[01] Настоящее изобретение испрашивает преимущество приоритета предварительной заявки на патент США №62/779400, поданной 13 декабря 2018 г.; предварительной заявки США №62/779406, поданной 13 декабря 2018 г., и предварительной заявки США №62/941220, поданной 27 ноября 2019 г. Все из вышеуказанных заявок включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[02] Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитела и лекарственного средства (ADC), содержащим модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, которые связывают опухолевый антиген-мишень человека. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам и композициям, применимым в лечении или диагностике видов рака, которые экспрессируют антиген-мишень и/или поддаются лечению путем нарушения сплайсинга РНК, а также к способам получения таких композиций.
[03] Большинство белок-кодирующих генов в геноме человека состоят из нескольких экзонов (кодирующих областей), которые разделены интронами (некодирующими областями). Экспрессия гена приводит к образованию единой матричной РНК-предшественника (pre-mRNA). Интронные последовательности впоследствии удаляются из pre-mRNA за счет процесса, называемого сплайсингом, который приводит к образованию зрелой матричной РНК (mRNA). Путем включения разных комбинаций экзонов альтернативный сплайсинг обуславливает образование mRNA, кодирующих различные изоформы белка.
[04] Сплайсинг РНК катализируется сплайсосомой, динамическим мультибелковым РНК-комплексом, состоящим из пяти малых ядерных РНК (snRNA U1, U2, U4, U5 и U6) и ассоциированных белков. Сплайсосома собирается на pre-mRNA для обеспечения динамического каскада из множественных взаимодействий РНК и белков, которые катализируют вырезание интронов и лигирование экзонов (Matera and Wang (2014) Nat Rev Mol Cell Biol. 15(2):108-21). Накапливающиеся сведения позволили установить связь заболеваний человека с дисрегуляцией сплайсинга РНК, что затрагивает множество генов (Scotti and Swanson (2016) Nat Rev Genet. 17(1):19-32).
[05] Сплайсосома представляет собой важную мишень в онкобиологии. В настоящее время несколько исследований зарегистрировали значительные изменения в профиле сплайсинга у раковых клеток, а также в факторах сплайсинга как таковых (Agrawal et al. (2018) Curr Opin Genet Dev. 48:67-74). Альтернативный сплайсинг может приводить к дифференциальному включению/исключению экзонов, сохранению интрона или использованию криптических сайтов сплайсинга (Seiler et al. (2018) Cell Rep. 23(1):282-296). В совокупности эти события лежат в основе функциональных изменений, которые могут вносить вклад в онкогенез или устойчивость к терапии (Siegfried and Karni (2018) Curr Opin Genet Dev. 48:16-21).
[06] Определенные природные продукты могут связывать комплекс сплайсосомы SF3b. Эти малые молекулы модулируют сплайсинг путем содействия сохранению интрона и/или пропуску экзона (Teng et al. (2017) Nat Commun. 8:15522). Например, было показано, что гербоксидиен, встречающийся в природе поликетид, выделенный из Streptomyces sp. A7847 (Isaac et al. (1992) J. Org. Chem. 57:7220-26), и его производные модулируют сплайсинг. См., например, Imaizumi et al. (2017) J. Antibiot. 70:675-79. Значительная часть полученных транскриптов содержит преждевременные стоп-кодоны, запускающие нонсенс-опосредованную деградацию mRNA (NMD). Кроме того, поскольку канонический сплайсинг нарушен, количество канонических транскриптов значительно снижено, что может отрицательно воздействовать на функцию и жизнеспособность клетки. В связи с этим модуляторы сплайсинга становятся перспективным классом лекарственных средств для лечения рака (Puthenveetil et al (2016) Bioconjugate Chem. 27:1880-8).
[07] Протоонкогенный рецептор-2 эпидермального фактора роста человека (HER2) кодирует трансмембранный тирозинкиназный рецептор, который входит в семейство рецепторов эпидермального фактора роста человека (EGFR) (King et al. (1985) Science 229:974-6). Сверхэкспрессия HER2 обеспечивает конститутивную активацию сигнальных путей фактора роста, таких как путь PI3K-AKT-mTOR, и тем самым выступает в качестве онкогенного фактора при нескольких типах рака, включая примерно 20% инвазивных карцином молочной железы (Slamon et al. (1989) Science 244:707-12; Gajria and Chandarlapaty (2011) Expert Rev Anticancer Ther. 11:263-75). С учетом того, что амплификация HER2 опосредует трансформированный фенотип, и поскольку экспрессия HER2 ограничена по большей части злокачественными клетками, HER2 представляет собой перспективный антиген для целенаправленного воздействия на определенные виды рака и/или доставки новых средств лечения рака (Parakh et al. (2017) Cancer Treat Rev. 59:1-21). Дополнительные антигены для целенаправленной доставки видов противораковой терапии включают без ограничения CD138 (также называемый синдекан-1) и рецептор 2 эфрина типа-A (EPHA2).
[08] CD138 представляет собой гепарансульфатный протеогликан клеточной поверхности, который является необходимым для поддержания морфологии клетки и ее взаимодействия с близлежащим микроокружением (Akl et al. (2015) Oncotarget 6(30):28693-715; Szatmári et al. (2015) Dis Markers 2015:796052). В целом, утрата экспрессии CD138 в клетках карциномы снижает адгезию клеток к внеклеточному матриксу и увеличивает подвижность клеток и инвазию (Teng et al. (2012) Matrix Biol. 31:3-16). Повышение экспрессии CD138 в строме также изменяет выработку фибронектина и организацию внеклеточного матрикса (Yang et al. (2011) Am J Pathol. 178:325-35). Дополнительно, повышение экспрессии CD138 в фибробластах стромы ассоциировано с ангиогенезом и прогрессированием рака (Maeda et al. (2006) Oncogene 25:1408-12). Экспрессия CD138 повышается во время развития B-клеток и его присутствие является характерным признаком плазматических клеток (Ribatti (2017) Immunol Lett. 188:64-7). Экспрессия CD138 сохраняется при множественной миеломе, злокачественном новообразовании из плазматических клеток. Следовательно, CD138 представляет собой привлекательный антиген для целенаправленного лечения нескольких видов рака и других гематологических злокачественных новообразований (Sherbenou et al. (2015) Blood Rev. 29(2):81-91; Wijdenes et al. (1996) Br J Haematol. 94(2):318-23).
[09] EPHA2 представляет собой трансмембранный гликопротеин, который обильно сверхэкспрессируется в нескольких линиях клеток, полученных из злокачественных раковых опухолей, и при поздних формах рака (Wykosky and Debinski (2008) Mol Cancer Ref. 6(12):1795-1806). Например, EPHA2 сильно сверхэкспрессируется в примерно 61% случаев опухоли у пациентов с GBM (Wykosky et al. (2008) Clin Cancer Res. 14:199-208), 76% случаев рака яичника (Thaker et al. (2004) Clin Cancer Res. 10:5145-50) и 85% случаев аденокарциномы предстательной железы (Zeng et al. (2003) Am J Pathol. 163:2271-6). Белок EPHA2 сверхэкспрессируется в высокой степени, если говорить о проценте опухолей пациентов и проценте клеток в пределах опухоли, и он представляет собой рецептор, локализованный в плазматической мембране, который может подвергаться интернализации при связывании с лигандом (Walker-Daniels et al. (2002) Mol Cancer Res. 1:79-87). Более того, экспрессия EPHA2 ассоциирована с неблагоприятным прогнозом, увеличением метастазирования и уменьшением выживания. Таким образом, вследствие его паттерна экспрессии, локализации и функциональной важности при определении исхода у пациентов с раком EPHA2 представляет собой другой привлекательный антиген для целенаправленной доставки новых видов противораковой терапии.
[10] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены, в частности, новые модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена с биологической активностью в отношении неопластических клеток. Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена можно применять по отдельности или в виде части ADC для замедления, подавления и/или обращения роста опухоли у млекопитающих, и они могут быть пригодными для лечения пациентов-людей, страдающих от рака. В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены новые конъюгаты антитела и лекарственного средства, в которых используются модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена.
[11] В различных вариантах осуществления настоящее изобретение более конкретно относится к соединениям, представляющим собой конъюгаты антитела и лекарственного средства (ADC), которые способны к связыванию и уничтожению неопластических клеток. В различных вариантах осуществления соединения, представляющие собой ADC, раскрытые в данном документе, содержат линкер, который присоединяет модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена к полноразмерному антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В различных вариантах осуществления соединения, представляющие собой ADC, также способны к интернализации в клетку-мишень после связывания.
[12] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства формулы (I): Ab-(L-H)p, где Ab представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку; H представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена; L представляет собой линкер, который ковалентно присоединяет Ab к H; и p представляет собой целое число от 1 до 15.
[13] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (I): 
(I), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
Y выбран из O, S, NR6 и CR6R7;
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
R4 выбран из водорода, C1-C6алкильных групп, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил) и -C(=O)-NR6R7;
R5 выбран из водорода, гидроксила, -CH2-OH, -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), -C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8, -O-C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8 и -NR6-C(=O)-NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил), и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[14] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (Ia): 
(Ia), или его фармацевтически приемлемую солю, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R9 выбран из C3-C8гетероциклильных групп;
R10 выбран из H и C1-C6алкильных групп,
где каждый из R9 и R10 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, -NH2, -NH-(C1-C3алкил) и -N-(C1-C3алкил)2, и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[15] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (Ib): 
(Ib), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R11 выбран из 
, 
и 
, где * обозначает точку присоединения R11 к остальной части соединения;
каждый из R12 и R13 независимо выбран из H и метила; и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[16] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (II): 
(II), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
X представляет собой гидроксил или NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8, -C(=O)-O-R8, -(C1-C6алкил)-O-C(=O)-R8 и -(C1-C6алкил)-NH-C(=O)-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0-1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил), и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[17] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (IIa): 
(II), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
Z выбран из NR9 и O;
R9 выбран из водорода и C1-C6алкильных групп;
каждый из R10 и R11 независимо выбран из водорода, галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп;
R12 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп, C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R9, R10, R11 и R12 независимо замещен 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп и C1-C3галогеналкильных групп;
t представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[18] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (IIb): 
(IIb), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R13 выбран из 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
, где * обозначает точку присоединения R13 к остальной части соединения;
каждый из R14 и R15 независимо выбран из водорода и метила; и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[19] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (III): 
(III), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8;
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп; и
R9 выбран из H, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
;
где каждый из R1, R2, R3, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил),
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена; и
где * обозначает точку присоединения R9 к остальной части соединения.
[20] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент является расщепляемым под действием фермента. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или линкер предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает валин-цитруллин ("Val-Cit" или "VC"). В некоторых других вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает валин-аланин ("Val-Ala" или "VA"). В некоторых других вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает глутаминовую кислоту-валин-цитруллин ("Glu-Val-Cit" или "EVC"). В некоторых других вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает аланин-аланин-аспарагин ("Ala-Ala-Asn" или "AAN").
[21] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает расщепляемый глюкуронидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый глюкуронидный фрагмент является расщепляемым под действием фермента. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый глюкуронидный фрагмент является расщепляемым под действием глюкуронидазы. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый глюкуронидный фрагмент является расщепляемым под действием β-глюкуронидазы.
