6) (3,46 г, 8,81 ммоль) и 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (1,15 г, 7,66 ммоль) в DMF (30 мл) и реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили с помощью MeOH (10 мл) и летучие вещества удаляли in vacuo. Остаток поглощали в EtOAc/насыщенный водный раствор NH₄Cl 1:1 и слои разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан). LCMS: Rt₌1,79 мин, масса/заряд=449,2 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,39 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,96 (t, J=54,5 Гц, 1H), 4,79 (s, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,07 (s, 6H).

Стадия 2. Синтез 1-(2-хлор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины

TBAF (1 М в THF, 2,45 мл, 2,45 ммоль) добавляли к раствору 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (полученной на стадии 1 выше) (1,1 г, 2,45 ммоль) в THF (8 мл) и смесь перемешивали при к. т. в течение 2 ч. Реакционную смесь выливали в воду и продукт экстрагировали с помощью EtOAc. Органический экстракт объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (MeOH/DCM) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,78 мин, масса/заряд=335,2 (M+H) (LCMS способ 2). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,75 (s, 1H), 9,22 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 6,97 (t, J=56 Гц, 1H), 5,79 (t, J=5 Гц, 1H), 4,59 (d, J=5 Гц, 2H).

Пример 6

1-(5-Амино-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина

Смесь 1-(5-нитро-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (промежуточное соединение 5) (3,77 г, 8,62 ммоль), TMAF (3,61 г, 38,8 ммоль) и DMF (83 мл) нагревали при 75°C в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили водой и экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фракции промывали водой, солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток затем очищали посредством флэш-хроматографии (EtOAc/гептан) с получением частично очищенного продукта (2,73 г), который поглощали в этанол (100 мл) и воду (20 мл). Добавляли хлорид аммония (2,13 г, 39,8 ммоль) и железо (1,91 г, 34,2 ммоль) и смесь нагревали до 45°C в течение 30 мин. Реакционную смесь затем фильтровали через небольшой слой целита, который промывали с помощью MeOH. Фильтрат концентрировали и затем разбавляли с помощью EtOAc и воды. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фракции промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток последовательно очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан), а затем посредством очистки с помощью ISCO с обращенной фазой на колонке C18 с элюированием водой+0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрилом+0,1% муравьиной кислоты. В заключение небольшое количество неочищенных фракций очищали посредством HPLC (способ с использованием муравьиной кислоты) и объединенные фракции предусматривали получение указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,12 мин, масса/заряд 304,2 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,15 (s, 1H), 8,92 (s, 1H), 7,63 (d, J=0,9 Гц, 1H), 7,46 (d, J=0,8 Гц, 1H), 7,14 (s, 1H), 6,95 (t, J=54,5 Гц, 1H), 4,82 (s, 2H).

Пример 7

1-(3-(Дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевина

Стадия 1. Синтез 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины.

К раствору 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (48 мг, 0,323 ммоль) и фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 7) (135 мг, 0,323 ммоль) в DMF (2 мл) добавляли LHMDS (1 М в THF, 0,484 мл, 0,484 ммоль) и полученную смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Смесь концентрировали in vacuo и продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,76 мин, масса/заряд 433,2 (M+H) (LCMS способ 1

Стадия 2. Синтез 1-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевины.

К раствору 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (119 мг, 0,275 ммоль) в THF (5 мл) добавляли TBAF (1 М в THF, 0,275 мл, 0,275 ммоль) и обеспечивали перемешивание полученной смеси при к. т. в течение 2 ч. Смесь концентрировали in vacuo и очищали посредством хроматографии на силикагеле (MeOH/DCM с гидроксидом аммония в качестве модификатора) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,16 мин, масса/заряд 337 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,76 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,22-6,70 (m, 2H), 5,73 (t, J=5,4 Гц, 1H), 4,59 (d, J=5,1 Гц, 2H).

Пример 8

1-(3-(Дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевина

Стадия 1. Синтез 1-(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины

К раствору 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (1,04 г, 6,93 ммоль) и фенил(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 8) (3,39 г, 9,00 ммоль) в DMF (35 мл) добавляли LHMDS (1 М в THF, 13,8 мл, 13,8 ммоль) при 0°C. Удаляли охлаждающую баню и полученную смесь перемешивали при к. т. в течение 45 мин. Смесь концентрировали in vacuo и продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,74 мин, масса/заряд 433,3 (M+H) (LCMS способ 1).

Стадия 2. Синтез 1-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевины

К раствору 1-(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (2,19 г, 5,06 ммоль) в THF (40 мл) добавляли TBAF (1 М в THF, 6,6 мл, 6,6 ммоль) и обеспечивали перемешивание полученной смеси при к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили водой, затем разбавляли с помощью EtOAc. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фракции объединяли, промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенную смесь очищали посредством флэш-хроматографии (MeOH/DCM) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,12 мин, масса/заряд 319,2 (M+H) (LCMS способ 1). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,89 (s, 1H), 9,44 (s, 1H), 8,10-8,02 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 6,95 (t, J=54,5 Гц, 1H), 5,83 (s, 1H), 4,62 (s, 2H).

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

Промежуточное соединение 1

3-(Дифторметил)изотиазол-5-амин

Стадия 1. 3-Метил-5-нитроизотиазол

Порошок Cu (96 г, 1,5 моль) помещали в реактор объемом 5 л. Добавляли воду (1 л), а затем NaNO₂ (104 г, 1,5 моль). Добавляли водный раствор HCl (12 М, 1,5 мл, 18 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин. Добавляли по каплям через капельную воронку раствор 3-метил-5-амино-изотиазола гидрохлорида (58 г, 507 ммоль) в 500 мл воды и водном растворе HCl (12 М, 65 мл, 0,78 моль), поддерживая температуру ниже 30°C. Добавляли дополнительные 100 мл воды. Обеспечивали перемешивание реакционной смеси в течение 3 ч. после добавления. Реакционную смесь фильтровали через целит с использованием воды и MTBE. Фильтрат переносили в реактор и слои разделяли. Водный слой промывали дважды с помощью MTBE. Объединенные органические слои высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 8,12 (s, 1H), 2,50 (s, 3H).

Стадия 2. 5-Нитроизотиазол-3-карбоновая кислота

В 3-горлую круглодонную колбу объемом 1 л на водяной бане, оснащенную механической мешалкой и устройством контроля температуры, добавляли 3-метил-5-нитроизотиазол (26,5 г, 184 ммоль), затем H₂SO₄ (350 мл) с такой скоростью, чтобы сохранять температуру ниже 30°C. Добавляли CrO₃ (55,1 г, 552 ммоль) 6 порциями каждые 20 мин., обеспечивая то, чтобы температура оставалась на уровне ниже 24°C. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при наличии водяной бани в течение 3 дней. Реакционную смесь выливали в ледяную воду (всего 1,4 л) и экстрагировали 3 раза с помощью Et₂O (1 л). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, затем высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали с получением желтого твердого вещества. Твердое вещество поглощали в гептан (80 мл) и Et₂O (20 мл) и растирали в порошок. После 2 мин. интенсивного перемешивания смесь фильтровали и затем ополаскивали с помощью смеси гептан/простой эфир 5:1 (минимальное количество) с получением указанного в заголовке соединения. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,89 (s, 1H), 8,57 (s, 1H).

Стадия 3. (5-Нитроизотиазол-3-ил)метанол

В колбу помещали 5-нитроизотиазол-3-карбоновую кислоту (3,0 г, 17,2 ммоль) в THF (50 мл), причем при охлаждении в бане со льдом, затем добавляли по каплям комплекс боран-тетрагидрофуран (1 М в THF) (22,4 мл, 22,4 ммоль) в течение 30 мин. и обеспечивали нагревание реакционной смеси в течение ночи. Реакционную смесь повторно охлаждали до 0°C, затем добавляли по каплям метанол (20 мл). Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 0°C в течение 5 мин., затем обеспечивали ее нагревание до к. т. и перемешивали в течение еще 15 мин. Реакционную смесь концентрировали in vacuo до половины объема, затем разбавляли с помощью EtOAc (100 мл), насыщенного водного раствора NH₄Cl (50 мл) и воды (50 мл). Слои разделяли и водную часть экстрагировали с помощью EtOAc (2×100 мл). Органические фракции объединяли и промывали солевым раствором, затем высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. С помощью очистки посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/DCM) получали указанное в заголовке соединение. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 8,09 (s, 1H), 5,77 (t, J=6,1 Гц, 1H), 4,58 (d, J=6,1 Гц, 2H). MS (ESI) масса/заряд 161,0 [M+H]⁺.

Стадия 4. Синтез 5-нитроизотиазол-3-карбальдегида

Периодинан Десса-Мартина (2,23 г, 5,27 ммоль) небольшими порциями добавляли в течение 5 мин. к (5-нитроизотиазол-3-ил)метанолу (767 мг, 4,79 ммоль) в DCM (25 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 10 мин., нагревали до к. т. и перемешивали при к. т. в течение 20 мин. Смесь разбавляли с помощью DCM. Добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ и насыщенный водный раствор тиосульфата натрия. Смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин. и затем два слоя разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенный органический экстракт промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. Продукт применяли непосредственно на следующей стадии без очистки. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,85 (s, 1H), 8,58 (s, 1H).

Стадия 5. Синтез 3-(дифторметил)-5-нитроизотиазола

DAST (0,201 мл, 1,518 ммоль) добавляли по каплям при 0°C к раствору 5-нитроизотиазол-3-карбальдегида (полученного на стадии 1 выше) (80 мг, 0,506 ммоль) в DCM (3,5 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 25 мин., нагревали до к. т. и перемешивали при к. т. в течение 2 ч. Смесь гасили при 0°C с помощью насыщенного водного раствора NaHCO₃ и разбавляли с помощью DCM. Смесь интенсивно перемешивали в течение 1 мин. и два слоя разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенный органический экстракт промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. Продукт применяли непосредственно на следующей стадии без очистки. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,54 (s, 1H), 7,16 (t, J=52 Гц, 1H).

Стадия 6. Синтез 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина

Смесь 3-(дифторметил)-5-нитроизотиазола (49 мг, 0,27 ммоль), порошка железа (46 мг, 0,81 ммоль) и уксусной кислоты (1,5 мл) нагревали до 50°C в течение 2 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и повышали ее основность с помощью 30% гидроксида аммония. Органический слой отделяли и концентрировали in vacuo, затем очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,42 мин; масса/заряд 151,2 (M+H) (LCMS способ 2); ¹H ЯМР (400 МГц, метанол-d4) δ 6,46 (t, J=55,0 Гц, 1H), 6,39 (s, 1H). ¹⁹F ЯМР (376 МГц, MeOD) δ -116,06.

Промежуточное соединение 2

3-(Трифторметил)изотиазол-5-амин

Стадия 1. Синтез 4,4,4-трифтор-3-оксобутаннитрила

В сухую колбу объемом 100 мл помещали KOt-Bu (1 М в THF, 85 мл, 85 ммоль) и охлаждали ее на льду. Через 30 мин. добавляли смесь этилтрифторацетата (7,27 мл, 60,9 ммоль) и ацетонитрила (3,18 мл, 60,9 ммоль) в течение 3 мин. Реакционная смесь превращалась в суспензию. Обеспечивали медленное нагревание смеси до температуры, не превышающей к. т., и перемешивали в течение 24 ч. Смесь гасили с помощью 1 М HCl и неочищенный продукт экстрагировали с помощью простого эфира и промывали с помощью воды. Органический слой отделяли, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли на следующей стадии без очистки. LCMS: Rt=0,22 мин, масса/заряд 136,1 (M-1) (LCMS способ 4). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 2,99 (s, 2H).

Стадия 2. Синтез (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-еннитрила

Смесь 4,4,4-трифтор-3-оксобутаннитрила (полученного на стадии 1) (1,1 г, 8,03 ммоль), формиата аммония (1,518 г, 24,08 ммоль) и уксусной кислоты (0,046 мл, 0,803 ммоль) в толуоле (100 мл) нагревали до 120°C в неазеотропных условиях в течение 18 ч. Смесь концентрировали in vacuo и применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 3. Синтез (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-ентиоамида

Обеспечивали перемешивание смеси (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-еннитрила (полученного на стадии 2) (1,00 г, 7,35 ммоль), MgCl₂ (0,70 г, 7,35 ммоль) и NaSH (0,824 г, 14,70 ммоль) в DMF (20 мл) при к. т. в течение 24 ч. Смесь разделяли между этилацетатом и водой. Объединенный органический экстракт высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,81 мин, масса/заряд 171 (M+H) (LCMS способ 1).

Стадия 4. Синтез 3-(трифторметил)изотиазол-5-амина

К смеси (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-ентиоамида (полученного на стадии 3) (1,2 г, 7,05 ммоль) в пиридине (24 мл) добавляли H₂O₂ (3 мл, 29,4 ммоль) при 0-5°C, и обеспечивали нагревание смеси до температуры, не превышающей к. т., и перемешивали ее в течение 2 ч. Смесь концентрировали in vacuo и остаток подвергали хроматографии на силикагеле (этилацетат/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,97 мин, масса/заряд 169 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,21 (s, 2H), 6,44 (s, 1H).