[22] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает по меньшей мере одно спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено или линкер предусматривает полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. В некоторых вариантах осуществления PEG-фрагмент предусматривает -(PEG)m-, и m представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления m равняется 2. В некоторых других вариантах осуществления спейсерное звено или линкер предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления алкильный фрагмент предусматривает -(CH2)n-, и n представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления n равняется 2. В некоторых вариантах осуществления n равняется 5. В некоторых вариантах осуществления n равняется 6.
[23] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено присоединено к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством малеимидного (Mal) фрагмента ("Mal-спейсерное звено"). В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено является реакционноспособным в отношении остатка цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединено к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством остатка цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте.
[24] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает PEG-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC).
[25] В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к расщепляемому фрагменту в линкере. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент в линкере предусматривает расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Val-Cit, Val-Ala, Glu-Val-Cit или Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает PEG-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC).
[26] В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент в линкере непосредственно присоединен к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, или спейсерное звено присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления расщепление конъюгата обеспечивает высвобождение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена от антитела или антигенсвязывающего фрагмента и линкера. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено, присоединяющее расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, является саморасщепляемым.
[27] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено, присоединяющее расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает п-аминобензилоксикарбонил (pABC). В некоторых вариантах осуществления pABC присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент в линкере предусматривает расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Val-Cit, Val-Ala, Glu-Val-Cit или Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pABC. В некоторых других вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Glu-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Ala-Ala-Asn-pABC.
[28] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено, присоединяющее расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает п-аминобензил (pAB). В некоторых вариантах осуществления pAB присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент в линкере предусматривает расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент или аминокислотное звено предусматривает Val-Cit, Val-Ala, Glu-Val-Cit или Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pAB. В некоторых других вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pAB. В некоторых других вариантах осуществления линкер предусматривает Glu-Val-Cit-pAB. В некоторых других вариантах осуществления линкер предусматривает Ala-Ala-Asn-pAB.
[29] В различных вариантах осуществления линкер представляет собой нерасщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена из ADC высвобождается в результате разложения антитела или антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления линкер остается ковалентно ассоциированным с по меньшей мере одной аминокислотой антитела и лекарственным средством после интернализации в клетку-мишень и разложения в ней.
[30] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой нерасщепляемый линкер, предусматривающий по меньшей мере одно спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено или линкер предусматривает полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. В некоторых вариантах осуществления PEG-фрагмент предусматривает -(PEG)m-, и m представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления m равняется 2. В некоторых других вариантах осуществления спейсерное звено или линкер предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления алкильный фрагмент предусматривает -(CH2)n- или -(CH2)n-O-(CH2)n, и n представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления n равняется 2. В некоторых вариантах осуществления n равняется 5. В некоторых вариантах осуществления n равняется 6.
[31] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено в нерасщепляемом линкере присоединено к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством малеимидного (Mal) фрагмента ("Mal-спейсерное звено"). В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено является реакционноспособным в отношении остатка цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединено к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством остатка цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает PEG-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC) и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает MC-(PEG)2. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает MC-(PEG)2 и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает Mal-Hex. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает Mal-Hex и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает Mal-Et. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает Mal-Et и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает Mal-Et-O-Et. В некоторых вариантах осуществления линкер или Mal-спейсерное звено предусматривает Mal-Et-O-Et и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена.
[32] В некоторых вариантах осуществления Ab выбран из любой из последовательностей антитела или связывающего домена, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на HER2 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на CD138 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на EPHA2 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на MSLN и/или неопластическую клетку, экспрессирующую MSLN. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на FOLH1 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую FOLH1. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на CDH6 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую CDH6. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на CEACAM5 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на CFC1B и/или неопластическую клетку, экспрессирующую CFC1B. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на ENPP3 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую ENPP3. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на FOLR1 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую FOLR1. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на HAVCR1 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на KIT и/или неопластическую клетку, экспрессирующую KIT. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на MET и/или неопластическую клетку, экспрессирующую MET. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на MUC16 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую MUC16. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на SLC39A6 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на SLC44A4 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на STEAP1 и/или неопластическую клетку, экспрессирующую STEAP1. В некоторых вариантах осуществления Ab представляет собой последовательность антитела или связывающего домена, которая целенаправленно воздействует на другой раковый антиген.
[33] В некоторых вариантах осуществления L выбран из любого из линкеров, раскрытых в данном документе, или любой комбинации линкерных компонентов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер, предусматривающий MC-Val-Cit-pABC, Mal-(PEG)2-CO, MC-Val-Ala-pAB, MC-Val-Ala-pABC, MC-Val-Cit-pAB, Mal-Hex, Mal-Et или Mal-Et-O-Et. В некоторых вариантах осуществления линкер также может предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL10, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21, ADL22 или ADL23. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL12, ADL14 или ADL15. В некоторых вариантах осуществления линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23 может также предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL1 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL2 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL5 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL6 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL7 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL12 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL14 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL15 и может необязательно предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В различных вариантах осуществления ADC, описанных в данном документе, p равняется 1-10. В различных вариантах осуществления p равняется 2-8. В различных вариантах осуществления p равняется 4-8. В некоторых вариантах осуществления p равняется 4. В некоторых вариантах осуществления p равняется 8.
[34] В некоторых вариантах осуществления представлен пул ADC, в котором происходит произвольная конъюгация, и среднее значение p в пуле составляет от приблизительно 2 до приблизительно 8. В некоторых вариантах осуществления представлен пул ADC, в котором происходит произвольная конъюгация, и среднее значение p в пуле составляет от приблизительно 4 до приблизительно 8. В некоторых вариантах осуществления представлен пул ADC, в котором происходит произвольная конъюгация, и среднее значение p в пуле составляет приблизительно 4. В некоторых вариантах осуществления представлен пул ADC, в котором происходит произвольная конъюгация, и среднее значение p в пуле составляет приблизительно 8. В данном документе представлены композиции (например, фармацевтические композиции), содержащие множественные копии любого из описанных ADC, где средняя нагрузка лекарственным средством (среднее значение p) ADC в композиции составляет от приблизительно 3,5 до приблизительно 5,5 (например, приблизительно 4) или от приблизительно 7 до приблизительно 9 (например, приблизительно 8).
[35] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) из ADC целенаправленно воздействует на неопластическую клетку, полученную из гематологического злокачественного новообразования или солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на неопластическую клетку, полученную из гематологического злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза (например, острого миелоидного лейкоза), лимфомы и миеломы (например, множественной миеломы). В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на неопластическую клетку, полученную из солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака молочной железы (например, HER2-положительного рака молочной железы), рака желудка (например, аденокарциномы желудка), рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из HER2-положительного рака молочной железы, аденокарциномы желудка, рака предстательной железы и остеосаркомы.
[36] В различных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) из ADC представляет собой антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с HER2 и целенаправленно воздействует на неопластические клетки, экспрессирующие HER2 (т.е. ADC целенаправленно воздействует на неопластические клетки, экспрессирующие HER2). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC представляет собой интернализующееся антитело к HER2 или его интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент.
[37] В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 1 (HCDR1), SEQ ID NO: 2 (HCDR2) и SEQ ID NO: 3 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 4 (LCDR1), SEQ ID NO: 5 (LCDR2) и SEQ ID NO: 6 (LCDR3). В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент предусматривает каркасные последовательности человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа- или лямбда-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или антигенсвязывающий фрагмент конкурирует за связывание и/или связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO: 19 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO: 20.
[38] В различных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) из ADC представляет собой антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с CD138 и целенаправленно воздействует на неопластические клетки, экспрессирующие CD138 (т.е. ADC целенаправленно воздействует на неопластические клетки, экспрессирующие CD138). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC представляет собой интернализующееся антитело к CD138 или его интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент.
[39] В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) и SEQ ID NO: 9 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) и SEQ ID NO: 12 (LCDR3). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент предусматривает каркасные последовательности человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG2a мыши. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig мыши. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG2a человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа- или лямбда-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или антигенсвязывающий фрагмент конкурирует за связывание и/или связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO: 21 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO: 22.
[40] В различных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) из ADC представляет собой антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с EPHA2 и целенаправленно воздействует на неопластические клетки, экспрессирующие EPHA2 (т.е. ADC целенаправленно воздействует на неопластические клетки, экспрессирующие EPHA2). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC представляет собой интернализующееся антитело к EPHA2 или его интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент.
[41] В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO: 14 (HCDR2) и SEQ ID NO: 15 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 16 (LCDR1), SEQ ID NO: 17 (LCDR2) и SEQ ID NO: 18 (LCDR3). В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент предусматривает каркасные последовательности человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа- или лямбда-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или антигенсвязывающий фрагмент конкурирует за связывание и/или связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO: 23 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO: 24.
[42] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты соединения формулы (I): (I), или их фармацевтически приемлемая соль, где
Y выбран из O, S, NR6 и CR6R7;
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
R4 выбран из водорода, C1-C6алкильных групп, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил) и -C(=O)-NR6R7;
R5 выбран из водорода, гидроксила, -CH2-OH, -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), -C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8, -O-C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8 и -NR6-C(=O)-NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил).
[43] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (Ia): (Ia), или их фармацевтически приемлемая соль, где
R9 выбран из C3-C8гетероциклильных групп; и
R10 выбран из H и C1-C6алкильных групп,
где каждый из R9 и R10 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, -NH2, -NH-(C1-C3алкил) и -N-(C1-C3алкил)2.
[44] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (Ib): (Ib), или их фармацевтически приемлемая соль, где
R11 выбран из , и , где * обозначает точку присоединения R11 к остальной части соединения; и
каждый из R12 и R13 независимо выбран из H и метила.
[45] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (II): (II), или их фармацевтически приемлемая соль, где
X представляет собой NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8, -C(=O)-O-R8, -(C1-C6алкил)-O-C(=O)-R8 и -(C1-C6алкил)-NH-C(=O)-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил).
[46] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (IIa): (IIa), или их фармацевтически приемлемая соль, где
Z выбран из NR9 и O;
R9 выбран из водорода и C1-C6алкильных групп;
каждый из R10 и R11 независимо выбран из водорода, галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп;
R12 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп, C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R9, R10, R11 и R12 независимо замещен 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп и C1-C3галогеналкильных групп; и
t представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5 и 6.
[47] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (IIb): (IIb), или их фармацевтически приемлемая соль, где
R13 выбран из , , , , , , , , , и , где * обозначает точку присоединения R13 к остальной части соединения; и
каждый из R14 и R15 независимо выбран из водорода и метила.
[48] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (III): (III), или их фармацевтически приемлемая соль, где
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8;
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп; и
R9 выбран из H, , , , , , , , , и ;
где каждый из R1, R2, R3, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил); и
где * обозначает точку присоединения R9 к остальной части соединения.
[49] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение, выбранное из:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
,
и его фармацевтически приемлемые соли,
где L представляет собой линкер, который ковалентно присоединен к антителу.
[50] Также в различных вариантах осуществления в данном документе представлены пути терапевтического применения описанных соединений, представляющих собой ADC, соединений на основе гербоксидиена и композиций, например, для лечения неопластического нарушения, например, рака. В определенных аспектах в настоящем изобретении представлены способы лечения неопластического нарушения, например, рака, при котором экспрессируется антиген, на который целенаправленно воздействуют антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC, такой как HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 или STEAP1.
[51] В определенных аспектах настоящего изобретения представлены способы лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества любого из описанных ADC или композиций на их основе и/или применения соответствующей схемы лечения. В некоторых вариантах осуществления неопластическое нарушение представляет собой гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления неопластическое нарушение представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза, лимфомы и миеломы. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления неопластическое нарушение представляет собой солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака молочной железы (например, HER2-положительного рака молочной железы), рака желудка (например, аденокарциномы желудка), рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из HER2-положительного рака молочной железы, аденокарциномы желудка, рака предстательной железы и остеосаркомы.
[52] В некоторых вариантах осуществления лечение с помощью конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует неспецифическое уничтожение неопластических клеток, которые не экспрессируют антиген-мишень, но являются смежными с неопластическими клетками, которые экспрессируют антиген-мишень. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется одна или несколько неопластических клеток, которые экспрессируют антиген-мишень.
[53] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой HER2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), остеосаркомы или карциномы слюнных протоков, экспрессирующих HER2. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к HER2 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности.
[54] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CD138. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток множественной миеломы, экспрессирующих CD138. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к CD138 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности.
[55] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой EPHA2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, меланомы, рака толстой кишки или рака пищевода, экспрессирующих EPHA2. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к EPHA2 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности.
[56] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MSLN. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака яичника, рака шейки матки, рака поджелудочной железы или рака легкого (например, аденокарциномы легкого), экспрессирующих MSLN. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к MSLN при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[57] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FOLH1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих FOLH1. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к FOLH1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[58] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CDH6. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака почки, экспрессирующих CDH6. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к CDH6 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[59] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток колоректального рака, экспрессирующих CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к CEACAM5 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[60] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CFC1B. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака поджелудочной железы, экспрессирующих CFC1B. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к CFC1B при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[61] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой ENPP3. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака почки, экспрессирующих ENPP3. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к ENPP3 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[62] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FOLR1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака яичника, экспрессирующих FOLR1. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к FOLR1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[63] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака почки или рака пищевода, экспрессирующих HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к HAVCR1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[64] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой KIT. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака почки, экспрессирующих KIT. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к KIT при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[65] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MET. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака почки или рака пищевода, экспрессирующих MET. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к MET при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[66] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MUC16. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака яичника, рака шейки матки или рака молочной железы, экспрессирующих MUC16. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к MUC16 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[67] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака молочной железы или рака предстательной железы, экспрессирующих SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к SLC39A6 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[68] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к SLC44A4 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[69] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой STEAP1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток происходят из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих STEAP1. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью (a) антитела к STEAP1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к лечению с помощью модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[70] В других определенных аспектах настоящего изобретения представлены способы снижения или подавления роста опухоли у субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества любого из описанных ADC или композиций на их основе и/или применения соответствующей схемы лечения.
[71] В некоторых вариантах осуществления лечение с помощью конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует неспецифическое уничтожение неопластических опухолевых клеток, которые не экспрессируют антиген-мишень, но являются смежными с неопластическими клетками, которые экспрессируют антиген-мишень. В некоторых вариантах осуществления опухоль содержит одну или несколько неопластических клеток, которые экспрессируют антиген-мишень.
[72] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой HER2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), остеосаркомы или карциномы слюнных протоков, экспрессирующих HER2. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к HER2 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности.
[73] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CD138. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток множественной миеломы, экспрессирующих CD138. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к CD138 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности.
[74] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой EPHA2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, меланомы, рака толстой кишки или рака пищевода, экспрессирующих EPHA2. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к EPHA2 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена при введении его по отдельности.
[75] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MSLN. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака яичника, рака шейки матки, рака поджелудочной железы или рака легкого (например, аденокарциномы легкого), экспрессирующих MSLN. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к MSLN при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[76] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FOLH1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих FOLH1. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к FOLH1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[77] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CDH6. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки, экспрессирующих CDH6. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к CDH6 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[78] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток колоректального рака, экспрессирующих CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к CEACAM5 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[79] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CFC1B. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака поджелудочной железы, экспрессирующих CFC1B. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к CFC1B при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[80] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой ENPP3. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки, экспрессирующих ENPP3. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антител а к ENPP3 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[81] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FOLR1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака яичника, экспрессирующих FOLR1. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к FOLR1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[82] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки или рака пищевода, экспрессирующих HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к HAVCR1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[83] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой KIT. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки, экспрессирующих KIT. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к KIT при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[84] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MET. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки или рака пищевода, экспрессирующих MET. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к MET при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[85] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MUC16. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака яичника, рака шейки матки или рака молочной железы, экспрессирующих MUC16. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к MUC16 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[86] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака молочной железы или рака предстательной железы, экспрессирующих SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к SLC39A6 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[87] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к SLC44A4 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[88] В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой STEAP1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих STEAP1. В некоторых вариантах осуществления опухоль является резистентной или рефрактерной к лечению с помощью (a) антитела к STEAP1 при введении его по отдельности и/или (b) модулятора сплайсинга при введении его по отдельности.
[89] В еще одних аспектах настоящего изобретения представлены способы определения того, будет ли субъект, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, восприимчивым к лечению с помощью любого из описанных ADC или композиций путем получения биологического образца от субъекта и приведения биологического образца в контакт с ADC или композицией. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец опухоли. В некоторых вариантах осуществления образец опухоли представляет собой биоптат опухоли или образец крови. В некоторых вариантах осуществления образец крови выбран из крови, фракции крови или клетки, полученной из крови или фракции крови. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется одна или несколько неопластических клеток, которые экспрессируют антиген-мишень. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой HER2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), остеосаркомы или карциномы слюнных протоков, экспрессирующих HER2. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CD138. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток множественной миеломы, экспрессирующих CD138. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой EPHA2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, меланомы, рака толстой кишки или рака пищевода, экспрессирующих EPHA2. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MSLN. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака яичника, рака шейки матки, рака поджелудочной железы или рака легкого (например, аденокарциномы легкого), экспрессирующих MSLN. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FOLH1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих FOLH1. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CDH6. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки, экспрессирующих CDH6. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток колоректального рака, экспрессирующих CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой CFC1B. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака поджелудочной железы, экспрессирующих CFC1B. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой ENPP3. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки, экспрессирующих ENPP3. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FOLR1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака яичника, экспрессирующих FOLR1. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки или рака пищевода, экспрессирующих HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой KIT. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки, экспрессирующих KIT. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MET. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака почки или рака пищевода, экспрессирующих MET. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой MUC16. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака яичника, рака шейки матки или рака молочной железы, экспрессирующих MUC16. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака молочной железы или рака предстательной железы, экспрессирующих SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой STEAP1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько неопластических клеток получены из клеток рака предстательной железы, экспрессирующих STEAP1.
[90] В различных вариантах осуществления в данном документе дополнительно представлены фармацевтические композиции, содержащие ADC и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель и/или вспомогательное вещество. Также раскрыты способы получения описанных соединений, представляющих собой ADC, и композиций на их основе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[91] На фиг. 1A-1D показаны дозозависимые эффекты иллюстративных соединений, представляющих собой полезные нагрузки, в отношении жизнеспособности клеток рака молочной железы (HCC1954) и клеток рака желудка (NCI-N87) с амплификацией HER2. Клетки инкубировали с соединением в течение 72 часов (3 дня) или 144 часов (6 дней) и жизнеспособность определяли с помощью реагента CellTiter-Glo® 2.0. На фиг. 1A показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток HCC1954 после 72-часовой инкубации. На фиг. 1B показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток NCI-N87 после 72-часовой инкубации. На фиг. 1C показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток HCC1954 после 144-часовой инкубации. На фиг. 1D показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток NCI-N87 после 144-часовой инкубации. Данные представлены в виде среднего значения ± SD.
[92] На фиг. 2A и фиг. 2B показаны результаты анализа сплайсинга SLC25A19 в клетках рака молочной железы (HCC1954) (фиг. 2A) и клетках рака желудка (NCI-N87) с амплификацией HER2 (фиг. 2B). Клетки инкубировали с соединениями в течение 6 часов и сплайсинг транскрипта SLC25A19 измеряли с помощью реакции qPCR в реальном времени с применением набора специфических праймеров-зондов Taqman. Ось y представляет собой процент (%) ответа по сравнению с контролем DMSO (0,1%). Данные представлены в виде среднего значения ± SD.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[93] Раскрытые композиции и способы можно легче понять, если обратиться к следующему подробному описанию.
[94] На всем протяжении данного текста описания относятся к композициям и способам применения композиций. Если в настоящем изобретении описывается или заявляется признак или вариант осуществления, ассоциированные с композицией, такие признак или вариант осуществления равным образом приложимы к способам применения композиции. Аналогичным образом, если в настоящем изобретении описывается или заявляется признак или вариант осуществления, ассоциированные со способом применения композиции, такие признак или вариант осуществления равным образом приложимы к композиции.
[95] Если представлен диапазон значений, он включает варианты осуществления с применением любого конкретного значения в пределах диапазона. Кроме того, ссылка на значения, изложенные в диапазоне, включает все без исключения значения в пределах данного диапазона. Все диапазоны включают свои предельные значения и являются комбинируемыми. Если значения выражены как приблизительные значения с применением предшествующего слова "приблизительно", будет понятно, что конкретное значение образует другой вариант осуществления. Ссылка на конкретное числовое значение включает по меньшей мере данное конкретное значение, если контекст явно не предусматривает иное. Применение "или" будет означать "и/или", если конкретный контекст его применения не предусматривает иное.
[96] Следует понимать, что определенные признаки раскрытых композиций и способов, которые для ясности описаны в данном документе в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть представлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки раскрытых композиций и способов которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть представлены по отдельности или в любой подкомбинации.
[97] Все ссылки, процитированные в данном документе, включены посредством ссылки для любой цели. Если ссылка и описание противоречат друг другу, описание будет иметь преимущественную силу.
Определения
[98] На всем протяжении настоящей заявки и формулы изобретения используются различные термины, связанные с аспектами настоящего описания. Если не указано иное, таким терминам присваивается их обычное значение из области техники. Другие специфически определяемые термины следует толковать в том смысле, который соответствует определениям, представленным в данном документе.
[99] При использовании в данном документе формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст явно не предусматривает иное.
[100] Термины "приблизительно" или "примерно" в контексте числовых значений и диапазонов означают значения или диапазоны, которые приблизительно равны описанным значениям или диапазонам или близки к ним, так что вариант осуществления можно осуществлять, как задумано, как, например, имеется требуемое количество нуклеиновых кислот или полипептидов в реакционной смеси, как очевидно специалисту в данной области техники на основании идей, содержащихся в данном документе. В некоторых вариантах осуществления "приблизительно" означает плюс или минус 10% от числового количества.