Промежуточное соединение 3

Фенил(2-хлорпиридин-4-ил)карбамат

К раствору 2-хлорпиридин-4-амина (12,9 г, 101 ммоль) и пиридина (8,13 мл, 101 ммоль) в DCM (315 мл) при 0°C добавляли фенилхлорформиат (13,3 мл, 106 ммоль). Обеспечивали нагревание смеси до к. т. в течение 2 ч. и концентрировали in vacuo. Добавляли воду и смесь перемешивали при к. т. Твердое вещество фильтровали через пластиковую воронку с пористой стеклянной пластинкой, ополаскивали с помощью воды и высушивали под высоким вакуумом при 40°C в течение 24 ч. с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,20 мин, масса/заряд=249,2 (M+H) (LCMS способ 2).

Промежуточное соединение 4

Фенил(2-хлор-5-нитропиридин-4-ил)карбамат

К раствору 4-амино-2-хлор-5-нитропиридина (150 мг, 0,864 ммоль) и пиридина (0,070 мл, 0,86 ммоль) в диоксане (4 мл) при 0°C добавляли фенилхлорформиат (0,114 мл, 0,907 ммоль). Смесь нагревали при 80°C в течение 18 ч., охлаждали до к. т. и выливали в воду. Продукт экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенный органический экстракт высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,51 мин, масса/заряд=294,1 (M+H) (LCMS способ 1).

Промежуточное соединение 5

1-(5-Нитро-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина

Раствор фенил(2-хлор-5-нитропиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 4) (4,50 г, 15,32 ммоль), 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (2,0 г, 13,32 ммоль) и DIPEA (5,8 мл, 33,3 ммоль) в диоксане (59 мл) нагревали при 85°C в течение 16 ч. Смесь концентрировали in vacuo и остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,43 мин, масса/заряд=350,1 (M+H) (LCMS способ 1).

Промежуточное соединение 6

Фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)карбамат

Стадия 1. Синтез метил-6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)никотината

Смесь п-метоксибензиламина (19,0 мл, 146 ммоль), метил-4,6-дихлорникотината (25 г, 121 ммоль), триэтиламина (20,3 мл, 146 ммоль) в MeCN (60 мл) перемешивали при к. т. в течение 24 ч. Добавляли еще 4-метоксибензиламин (2,5 мл) и смесь перемешивали при к. т. в течение 72 ч. Смесь концентрировали и остаток разделяли между EtOAc и водным насыщенным раствором NH₄Cl. Органический экстракт объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,42 мин, масса/заряд=307,1 (M+H) (LCMS способ 1).

Стадия 2. Синтез (6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)пиридин-3-ил)метанола

К раствору LAH (2 М в THF, 21,52 мл, 43,0 ммоль) в THF (150 мл), перемешиваемому при 0°C, добавляли по каплям раствор метил-6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)никотината (полученного на стадии 1) (12 г, 39,1 ммоль) в THF (100 мл). Обеспечивали нагревание реакционной смеси до к. т. и перемешивали ее в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили с помощью медленного добавления EtOAc в бане со льдом, затем подвергали условиям Стейнхардта для гашения LAH (2 мл H₂O, затем 2 мл 15% NaOH и 6 мл H₂O). Полученный раствор перемешивали в течение 15 мин. и обеспечивали его нагревание до к. т. Смесь фильтровали через целит и фильтрат переносили в делительную воронку. Продукт дополнительно разбавляли водой и затем экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,84 мин, масса/заряд=279,3 (M+H) (LCMS 1 способ 1).

Стадия 3. Синтез (4-амино-6-хлорпиридин-3-ил)метанола

Раствор (6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)пиридин-3-ил)метанола (полученного на стадии 2) (9,82 г, 35,2 ммоль) в TFA (2,71 мл, 35,2 ммоль) нагревали при 60°C в течение 18 ч. Реакционную смесь нейтрализовали с помощью 10% водного раствора K₂CO₃ до pH ~7. Смесь затем переносили в делительную воронку и экстрагировали с помощью DCM. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и in vacuo удаляли летучие вещества с получением порции указанного в заголовке соединения. Водный слой концентрировали in vacuo и полученное твердое вещество разбавляли в изопропаноле. Нерастворимые соли отфильтровывали и раствор охлаждали на льду. Дополнительные соли, которые осаждались, отфильтровали. Летучие вещества удаляли in vacuo с получением большего количества указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,26 мин, масса/заряд=159,1 (M+H) (LCMS способ 2).

Стадия 4. Синтез 5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-амина

Смесь (4-амино-6-хлорпиридин-3-ил)метанола (полученного на стадии 3) (5 г, 32 ммоль), TBDMSCl (5,23 г, 34,7 ммоль) и имидазола (5,37 г, 79 ммоль) в DMF (10 мл) перемешивали при к. т. в течение 1 ч. Реакционную смесь выливали в воду и экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,52 мин, масса/заряд=273,2 (M+H) (LCMS способ 2).

Стадия 5. Синтез фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)карбамата

К раствору 5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-амина (полученного на стадии 4) (5,55 г, 20,3 ммоль) и пиридина (1,8 мл, 22,4 ммоль) в DCM (75 мл), перемешивая при к. т., добавляли фенилхлорформиат (2,68 мл, 21,4 ммоль). Обеспечивали нагревание реакционной смеси до к. т. в течение 2 ч. Летучие вещества удаляли in vacuo и остаток разбавляли с помощью EtOAc и насыщенного водного раствора NaHCO₃. Смесь затем экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,94 мин, масса/заряд=393,3 (M+H) (LCMS способ 1).

Промежуточное соединение 7

Фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамат

Стадия 1. Синтез метил-4-амино-6-фторникотината.

В колбу объемом 500 мл, содержащую метил-4,6-дихлорникотинат (6,75 г, 32,8 ммоль) и TMAF (8,0 г, 86 ммоль), добавляли DMF (100 мл) и смесь перемешивали при к. т. в течение 1,5 ч., пока согласно результатам LCMS не идентифицировали завершение образования промежуточного соединения метил-4,6-дифторникотината. К данной реакционной смеси затем добавляли 2 М раствор аммиака в изопропаноле (35 мл, 70 ммоль) и перемешивали при к. т. в течение 20 ч. Завершение образования указанного в заголовке соединения идентифицировали согласно результатам LCMS. Реакционную смесь гасили водой и неочищенный продукт экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой промывали солевым раствором, затем высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,97 мин, масса/заряд 174 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,43 (s, 1H), 7,52 (s, 2H), 6,30 (s, 1H), 3,82 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез (4-амино-6-фторпиридин-3-ил)метанола.

К ледяному (0°C) раствору LAH (2 М в THF, 24,8 мл, 49,6 ммоль), дополнительно разбавленному с помощью THF (200 мл), добавляли посредством капельной воронки в течение 45 мин. раствор метил-4-амино-6-фторникотината (4,22 г, 24,8 ммоль) в THF (100 мл) с получением суспензии. Обеспечивали нагревание смеси до к. т. в течение 2 ч., после чего согласно результатам LCMS реакцию считали завершенной. Реакционную смесь разбавляли с помощью THF (200 мл) и охлаждали на льду. К смеси порциями добавляли декагидрат сульфата натрия до прекращения выделения пузырьков газа. Смесь перемешивали в течение 18 ч., затем фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,27 мин., масса/заряд 143 (M+H) (способ LCMS 3). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,63 (s, 1H), 6,20 (s, 2H), 6,09 (s, 1H), 5,04 (t, J=5,5 Гц, 1H), 4,35 (d, J=5,5 Гц, 2H).

Стадия 3. Синтез 5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-амина.

Смесь (4-амино-6-фторпиридин-3-ил)метанола (1,52 г, 10,7 ммоль), TBDMSCl (1,77 г, 11,8 ммоль) и имидазола (1,82 г, 26,7 ммоль) в DMF (50 мл) перемешивали при к. т. в течение 1 ч., после чего согласно результатам TLC реакцию считали завершенной, 100% EtOAc. Реакционную смесь концентрировали in vacuo, затем очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,46 мин, масса/заряд 257 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,60 (s, 1H), 6,11 (s, 2H), 6,04 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 0,81 (s, 9H), 0,00 (s, 6H).

Стадия 4. Синтез фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата.

К смеси (4-амино-6-фторпиридин-3-ил)метанола (1,45 г, 5,66 ммоль) и пиридина (0,46 мл, 5,66 ммоль) в диоксане (30 мл) добавляли фенилхлорформиат (0,710 мл, 5,66 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 1 ч. Смесь затем разбавляли с помощью EtOAc, затем промывали бикарбонатом натрия, а затем водой. Органическую часть высушивали над сульфатом натрия и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения.LCMS: Rt=1,89 мин, масса/заряд 377 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,66 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,39-7,31 (m, 2H), 7,16-7,09 (m, 2H), 6,74-6,52 (m, 1H), 4,78 (s, 2H), 0,80 (s,9 H), 0,00 (s, 6H).

Промежуточное соединение 8

Фенил(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамат

Стадия 1. Синтез метил-2,4-дифторникотината

Раствор 2,4-дифторпиридина (5 г, 43,4 ммоль) в THF (120 мл) добавляли по каплям к перемешиваемому раствору диизопропиламида лития (2 М в смеси THF/гептан/этилбензол, 26,1 мл, 52,1 ммоль) при -78°C. После перемешивания в течение 1 ч. реакционную смесь переносили с помощью канюли в перемешиваемый раствор метилхлорформиата (5,05 мл, 65,2 ммоль) в THF (120 мл) при -78°C. Обеспечивали нагревание реакционной смеси до к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь медленно гасили водой (100 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3×100 мл). Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,94 мин, масса/заряд 174,1 (M+H) (LCMS способ 1).

Стадия 2. Синтез метил-4-амино-2-фторникотината

К раствору метил-2,4-дифторникотината (полученного на стадии 1) (2 г, 11,55 ммоль) в диоксане (40 мл) добавляли аммиак в диоксане (0,5 М, 46,2 мл, 23,11 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 60°C в течение 18 ч. Реакционную смесь выливали в насыщенный раствор NaHCO_3(водн.) и экстрагировали с помощью EtOAc (3×100 мл). Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,77 мин, масса/заряд 171,1 (M+H) (LCMS способ 1).

Стадия 3. Синтез (4-амино-2-фторпиридин-3-ил)метанола

К раствору метил-4-амино-2-фторникотината (2,02 г, 11,87 ммоль) в THF (70 мл), перемешиваемому в бане со льдом, добавляли по каплям LAH (2 М в THF, 7,1 мл, 14,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. и реакционную смесь гасили с помощью медленного добавления декагидрата сульфата натрия (3,5 г). Смесь перемешивали в течение 15 мин. перед добавлением безводного Na₂SO₄. Смесь фильтровали через целит и летучие вещества удаляли in vacuo. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,56 (d, J=5,7 Гц, 1H), 6,47 (dd, J=5,7, 1,2 Гц, 1H), 6,29 (s, 2H), 4,96 (t, J=5,4 Гц, 1H), 4,40 (d, J=5,4 Гц, 2H).

Стадия 4. Синтез 3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-амина

Смесь (4-амино-2-фторпиридин-3-ил)метанола (1,57 г, 11,05 ммоль), TBDMSCl (2,00 г, 13,26 ммоль) и имидазола (1,88 г, 27,6 ммоль) перемешивали в DMF (30 мл) при к. т. Через 90 мин. реакционную смесь гасили с помощью насыщ. водн. раствора NaHCO₃, затем разбавляли с помощью EtOAc. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические фракции объединяли, промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенную смесь очищали посредством флэш-хроматографии (EtOAc/гептан). LCMS: Rt=1,47 мин, масса/заряд 257,3 (M+H) (LCMS способ 1).

Стадия 5. Синтез фенил(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата

К раствору 3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-амина (2,36 г, 9,20 ммоль) и пиридина (0,89 мл, 11,0 ммоль) в диоксане (40 мл) добавляли фенилхлорформиат (1,21 мл, 9,7 ммоль) при к. т. Через 2,5 ч. реакционную смесь гасили с помощью насыщенного водного раствора NaHCO₃, затем разбавляли с помощью EtOAc. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические фракции объединяли, промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo.

Неочищенную смесь очищали посредством флэш-хроматографии (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,91 мин, масса/заряд 377,4 (M+H) (LCMS способ 1). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,92 (s, 1H), 8,11 (d, J=5,7 Гц, 1H), 7,78 (d, J=5,7 Гц, 1H), 7,52-7,42 (m, 2H), 7,36-7,26 (m, 1H), 7,26-7,19 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 0,87 (s, 9H), 0,08 (s, 6H).

Фармацевтические композиции и комбинации

Соединения по настоящему изобретению, как правило, применяют в виде фармацевтической композиции (например, соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель). "Фармацевтически приемлемый носитель (разбавитель или вспомогательное вещество)" обозначает среды, общепринятые в данной области техники для доставки биологически активных средств животным, в частности млекопитающим, включая в целом признанные безопасными (GRAS) растворители, дисперсионные среды, средства для нанесения покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические средства, замедляющие абсорбцию средства, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственных средств, связующие, буферные средства (например, малеиновая кислота, винная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, бикарбонат натрия, фосфат натрия и т. п.), разрыхляющие средства, смазывающие вещества, подслащивающие вещества, ароматизаторы, красители и т. п. и их комбинации, как должно быть известно специалистам в данной области техники (см., например, Allen, L.V., Jr. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2 Volumes), 22nd Edition, Pharmaceutical Press (2012).