[101] Термины "конъюгат антитела и лекарственного средства" "конъюгат на основе антитела", "конъюгат", "иммуноконъюгат" и "ADC" используются взаимозаменяемо и означают одно или несколько терапевтических соединений (например, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена), которые связаны с одним или несколькими антителами или антигенсвязывающими фрагментами и определяются общей формулой: Ab-(L-H)p (формула I), где Ab = антитело или антигенсвязывающий фрагмент, L = линкерный фрагмент, H = модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (например, гербоксидиен или его производное), и p = количество фрагментов, представляющих собой лекарственное средство, на антитело или антигенсвязывающий фрагмент. ADC, содержащий модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, также может называться в данном документе более конкретно "антителом, загруженным модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена", или "SMLA". В ADC, содержащих модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, "p" означает количество модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, связанных с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления линкер L может включать расщепляемый фрагмент между антителом или антигенсвязывающим фрагментом и модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления линкер L может включать расщепляемый фрагмент, который может быть присоединен либо к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, либо к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, либо к ним обоим с помощью спейсерного(спейсерных) звена(звеньев). В некоторых вариантах осуществления, если спейсерное звено присоединяет расщепляемый фрагмент к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, то оно представляет собой саморасщепляемое спейсерное звено. В других вариантах осуществления линкер L не включает расщепляемый фрагмент, а представляет собой нерасщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер L может включать по меньшей мере одно спейсерное звено, которое может непосредственно присоединяться к антителу или антигенсвязывающему фрагменту и к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В данном документе описаны иллюстративные расщепляемые и нерасщепляемые линкеры, и приведены их примеры.
[102] Термин "антитело" используется в самом широком смысле для обозначения молекулы иммуноглобулина, которая распознает мишень, такую как белок, полипептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеуказанного, и специфически связывается с ней посредством по меньшей мере одного сайта распознавания антигена в пределах вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Тяжелая цепь антитела состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (VL) и константного домена легкой цепи (CL). Для целей данной заявки каждый зрелый вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит три определяющие комплементарность области (CDR1, CDR2 и CDR3) в пределах четырех каркасных областей (FR1, FR2, FR3 и FR4), расположенных от N-конца к C-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. "Антитело" может быть встречающимся в природе или созданным человеком, таким как моноклональные антитела, полученные с помощью традиционной гибридомной технологии. Термин "антитело" включает полноразмерные моноклональные антитела и полноразмерные поликлональные антитела, а также фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv и одноцепочечные антитела. Антитело может принадлежать к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или к их подклассам (например, изотипам IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Термин дополнительно охватывает антитела человека, химерные антитела, гуманизированные антитела и любую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, при условии, что она демонстрирует требуемую биологическую активность (например, связывает антиген-мишень, интернализуется в клетку, экспрессирующую антиген-мишень).
[103] Используемый в данном документе термин "моноклональное антитело" означает антитело, полученное из популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав популяции, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направлены против одного антигенного эпитопа. В отличие от этого, традиционные препараты (поликлональных) антител, как правило, включают большое разнообразие антител, направленных против (или специфических в отношении) разных эпитопов. Модификатор "моноклональный" указывает на характеристику антитела как полученного из практически однородной популяции антител и не должен рассматриваться как требующий получения антитела с помощью какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены посредством гибридомного способа, впервые описанного в Kohler et al. (1975) Nature 256:495, или могут быть получены посредством способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с применением, например, методик, описанных в Clackson et al. (1991) Nature 352:624-8, и Marks et al. (1991) J Mol Biol. 222:581-97.
[104] Моноклональные антитела, описанные в данном документе, в частности, включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они специфически связывают антиген-мишень и/или проявляют требуемую биологическую активность.
[105] Используемый в данном документе термин "антитело человека" означает антитело, продуцируемое человеком, или антитело, имеющее аминокислотную последовательность антитела, продуцируемого человеком.
[106] Используемый в данном документе термин "химерное антитело" означает антитела, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена от двух или более видов. В некоторых случаях вариабельные области обеих тяжелой и легкой цепей соответствуют вариабельным областям антител, полученных от одного вида с требуемой специфичностью, аффинностью и активностью, в то время как константные области гомологичны антителам, полученным от другого вида (например, человека), чтобы минимизировать иммунный ответ у последнего вида.
[107] Используемый в данном документе термин "гуманизированное антитело" означает формы антител, которые содержат последовательности из антител, отличных от антител человека (например, мыши), а также антител человека. Такие антитела представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека. В целом, гуманизированное антитело будет содержать практически весь из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из гипервариабельных петель соответствуют петлям иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека, а все или практически все из каркасных областей (FR) представляют собой каркасные области из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, часть константной области иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может быть дополнительно модифицировано посредством замены остатков в каркасной области Fv и/или в пределах замененных остатков, отличных от человеческих, для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности и/или активности антитела.
[108] Используемый в данном документе термин "антигенсвязывающий фрагмент" или "антигенсвязывающая часть" антитела означает один или несколько фрагментов антитела или белка, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 или STEAP1). Антигенсвязывающие фрагменты также могут сохранять способность к интернализации в клетку, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты также сохраняют иммунную эффекторную активность. Было показано, что фрагменты полноразмерного антитела способны выполнять антигенсвязывающую функцию полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий фрагмент" или "антигенсвязывающая часть" антитела включают: (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент, который содержит один вариабельный домен, например, VH-домен (см., например, Ward et al. (1989) Nature 341:544-6; и публикацию международной заявки № WO 1990/005144); и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv)). См., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-6; и Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci. USA 85:5879-83. Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающий фрагмент" или "антигенсвязывающая часть" антитела, и они известны из уровня техники как иллюстративный тип связывающего фрагмента, который может подвергаться интернализации в клетки после связывания (см., например, Zhu et al. (2010) 9:2131-41; He et al. (2010) J Nucl Med. 51:427-32; и Fitting et al. (2015) MAbs 7:390-402). В определенных вариантах осуществления молекулы scFv могут быть включены в слитый белок. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой бивалентные биспецифические антитела, у которых VH- и VL-домены экспрессируются в виде одной полипептидной цепи, но с применением линкера, который слишком короткий, чтобы позволить спаривание между двумя доменами в одной цепи, что, таким образом, заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci. USA 90:6444-8; и Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-3). Антигенсвязывающие фрагменты получают с применением традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, и связывающие фрагменты подвергают скринингу в отношении применимости (например, аффинности связывания, интернализации) так же, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие фрагменты можно получать путем расщепления интактного белка, например, с помощью протеазы или химического расщепления.
[109] "Интернализующиеся", при использовании в данном документе в отношении антитела или антигенсвязывающего фрагмента, означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые могут захватываться через липидную бислойную мембрану клетки во внутренний компартмент (т.е. "подвергаться интернализации") после связывания с клеткой, предпочтительно в компартмент клетки, в котором происходит разложение. Например, интернализующееся антитело к HER2 представляет собой антитело, которое может захватываться в клетку после связывания с HER2 на клеточной мембране. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, применяемые в ADC, раскрытых в данном документе, целенаправленно воздействуют на антиген клеточной поверхности (например, HER2) и представляют собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент (т.е. ADC транспортируется через клеточную мембрану после связывания антигена). В некоторых вариантах осуществления интернализующиеся антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывают рецептор на клеточной поверхности. Интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на рецептор на клеточной мембране, способны индуцировать опосредованный рецептором эндоцитоз. В некоторых вариантах осуществления интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент захватываются в клетку посредством опосредованного рецептором эндоцитоза.
[110] "Неинтернализующиеся", при использовании в данном документе в отношении антитела или антигенсвязывающего фрагмента, означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые остаются на клеточной поверхности после связывания с клеткой. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, применяемые в ADC, раскрытых в данном документе, целенаправленно воздействуют на антиген клеточной поверхности и представляют собой неинтернализующееся антитело или неинтернализующийся антигенсвязывающий фрагмент (т.е. ADC остается на клеточной поверхности и не транспортируется через клеточную мембрану после связывания антигена). В некоторых вариантах осуществления неинтернализующиеся антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывают неинтернализующийся рецептор или другой антиген клеточной поверхности. Иллюстративные неинтернализующиеся антигены клеточной поверхности включают без ограничения CA125 и CEA, и антитела, которые связываются с неинтернализующимися антигенами-мишенями, также известны из уровня техники (см., например, Bast et al. (1981) J Clin Invest. 68(5):1331-7; Scholler and Urban (2007) Biomark Med. 1(4):513-23; и Boudousq et al. (2013) PLoS One 8(7):e69613).
[111] Используемый в данном документе термин "рецептор 2 эпидермального фактора роста человека", "HER2" или "HER2/NEU", означает любую нативную форму HER2 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность HER2 (например, эталонную последовательность в UniProt: P04626; SEQ ID NO: 31), а также любую форму HER2 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты HER2 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций HER2 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). HER2 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[112] Термин "антитело к HER2" или "антитело, которое связывается с HER2", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с HER2, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с HER2. В патенте США №5821337, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные HER2-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к HER2. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. Трастузумаб (патент США №5821337; Molina et al. (2001) Cancer Res. 61(12):4744-9) представляет собой иллюстративное антитело к HER2 человека.
[113] Используемый в данном документе термин "синдекан-1", "SDC1" или "CD138" означает любую нативную форму CD138 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность CD138 (например, эталонную последовательность в UniProt: P18827; SEQ ID NO: 32), а также любую форму CD138 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты CD138 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций CD138 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). CD138 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[114] Термин "антитело к CD138" или "антитело, которое связывается с CD138", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с CD138, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с CD138. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. B-B4 (Tassone et al. (2004) Blood 104:3688-96) представляет собой иллюстративное антитело к CD138 человека.
[115] Используемый в данном документе термин "рецептор 2 эфрина типа-A" или "EPHA2" означает любую нативную форму EPHA2 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность EPHA2 (например, эталонную последовательность в UniProt: P29317; SEQ ID NO: 33), а также любую форму EPHA2 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты EPHA2 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций EPHA2 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). EPHA2 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[116] Термин "антитело к EPHA2" или "антитело, которое связывается с EPHA2", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с EPHA2, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с EPHA2. В WO 2007/030642, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные EPHA2-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к EPHA2. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. 1C1 (WO 2007/030642; Jackson et al. (2008) Cancer Res. 68(22): 9367-74) представляет собой иллюстративное антитело к EPHA2 человека.
[117] Используемый в данном документе термин "мезотелин" или "MSLN" означает любую нативную форму MSLN человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность MSLN (например, эталонную последовательность в UniProt: Q13421; SEQ ID NO: 94), а также любую форму MSLN человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты MSLN человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций MSLN человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). MSLN может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[118] Термин "антитело к MSLN" или "антитело, которое связывается с MSLN", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с MSLN, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с MSLN. В WO 2011/074621, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные MSLN-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к MSLN. В некоторых вариантах осуществления антитело к MSLN, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. 11-25, IC14-30, IC7-4, IC17-35 и 2-9 представляют собой иллюстративные антитела к MSLN человека.
[119] Используемый в данном документе термин "глутаматкарбоксипептидаза 2" или "FOLH1" означает любую нативную форму FOLH1 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность FOLH1 (например, эталонную последовательность в UniProt: Q04609; SEQ ID NO: 95), а также любую форму FOLH1 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты FOLH1 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций FOLH1 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). FOLH1 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[120] Термин "антитело к FOLH1" или "антитело, которое связывается с FOLH1", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с FOLH1, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с FOLH1. В WO 2019/012260 и WO 2017/212250, включенных в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные FOLH1-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к FOLH1. В некоторых вариантах осуществления антитело к FOLH1, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. J591 (деиммунизированное) представляет собой иллюстративное антитело к FOLH1 человека.