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере два фармацевтически приемлемых носителя, таких как описанные в данном документе. Для целей настоящего изобретения, если не обозначено иным образом, сольваты и гидраты обычно подразумевают композиции. Предпочтительно, фармацевтически приемлемые носители являются стерильными. Фармацевтическую композицию можно составлять для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение, ректальное введение и т. д. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно изготавливать в твердой форме (в том числе без ограничения в виде капсул, таблеток, пилюль, гранул, порошков или суппозиториев) или в жидкой форме (в том числе без ограничения в виде растворов, суспензий или эмульсий). Фармацевтические композиции могут подвергаться традиционным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать традиционные инертные разбавители, смазывающие средства или буферные средства, а также вспомогательные средства, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие средства, эмульгаторы и буферы и т. д. Как правило, фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с одним или несколькими из:

a) разбавителей, например, с лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином;

b) смазывающих веществ, например, с диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; для таблеток также

c) связующих, например, с алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, натрий-карбоксиметилцеллюлозой и/или поливинилпирролидоном; при необходимости

d) разрыхлителей, например, с видами крахмала, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучими смесями; и

e) абсорбентов, красителей, ароматизаторов и подсластителей.

Таблетки могут быть либо покрыты пленочной оболочкой, либо покрыты кишечнорастворимой оболочкой в соответствии со способами, известными из уровня техники.

Подходящие композиции для перорального введения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в форме таблеток, пастилок для рассасывания, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул, или сиропов, или настоек. Композиции, предназначенные для перорального применения, получают в соответствии с любым способом, известным из уровня техники, предназначенным для изготовления фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих веществ, ароматизирующих средств, красящих средств и консервирующих средств, с целью получения препаратов, которые являются фармацевтически приемлемыми и имеют привлекательный вкус. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые являются подходящими для изготовления таблеток. Такие вспомогательные вещества представляют собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактозу, фосфат кальция или фосфат натрия; средства для грануляции и разрыхляющие средства, например кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; связующие средства, например, крахмал, желатин или аравийскую камедь; и смазывающие средства, например, стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Таблетки являются непокрытыми или покрытыми посредством известных методик для замедления распада и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и обеспечения таким образом устойчивого действия в течение более длительного периода. Например, можно использовать вещество для замедленного действия, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Составы для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Определенные инъекционные композиции представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории преимущественно получают из жирных эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать вспомогательные средства, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие средства, ускорители растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически ценные вещества. Указанные композиции получают в соответствии с традиционными способами смешивания, гранулирования или нанесения покрытия соответственно, и они содержат приблизительно 0,1-75% или содержат приблизительно 1-50% активного ингредиента.

Подходящие композиции для трансдермального применения содержат эффективное количество соединения по настоящему изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для трансдермальной доставки, включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители для содействия прохождению через кожу получающего их пациента. Например, трансдермальные устройства представлены в форме перевязочного материала, содержащего поддерживающий элемент, резервуар, содержащий соединение, необязательно вместе с носителями, необязательно барьерный элемент, контролирующий скорость, для доставки соединения через кожу получающего его пациента с контролируемой и предварительно определенной скоростью в течение длительного периода времени, а также средство для прикрепления устройства к коже.

Подходящие композиции для местного применения, например, в отношении кожи и глаз, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели или распыляемые составы, например, для доставки посредством аэрозоля или т. п. Такие системы для местной доставки будут, в частности, подходящими для накожного применения, например для лечения рака кожи, например для профилактического применения в солнцезащитных кремах, лосьонах, аэрозолях и т. п. Таким образом, они являются особенно подходящими для применения в составах для местного применения, в том числе косметических, хорошо известных из уровня техники. Таковые могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, средства для увеличения тоничности, буферы и консерванты.

Используемое в данном документе "местное применение" может также относиться к ингаляционному или интраназальному применению. В целях удобства их можно доставлять в форме сухого порошка (либо отдельно, в качестве смеси, например сухой смеси с лактозой, либо частицы из смешанных компонентов, например с фосфолипидами) из ингалятора сухого порошка или подачи распыляемого аэрозоля из контейнера под давлением, диспенсера с помпой, пульвелизатора, распылителя или небулайзера с применением подходящего газа-вытеснителя или без него.

В настоящем изобретении дополнительно предусматриваются безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может содействовать разрушению некоторых соединений.

Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы по настоящему изобретению можно получать с применением безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и условий с низким содержанием влаги или низкой влажностью. Безводную фармацевтическую композицию можно получать и хранить таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа. Соответственно, безводные композиции упаковывают с применением материалов, которые, как известно, предотвращают воздействие воды, так что они могут быть включены в подходящие рецептурные наборы. Примеры подходящей упаковки включают без ограничения виды герметично закрываемой фольги, пластиковые материалы, контейнеры с однократной дозой (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные безъячейковые упаковки.

В настоящем изобретении дополнительно предусматриваются фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие одно или несколько средств, которые снижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента будет распадаться. Такие средства, которые упоминаются в данном документе как "стабилизаторы", включают без ограничения антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, буферы для регулирования pH или солевые буферы и т. д.

Соединение по настоящему изобретению, как правило, составляют в фармацевтических лекарственных формах для обеспечения легко контролируемого дозирования лекарственного средства и обеспечения пациента простым и легким в применении продуктом. Схема дозирования для соединений по настоящему изобретению, естественно, будет варьироваться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного средства, а также способ и путь его введения; вид, возраст, пол, состояние здоровья, медицинское показание и вес реципиента; природа и степень выраженности симптомов; вид сопутствующего лечения; частота лечения; путь введения, функция почек и печени пациента и необходимый эффект. Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде однократной суточной дозы или общую суточную дозу можно вводить разделенными дозами два, три или четыре раза в сутки.

В некоторых случаях может быть преимущественным введение соединения по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими терапевтически активными средствами, независимо выбранными из противораковых средств, противоаллергических средств, противорвотных средств, обезболивающих средств, иммуномодуляторов и цитопротекторных средств.

Термин "комбинированная терапия" обозначает введение двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического заболевания, нарушения или состояния, описанного в настоящем изобретении. Такое введение охватывает совместное введение данных терапевтических средств по сути одновременно, как, например, в одной капсуле, содержащей фиксированное соотношение активных ингредиентов. В качестве альтернативы такое введение охватывает совместное введение в составных или в отдельных контейнерах (например, капсулы, порошки и жидкости) для каждого активного ингредиента. Соединение по настоящему изобретению и дополнительные терапевтические средства можно вводить одним и тем же путем введения или разными путями введения. Порошки и/или жидкости могут быть растворены или разбавлены до необходимой дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательно, при этом примерно в одно и то же время, либо в разное время. В любом случае схема лечения будет обеспечивать благоприятные эффекты комбинации лекарственных средств при лечении заболеваний, состояний или нарушений, описанных в данном документе.

Основные химиотерапевтические средства, рассматриваемые для применения в видах комбинированной терапии, включают капецитабин (Xeloda®), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin®), цисплатин (Platinol®), кладрибин (Leustatin®), циклофосфамид (Cytoxan® или Neosar®), цитарабин, цитозин-арабинозид (Cytosar-U®), липосомальный цитарабин для инъекций (DepoCyt®), дакарбазин (DTIC-Dome®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin®, Rubex®), флударабина фосфат (Fludara®), 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®), гемцитабин (дифтордезоксицитидин), иринотекан (Camptosar®), L-аспарагиназу (ELSPAR®), 6-меркаптопурин (Purinethol®), метотрексат (Folex®), пентостатин, 6-тиогуанин, тиотепу и топотекана гидрохлорид для инъекций (Hycamptin®).

Представляющие особый интерес противораковые средства для комбинаций с соединениями по настоящему изобретению включают следующее.

Ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K): 4-[2-(1H-индазол-4-ил)-6-[[4-(метилсульфонил)пиперазин-1-ил]метил]тиено[3,2-d]пиримидин-4-ил]морфолин (также известный как GDC 0941 и описанный в публикациях согласно PCT №№ WO 09/036082 и WO 09/055730); 4-(трифторметил)-5-(2,6-диморфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин (также известный как BKM120 или NVP-BKM120 и описанный в публикации согласно PCT № WO2007/084786); алпелисиб (BYL719): (5Z)-5-[[4-(4-пиридинил)-6-хинолинил]метилен]-2,4-тиазолидиндион (GSK1059615, CAS 958852-01-2); 5-[8-метил-9-(1-метилэтил)-2-(4-морфолинил)-9H-пурин-6-ил]-2-пиримидинамин (VS-5584, CAS 1246560-33-7) и эверолимус (AFINITOR®).

Ингибиторы митоген-активируемой протеинкиназы (MEK): XL-518 (также известный как GDC-0973, Cas № 1029872-29-4, доступный от ACC Corp.); селуметиниб (5-[(4-бром-2-хлорфенил)амино]-4-фтор-N-(2-гидроксиэтокси)-1-метил-1H-бензимидазол-6-карбоксамид, также известный как AZD6244 или ARRY 142886, описанный в публикации согласно PCT № WO2003077914); 2-[(2-хлор-4-йодфенил)амино]-N-(циклопропилметокси)-3,4-дифторбензамид (также известный как CI-1040 или PD184352 и описанный в публикации согласно PCT № WO2000035436); N-[(2R)-2,3-дигидроксипропокси]-3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4-йодфенил)амино]-бензамид (также известный как PD0325901 и описанный в публикации согласно PCT № WO2002006213); 2,3-бис[амино[(2-аминофенил)тио]метилен]-бутандинитрил (также известный как U0126 и описанный в патенте США № 2779780); N-[3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4-йодфенил)амино]-6-метоксифенил]-1-[(2R)-2,3-дигидроксипропил]-циклопропансульфонамид (также известный как RDEA119 или BAY869766 и описанный в публикации согласно PCT № WO2007014011); (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(этиламино)-8,9,16-тригидрокси-3,4-диметил-3,4,9,19-тетрагидро-1H-2-бензоксациклотетрадецин-1,7(8H)-дион] (также известный как E6201 и описанный в публикации согласно PCT № WO2003076424); 2'-амино-3'-метоксифлавон (также известный как PD98059, доступный от Biaffin GmbH & Co., KG, Германия); (R)-3-(2,3-дигидроксипропил)-6-фтор-5-(2-фтор-4-йодфениламино)-8-метилпиридо[2,3-d]пиримидин-4,7(3H,8H)-дион (TAK-733, CAS 1035555-63-5); пимасертиб (AS-703026, CAS 1204531-26-9); траметиниба диметилсульфоксид (GSK-1120212, CAS 1204531-25-80); 2-(2-фтор-4-йодфениламино)-N-(2-гидроксиэтокси)-1,5-диметил-6-оксо-1,6-дигидропиридин-3-карбоксамид (AZD 8330); 3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4-йодфенил)амино]-N-(2-гидроксиэтокси)-5-[(3-оксо-[1,2]оксазинан-2-ил)метил]бензамид (CH 4987655 или Ro 4987655); () и 5-[(4-бром-2-фторфенил)амино]-4-фтор-N-(2-гидроксиэтокси)-1-метил-1H-бензимидазол-6-карбоксамид (MEK162).

Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR): эрлотиниба гидрохлорид (Tarceva®), гефитиниб (Iressa®); дакомитиниб (PF299804); N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[[(3''S'')-тетрагидро-3-фуранил]окси]-6-хиназолинил]-4(диметиламино)-2-бутенамид (Tovok®); вандетаниб (Caprelsa®); лапатиниб (Tykerb®); (3R,4R)-4-амино-1-((4-((3-метоксифенил)амино)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил)метил)пиперидин-3-ол (BMS690514); канертиниба дигидрохлорид (CI-1033); 6-[4-[(4-этил-1-пиперазинил)метил]фенил]-N-[(1R)-1-фенилэтил]-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-амин (AEE788, CAS 497839-62-0); мубритиниб (TAK165); пелитиниб (EKB569); афатиниб (BIBW2992); нератиниб (HKI-272); N-[4-[[1-[(3-фторфенил)метил]-1H-индазол-5-ил]амино]-5-метилпирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-6-ил]карбаминовой кислоты (3S)-3-морфолинилметиловый сложный эфир (BMS599626); N-(3,4-дихлор-2-фторфенил)-6-метокси-7-[[(3aα,5β,6aα)-октагидро-2-метилциклопента[c]пиррол-5-ил]метокси]-4-хиназолинамин (XL647, CAS 781613-23-8) и 4-[4-[[(1R)-1-фенилэтил]амино]-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенол (PKI166, CAS 187724-61-4).

Антитела к EGFR: цетуксимаб (Erbitux®); панитумумаб (Vectibix®); матузумаб (EMD-72000); трастузумаб (Herceptin®); нимотузумаб (hR3); залутумумаб; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1) и ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1).

Ингибиторы MAPK: вемурафиниб (Zelboraf®), сорафиниб (Nexavar®), дабрефиниб (Tafinlar®), траметиниб (Mekinist®) и селуметиниб (AZD6244, ARRY-142886).

Ингибиторы EED/EZH2: таземетостат (EPZ-6438), GSK2816126 (CAS 1346574-57-9), CPI-1205 (CAS 1621862-70-1) и DS-3201 (также известный как DS-3201b, Daiichi Sankyo, Inc).

Модуляторы контрольных точек иммунного ответа: пембролизумаб (Keytruda®), ниволумаб (Opdivo®), атезолизумаб (Tecentriq®) и ипилумумаб (Yervoy®).

У некоторых пациентов могут проявиться аллергические реакции на соединения по настоящему изобретению и/или другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а) в ходе или после введения; в связи с этим, чтобы свести к минимуму риск возникновения аллергической реакции часто вводят противоаллергические средства. Подходящие противоаллергические средства включают кортикостероиды (Knutson, S., et al., PLoS One, DOI:10.1371/journal.pone.0111840 (2014)), такие как дексаметазон (например Decadron®), беклометазон (например Beclovent®), гидрокортизон (также известный как кортизон, гидрокортизона натрия сукцинат, гидрокортизона натрия фосфат и продаваемый под торговыми названиями Ala-Cort® гидрокортизона фосфат, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® и Lanacort®), преднизолон (продаваемый под торговыми названиями Delta-Cortel®, Orapred®, Pediapred® и Prelone®), преднизон (продаваемый под торговыми названиями Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® и Orasone®), метилпреднизолон (также известный как 6-метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолона натрия сукцинат, продаваемый под торговыми названиями Duralone®, Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® и Solu-Medrol®); антигистаминные средства, такие как дифенгидрамин (например Benadryl®), гидроксизин и ципрогептадин; и бронхорасширяющие средства, такие как агонисты бета-адренергических рецепторов, альбутерол (например Proventil®) и тербуталин (Brethine®).

Некоторые пациенты могут испытывать тошноту во время и после введения соединения по настоящему изобретению и/или другого(-их) противоракового(-ых) средства(средств); в связи с этим для предупреждения тошноты (верхняя часть желудка) и рвоты используют противорвотные средства. Подходящие противорвотные средства включают апрепитант (Emend®), ондансетрон (Zofran®), гранисетрон HCl (Kytril®), лоразепам (Ativan®), дексаметазон (Decadron®), прохлорперазин (Compazine®), казопитант (Rezonic® и Zunrisa®) и их комбинации.

Лекарственные препараты для облегчения боли, испытываемой в период лечения, часто прописывают для облегчения состояния пациента. Часто используют обычные отпускаемые без рецепта анальгетики, такие как Tylenol®. Однако при умеренной или сильной боли пригодны также опиоидные анальгезирующие лекарственные средства, такие как гидрокодон/парацетамол или гидрокодон/ацетаминофен (например, Vicodin®), морфин (например, Astramorph® или Avinza®), оксикодон (например, OxyContin® или Percocet®), оксиморфона гидрохлорид (Opana®) и фентанил (например, Duragesic®).

Иммуномодуляторы, представляющие особый интерес для комбинаций с соединениями по настоящему изобретению, включают: афутузумаб (доступный от Roche®); пэгфилграстим (Neulasta®); леналидомид (CC-5013, Revlimid®); талидомид (Thalomid®), актимид (CC4047) и IRX-2 (смесь цитокинов человека, содержащая интерлейкин-1, интерлейкин-2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступная от IRX Therapeutics).

С целью защиты нормальных клеток от токсичности, обусловленной лечением, и ограничения токсичности по отношению к органам можно использовать цитопротекторные средства (такие как нейропротекторы, поглотители свободных радикалов, кардиопротекторы, нейтрализаторы антрациклина, вызывающего кровоизлияния, питательные вещества и т. п.) в качестве вспомогательной терапии. Подходящие цитопротекторные средства включают амифостин (Ethyol®), глутамин, димесну (Tavocept®), месну (Mesnex®), дексразоксан (Zinecard® или Totect®), ксалипроден (Xaprila®) и лейковорин (также известный как лейковорин кальция, цитроворум-фактор и фолиновая кислота).

Структура активных соединений, определяемая кодовыми номерами, тривиальными названиями или торговыми марками, может быть взята из актуального издания стандартного сборника "The Merck Index" или из баз данных, например, Patents International (например, IMS World Publications).

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем, подходящим для введения субъекту-человеку или субъекту-животному либо отдельно, либо совместно с другими противораковыми средствами.

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предусматриваются способы лечения субъектов-людей или субъектов-животных, страдающих клеточным пролиферативным заболеванием, таким как злокачественное новообразование. В настоящем изобретении предусматриваются способы лечения субъекта-человека или субъекта-животного, нуждающихся в таком лечении, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли либо отдельно, либо в комбинации с другими противораковыми средствами.

В частности, композиции будут либо составлены вместе в виде комбинированного терапевтического средства, либо вводиться отдельно.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается фармацевтическая комбинация, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько терапевтически активных средств, выбранных из группы, состоящей из абитрексата (метотрексат), абраксана (состав стабилизированных альбумином наночастиц паклитаксела), афатиниба дималеата, афинитора (эверолимус), алецензы (алектиниб), алектиниба, алимты (пеметрекседа динатрий), авастина (бевацизумаб), бевацизумаба, карбоплатина, церитиниба, кризотиниба, цирамзы (рамуцирумаб), доцетаксела, эрлотиниба гидрохлорида, эверолимуса, фолекса (метотрексат), Folex PFS (метотрексат), гефитиниба, гилотрифа (афатиниба дималеат), гемцитабина гидрохлорида, гемзара (гемцитабина гидрохлорид), ирессы (гефитиниб), кейтруды (пембролизумаб), мехлорэтамина гидрохлорида, метотрексата, Methotrexate LPF (метотрексат), мексата (метотрексат), Mexate-AQ (метотрексат), мустаргена (мехлорэтамина гидрохлорид), навелбина (винорелбина тартрат), нецитумумаба, ниволумаба, опдиво (ниволумаб), осимертиниба, паклитаксела, состава стабилизированных альбумином наночастиц паклитаксела, параплата (карбоплатин), параплатина (карбоплатин), пембролизумаба, пеметрекседа динатрия, портраззы (нецитумумаб), рамуцирумаба, тагриссо (осимертиниб), тарцевы (эрлотиниба гидрохлорид), таксола (паклитаксел), таксотера (доцетаксел), винорелбина тартрата, ксалкори (кризотиниб), зикадии (церитиниб), карбоплатина-таксола и гемцитабина-цисплатина, для лечения карциномы легкого (включая без ограничения немелкоклеточную карциному легкого, аденокарциному легкого, карциному легкого, виды крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточную карциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого).

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается фармацевтическая комбинация, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько терапевтически активных средств, выбранных из группы, состоящей из альдеслейкина, кобиметиниба, котеллика (кобиметиниб), дабрафениба, дакарбазина, DTIC-Dome (дакарбазин), IL-2 (альдеслейкин), ImLygic (талимоген лагерпарепвек), интерлейкина-2 (альдеслейкин), Intron A (рекомбинантный интерферон альфа-2b), ипилимумаба, кейтруда (пембролизумаб), мекиниста (траметиниб), ниволумаба, опдиво (ниволумаб), пегинтерферона альфа-2b, PEG-Intron (пегинтерферон альфа-2b), пембролизумаба, пролейкина (альдеслейкин), рекомбинантного интерферона альфа-2b, силатрона (пегинтерферон альфа-2b), тафинлара (дабрафениб), талимоген лагерпарепвека, траметиниба, вемурафениба, ервоя (ипилимумаб) и зелборафа (вемурафениб), для лечения меланомы (включая без ограничения меланому кожи, десмопластическую меланому и увеальную меланому).

При комбинированной терапии для лечения злокачественного новообразования соединение по настоящему изобретению и другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а) можно вводить одновременно, совместно или последовательно без определенных временных ограничений, при этом такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме субъекта.

В предпочтительном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению и другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а), как правило, вводят последовательно в любом порядке с помощью инфузии или перорально. Схема дозирования может варьироваться в зависимости от стадии заболевания, физического состояния пациента, профилей безопасности отдельных лекарственных средств и переносимости отдельных лекарственных средств, а также от других критериев, хорошо известных лечащему врачу и медицинскому(-им) работнику(-ам), вводящему(-им) данную комбинацию. Соединение по настоящему изобретению и другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а) можно вводить в пределах минутных интервалов друг от друга, с интервалом, составляющим часы, сутки или даже недели, в зависимости от определенного цикла, используемого для лечения. Кроме того, цикл может включать более частое введение одного лекарственного средства по сравнению с другим в ходе цикла лечения и в различных дозах на одно введение лекарственного средства.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусматривается набор, содержащий две или более отдельных фармацевтических композиций, по меньшей мере одна из которых содержит соединение по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления набор содержит средства для раздельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, секционная бутылка или секционный пакет из фольги. Примером такого набора является блистерная упаковка, как правило, применяемая для упаковывания таблеток, капсул и т. п.

Набор по настоящему изобретению можно применять для введения различных лекарственных форм, например, для перорального и парентерального применения, для введения отдельных композиций с различными интервалами между введениями доз или для титрования отдельных композиций одна относительно другой. Для содействия соблюдению режима лечения набор по настоящему изобретению, как правило, содержит инструкции по введению.

Соединение по настоящему изобретению также может успешно применяться в сочетании с известными терапевтическими процессами, например, введением гормонов или, особенно, облучением. Соединение по настоящему изобретению, в частности, может применяться в качестве радиосенсибилизатора, особенно для лечения опухолей, которые характеризуются слабой чувствительностью к лучевой терапии.

В видах комбинированной терапии по настоящему изобретению соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство могут быть изготовлены и/или составлены одним и тем же или разными производителями. Более того, соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое (или фармацевтическое) средство могут быть сведены в комбинированную терапию: (i) до того, как комбинированный продукт попадает к врачам (например, в случае набора, содержащего соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство); (ii) самими врачами (или под наблюдением врача) незадолго до введения; (iii) в организме пациентов, например в ходе последовательного введения соединения по настоящему изобретению и другого терапевтического средства.

Фармацевтическая композиция (или состав) для применения может быть упакована различными способами в зависимости от способа, применяемого для введения лекарственного средства. Как правило, изделие для распределения включает контейнер, в который помещен фармацевтический состав в соответствующей форме. Подходящие контейнеры хорошо известны специалистам в данной области техники и предусматривают такие материалы, как бутылки (пластиковые и стеклянные), саше, ампулы, пластиковые пакеты, металлические цилиндры и т. п. Контейнер также может предусматривать сборку с индикацией вскрытия для предотвращения несанкционированного доступа к содержимому упаковки. Кроме того, на контейнер нанесена этикетка, на которой описывается содержимое контейнера. Этикетка также может содержать соответствующие предупреждения.

Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению может быть представлена в однократной дозировке, составляющей приблизительно 1-1000 мг активного(-ых) ингредиента(-ов) для субъекта весом приблизительно 50-70 кг, или приблизительно 1-500 мг, или приблизительно 1-250 мг, или приблизительно 1-150 мг, или приблизительно 0,5-100 мг, или приблизительно 1-50 мг активных ингредиентов. Терапевтически эффективная дозировка соединения, фармацевтической композиции или их комбинаций зависит от вида субъекта, массы тела, возраста, а также индивидуального состояния, нарушения или заболевания, лечение которых осуществляется, или их тяжести. Лечащий врач, клиницист или ветеринар средней квалификации может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предупреждения, лечения или подавления прогрессирования нарушения или заболевания.

Вышеупомянутые свойства дозировки можно продемонстрировать в тестах in vitro и in vivo с применением преимущественно млекопитающих, например, мышей, крыс, собак, обезьян, или выделенных органов, тканей и препаратов на их основе. Соединения по настоящему изобретению можно применять in vitro в форме растворов, например водных растворов, и in vivo, будь то энтерально, парентерально, преимущественно внутривенно, например, в виде суспензии или в водном растворе. Дозировка in vitro может находиться в диапазоне значений концентрации от приблизительно 10^-3 моль/л до 10^-9 моль/л. В зависимости от пути введения терапевтически эффективное количество in vivo может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 до 500 мг/кг или от приблизительно 1 до 100 мг/кг.

ФАРМАКОЛОГИЯ И ПРИМЕНИМОСТЬ

Мутации в комплексах ремоделирования хроматина SWI/SNF являются широко распространенными при видах рака и появляются с частотой примерно 20% (Kadoch, C., Hargreaves, D. C., et al. 2013 Nat Genet. 45: 592-601) (Shain, A.H., and Pollack, J.R. 2013 PLoS ONE 8(1): e55119). Комплексы SWI/SNF состоят из различных субъединиц и участвуют в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина с обеспечением контроля ключевых событий в клетках, таких как регуляция экспрессии генов. Каталитические субъединицы АТФазы внутри комплекса SWI/SNF состоят либо из BRM/SMARCA2, либо из BRG1/SMARCA4 и, таким образом, являются взаимоисключающими (Hodges, C., Kirkland, J.G., et al. 2016 Cold Spring Harb Persp Med 6(8)). С помощью функционального геномного скрининга с помощью shRNA раскрыли заметное синтетическое летальное взаимодействие между такими двумя АТФазами SWI/SNF, BRM и BRG1 (Hoffman, G.R; Rahal, R et al. 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Wilson, B.G., Helming, K.C., et al. 2014 Molecular and Cellular Biology 34(6): 1136-44). В частности, раковые клетки, у которых отсутствует функциональный BRG1, например, вследствие мутаций с потерей функции или делеций, являются особенно чувствительными к истощению по BRM посредством опосредованного shRNA нокдауна, что приводит к подавлению роста (Hoffman, G.R., Rahal, R et al., 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Oike, T., Ogiwara, H., et al. 2013 Cancer Research 73(17): 5508-5518); и Vangamudi, B., Paul, T.A., et al. 2015 Cancer Research 75(18): 3865-3878). Следовательно, в таких исследованиях раскрывается, что при отсутствии одной из АТФаз SWI/SNF для выживания раковые клетки могут стать высоко зависимыми от оставшейся АТФазы, что открывает уязвимость, которую можно использовать для направленной терапии. Генетические повреждения в BRG1 действительно были идентифицированы при различных видах рака, преимущественно при видах немелкоклеточного рака легкого с частотой примерно 10%, но также при других типах рака, таких как рак печени, поджелудочной железы, виды меланомы и т. д. (Imielinski, M., A. H. Berger, et al. (2012) Cell 150(6): 1107-1120); информационный портал The Cancer Genome Atlas (TCGA) и cBioPortal for Cancer Genomics). Таким образом, они составляют весьма значительные популяции пациентов с очевидными неудовлетворенными медицинскими потребностями, и ожидается, что они получат пользу от терапевтического ингибирования BRM. Так же, как некоторые раковые клетки являются зависимыми от BRM из-за потери функции BRG1, интересно, что другие типы рака, как сообщалось, являются BRG1-зависимыми, потенциально возникающими посредством различных механизмов, включая мутации в других субъединицах комплекса SWI/SNF (Shi, J; Whyte, W.A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; Xi, W., Sansam, C.G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101; и Zuber, J., Shi, J., et al. 2011 Nature 478(7370), 524-528). Кроме того, сообщалось, что активность SWI/SNF изменяется при других заболеваниях, что делает его привлекательной терапевтической мишенью при других заболеваниях, помимо рака. (Han, P., Li, W., et al. 2014 Nature 514(7520): 102-06). Следовательно, способность ингибировать либо одну из АТФаз, либо обе из них может иметь множество применений при лечении различных типов рака и заболеваний.