[121] Используемый в данном документе термин "кадгерин-6" или "CDH6" означает любую нативную форму CDH6 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность CDH6 (например, эталонную последовательность в UniProt: P55285; SEQ ID NO: 96), а также любую форму CDH6 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты CDH6 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций CDH6 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). CDH6 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[122] Термин "антитело к CDH6" или "антитело, которое связывается с CDH6", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с CDH6, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с CDH6. В WO 2018/185618, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные CDH6-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к CDH6. В некоторых вариантах осуществления антитело к CDH6, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[123] Используемый в данном документе термин "молекула 5 клеточной адгезии, родственная карциноэмбриональному антигену", или "CEACAM5", означает любую нативную форму CEACAM5 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность CEACAM5 (например, эталонную последовательность в UniProt: P06731; SEQ ID NO: 97), а также любую форму CEACAM5 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты CEACAM5 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций CEACAM5 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). CEACAM5 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[124] Термин "антитело к CEACAM5" или "антитело, которое связывается с CEACAM5", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с CEACAM5, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с CEACAM5. В US 2015/0125386, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные CEACAM5-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления антитело к CEACAM5, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. hMN14 представляет собой иллюстративное антитело к CEACAM5 человека.
[125] Используемый в данном документе термин "белок 1B семейства криптических белков" или "CFC1B" означает любую нативную форму CFC1B человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность CFC1B (например, эталонную последовательность в UniProt: P0CG36; SEQ ID NO: 98), а также любую форму CFC1B человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты CFC1B человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций CFC1B человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). CFC1B может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[126] Термин "антитело к CFC1B" или "антитело, которое связывается с CFC1B", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с CFC1B, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с CFC1B. В WO 2002/088170, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные CFC1B-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к CFC1B. В некоторых вариантах осуществления антитело к CFC1B, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[127] Используемый в данном документе термин "представитель 3 семейства эктонуклеотидпирофосфатаз/фосфодиэстераз" или "ENPP3" означает любую нативную форму ENPP3 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность ENPP3 (например, эталонную последовательность в UniProt: O14638; SEQ ID NO: 99), а также любую форму ENPP3 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты ENPP3 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций ENPP3 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). ENPP3 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[128] Термин "антитело к ENPP3" или "антитело, которое связывается с ENPP3", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с ENPP3, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с ENPP3. В Donate et al. ((2016) Clin Cancer Res. 22(8):1989-99), включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные ENPP3-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к ENPP3. В некоторых вариантах осуществления антитело к ENPP3, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[129] Используемый в данном документе термин "фолатный рецептор альфа" или "FOLR1" означает любую нативную форму FOLR1 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность FOLR1 (например, эталонную последовательность в UniProt: P15328; SEQ ID NO: 100), а также любую форму FOLR1 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты FOLR1 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций FOLR1 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). FOLR1 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[130] Термин "антитело к FOLR1" или "антитело, которое связывается с FOLR1", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с FOLR1, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с FOLR1. В WO 2005/080431 и Coney et al. ((1991) Cancer Res. 51(22):6125-32), включенных в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные FOLR1-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к FOLR1. В некоторых вариантах осуществления антитело к FOLR1, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела. Фарлетузумаб и MOv19 представляют собой иллюстративные антитела к FOLR1 человека.
[131] Используемый в данном документе термин "клеточный рецептор 1 вируса гепатита A" или "HAVCR1" означает любую нативную форму HAVCR1 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность HAVCR1 (например, эталонную последовательность в UniProt: Q96D42; SEQ ID NO: 101), а также любую форму HAVCR1 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты HAVCR1 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций HAVCR1 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). HAVCR1 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[132] Термин "антитело к HAVCR1" или "антитело, которое связывается с HAVCR1", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с HAVCR1, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с HAVCR1. В Thomas et al. ((2016) Mol Cancer Ther. 15(12):2946-54), включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные HAVCR1-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления антитело к HAVCR1, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[133] Используемый в данном документе термин "рецептор Kit фактора роста тучных/стволовых клеток" или "KIT" означает любую нативную форму KIT человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность KIT (например, эталонную последовательность в UniProt: P10721; SEQ ID NO: 102), а также любую форму KIT человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты KIT человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций KIT человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). KIT может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[134] Термин "антитело к KIT" или "антитело, которое связывается с KIT", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с KIT, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с KIT. В Shi et al. ((2016) Proc Natl Acad Sci USA 113(33):E4784-93) и Abrams et al. ((2018) Clin Cancer Res. 24(17):4297-308), включенных в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные KIT-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к KIT. В некоторых вариантах осуществления антитело к KIT, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[135] Используемый в данном документе термин "рецептор фактора роста гепатоцитов" или "MET" означает любую нативную форму MET человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность MET (например, эталонную последовательность в UniProt: P08581; SEQ ID NO: 103), а также любую форму MET человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты MET человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций MET человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). MET может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[136] Термин "антитело к MET" или "антитело, которое связывается с MET", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с MET, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с MET. В Yang et al. ((2019) Acta Pharmacol Sin.), включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные MET-связывающие последовательности, включающие иллюстративные последовательности антител к MET. В некоторых вариантах осуществления антитело к MET, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[137] Используемый в данном документе термин "муцин-16" или "MUC16" означает любую нативную форму MUC16 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность MUC16 (например, эталонную последовательность в UniProt: Q8WXI7; SEQ ID NO: 104), а также любую форму MUC16 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты MUC16 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций MUC16 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). MUC16 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[138] Термин "антитело к MUC16" или "антитело, которое связывается с MUC16", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с MUC16, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с MUC16. В Liu et al. ((2016) Ann Oncol. 27(11):2124-30), включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные MUC16-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к MUC16. В некоторых вариантах осуществления антитело к MUC16, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[139] Используемый в данном документе термин "транспортер цинка ZIP6" или "SLC39A6" означает любую нативную форму SLC39A6 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность SLC39A6 (например, эталонную последовательность в UniProt:Q13433; SEQ ID NO: 105), а также любую форму SLC39A6 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты SLC39A6 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций SLC39A6 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). SLC39A6 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[140] Термин "антитело к SLC39A6" или "антитело, которое связывается с SLC39A6", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с SLC39A6, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с SLC39A6. В Sussman et al. ((2014) Mol Cancer Ther. 13(12):2991-3000), включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные SLC39A6-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления антитело к SLC39A6, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[141] Используемый в данном документе термин "белок 4, подобный транспортеру холина", или "SLC44A4", означает любую нативную форму SLC44A4 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность SLC44A4 (например, эталонную последовательность в UniProt: Q53GD3; SEQ ID NO: 106), а также любую форму SLC44A4 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты SLC44A4 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций SLC44A4 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). SLC44A4 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[142] Термин "антитело к SLC44A4" или "антитело, которое связывается с SLC44A4", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с SLC44A4, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с SLC44A4. В Mattie et al. ((2016) Mol Cancer Ther. 15(11):2679-87), включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные SLC44A4-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления антитело к SLC44A4, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[143] Используемый в данном документе термин "металлоредуктаза STEAP1" или "STEAP1" означает любую нативную форму STEAP1 человека. Термин охватывает полноразмерную последовательность STEAP1 (например, эталонную последовательность в UniProt: Q9UHE8; SEQ ID NO: 107), а также любую форму STEAP1 человека, которая может возникать в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает функциональные варианты или фрагменты STEAP1 человека, включая без ограничения сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы, которые сохраняют одну или несколько биологических функций STEAP1 человека (т.е. охватываются варианты и фрагменты, если контекст не указывает на то, что термин используется для обозначения только белка дикого типа). STEAP1 может быть выделен из клеток человека или может быть получен рекомбинантным путем или с помощью способов синтеза.
[144] Термин "антитело к STEAP1" или "антитело, которое связывается с STEAP1", означает любую форму антитела или его фрагмента, которая связывается, например, специфически связывается, с STEAP1, и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и биологически функциональные фрагменты антител, при условии, что они связываются, например, специфически связываются, с STEAP1. В WO 2008/052187, включенном в данный документ посредством ссылки, представлены иллюстративные STEAP1-связывающие последовательности, включая иллюстративные последовательности антител к STEAP1. В некоторых вариантах осуществления антитело к STEAP1, применяемое в ADC, раскрытых в данном документе, представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся фрагмент антитела.
[145] Используемый в данном документе термин "специфический" "специфически связывает" или "связывается специфическим образом" означает реакцию связывания между антителом или антигенсвязывающим фрагментом (например, антителом к HER2) и антигеном-мишенью (например, HER2) в неоднородной популяции белков и других биологических молекул. Антитела можно тестировать в отношении специфичности связывания путем сравнения связывания с соответствующим антигеном со связыванием с нерелевантным антигеном или смесью антигенов при определенном наборе условий. Если антитело связывается с соответствующим антигеном с аффинностью, превышающей в по меньшей мере 2, 5, 7 и предпочтительно 10 или более раз аффинность к нерелевантному антигену или к смеси антигенов, то считается, что оно является специфическим. "Специфическое антитело" или "мишень-специфическое антитело" представляет собой антитело, которое связывается только с антигеном-мишенью (например, HER2), но не связывается (или проявляет минимальное связывание) с другими антигенами. В определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают антиген-мишень (например, HER2), характеризуются KD, составляющей менее 1×10−6 М, менее 1×10−7 М, менее 1×10−8 М, менее 1×10−9 М, менее 1×10−10 М, менее 1×10−11 М, менее 1 × 10−12 М или менее 1×10−13 М. В некоторых вариантах осуществления KD составляет от 1 пМ до 500 пМ. В некоторых вариантах осуществления KD составляет от 500 пМ до 1 мкМ, от 1 мкМ до 100 нМ или от 100 мМ до 10 нМ.
[146] Термин "эпитоп" означает часть антигена, которую может распознавать антитело и специфически связываться с ней. Если антиген представляет собой полипептид, эпитопы могут быть образованы из смежных аминокислот или несмежных аминокислот, приводимых в соприкосновение за счет третичной укладки полипептида. Эпитоп, связываемый антителом, может быть идентифицирован с применением любой методики картирования эпитопов, известной из уровня техники, включая рентгеноструктурную кристаллографию для идентификации эпитопов путем непосредственной визуализации комплекса антиген-антитело, а также отслеживания связывания антитела с фрагментами или мутированными вариантами антигена или отслеживание доступа растворителя к разным частям антитела и антигена. Иллюстративные стратегии, применяемые для картирования эпитопов антитела, включают без ограничения олигопептидное сканирование на основе массива, ограниченный протеолиз, сайт-направленный мутагенез, высокопроизводительное картирование на основе мутагенеза, водород-дейтериевый обмен и масс-спектрометрию (см., например, Gershoni et al. (2007) 21:145-56; и Hager-Braun and Tomer (2005) Expert Rev Proteomics 2:745-56).