Мутации, делеции или потеря экспрессии BRG1, которые могут привести к потере функции, могут возникать при различных типах рака. (информационный портал The Cancer Genome Atlas (TCGA); cBioPortal for Cancer Genomics; Becker, T. M., S. Haferkamp, et al. (2009) Mol Cancer 8: 4.; Matsubara, D., Kishaba, Y., et al. 2013 Cancer Science 104(2): 266-273; и Yoshimoto, T., Matsubara, D., et al. 2015 Pathology International 65(11): 595-602). Примеры конкретных типов рака с мутацией, делецией или потерей экспрессии в отношении BRG1 включают без ограничения немелкоклеточную карциному легкого, аденокарциному легкого, карциному легкого, виды крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточную карциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого, меланому кожи, десмопластическую меланому, увеальную меланому, мелкоклеточную карциному яичника, плоскоклеточную карциному кожи, глиому, карциносаркому матки, карциному тела матки и эндометрия, серозную цистаденокарциному яичников, уротелиальную карциному мочевого пузыря, первичную лимфому центральной нервной системы, карциному пищевода, рак мочевого пузыря, плазмацитоидный вариант рака мочевого пузыря, аденокарциному желудка, аденокистозную карциному, лимфосаркому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, рак поджелудочной железы, колоректальную аденокарциному, холангиокарциному, саркому, виды рака головы и шеи, виды рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластому, T-клеточную лимфому кожи, гепатоцеллюлярную карциному печени, папиллярную почечно-клеточную карциному почки, рак молочной железы, лимфому из клеток мантийной зоны, карциному желчного пузыря, виды рака половых клеток яичек, почечно-клеточную светлоклеточную карциному почки, рак предстательной железы, детскую саркому Юинга, тимому, хромофобную почечно-клеточную карциному, непрозрачно-клеточную карциному почки, феохромоцитому и параганглиому, виды рака щитовидной железы.

Виды рака с мутацией в SMARCB1/SNF5 включают злокачественные рабдоидные опухоли, в которых была продемонстрирована зависимость от BRG1 (Xi, W., Sansam, C.G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101), а также виды эпителиоидной саркомы с мутацией в SMARCB1/SNF, семейный шванноматоз, виды медуллярной карциномы почки и виды саркомы Юинга (Jahromi, M.S; Putnam, A.R, et al. 2012 Cancer Genetics 205(7-8): 391-404; Prensner, J.R., Iyer, M.K., et al. 2013 Nature Genetics 45(11): 1392-8; и Roberts, C.W.M., and Biegel, J.A., 2009 Cancer Biology and Therapy 8(5): 412-416) и виды рака, при которых SNF5 является дефицитным в комплексе SWI/SNF, что не возникает в результате мутаций, например, при видах синовиальной саркомы. (Kadoch, C., and Crabtree, G.R., 2013 Cell 153(1): 71-85), а также BRG1-зависимые гематопоэтические злокачественные опухоли, такие как виды острого миелоидного лейкоза (AML) (Shi, J., Whyte, W.A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; и Zuber, J., Shi, J., et al. 2011 Nature 478(7370), 524-528). Виды рака с мутацией в BRM (включая делецию) или в SNF5/SMARCB1 (включая делецию) (информационный портал The Cancer Genome Atlas (TCGA) и cBioPortal for Cancer Genomics) включают без ограничения злокачественную опухоль оболочек периферических нервов, нейроэндокринный рак предстательной железы, рак молочной железы, уротелиальную карциному мочевого пузыря, аденокистозную карциному, аденокарциному желудка, серозную цистаденокарциному яичников, карциносаркому матки, карциному пищевода, плоскоклеточную карциному головы и шеи, виды немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, карциному коры надпочечников, меланому кожи, саркому, колоректальную аденокарциному, виды рака шейки матки и канала шейки матки, гепатоцеллюлярную карциному печени, плоскоклеточный рак кожи, рак половых клеток яичек, глиобластому, мультиформную глиобластому, холангиокарциному, саркому Юинга, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, нейробластому, тимому, диффузную B-крупноклеточную лимфому, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, медуллобластому, феохромоцитому и параганглиому и множественную миелому.

Двойные ингибиторы которые обладают преимуществом ингибирования либо BRM, либо BRG1, либо и BRM, и BRG1, могут также быль пригодными при видах рака, предусматривающих мутации или дефицит субъединиц SWI/SNF, отличных от BRG1/SMARCA4, BRM/SMARCA2, или SNF5/SMARCB1, детально описанных выше, таких как ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9 и ACTB. В других случаях зависимость от АТФаз BRM/BRG1 может возникнуть посредством механизмов, отличных от мутаций SWI/SNF.

Соединения по настоящему изобретению характеризуются предпочтительными терапевтическими преимуществами в отношении опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний. Соединения по настоящему изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли проявляют ценные фармакологические свойства, которые могут быть продемонстрированы по меньшей мере с применением любой из следующих процедур тестирования. Соединения по настоящему изобретению оценивали в отношении их способности к подавлению активности BRM и BRG1 с помощью биохимических анализов.

Анализ ингибирования АТФазы BRM

I. Выделение рекомбинантного домена АТФазы BRM

A. Клонирование His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM(636-1331) в pFastBac1

Последовательности, кодирующие His₁₀-метку (SEQ ID NO: 1), ZZ-домен белка A, связывающий иммуноглобулин G (IgG) (Staphylococcus aureus), и сайт протеазы 3C риновируса человека, составляли выше по последовательности от остатков 636-1331 BRM с применением стандартных способов синтеза ДНК. Синтезированную конструкцию клонировали в MCS pFastBac1 (Life Technologies) путем ПЦР-амплификации с применением следующих 5'- и 3'-праймеров: 5'-GACCGAACTAGTATGGCTTCTCACCACCAT-3' (SEQ ID NO: 2) и 5'-AGCGTTAAGCTTTTAATCCTCGATGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 3) для включения стоп-кодона и встраивали посредством лигирования в сайты SpeI и HindIII с применением стандартных методик молекулярной биологии. Конечный рекомбинантный вектор, pFB1-His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), обеспечивает экспрессию расщепляемой протеазой HCV3C His₁₀-ZZ-метки (подчеркнуто) выше по последовательности от нативных последовательностей BRM, кодирующих АТФазу и домены SnAC.

MASHHHHHHHHHHAQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDANGGGGSGGGGSLEVLFQGPEESDSDYEEEDEEEESSRQETEEKILLDPNSEEVSEKDAKQIIETAKQDVDDEYSMQYSARGSQSYYTVAHAISERVEKQSALLINGTLKHYQLQGLEWMVSLYNNNLNGILADEMGLGKTIQTIALITYLMEHKRLNGPYLIIVPLSTLSNWTYEFDKWAPSVVKISYKGTPAMRRSLVPQLRSGKFNVLLTTYEYIIKDKHILAKIRWKYMIVDEGHRMKNHHCKLTQVLNTHYVAPRRILLTGTPLQNKLPELWALLNFLLPTIFKSCSTFEQWFNAPFAMTGERVDLNEEETILIIRRLHKVLRPFLLRRLKKEVESQLPEKVEYVIKCDMSALQKILYRHMQAKGILLTDGSEKDKKGKGGAKTLMNTIMQLRKICNHPYMFQHIEESFAEHLGYSNGVINGAELYRASGKFELLDRILPKLRATNHRVLLFCQMTSLMTIMEDYFAFRNFLYLRLDGTTKSEDRAALLKKFNEPGSQYFIFLLSTRAGGLGLNLQAADTVVIFDSDWNPHQDLQAQDRAHRIGQQNEVRVLRLCTVNSVEEKILAAAKYKLNVDQKVIQAGMFDQKSSSHERRAFLQAILEHEEENEEEDEVPDDETLNQMIARREEEFDLFMRMDMDRRREDARNPKRKPRLMEEDELPWIIKDDAEVERLTCEEEEEKIFGRGSRQRRDVDYSDALTEKQWLRAIED (SEQ ID NO: 4)

B. Экспрессия BRM (636-1331)

Рекомбинантный вектор, полученный выше, применяли для создания рекомбинантной бакмиды путем трансформирования в клетках DH10Bac с применением стандартных протоколов, подробно описанных производителем (Life Technologies). Большой титр вируса P3 получали путем осуществления трансфекции бакмиды в клетки Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) и амплификации вируса с применением стандартных способов, подробно описанных Life Technologies. Экспрессировали His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) из 25 л клеток Sf9 на логарифмической фазе роста (1,5 × 10⁶ клеток/мл) в биореакторе WAVE (GE Healthcare Life Sciences) при концентрации вируса 1:100 об./об. Обеспечивали развитие инфекции в качающемся инкубаторе при 27°C и собирали через три дня после заражения после того, как жизнеспособность клеток падала до 80%, при этом повышение общего диаметра клеток соответствовало заражению. Клетки собирали при 4000 g в течение 20 мин., подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения.

C. Очистка BRM (636-1331)

Обеспечивали лизис клеток Sf9, экспрессирующих рекомбинантный His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), в 50 мМ Трис (8,0), 300 мМ NaCl, 10% глицерина и 2 мМ TCEP, дополненного смесью ингибиторов протеаз (Roche cOmplete), с применением 7,5 мл буфера для лизиса на грамм пасты клеток. После оттаивания обеспечивали лизис клеток, их гомогенизировали и затем очищали в роторе JA25.50 при 50000 g в течение 30 мин. с удалением нерастворимого материала. Очищенный лизат наносили на колонку His-Trap HP объемом 5 мл (GE Healthcare Life Sciences), тщательно промывали буфером для лизиса без ингибиторов протеаз, дополненным 25 мМ имидазола. Связанный белок элюировали при градиенте на протяжении пятнадцати объемов колонки против буфера для лизиса, дополненного 500 мМ имидазола. Фракции, содержащие His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), объединяли и подвергали диализу в течение ночи против 50 мМ Трис (8,0), 300 мМ NaCl, 10% глицерина и 2 мМ TCEP, дополненного протеазой HCV3C, с осуществлением удаления His₁₀-ZZ-метки. Расщепление отслеживали с помощью SDS/PAGE с окрашиванием кумасси и LC/MS. Интактная масса соответствовала остаткам 636-1331 BRM, после которых следуют две отличные от нативных аминокислоты, Gly-Pro, которые являются остатком от сайта расщепления HCV3C. Рассчитанная масса была на 160 Да большей, чем теоретическая, что соответствовало двум сайтам фосфорилирования.

Расщепленный продукт разбавляли буфером для диализа без добавления соли, пока конечная концентрация NaCl не составляла 100 мМ, пропускали через шприцевой фильтр 0,2 мкм и непосредственно загружали в колонку HiTrap Q HP объемом 1 мл (GE Health Biosciences), ранее откалиброванную в 50 мМ Трис (8,0), 100 мМ NaCl, 10% глицерина и 1 мМ TCEP. После захватывания связанный белок оценивали против того же буфера, дополненного 1 М NaCl. Фракции, содержащие BRM (636-1331), объединяли и загружали в эксклюзионную колонку S200 размера 16/60, откалиброванную в 50 мМ Трис (8,0), 200 мМ NaCl, 10% глицерина и 2 мМ TCEP. Очищенную конструкцию концентрировали до 2,5 мг/мл, подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения в последующих анализах.

II. Активность в отношении ингибирования АТФазы Brm

Активность ингибирования АТФазы соединением в отношении АТФазы-SnAC Brm (636-1331) измеряли с помощью набора для анализа ADP-Glo от Promega (V6930). Переносили 120 нл соединения в 100% DMSO в белый 384-луночный титрационный микропланшет для анализа с применением ATS Acoustic Transfer System от EDC Biosystems. Все последующие добавления реагентов проводили с применением многорежимного дозатора MultiFlo FX. Буфер для анализа состоял из 20 мМ HEPES pH 7,5, 1 мМ MgCl₂, 20 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0,01% BSA, 0,005% Tween 20. В планшет для анализа добавляли 4 мкл 7,5 нМ АТФазы-SnAC Brm в буфере для анализа и инкубировали с соединением при к. т. в течение 5 мин. В планшет для анализа добавляли 2 мкл 255 мкм АТФ и 6 нМ плазмиды pCMV-dR8.91 в буфере для анализа для инициирования начала реакции. Конечные значения концентрации реагентов составляли 5 нМ АТФазы-SnAC BRM, 85 мкМ АТФ и 2 нМ плазмиды pCMV-dR8.91. Реакционную смесь с АТФазой инкубировали при к. т. в течение 60 мин. Добавляли 3 мкл реагента ADP-Glo для остановки реакции и ее инкубировали в течение 30 мин. при к. т. Добавляли 3 мкл реагента для обнаружения киназ в планшет для анализа, который инкубировали в течение 90 мин. при к. т. Планшеты считывали с помощью многоканального считывающего устройства 2103 Envision с применением сверхчувствительной люминесцентной детекции. Значения IC₅₀ определяли по средним значениям точек данных из двух повторностей с помощью нелинейного регрессионного анализа зависимости значений процента ингибирования от концентрации соединения.

Анализ ингибирования АТФазы BRG1

I. Выделение рекомбинантного домена АТФазы BRG1

A. Клонирование BRG1(658-1361)-His₆ в pDEST8

Конструкцию BRG1(658-1361)-His₆ для экспрессии в клетках насекомых субклонировали из полноразмерной плазмиды BRG1, pDONR221-BRG1-His₆ (OPS7173), с помощью ПЦР следующим образом. ATTB-фланкированный ПЦР-фрагмент, кодирующий BRG1(658-1361)-His₆, получали с применением следующих праймеров: прямой, ATTB1 BRG1(658-x) 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGA

AGAAAGTGGCTCAGAAGAAGAGGAAG (SEQ ID NO: 5); обратный, BRG1(x-1361)HISstpATTB2rev, 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTGATGATGATGATGATGCTCCTCGATGGCCTTGAGCCACTGC (SEQ ID NO: 6). Данный ПЦР-фрагмент повторно объединяли в вектор pDEST8 с применением метода Gateway® в соответствии с протоколом производителя (Life Technologies). Вставку подтверждали путем секвенирования и вводили в базу данных OPS (OPS8023), после чего переходили к получению бакмиды.

MEESGSEEEE EEEEEEQPQA AQPPTLPVEE KKKIPDPDSD DVSEVDARHI IENAKQDVDD EYGVSQALAR GLQSYYAVAH AVTERVDKQS ALMVNGVLKQ YQIKGLEWLV SLYNNNLNGI LADEMGLGKT IQTIALITYL MEHKRINGPF LIIVPLSTLS NWAYEFDKWA PSVVKVSYKG SPAARRAFVP QLRSGKFNVL LTTYEYIIKD KHILAKIRWK YMIVDEGHRM KNHHCKLTQV LNTHYVAPRR LLLTGTPLQN KLPELWALLN FLLPTIFKSC STFEQWFNAP FAMTGEKVDL NEEETILIIR RLHKVLRPFL LRRLKKEVEA QLPEKVEYVI KCDMSALQRV LYRHMQAKGV LLTDGSEKDK KGKGGTKTLM NTIMQLRKIC NHPYMFQHIE ESFSEHLGFT GGIVQGLDLY RASGKFELLD RILPKLRATN HKVLLFCQMT SLMTIMEDYF AYRGFKYLRL DGTTKAEDRG MLLKTFNEPG SEYFIFLLST RAGGLGLNLQ SADTVIIFDS DWNPHQDLQA QDRAHRIGQQ NEVRVLRLCT VNSVEEKILA AAKYKLNVDQ KVIQAGMFDQ KSSSHERRAF LQAILEHEEQ DEEEDEVPDD ETVNQMIARH EEEFDLFMRM DLDRRREEAR NPKRKPRLME EDELPSWIIK DDAEVERLTC EEEEEKMFGR GSRHRKEVDY SDSLTEKQWL KAIEEHHHHH H (SEQ ID NO: 7)

B. Экспрессия BRG1(658-1361)-His₆

Рекомбинантный вектор, полученный выше, применяли для создания рекомбинантной бакмиды путем трансформирования в клетках DH10Bac с применением стандартных протоколов, подробно описанных производителем (Life Technologies). Большой титр вируса P3 получали путем осуществления трансфекции бакмиды в клетки Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) и амплификации вируса с применением стандартных способов, подробно описанных Life Technologies. Экспрессировали BRG1 (658-1361)-His₆ из клеток Sf9 на логарифмической фазе роста (1,5-3,9 × 10⁶ клеток/мл) при концентрации 15 вирусов/клетка. Обеспечивали развитие инфекции в качающемся инкубаторе при 27°C и собирали через три дня после заражения после того, как жизнеспособность клеток падала до 80%, при этом повышение общего диаметра клеток соответствовало заражению. Клетки собирали при 4000 g в течение 20 мин., подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения.

C. Очистка BRG1(658-1361)-His₆

Обеспечивали лизис клеток Sf9, экспрессирующих рекомбинантный BRG1(658-1361)-His₆, в 50 мМ Трис (8,0), 300 мМ NaCl, 5% глицерина и 1 мМ TCEP, дополненном смесью ингибиторов протеаз (Roche cOmplete), с применением 7,5 мл буфера для лизиса на грамм пасты клеток. После оттаивания обеспечивали лизис клеток, их гомогенизировали и затем очищали в роторе JA25.50 при 50000 g в течение 30 мин. с удалением нерастворимого материала. Очищенный лизат наносили на колонку His-Trap HP объемом 5 мл (GE Healthcare Life Sciences), тщательно промывали буфером для лизиса без ингибиторов протеаз, дополненным 20 мМ имидазола. Связанный белок элюировали при градиенте на протяжении десяти объемов колонки против буфера для лизиса, дополненного 250 мМ имидазола. Фракции, содержащие BRG1(658-1361)-His₆, объединяли и разбавляли до тех пор, пока проводимость не достигла приблизительно 6 мСм/см (~60 мМ NaCl), с применением 50 мМ Трис pH 8,0, 5% глицерина и 1 мМ TCEP, пропускали через фильтр 0,2 мкм и непосредственно загружали в колонку HiTrap Q HP объемом 5 мл (GE Health Biosciences), ранее откалиброванную в 50 мМ Трис (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 5% глицерина и 1 мМ TCEP. После захватывания связанный белок оценивали против того же буфера, дополненного 1 М NaCl. Фракции, содержащие BRG1(658-1361)-His₆, объединяли и загружали в эксклюзионную колонку S200 размера 16/60, откалиброванную в 50 мМ Трис (8,0), 200 мМ NaCl, 5% глицерина и 1 мМ TCEP. Очищенную конструкцию концентрировали до концентрации, составляющей от 1 до 2,5 мг/мл, подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения в последующих анализах.

Активность в отношении ингибирования АТФазы BRG1

Активность ингибирования АТФазы соединением в отношении АТФазы-SnAC Brg1 (658-1361) измеряли с помощью набора для анализа ADP-Glo от Promega (V6930). Переносили 120 нл соединения в 100% DMSO в белый 384-луночный титрационный микропланшет для анализа с применением ATS Acoustic Transfer System от EDC Biosystems. Все последующие добавления реагентов проводили с применением многорежимного дозатора MultiFlo FX. Буфер для анализа состоял из 20 мМ HEPES pH 7,5, 1 мМ MgCl₂, 20 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0,01% BSA, 0,005% Tween 20. В планшет для анализа добавляли 4 мкл 7,5 нМ АТФазы-SnAC Brg1 в буфере для анализа и инкубировали с соединением при к. т. в течение 5 мин. В планшет для анализа добавляли 2 мкл 195 мкм АТФ и 6 нМ плазмиды pCMV-dR8.91 в буфере для анализа для инициирования начала реакции. Конечные значения концентрации реагентов составляли 5 нМ АТФазы-SnAC Brg1, 65 мкМ АТФ и 2 нМ плазмиды pCMV-dR8.91. Реакционную смесь с АТФазой инкубировали при к. т. в течение 60 мин. Добавляли 3 мкл реагента ADP-Glo для остановки реакции и ее инкубировали в течение 30 мин. при к. т. Добавляли 3 мкл реагента для обнаружения киназ в планшет для анализа, который инкубировали в течение 90 мин. при к. т. Планшеты считывали с помощью многоканального считывающего устройства 2103 Envision с применением сверхчувствительной люминесцентной детекции. Значения IC₅₀ определяли по средним значениям точек данных из двух повторностей с помощью нелинейного регрессионного анализа зависимости значений процента ингибирования от концентрации соединения.

Плазмида pCMV-dR8.91, применяемая для анализов ингибирования АТФазы BRM/BRG1

Плазмидную матрицу pCMV-dR8.91 (см. последовательность ниже) размножают с применением химически компетентной E. coli One Shot Stbl3 (номер по каталогу C73C7303, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific), следуя протоколу трансформации, предоставленному с реагентом. Затем трансформированные бактериальные колонии отбирают на планшеты с LB-агаром, содержащие селекционную среду на основе антибиотика ампициллина/карбенициллина (номер по каталогу L1010, Teknova). Колонии бактерий выращивают в жидком LB-бульоне (номер по каталогу 10855001, Invitrogen), содержащем ампициллин в концентрации 100 микрограмм/мл и плазмидную ДНК, выделенную в соответствии с требуемым масштабом, в соответствии с протоколом производителя, предоставленным с наборами для выделения плазмид от Qiagen (Maxi prep, номер продукта Id 10063).

ttgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcgacggatcgatcccgtaataagcttcgaggtccgcggccggccgcgttgacgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattaccctatagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtgatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtgcatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacacataatccacctatcccagtaggagaaatctataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaggaaccctttagagactatgtagaccgattctataaaactctaagagccgagcaagcttcacaagaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaagactattttaaaagcattgggaccaggagcgacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtggggggacccggccataaagcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaatccagctaccataatgatacagaaaggcaattttaggaaccaaagaaagactgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacatagccaaaaattgcagggcccctaggaaaaagggctgttggaaatgtggaaaggaaggacaccaaatgaaagattgtactgagagacaggctaattttttagggaagatctggccttcccacaagggaaggccagggaattttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcttcaggtttggggaagagacaacaactccctctcagaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttagcttccctcagatcactctttggcagcgacccctcgtcacaataaagataggggggcaattaaaggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattagaagaaatgaatttgccaggaagatggaaaccaaaaatgatagggggaattggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcagatactcatagaaatctgcggacataaagctataggtacagtattagtaggacctacacctgtcaacataattggaagaaatctgttgactcagattggctgcactttaaattttcccattagtcctattgagactgtaccagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagaaatggaaaaggaaggaaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagatttctgggaagttcaattaggaataccacatcctgcagggttaaaacagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggcgatgcatatttttcagttcccttagataaagacttcaggaagtatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccagtgtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagtcatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggaactgagacaacatctgttgaggtggggatttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattcctttggatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaggacagctggactgtcaatgacatacagaaattagtgggaaaattgaattgggcaagtcagatttatgcagggattaaagtaaggcaattatgtaaacttcttaggggaaccaaagcactaacagaagtagtaccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagggagattctaaaagaaccggtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaagtatgcaagaatgaagggtgcccacactaatgatgtgaaacaattaacagaggcagtacaaaaaatagccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaattacccatacaaaaggaaacatgggaagcatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgtcaatacccctcccttagtgaagttatggtaccagttagagaaagaacccataataggagcagaaactttctatgtagatggggcagccaatagggaaactaaattaggaaaagcaggatatgtaactgacagaggaagacaaaaagttgtccccctaacggacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaattcatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtgacagactcacaatatgcattgggaatcattcaagcacaaccagataagagtgaatcagagttagtcagtcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaagtctacctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattggtcagtgctggaatcaggaaagtactatttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctagattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacataaaagtagtgccaagaagaaaagcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggattaacacatggaattctgcaacaactgctgtttatccatttcagaattgggtgtcgacatagcagaataggcgttactcgacagaggagagcaagaaatggagccagtagatcctagactagagccctggaagcatccaggaagtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctattgtaaaaagtgttgctttcattgccaagtttgtttcatgacaaaagccttaggcatctcctatggcaggaagaagcggagacagcgacgaagagctcatcagaacagtcagactcatcaagcttctctatcaaagcagtaagtagtacatgtaatgcaacctataatagtagcaatagtagcattagtagtagcaataataatagcaatagttgtgtggtccatagtaatcatagaatataggaaaatggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatccttggcacttatctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtaacgaggattgtggaacttctgggacgcagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctcctacaatattggagtcaggagctaaagaatagtgctgttagcttgctcaatgccacagccatagcagtagctgaggggacagatagggttatagaagtagtacaaggagcttgtagagctattcgccacatacctagaagaataagacagggcttggaaaggattttgctataagctcgaggccgccccggtgaccttcagaccttggcactggaggtggcccggcagaagcgcggcatcgtggatcagtgctgcaccagcatctgctctctctaccaactggagaactactgcaactaggcccaccactaccctgtccacccctctgcaatgaataaaacctttgaaagagcactacaagttgtgtgtacatgcgtgcatgtgcatatgtggtgcggggggaacatgagtggggctggctggagtggcgatgataagctgtcaaacatgagaattaattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagtctagaattaattccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcagggtcatcgctagccagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttggacacaagacaggcttgcgagatatgtttgagaataccactttatcccgcgtcagggagaggcagtgcgtaaaaagacgcggactcatgtgaaatactggtttttagtgcgccagatctctataatctcgcgcaacctattttcccctcgaacactttttaagccgtagataaacaggctgggacacttcacatgagcgaaaaatacatcgtcacctgggacatgttgcagatccatgcacgtaaactcgcaagccgactgatgccttctgaacaatggaaaggcattattgccgtaagccgtggcggtctgtaccgggtgcgttactggcgcgtgaactgggtattcgtcatgtcgataccgtttgtatttccagctacgatcacgacaaccagcgcgagcttaaagtgctgaaacgcgcagaaggcgatggcgaaggcttcatcgttattgatgacctggtggataccggtggtactgcggttgcgattcgtgaaatgtatccaaaagcgcactttgtcaccatcttcgcaaaaccggctggtcgtccgctggttgatgactatgttgttgatatcccgcaagatacctggattgaacagccgtgggatatgggcgtcgtattcgtcccgccaatctccggtcgctaatcttttcaacgcctggcactgccgggcgttgttctttttaacttcaggcgggttacaatagtttccagtaagtattctggaggctgcatccatgacacaggcaaacctgagcgaaaccctgttcaaaccccgctttaaacatcctgaaacctcgacgctagtccgccgctttaatcacggcgcacaaccgcctgtgcagtcggcccttgatggtaaaaccatccctcactggtatcgcatgattaaccgtctgatgtggatctggcgcggcattgacccacgcgaaatcctcgacgtccaggcacgtattgtgatgagcgatgccgaacgtaccgacgatgatttatacgatacggtgattggctaccgtggcggcaactggatttatgagtgggccccggatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaacccggatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttgggctgcaggaattaattcgagctcgcccgaca (SEQ ID NO: 8)

Данные в отношении ингибирующей активности иллюстративных соединений по настоящему изобретению из двух анализов, описанных выше (например, анализ ингибирования АТФазы BRM; и анализ ингибирования АТФазы BRG1), представлены в следующей таблице 1.