[147] Для определения антител, совместно связывающих идентичные или перекрывающиеся эпитопы, также можно применять конкурентное связывание и эпитоп-специфическую сортировку. Конкурентное связывание можно оценивать с применением анализа перекрестного блокирования, такого как анализ, описанный в "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane (1-е издание 1988 г., 2-е издание 2014 г.). В некоторых вариантах осуществления конкурентное связывание идентифицируется, если тестируемое антитело или связывающий белок снижают степень связывания эталонного антитела или связывающего белка с антигеном-мишенью, таким как HER2 (например, связывающего белка, содержащего CDR и/или вариабельные домены, выбранные из идентифицированных в таблицах 2-4), на по меньшей мере приблизительно 50% в анализе перекрестного блокирования (например, на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или больше, или на любой процент между ними) и/или наоборот. В некоторых вариантах осуществления конкурентное связывание может быть обусловлено общими или подобными (например, частично перекрывающимися) эпитопами или обусловлено стерическим несоответствием, при котором антитела или связывающие белки связываются на близкорасположенных эпитопах (см., например, Tzartos, Methods in Molecular Biology (Morris, ed. (1998) vol. 66, pp. 55-66)). В некоторых вариантах осуществления конкурентное связывание можно использовать для сортировки групп связывающих белков, которые имеют аналогичные эпитопы. Например, связывающие белки, которые конкурируют за связывание, могут быть "отсортированы" как группа связывающих белков, которые содержат перекрывающиеся или расположенные близко эпитопы, в то время как белки, которые не конкурируют, помещаются в отдельную группу связывающих белков, которые не содержат перекрывающихся или расположенных близко эпитопов.
[148] Термин "kon" или "ka" означает константу скорости ассоциации в случае ассоциации антитела с антигеном с образованием комплекса антитело/антиген. Скорость может быть определена с применением стандартных анализов, таких как поверхностный плазмонный резонанс, биослойная инферометрия или ELISA-анализ.
[149] Термин "koff" или "kd" означает константу скорости диссоциации в случае диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген. Скорость может быть определена с применением стандартных анализов, таких как поверхностный плазмонный резонанс, биослойная инферометрия или ELISA-анализ.
[150] Термин "KD" означает равновесную константу диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. KD рассчитывают как ka/kd. Скорость может быть определена с применением стандартных анализов, таких как поверхностный плазмонный резонанс, биослойная инферометрия или ELISA-анализ.
[151] Термин "p", или "нагрузка модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена", или "соотношение модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена:антитело", или "соотношение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена и антитела", или "HAR" означает количество модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена на антитело или антигенсвязывающий фрагмент, т.е. нагрузку модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена или количество фрагментов -L-H на антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) в ADC, раскрытых в данном документе. В ADC, содержащих модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, "p" означает количество модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, связанных с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. Например, если два модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена (например, два соединения, каждое из которых характеризуется структурой H3) связаны с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, то p=2. В композициях, содержащих множество копий ADC, как описано в данном документе, "среднее значение p" означает среднее количество фрагментов -L-H на антитело или антигенсвязывающий фрагмент, также называемое "средней нагрузкой модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена".
[152] "Линкер" или "линкерный фрагмент" применяется в данном документе для обозначения любого химического фрагмента, который способен ковалентно присоединить соединение, обычно фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, такой как фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, к другому фрагменту, такому как антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Линкеры могут быть восприимчивыми или в значительной степени устойчивыми к индуцированному кислотой расщеплению, индуцированному пептидазой расщеплению, расщеплению под действием света, индуцированному эстеразой расщеплению и/или расщеплению дисульфидной связи в условиях, при которых соединение или антитело остается активным.
[153] Термин "средство" используется в данном документе для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Термин "терапевтическое средство" или "лекарственное средство" означает средство, которое способно модулировать биологический процесс и/или обладает биологической активностью. Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена, описанные в данном документе, представляют собой иллюстративные терапевтические средства.
[154] Термин "химиотерапевтическое средство" или "противораковое средство" используется в данном документе для обозначения всех средств, которые являются эффективными при лечении рака, независимо от механизма действия. Подавление метастазирования или ангиогенеза зачастую является характерной особенностью химиотерапевтического средства. Химиотерапевтические средства включают антитела, биологические молекулы и малые молекулы и охватывают соединения, представляющие собой модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена, описанные в данном документе. Химиотерапевтическое средство может представлять собой цитотоксическое или цитостатическое средство. Термин "цитостатическое средство" означает средство, которое подавляет или тормозит клеточный рост и/или размножение клеток. Термин "цитотоксическое средство" означает вещество, которое вызывает гибель клеток в первую очередь в результате вмешательства в активность экспрессии и/или функционирование клетки.
[155] Используемые в данном документе термины "модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена", "модулятор сплайсосомы на основе гербоксидиена" или "сплайс-модулятор на основе гербоксидиена" означают соединения, которые характеризуются противораковой активностью в результате взаимодействия с компонентами сплайсосомы и являются структурно родственными гербоксидиену. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена изменяет скорость или форму сплайсинга в клетке-мишени. Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена, которые функционируют как ингибирующие средства, например, способны к снижению неконтролируемой клеточной пролиферации. В некоторых вариантах осуществления модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена могут действовать посредством связывания с комплексом сплайсосомы SF3b. Такие модуляторы могут представлять собой встречающиеся в природе или синтетические производные или аналоги гербоксидиена. Используемые в данном документе термины "производное" и "аналог" в отношении модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или т. п. означают любое такое соединение, которое сохраняет по сути такую же, сходную или улучшенную биологическую функцию или активность, что и гербоксидиен, но характеризуется измененной химической или биологической структурой. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена представляет собой производное гербоксидиена.
[156] Используемый в данном документе термин "фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена", означает компонент ADC или композиции, который обеспечивает структуру соединения, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, например, компонент, представляющий собой модулятор сплайсинга (H) на основе гербоксидиена, в ADC формулы (I) или в композиции, содержащей -L-H.
[157] Используемый в данном документе термин "сплайсосома" означает рибонуклеопротеиновый комплекс, который удаляет интроны из одного или нескольких сегментов РНК, таких как сегменты pre-mRNA.
[158] Термин "гомолог" означает молекулу, которая проявляет гомологию с другой молекулой, например, имеет последовательности химических остатков, которые являются такими же или аналогичными в соответствующих положениях.
[159] Используемый в данном документе термин "подавлять" или "подавление" означает уменьшение измеряемого количества и может включать, но не обязательно, полное предотвращение или подавление.
[160] Термин "отрицательный по мишени", "отрицательный по антигену-мишени" или "отрицательный по антигену" означает отсутствие экспрессии антигена-мишени в клетке или ткани. Термин "положительный по мишени", "положительный по антигену-мишени" или "положительный по антигену" означает присутствие экспрессии антигена-мишени. Например, клетка или линия клеток, которые не экспрессируют антиген-мишень, могут быть описаны как отрицательные по мишени, при этом клетка или линия клеток, которые экспрессируют антиген-мишень, могут быть описаны как положительные по мишени.
[161] Термин "неспецифическое уничтожение" или "неспецифический эффект" означает уничтожение отрицательных по мишени клеток в присутствии положительных по мишени клеток, при этом уничтожение отрицательных по мишени клеток не наблюдается при отсутствии положительных по мишени клеток. Межклеточный контакт или по меньшей мере близость между положительными по мишени и отрицательными по мишени клетками делает возможным неспецифическое уничтожение. Данный тип уничтожения отличается от "нецелевого уничтожения", которое означает неизбирательное уничтожение отрицательных по мишени клеток. "Нецелевое уничтожение" может наблюдаться при отсутствии положительных по мишени клеток.
[162] Термины "неопластическое нарушение" и "рак" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения присутствия клеток, обладающих характеристиками, типичными для вызывающих рак клеток, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертие, метастатический потенциал, быстрые рост и скорость пролиферации и/или определенные морфологические признаки. Зачастую раковые клетки могут быть в форме опухоли или массы, но такие клетки могут существовать по отдельности в организме субъекта или могут циркулировать в кровотоке как независимые клетки, такие как лейкозные или лимфомные клетки. Термины "неопластическое нарушение" и "рак" включают все типы рака и метастазы рака, включая гематологическое злокачественное новообразование, солидные опухоли, виды саркомы, виды карциномы и другие солидные или несолидные раковые опухоли. Гематологические злокачественные новообразования могут включать B-клеточные злокачественные новообразования, виды рака крови (лейкозы), виды рака плазматических клеток (миеломы, например, множественную миелому) или виды рака лимфатических узлов (лимфомы). Иллюстративные B-клеточные злокачественные новообразования включают хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны и диффузную В-крупноклеточную лимфому. Лейкозы могут включать острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML), острый моноцитарный лейкоз (AMoL) и т.д. Лимфомы могут включать лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому. Другие гематологические злокачественные новообразования могут включать миелодиспластический синдром (MDS). Солидные опухоли могут включать карциномы, такие как аденокарцинома, например, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак толстой кишки или колоректальный рак, рак легкого, рак желудка, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичника, холангиокарциному, глиому, меланому и т.д.
[163] Термины "опухоль" и "новообразование" означают любую массу ткани, которая образуется в результате избыточного роста или пролиферации клеток, либо доброкачественную, либо злокачественную, включая предраковые поражения.
[164] Термины "опухолевая клетка" и "неопластическая клетка" используются взаимозаменяемо и означают отдельные клетки или общую популяцию клеток, полученную из опухоли или новообразования, включая как неканцерогенные клетки, так и раковые стволовые клетки. Используемый в данном документе термин "опухолевая клетка" будет модифицирован с помощью термина "неканцерогенная", если она относится исключительно к тем опухолевым клеткам, у которых отсутствует способность обновляться и дифференцироваться, чтобы отличать такие опухолевые клетки от раковых стволовых клеток.
[165] Термины "субъект" и "пациент" используются взаимозаменяемо в данном документе для обозначения любого животного, такого как любое млекопитающее, включая без ограничения людей, отличных от человека приматов, грызунов и т.п. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является мышью. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является человеком. В некоторых вариантах осуществления субъект является мышью. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.
[166] Термин "совместное введение" или введение "в комбинации с" одним или несколькими терапевтическими средствами включает одновременное введение и последовательное введение в любом порядке.
[167] "Фармацевтическая композиция" означает препарат, который находится в такой форме, которая допускает введение и впоследствии обеспечивает предусмотренную биологическую активность активного(активных) ингредиента(ингредиентов) и/или достижение терапевтического эффекта и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются недопустимо токсичными для субъекта, которому состав будет вводиться. Фармацевтическая композиция может быть стерильной.
[168] "Фармацевтическое вспомогательное вещество" предусматривает материал, такой как адъювант, носитель, pH-регулирующие и буферные средства, регулирующие тоничность средства, смачивающие средства, консервант и т.п.
[169] "Фармацевтически приемлемый" означает одобренный или тот, который может быт одобрен, органом регулирования Федерального правительства или правительства штата, или перечисленный в фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у человека.