Таблица 1.

№ примера IC₅₀ BRM (мкМ) IC₅₀ BRG1 (мкМ) 1 0,005 0,006 2 0,033 0,03 3 0,010 0,010 4 <0,005 <0,005 5 <0,005 <0,005 6 <0,005 <0,005 7 <0,005 <0,005 8 0,09 0,019

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NOVARTIS AG

<120> СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МОЧЕВИНЫ И КОМПОЗИЦИИ НА ИХ ОСНОВЕ В КАЧЕСТВЕ

ИНГИБИТОРОВ АТФАЗЫ SMARCA2/BRM

<130> PAT057524-US-PSP

<140>

<141>

<160> 8

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая 10xHis метка

<400> 1

His His His His His His His His His His

1. 5 10

<210> 2

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер

<400> 2

gaccgaacta gtatggcttc tcaccaccat 30

<210> 3

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер

<400> 3

agcgttaagc ttttaatcct cgatggcgcg 30

<210> 4

<211> 852

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 4

Met Ala Ser His His His His His His His His His His Ala Gln His

1. 5 10 15

Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe

20 25 30

Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala

35 40 45

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

50 55 60

Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn

65 70 75 80

Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu

85 90 95

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys

100 105 110

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

115 120 125

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Glu Glu Ser

145 150 155 160

Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Ser Arg Gln

165 170 175

Glu Thr Glu Glu Lys Ile Leu Leu Asp Pro Asn Ser Glu Glu Val Ser

180 185 190

Glu Lys Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Ala Lys Gln Asp Val Asp

195 200 205

Asp Glu Tyr Ser Met Gln Tyr Ser Ala Arg Gly Ser Gln Ser Tyr Tyr

210 215 220

Thr Val Ala His Ala Ile Ser Glu Arg Val Glu Lys Gln Ser Ala Leu

225 230 235 240

Leu Ile Asn Gly Thr Leu Lys His Tyr Gln Leu Gln Gly Leu Glu Trp

245 250 255

Met Val Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu

260 265 270

Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr Leu

275 280 285

Met Glu His Lys Arg Leu Asn Gly Pro Tyr Leu Ile Ile Val Pro Leu

290 295 300

Ser Thr Leu Ser Asn Trp Thr Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro Ser

305 310 315 320

Val Val Lys Ile Ser Tyr Lys Gly Thr Pro Ala Met Arg Arg Ser Leu

325 330 335

Val Pro Gln Leu Arg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr

340 345 350

Glu Tyr Ile Ile Lys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp Lys

355 360 365

Tyr Met Ile Val Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys

370 375 380

Leu Thr Gln Val Leu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Ile Leu

385 390 395 400

Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu

405 410 415

Leu Asn Phe Leu Leu Pro Thr Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu

420 425 430

Gln Trp Phe Asn Ala Pro Phe Ala Met Thr Gly Glu Arg Val Asp Leu

435 440 445

Asn Glu Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu

450 455 460

Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln Leu

465 470 475 480

Pro Glu Lys Val Glu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu Gln

485 490 495

Lys Ile Leu Tyr Arg His Met Gln Ala Lys Gly Ile Leu Leu Thr Asp

500 505 510

Gly Ser Glu Lys Asp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Ala Lys Thr Leu Met

515 520 525

Asn Thr Ile Met Gln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met Phe

530 535 540

Gln His Ile Glu Glu Ser Phe Ala Glu His Leu Gly Tyr Ser Asn Gly

545 550 555 560

Val Ile Asn Gly Ala Glu Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu Leu

565 570 575

Leu Asp Arg Ile Leu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Arg Val Leu

580 585 590

Leu Phe Cys Gln Met Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Phe

595 600 605

Ala Phe Arg Asn Phe Leu Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys Ser

610 615 620

Glu Asp Arg Ala Ala Leu Leu Lys Lys Phe Asn Glu Pro Gly Ser Gln

625 630 635 640

Tyr Phe Ile Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn

645 650 655

Leu Gln Ala Ala Asp Thr Val Val Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro

660 665 670

His Gln Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln

675 680 685

Asn Glu Val Arg Val Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu Glu

690 695 700

Lys Ile Leu Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Asn Val Asp Gln Lys Val

705 710 715 720

Ile Gln Ala Gly Met Phe Asp Gln Lys Ser Ser Ser His Glu Arg Arg

725 730 735

Ala Phe Leu Gln Ala Ile Leu Glu His Glu Glu Glu Asn Glu Glu Glu

740 745 750

Asp Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Leu Asn Gln Met Ile Ala Arg Arg

755 760 765

Glu Glu Glu Phe Asp Leu Phe Met Arg Met Asp Met Asp Arg Arg Arg

770 775 780

Glu Asp Ala Arg Asn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu Asp

785 790 795 800

Glu Leu Pro Trp Ile Ile Lys Asp Asp Ala Glu Val Glu Arg Leu Thr

805 810 815

Cys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Ile Phe Gly Arg Gly Ser Arg Gln Arg

820 825 830

Arg Asp Val Asp Tyr Ser Asp Ala Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu Arg

835 840 845

Ala Ile Glu Asp

850

<210> 5

<211> 77

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgg aagaaagtgg 60

ctcagaagaa gaggaag 77

<210> 6

<211> 76

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagtgatga tgatgatgat gctcctcgat 60

ggccttgagc cactgc 76

<210> 7

<211> 711

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 7

Met Glu Glu Ser Gly Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Ala Gln Pro Pro Thr Leu Pro Val Glu Glu Lys Lys

20 25 30

Lys Ile Pro Asp Pro Asp Ser Asp Asp Val Ser Glu Val Asp Ala Arg

35 40 45

His Ile Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Val Asp Asp Glu Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Gln Ala Leu Ala Arg Gly Leu Gln Ser Tyr Tyr Ala Val Ala His

65 70 75 80

Ala Val Thr Glu Arg Val Asp Lys Gln Ser Ala Leu Met Val Asn Gly

85 90 95

Val Leu Lys Gln Tyr Gln Ile Lys Gly Leu Glu Trp Leu Val Ser Leu

100 105 110

Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly

115 120 125

Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr Leu Met Glu His Lys

130 135 140

Arg Ile Asn Gly Pro Phe Leu Ile Ile Val Pro Leu Ser Thr Leu Ser

145 150 155 160

Asn Trp Ala Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro Ser Val Val Lys Val

165 170 175

Ser Tyr Lys Gly Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ala Phe Val Pro Gln Leu

180 185 190

Arg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu Tyr Ile Ile

195 200 205

Lys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Met Ile Val

210 215 220

Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu Thr Gln Val

225 230 235 240

Leu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Leu Leu Leu Thr Gly Thr

245 250 255

Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe Leu

260 265 270

Leu Pro Thr Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu Gln Trp Phe Asn

275 280 285

Ala Pro Phe Ala Met Thr Gly Glu Lys Val Asp Leu Asn Glu Glu Glu

290 295 300

Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu

305 310 315 320

Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ala Gln Leu Pro Glu Lys Val

325 330 335

Glu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu Gln Arg Val Leu Tyr

340 345 350

Arg His Met Gln Ala Lys Gly Val Leu Leu Thr Asp Gly Ser Glu Lys

355 360 365

Asp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Thr Lys Thr Leu Met Asn Thr Ile Met

370 375 380

Gln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met Phe Gln His Ile Glu

385 390 395 400

Glu Ser Phe Ser Glu His Leu Gly Phe Thr Gly Gly Ile Val Gln Gly

405 410 415

Leu Asp Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp Arg Ile

420 425 430

Leu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Lys Val Leu Leu Phe Cys Gln

435 440 445

Met Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Phe Ala Tyr Arg Gly

450 455 460

Phe Lys Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys Ala Glu Asp Arg Gly

465 470 475 480

Met Leu Leu Lys Thr Phe Asn Glu Pro Gly Ser Glu Tyr Phe Ile Phe

485 490 495

Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Ser Ala

500 505 510

Asp Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Gln Asp Leu

515 520 525

Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln Asn Glu Val Arg

530 535 540

Val Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu Glu Lys Ile Leu Ala

545 550 555 560

Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Asn Val Asp Gln Lys Val Ile Gln Ala Gly

565 570 575

Met Phe Asp Gln Lys Ser Ser Ser His Glu Arg Arg Ala Phe Leu Gln

580 585 590

Ala Ile Leu Glu His Glu Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Val Pro

595 600 605

Asp Asp Glu Thr Val Asn Gln Met Ile Ala Arg His Glu Glu Glu Phe

610 615 620

Asp Leu Phe Met Arg Met Asp Leu Asp Arg Arg Arg Glu Glu Ala Arg

625 630 635 640

Asn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu Asp Glu Leu Pro Ser

645 650 655

Trp Ile Ile Lys Asp Asp Ala Glu Val Glu Arg Leu Thr Cys Glu Glu

660 665 670

Glu Glu Glu Lys Met Phe Gly Arg Gly Ser Arg His Arg Lys Glu Val

675 680 685

Asp Tyr Ser Asp Ser Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu Lys Ala Ile Glu

690 695 700

Glu His His His His His His

705 710

<210> 8

<211> 12150

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 8

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 60

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 120

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 180

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 240

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 300

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 360

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 420

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 480

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 540

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 600

cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag 660

cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag 720

taccgcctat agagtctata ggcccacccc cttggcttct tatgcgacgg atcgatcccg 780

taataagctt cgaggtccgc ggccggccgc gttgacgcgc acggcaagag gcgaggggcg 840

gcgactggtg agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa ttagatcgat 900

gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 960

gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 1020

gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 1080

gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 1140

acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag aaaaaagcac 1200

agcaagcagc agctgacaca ggacacagca atcaggtcag ccaaaattac cctatagtgc 1260

agaacatcca ggggcaaatg gtacatcagg ccatatcacc tagaacttta aatgcatggg 1320

taaaagtagt agaagagaag gctttcagcc cagaagtgat acccatgttt tcagcattat 1380

cagaaggagc caccccacaa gatttaaaca ccatgctaaa cacagtgggg ggacatcaag 1440

cagccatgca aatgttaaaa gagaccatca atgaggaagc tgcagaatgg gatagagtgc 1500

atccagtgca tgcagggcct attgcaccag gccagatgag agaaccaagg ggaagtgaca 1560

tagcaggaac tactagtacc cttcaggaac aaataggatg gatgacacat aatccaccta 1620

tcccagtagg agaaatctat aaaagatgga taatcctggg attaaataaa atagtaagaa 1680

tgtatagccc taccagcatt ctggacataa gacaaggacc aaaggaaccc tttagagact 1740

atgtagaccg attctataaa actctaagag ccgagcaagc ttcacaagag gtaaaaaatt 1800

ggatgacaga aaccttgttg gtccaaaatg cgaacccaga ttgtaagact attttaaaag 1860

cattgggacc aggagcgaca ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga gtggggggac 1920

ccggccataa agcaagagtt ttggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca 1980

taatgataca gaaaggcaat tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg 2040

gcaaagaagg gcacatagcc aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat 2100

gtggaaagga aggacaccaa atgaaagatt gtactgagag acaggctaat tttttaggga 2160

agatctggcc ttcccacaag ggaaggccag ggaattttct tcagagcaga ccagagccaa 2220

cagccccacc agaagagagc ttcaggtttg gggaagagac aacaactccc tctcagaagc 2280

aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt tagcttccct cagatcactc tttggcagcg 2340