[170] "Фармацевтически приемлемая соль" представляет собой соль, которая сохраняет требуемую биологическую активность исходного соединения и не вызывает нежелательных токсикологических эффектов. Примеры таких солей представляют собой: (a) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п.; и соли, образованные с органическими кислотами, например, уксусной кислотой, щавелевой кислотой, винной кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, глюконовой кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, аскорбиновой кислотой, бензойной кислотой, дубильной кислотой, пальмитиновой кислотой, альгиновой кислотой, полиглутаминовой кислотой, нафталинсульфоновой кислотой, метансульфоновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой, нафталиндисульфоновой кислотой, полигалактуроновой кислотой и т.п.; и (b) соли, образованные из элементарных анионов, таких как хлор, бром и йод. См. например, Haynes et al. "Commentary: Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the Cambridge Structural Database," J Pharmaceutical Sciences, vol. 94, no. 10 (2005), и Berge et al. "Pharmaceutical Salts," J Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1 (1977), которые
включены в данный документ посредством ссылки.
[171] Используемый в данном документе термин "эффективное количество" означает количество соединения, ADC или композиции, описанных в данном документе (например, модулятора сплайсинга или ADC на основе гербоксидиена), которое является достаточным для достижения специально поставленной цели, например, для достижения терапевтического эффекта после введения, такого как снижение скорости роста опухоли или уменьшение объема опухоли, ослабление симптома рака или некоторые другие признаки эффективности лечения. Эффективное количество можно определять традиционным образом относительно поставленной цели. Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, ADC или композиции, описанных в данном документе, которое является эффективным для выявляемого уничтожения, снижения и/или подавления роста или распространения опухолевых клеток, размера или количества опухолей и/или другого показателя уровня, стадии, прогрессирования и/или тяжести рака. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от предусмотренного применения (in vitro или in vivo) или субъекта и болезненного состояния, подлежащих лечению, например, массы и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, способа введения и т.п., что может легко определить специалист в данной области техники. Термин также применим к дозе, которая будет индуцировать конкретный ответ в клетках-мишенях, например, подавление клеточного роста. Конкретная доза может варьироваться, например, в зависимости от конкретной фармацевтической композиции, субъекта и его возраста и состояния здоровья в настоящее время или рисков, связанных с состоянием здоровья, схемы введения, которой будут следовать, тяжести заболевания, того, вводят ли ее в комбинации с другими средствами, времени введения, ткани, в которую ее вводят, и физической системы доставки, в которой она переносится. В случае рака терапевтически эффективное количество ADC может снижать количество раковых клеток, уменьшать размер опухоли, подавлять (например, замедлять или останавливать) метастазирование опухоли, подавлять (например, замедлять или останавливать) рост опухоли и/или облегчать один или несколько симптомов.
[172] "Профилактически эффективное количество" означает количество, при необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени эффективное в достижении требуемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до проявления заболевания или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
[173] Используемые в данном документе "лечить" или "терапевтический" и грамматически родственные термины означают любое улучшение любого последствия заболевания, такое как продление выживания, меньшие клинические проявления и/или ослабление побочных эффектов, которые являются результатом альтернативного терапевтического способа воздействия. Как легко понять из уровня техники, полное устранение заболевания охватывается лечебным действием, но не требуется для него. Используемые в данном документе термины "лечение" или "лечить" означают введение описанных ADC или композиции субъекту, например, пациенту. Лечение может представлять собой излечение, заживление, смягчение, ослабление, изменение, устранение, облегчение, временное ослабление, улучшение или воздействие на нарушение, симптомы нарушения или предрасположенность к нарушению, например раку. В некоторых вариантах осуществления в дополнение к лечению субъекта, у которого имеется состояние, композицию, раскрытую в данном документе, также можно применять профилактически для предупреждения или снижения вероятности развития данного состояния.
[174] В некоторых вариантах осуществления применяют меченый ADC. Подходящие "метки" включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные фрагменты, хемилюминесцентные фрагменты, магнитные частицы и т.п.
[175] Под применяемым в данном документе "белком" подразумевают по меньшей мере две ковалентно связанные аминокислоты. Термин охватывает полипептиды, олигопептиды и пептиды. В некоторых вариантах осуществления две или более ковалентно связанные аминокислоты связаны посредством пептидной связи. Белок может быть составлен из встречающихся в природе аминокислот и пептидных связей, например, когда белок получают рекомбинантным образом с применением систем экспрессии и клеток-хозяев. В качестве альтернативы, белок может содержать синтетические аминокислоты (например, гомофенилаланин, цитруллин, орнитин и норлейцин) или пептидомиметические структуры, т.е. "аналоги пептидов или белков", такие как пептоиды. Пептоиды представляют собой иллюстративный класс пептидомиметиков, боковые цепи которых прикреплены к атому азота пептидного остова, а не к α-атомам углерода (как они расположены в аминокислотах), и характеризуются иным расположением водородных связей и конформационными характеристиками по сравнению с пептидами (см., например, Simon et al. (1992) Proc Natl Acad Sci. USA 89:9367). В связи с этим пептоиды могут быть устойчивыми к протеолизу или к другим физиологическим условиям или условиям хранения и быть эффективными при проникновении через клеточные мембраны. Такие синтетические аминокислоты можно включать, в частности, когда антитело синтезируется in vitro с помощью общепринятых способов, широко известных из уровня техники. Кроме того, может применяться любая комбинация пептидомиметических, синтетических и встречающихся в природе остатков/структур. "Аминокислота" также включает иминокислотные остатки, такие как пролин и гидроксипролин. "R группа" или "боковая цепь" аминокислоты могут находиться в одной из (L)- или (S)-конфигурации. В конкретном варианте осуществления аминокислоты находятся в (L)- или (S)-конфигурации.
[176] "Рекомбинантный белок" представляет собой белок, полученный с применением рекомбинантных методик с применением любых методик и способов, известных из уровня техники, т.е. вследствие экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Способы и методики получения рекомбинантных белков широко известны из уровня техники.
[177] "Выделенный" белок не сопровождается по меньшей мере некоторой частью материала, с которым он в норме ассоциирован в природном состоянии, например, составляет по меньшей мере приблизительно 5% или по меньшей мере приблизительно 50% по весу от общего белка в указанном образце. Известно, что выделенный белок может составлять от 5% до 99,9% по весу от общего содержания белка в зависимости от обстоятельств. Например, белок может продуцироваться в значительно более высокой концентрации при применении индуцибельного промотора или промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии, за счет чего белок продуцируется с повышенными уровнями концентрации. Определение включает продуцирование антитела в самых разнообразных организмах и/или клетках-хозяевах, которые известны из уровня техники.
[178] В случае аминокислотных последовательностей идентичность и/или сходство последовательности могут быть определены с применением стандартных методик, известных из уровня техники, включая без ограничения алгоритм локальной идентичности последовательностей из Smith and Waterman (1981) Adv Appl Math. 2:482, алгоритм выравнивания для определения идентичности последовательностей из Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol. 48:443, способ поиска сходства из Pearson and Lipman (1988) Proc Nat Acad Sci. USA 85:2444, компьютеризированные реализации таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, США), программу анализа последовательностей Best Fit, описанную в работе Devereux et al. (1984) Nucl Acid Res. 12:387-95, предпочтительно с применением установок по умолчанию, или путем визуального просмотра. Предпочтительно процент идентичности рассчитывается с помощью FastDB на основе следующих параметров: штраф за несовпадение - 1; штраф за гэп - 1; штраф за удлинение гэпа - 0,33 и штраф за соединение - 30 ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, сс. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc).
[179] Примером применимого алгоритма является PILEUP. PILEUP создает выравнивание множественных последовательностей из группы родственных последовательностей с применением прогрессивных попарных выравниваний. Он также может строить дерево, показывающее кластеризующие взаимосвязи, применяемые для создания выравнивания. PILEUP использует упрощение способа прогрессивного выравнивания из Feng & Doolittle (1987) J Mol Evol. 35:351-60; причем способ подобен способу, описанному в работе Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3. Применимые параметры в PILEUP включают штраф за введение гэпа по умолчанию - 3,00, штраф за удлинение гэпа по умолчанию - 0,10 и оцениваемые концевые гэпы.
[180] Другим примером применимого алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в Altschul et al. (1990) J Mol Biol. 215:403-10; Altschul et al. (1997) Nucl Acid Res. 25:3389-402; и Karin et al. (1993) Proc Natl Acad Sci. USA 90:5873-87. Особенно применимой программой BLAST является программа WU-BLAST-2, которую получили из Altschul et al. (1996) Methods in Enzymology 266:460-80. WU-BLAST-2 применяет несколько параметров поиска, большинство из которых установлены как значения по умолчанию. Регулируемые параметры установлены на следующие значения: длина перекрывания=l, доля перекрывания=0,125, пороговая длина слова (T)=II. Параметры HSP S и HSP S2 представляют собой динамические значения и устанавливаются программой самостоятельно в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, относительно которой производится поиск представляющей интерес последовательности; однако значения можно корректировать для повышения чувствительности.
[181] Дополнительным применимым алгоритмом является BLAST с введением гэпов, сообщаемый в работе Altschul et al. (1997) Nucl Acid Res. 25:3389-402. BLAST с введением гэпов применяет матрицу замен BLOSUM-62; пороговый параметр T, установленный на 9; метод "двух совпадений" для запуска продлений без гэпов, штраф за удлинение гэпов на k составляет 10+k; Xu установлен на 16, и Xg установлен на 40 для стадии поиска в базе данных и на 67 для стадии вывода результатов алгоритмов. Выравнивания с введением гэпов запускаются при показателе, соответствующем приблизительно 22 битам.
[182] Обычно гомология аминокислот, сходство или идентичность между белками, раскрытыми в данном документе, и их вариантами, включая варианты антигенов-мишеней (такие как HER2, CD138 или EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 или STEAP1) и варианты вариабельных доменов антител (включая отдельные варианты CDR), составляют по меньшей мере 80% относительно последовательностей, изображенных в данном документе, например, показатели гомологии или идентичности составляют по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, почти 100% или 100%.
[183] Аналогичным образом, "процент (%) идентичности последовательности нуклеиновой кислоты" в отношении последовательности нуклеиновой кислоты антител и других белков, идентифицированных в данном документе, определяется как процент нуклеотидных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам в кодирующей последовательности антигенсвязывающего белка. В специфическом способе используется модуль BLASTN из WU-BLAST-2, установленный на параметры по умолчанию, при этом длина перекрывания и доля перекрывания установлены на 1 и 0,125 соответственно.
[184] Поскольку сайт или область введения вариации аминокислотной последовательности предварительно определены, то мутацию саму по себе не нужно предварительно определять. Например, чтобы оптимизировать свойства мутации в заданном сайте, в кодоне- или области-мишени можно выполнять случайный мутагенез, а экспрессированные варианты CDR антигенсвязывающих белков подвергать скринингу в отношении оптимальной комбинации требуемой активности. Широко известны методики получения мутаций, представляющих собой замены в предварительно определенных сайтах в ДНК с известной последовательностью, например, мутагенез с праймером MI3 и ПЦР-мутагенез.
[185] Используемые в данном документе термины "алкил" или "алкильная группа" означают углеводород с неразветвленной, разветвленной или циклической цепью, который является полностью насыщенным. В определенных вариантах осуществления алкильные группы могут содержать 1-8 атомов углерода ("C1-C8алкил"). В определенных вариантах осуществления алкильные группы могут содержать 1-6 атомов углерода ("C1-C6алкил"). В определенных вариантах осуществления алкильные группы содержат 1-3 атома углерода. В еще одних вариантах осуществления алкильные группы содержат 2-3 атома углерода, и в других вариантах осуществления алкильные группы содержат 1-2 атома углерода.