acccctcgtc acaataaaga taggggggca attaaaggaa gctctattag atacaggagc 2400

agatgataca gtattagaag aaatgaattt gccaggaaga tggaaaccaa aaatgatagg 2460

gggaattgga ggttttatca aagtaagaca gtatgatcag atactcatag aaatctgcgg 2520

acataaagct ataggtacag tattagtagg acctacacct gtcaacataa ttggaagaaa 2580

tctgttgact cagattggct gcactttaaa ttttcccatt agtcctattg agactgtacc 2640

agtaaaatta aagccaggaa tggatggccc aaaagttaaa caatggccat tgacagaaga 2700

aaaaataaaa gcattagtag aaatttgtac agaaatggaa aaggaaggaa aaatttcaaa 2760

aattgggcct gaaaatccat acaatactcc agtatttgcc ataaagaaaa aagacagtac 2820

taaatggaga aaattagtag atttcagaga acttaataag agaactcaag atttctggga 2880

agttcaatta ggaataccac atcctgcagg gttaaaacag aaaaaatcag taacagtact 2940

ggatgtgggc gatgcatatt tttcagttcc cttagataaa gacttcagga agtatactgc 3000

atttaccata cctagtataa acaatgagac accagggatt agatatcagt acaatgtgct 3060

tccacaggga tggaaaggat caccagcaat attccagtgt agcatgacaa aaatcttaga 3120

gccttttaga aaacaaaatc cagacatagt catctatcaa tacatggatg atttgtatgt 3180

aggatctgac ttagaaatag ggcagcatag aacaaaaata gaggaactga gacaacatct 3240

gttgaggtgg ggatttacca caccagacaa aaaacatcag aaagaacctc cattcctttg 3300

gatgggttat gaactccatc ctgataaatg gacagtacag cctatagtgc tgccagaaaa 3360

ggacagctgg actgtcaatg acatacagaa attagtggga aaattgaatt gggcaagtca 3420

gatttatgca gggattaaag taaggcaatt atgtaaactt cttaggggaa ccaaagcact 3480

aacagaagta gtaccactaa cagaagaagc agagctagaa ctggcagaaa acagggagat 3540

tctaaaagaa ccggtacatg gagtgtatta tgacccatca aaagacttaa tagcagaaat 3600

acagaagcag gggcaaggcc aatggacata tcaaatttat caagagccat ttaaaaatct 3660

gaaaacagga aagtatgcaa gaatgaaggg tgcccacact aatgatgtga aacaattaac 3720

agaggcagta caaaaaatag ccacagaaag catagtaata tggggaaaga ctcctaaatt 3780

taaattaccc atacaaaagg aaacatggga agcatggtgg acagagtatt ggcaagccac 3840

ctggattcct gagtgggagt ttgtcaatac ccctccctta gtgaagttat ggtaccagtt 3900

agagaaagaa cccataatag gagcagaaac tttctatgta gatggggcag ccaataggga 3960

aactaaatta ggaaaagcag gatatgtaac tgacagagga agacaaaaag ttgtccccct 4020

aacggacaca acaaatcaga agactgagtt acaagcaatt catctagctt tgcaggattc 4080

gggattagaa gtaaacatag tgacagactc acaatatgca ttgggaatca ttcaagcaca 4140

accagataag agtgaatcag agttagtcag tcaaataata gagcagttaa taaaaaagga 4200

aaaagtctac ctggcatggg taccagcaca caaaggaatt ggaggaaatg aacaagtaga 4260

taaattggtc agtgctggaa tcaggaaagt actattttta gatggaatag ataaggccca 4320

agaagaacat gagaaatatc acagtaattg gagagcaatg gctagtgatt ttaacctacc 4380

acctgtagta gcaaaagaaa tagtagccag ctgtgataaa tgtcagctaa aaggggaagc 4440

catgcatgga caagtagact gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga 4500

aggaaaagtt atcttggtag cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat 4560

tccagcagag acagggcaag aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc 4620

agtaaaaaca gtacatacag acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc 4680

ctgttggtgg gcggggatca agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg 4740

agtaatagaa tctatgaata aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc 4800

tgaacatctt aagacagcag tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg 4860

ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca 4920

aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga 4980

cagcagagat ccagtttgga aaggaccagc aaagctcctc tggaaaggtg aaggggcagt 5040

agtaatacaa gataatagtg acataaaagt agtgccaaga agaaaagcaa agatcatcag 5100

ggattatgga aaacagatgg caggtgatga ttgtgtggca agtagacagg atgaggatta 5160

acacatggaa ttctgcaaca actgctgttt atccatttca gaattgggtg tcgacatagc 5220

agaataggcg ttactcgaca gaggagagca agaaatggag ccagtagatc ctagactaga 5280

gccctggaag catccaggaa gtcagcctaa aactgcttgt accaattgct attgtaaaaa 5340

gtgttgcttt cattgccaag tttgtttcat gacaaaagcc ttaggcatct cctatggcag 5400

gaagaagcgg agacagcgac gaagagctca tcagaacagt cagactcatc aagcttctct 5460

atcaaagcag taagtagtac atgtaatgca acctataata gtagcaatag tagcattagt 5520

agtagcaata ataatagcaa tagttgtgtg gtccatagta atcatagaat ataggaaaat 5580

ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat 5640

ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa 5700

gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg 5760

gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat 5820

tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc 5880

atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg 5940

aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt 6000

gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga 6060

atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact 6120

ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag 6180

ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat 6240

tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta 6300

tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc 6360

cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca 6420

gatccattcg attagtgaac ggatccttgg cacttatctg ggacgatctg cggagcctgt 6480

gcctcttcag ctaccaccgc ttgagagact tactcttgat tgtaacgagg attgtggaac 6540

ttctgggacg cagggggtgg gaagccctca aatattggtg gaatctccta caatattgga 6600

gtcaggagct aaagaatagt gctgttagct tgctcaatgc cacagccata gcagtagctg 6660

aggggacaga tagggttata gaagtagtac aaggagcttg tagagctatt cgccacatac 6720

ctagaagaat aagacagggc ttggaaagga ttttgctata agctcgaggc cgccccggtg 6780

accttcagac cttggcactg gaggtggccc ggcagaagcg cggcatcgtg gatcagtgct 6840

gcaccagcat ctgctctctc taccaactgg agaactactg caactaggcc caccactacc 6900

ctgtccaccc ctctgcaatg aataaaacct ttgaaagagc actacaagtt gtgtgtacat 6960

gcgtgcatgt gcatatgtgg tgcgggggga acatgagtgg ggctggctgg agtggcgatg 7020

ataagctgtc aaacatgaga attaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 7080

ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagtc tagaattaat tccgtgtatt 7140

ctatagtgtc acctaaatcg tatgtgtatg atacataagg ttatgtatta attgtagccg 7200

cgttctaacg acaatatgta caagcctaat tgtgtagcat ctggcttact gaagcagacc 7260

ctatcatctc tctcgtaaac tgccgtcaga gtcggtttgg ttggacgaac cttctgagtt 7320

tctggtaacg ccgtcccgca cccggaaatg gtcagcgaac caatcagcag ggtcatcgct 7380

agccagatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt 7440

gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc 7500

atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc 7560

gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta 7620

ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaatggt gcactctcag 7680

tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga 7740

cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 7800

cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg 7860

cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc 7920

aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 7980

ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 8040

aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 8100

ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 8160

gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 8220

ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 8280

ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 8340

gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 8400

aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 8460

gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 8520

aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 8580

caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 8640

tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 8700

acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 8760

gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 8820

agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 8880

gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 8940

ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 9000

taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 9060

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 9120

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 9180

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 9240

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 9300

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 9360

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 9420

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 9480

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 9540

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 9600

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 9660

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 9720

tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 9780

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 9840

ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 9900

atgcagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 9960

agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 10020

tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 10080

cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 10140

ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 10200

cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct tggacacaag 10260

acaggcttgc gagatatgtt tgagaatacc actttatccc gcgtcaggga gaggcagtgc 10320

gtaaaaagac gcggactcat gtgaaatact ggtttttagt gcgccagatc tctataatct 10380

cgcgcaacct attttcccct cgaacacttt ttaagccgta gataaacagg ctgggacact 10440

tcacatgagc gaaaaataca tcgtcacctg ggacatgttg cagatccatg cacgtaaact 10500

cgcaagccga ctgatgcctt ctgaacaatg gaaaggcatt attgccgtaa gccgtggcgg 10560

tctgtaccgg gtgcgttact ggcgcgtgaa ctgggtattc gtcatgtcga taccgtttgt 10620

atttccagct acgatcacga caaccagcgc gagcttaaag tgctgaaacg cgcagaaggc 10680

gatggcgaag gcttcatcgt tattgatgac ctggtggata ccggtggtac tgcggttgcg 10740

attcgtgaaa tgtatccaaa agcgcacttt gtcaccatct tcgcaaaacc ggctggtcgt 10800

ccgctggttg atgactatgt tgttgatatc ccgcaagata cctggattga acagccgtgg 10860

gatatgggcg tcgtattcgt cccgccaatc tccggtcgct aatcttttca acgcctggca 10920

ctgccgggcg ttgttctttt taacttcagg cgggttacaa tagtttccag taagtattct 10980

ggaggctgca tccatgacac aggcaaacct gagcgaaacc ctgttcaaac cccgctttaa 11040

acatcctgaa acctcgacgc tagtccgccg ctttaatcac ggcgcacaac cgcctgtgca 11100

gtcggccctt gatggtaaaa ccatccctca ctggtatcgc atgattaacc gtctgatgtg 11160

gatctggcgc ggcattgacc cacgcgaaat cctcgacgtc caggcacgta ttgtgatgag 11220

cgatgccgaa cgtaccgacg atgatttata cgatacggtg attggctacc gtggcggcaa 11280

ctggatttat gagtgggccc cggatctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat 11340

aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa tttttaaccc 11400

ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag 11460

agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga 11520

ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt 11580

ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg 11640

aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc 11700

ccaaggactt tccttcagaa ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa 11760

ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa 11820

ttatggaaaa atattctgta acctttataa gtaggcataa cagttataat cataacatac 11880

tgttttttct tactccacac aggcatagag tgtctgctat taataactat gctcaaaaat 11940

tgtgtacctt tagcttttta atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg 12000

ccttgactag agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 12060

aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttggg 12120

ctgcaggaat taattcgagc tcgcccgaca 12150

<---

Изобретение относится к области органической химии, а именно к соединению или его фармацевтически приемлемой соли формулы I, где R¹ выбран из водорода, амино и гидрокси-замещенного C_1-2алкила; R² представляет собой водород; R³ выбран из C_1-2алкила и галоген-замещенного C_1-2алкила; R⁴ представляет собой водород; R⁵ выбран из водорода и галогена и R⁶ выбран из водорода и галогена. Также изобретение относится к конкретному соединению формулы I, фармацевтической композиции на основе соединения формулы I и способу лечения опосредованного BRM и/или опосредованного BRG1 нарушения или заболевания. Технический результат: эффективное лечение опосредованного BRM и/или опосредованного BRG1 нарушения или заболевания. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 пр.

1. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль формулы I

где R¹ выбран из водорода, амино и гидрокси-замещенного C_1-2алкила;

R² представляет собой водород;

R³ выбран из C_1-2алкила и галоген-замещенного C_1-2алкила;

R⁴ представляет собой водород;

R⁵ выбран из водорода и галогена и

R⁶ выбран из водорода и галогена.

2. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1,

где R¹ выбран из водорода, амино и гидроксиметила;

R² представляет собой водород;

R³ выбран из метила, дифторметила и трифторметила;

R⁴ представляет собой водород;

R⁵ выбран из водорода, хлора и фтора и

R⁶ выбран из водорода и фтора.

3. Соединение по п. 2 или его фармацевтически приемлемая соль, выбранные из:

4. Соединение, имеющее структуру

или его фармацевтически приемлемая соль.

5. Фармацевтическая композиция для лечения BRM-опосредованного и/или BRG1-опосредованного нарушения или заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

6. Способ лечения опосредованного BRM и/или опосредованного BRG1 нарушения или заболевания, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли.

7. Способ по п. 6, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRG1 и/или дефицитом BRM.

8. Способ по п. 6, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRG1 и/или мутацией BRM.

9. Способ по п. 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой солидную опухоль, лейкоз или лимфому.

10. Способ по п. 9, где указанное нарушение или заболевание выбрано из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы, увеальной меланомы, мелкоклеточной карциномы яичника (гиперкальциемического типа), рабдоидной опухоли яичника, плоскоклеточной карциномы кожи, глиомы, карциносаркомы матки, карциномы тела матки и эндометрия, серозной цистаденокарциномы яичников, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, первичной лимфомы центральной нервной системы, карциномы пищевода, рака мочевого пузыря, плазмацитоидного варианта рака мочевого пузыря, аденокарциномы желудка, аденокистозной карциномы, лимфосаркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, рака поджелудочной железы, колоректальной аденокарциномы, холангиокарциномы, саркомы, видов рака головы и шеи, видов рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластомы, T-клеточной лимфомы кожи, гепатоцеллюлярной карциномы печени, папиллярной почечно-клеточной карциномы почки, рака молочной железы, лимфомы из клеток мантийной зоны, карциномы желчного пузыря, видов рака половых клеток яичек, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, рака предстательной железы, детской саркомы Юинга, тимомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, непрозрачно-клеточной карциномы почки, феохромоцитомы и параганглиомы, видов рака щитовидной железы, злокачественной опухоли оболочек периферических нервов, нейроэндокринного рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы коры надпочечников, видов рака шейки матки и канала шейки матки, плоскоклеточной карциномы кожи, рака половых клеток яичек, глиобластомы, мультиформной глиобластомы, саркомы Юинга, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, нейробластомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, злокачественных рабдоидных опухолей, видов эпителиоидной саркомы, семейного шванноматоза, видов медуллярной карциномы почки, синовиальной саркомы и видов менингиомы.