[186] Используемый в данном документе термин "алкилалкокси" означает алкильную группу, замещенную алкоксигруппой.
[187] Используемый в данном документе термин "алкокси" означает алкильную группу, определенную ранее, присоединенную к основной углеродной цепи посредством атома кислорода ("алкокси").
[188] Используемый в данном документе термин "алкилгидрокси" означает алкильную группу, замещенную гидроксильной группой.
[189] Используемые в данном документе термины "гидрокси" или "гидроксил" означают -OH.
[190] Используемый в данном документе "карбоцикл" или "карбоциклил" включает как ароматическую (например, арильную), так и неароматическую (например, циклоалкильную) группы. В определенных вариантах осуществления карбоциклические группы содержат 3-10 атомов углерода ("3-10-членный карбоцикл"). В определенных вариантах осуществления карбоциклические группы содержат 3-8 атомов углерода ("3-8-членный карбоцикл"). В определенных вариантах осуществления карбоциклические группы содержат 3-6 атомов углерода ("3-6-членный карбоцикл"). В определенных вариантах осуществления карбоциклические группы содержат 3-5 атомов углерода ("3-5-членный карбоцикл").
[191] Используемый в данном документе термин "галогеналкил" означает алкильную группу, замещенную одним или несколькими атомами галогена.
[192] "Галоген" означает радикал любого галогена, например, -F, -Cl, -Br или -I.
[193] Применяемые в данном документе термины "гетероцикл", "гетероциклил" и "гетероциклический" означают моноциклический гетероцикл, бициклический гетероцикл или трициклический гетероцикл, содержащий по меньшей мере один гетероатом в кольце.
[194] Моноциклический гетероцикл представляет собой 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-членное кольцо, содержащее по меньшей мере один гетероатом, независимо выбранный из O, N и S. В некоторых вариантах осуществления гетероцикл представляет собой 3- или 4-членное кольцо, содержащее один гетероатом, выбранный из O, N и S. В некоторых вариантах осуществления гетероцикл представляет собой 5-членное кольцо, не содержащее двойных связей или содержащее одну двойную связь, и один, два или три гетероатома, выбранные из O, N и S. В некоторых вариантах осуществления гетероцикл представляет собой 6-, 7- или 8-членное кольцо, не содержащее двойных связей, содержащее одну или две двойные связи, и один, два или три гетероатома, выбранные из O, N и S. Иллюстративные примеры моноциклического гетероцикла включают без ограничения азетидинил, азепанил, азиридинил, диазепанил, 1,3-диоксанил, 1,3-диоксоланил, дигидропиранил (включая 3,4-дигидро-2H-пиран-6-ил), 1,3-дитиоланил, 1,3-дитианил, имидазолинил, имидазолидинил, изотиазолинил, изотиазолидинил, изоксазолинил, изоксазолидинил, морфолинил, оксадиазолинил, оксадиазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, пиперазинил, пиперидинил, пиранил, пиразолинил, пиразолидинил, пирролинил, пирролидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил (включая тетрагидро-2H-пиран-4-ил), тетрагидротиенил, тиадиазолинил, тиадиазолидинил, тиазолинил, тиазолидинил, тиоморфолинил, 1,1-диоксидотиоморфолинил (тиоморфолинсульфон), тиопиранил и тритианил.
[195] Бициклические гетероциклы по настоящему изобретению могут включать моноциклический гетероцикл, конденсированный с арильной группой, или моноциклический гетероцикл, конденсированный с моноциклическим циклоалкилом, или моноциклический гетероцикл, конденсированный с моноциклическим циклоалкенилом, или моноциклический гетероцикл, конденсированный с моноциклическим гетероциклом, имеющие в общей сложности 5-12 атомов в кольце. Примеры бициклических гетероциклов включают без ограничения 3,4-дигидро-2H-пиранил, 1,3-бензодиоксолил, 1,3-бензодитиолил, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинил, 2,3-дигидро-1-бензофуранил, 2,3-дигидро-1-бензотиенил, 2,3-дигидро-1H-индолил и 1,2,3,4-тетрагидрохинолинил.
[196] Термины "гетероцикл", "гетероциклил" и "гетероциклический" охватывают гетероарилы. "Гетероарил" означает циклический фрагмент, содержащий одно или несколько замкнутых колец с одним или несколькими гетероатомами (кислорода, азота или серы) в по меньшей мере одном из колец, где по меньшей мере одно из колец является ароматическим, и где кольцо или кольца независимо могут быть конденсированными и/или соединенными мостиковой связью. Примеры включают без ограничения фенил, тиофенил, триазолил, пиридинил, пиримидинил, пиридазинил и пиразинил.
[197] Как описано в данном документе, соединения по настоящему изобретению могут содержать "необязательно замещенные" фрагменты. В целом, термин "замещенный", независимо от того, предшествует ли ему термин "необязательно" или нет, означает, что один или несколько атомов водорода в обозначенном фрагменте заменены подходящим заместителем. Если не указано иное, "необязательно замещенная" группа может содержать подходящий заместитель в каждом замещаемом положении группы, и если более одного положения в любой приведенной структуре могут быть замещены более чем одним заместителем, выбранным из указанной группы, то в каждом положении заместитель может быть либо одинаковым, либо разным. Комбинации заместителей, предусмотренные в настоящем изобретении, предпочтительно являются такими, которые приводят к образованию стабильных или химически возможных соединений.
[198] Специалисту в данной области техники будет понятно, что "замещение", или "замещенный", или "отсутствует" включают неявное условие, что такое замещение или его отсутствие находятся в соответствии с допустимой валентностью замещаемого атома и заместителя, и что замещение или его отсутствие приводят к получению стабильного соединения, например, которое не подвергается спонтанному превращению, например, за счет перегруппировки, циклизации, элиминирования и т.д. Для целей данного изобретения гетероатомы, такие как азот, могут иметь водородные заместители и/или любые возможные заместители органических соединений, описанные в данном документе, которые соответствуют валентностям гетероатомов.
[199] "Стабильный" означает соединения, которые по сути не изменяются химически и/или физически при воздействии условий, обеспечивающих их получение, обнаружение и, в определенных вариантах осуществления, их извлечение, очистку и применение для обеспечения одной или нескольких целей, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления стабильное соединение или химически возможное соединение представляют собой соединение, которое по сути не изменяется во время хранения при температуре 40°C или меньше при отсутствии влаги или других химически активных условий в течение по меньшей мере недели. В некоторых вариантах осуществления соединения, раскрытые в данном документе, являются стабильными.
[200] Описанные в данном документе энантиомеры могут включать "энантиомерно чистые" изомеры, которые содержат по сути один энантиомер, например, в количестве, равном 90%, 92%, 95%, 98% или 99% или больше или равном 100% одного энантиомера по конкретному асимметричному центру или центрам. "Асимметричный центр" или "хиральный центр" означают тетраэдрический атом углерода, который содержит четыре различных заместителя.
[201] Соединения, описанные в данном документе, также могут содержать неприродные доли атомных изотопов по одному или нескольким атомам, которые составляют эти соединения. Например, соединения могут быть помечены радиоактивной меткой с помощью радиоактивных изотопов, таких как, например, дейтерий (2H), тритий (3H), углерод-13 (13C) или углерод-14 (14C). Подразумевается, что все изотопные варианты соединений, раскрытых в данном документе, независимо от того, являются ли они радиоактивными или нет, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Кроме того, подразумевается, что все таутомерные формы соединений, описанных в данном документе, находятся в пределах объема заявляемого изобретения.
Конъюгаты антитела и лекарственного средства
[202] Соединения по настоящему изобретению, представляющие собой конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), включают соединения с противораковой активностью. В частности, соединения, представляющие собой ADC, содержат антитело или антигенсвязывающий фрагмент (включая его антигенсвязывающий фрагмент), конъюгированные (т.е. ковалентно соединенные посредством линкера) с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, где модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, если он не конъюгирован с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, характеризуется цитотоксическим или цитостатическим эффектом. В различных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, если он не конъюгирован с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, способен связываться и/или взаимодействовать с комплексом сплайсосомы SF3b. В различных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, если он не конъюгирован с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, способен модулировать сплайсинг РНК in vitro и/или in vivo. В различных вариантах осуществления за счет целенаправленного воздействия на сплайсинг РНК модулятор сплайсинга и ADC на основе гербоксидиена, раскрытые в данном документе, представляют собой эффективные антипролиферативные средства. В различных вариантах осуществления модулятор сплайсинга и ADC на основе гербоксидиена, раскрытые в данном документе, способны целенаправленно воздействовать как на активно делящиеся, так и на покоящиеся клетки.
[203] В различных вариантах осуществления настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаружении того, что определенный биологически активный модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена способен обеспечивать улучшенные свойства, если применяется в ADC. Хотя модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена способен демонстрировать требуемым образом улучшенные признаки (например, надежное связывание комплекса сплайсосомы SF3b, эффективную модуляцию сплайсинга РНК) при применении его как такового, в различных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена способен проявлять меньшее количество из тех же требуемым образом улучшенных признаков при конъюгации с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. Таким образом, разработка и получение ADC для применения в качестве терапевтического средства для человека, например, в качестве средства для онкотерапии, могут потребовать больше, чем идентификация антитела, способного к связыванию с требуемой мишенью или мишенями и присоединению к лекарственному средству, применяемому как таковое для лечения рака. Связывание антитела с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена способно оказывать значительные эффекты на активность одного или обоих из антитела и модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, при этом эффекты будут варьироваться в зависимости от выбранного типа линкера и/или модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления компоненты ADC выбираются таким образом, чтобы (i) сохранить одно или несколько терапевтических свойств, проявляемых антителом и фрагментами, представляющими собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, при применении по отдельности, (ii) поддержать свойства специфического связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента; (iii) оптимизировать нагрузку модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена и соотношения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена и антитела; (iv) обеспечить доставку, например, внутриклеточную доставку, фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, за счет стабильного присоединения к антителу или антигенсвязывающему фрагменту; (v) сохранить стабильность ADC в качестве интактного конъюгата до момента транспортировки или доставки в сайт-мишень; (vi) минимизировать агрегацию ADC до или после введения; (vii) обеспечить терапевтический эффект, например, цитотоксический эффект фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, после отщепления или другого механизма высвобождения в клеточной среде; (viii) обеспечить проявление эффективности противоракового лечения in vivo, сопоставимой с эффективностью антитела и фрагментов, представляющих собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, или превосходящей ее, при применении отдельно; (ix) минимизировать нецелевое уничтожение под действием фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или (x) обеспечить проявление требуемых фармакокинетических и фармакодинамических свойств, возможности получения составов и токсикологического/иммунологического профилей. Для проявления каждого из этих свойств может быть необходимо идентифицировать улучшенный ADC для терапевтического применения (Ab et al. (2015) Mol Cancer Ther. 14:1605-13).
[204] В различных вариантах осуществления ADC, раскрытые в данном документе, проявляют неожиданно благоприятные свойства в некоторых или каждой из категорий, перечисленных выше. Например, в некоторых вариантах осуществления конструкции, представляющие собой ADC, раскрытые в данном документе, проявляют неожиданно благоприятные профили нагрузки модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, агрегации и/или стабильности и/или сохраняют функцию связывания антитела, активность лекарственного средства и/или улучшенное неспецифическое уничтожение, при этом снижая нецелевое уничтожение, по сравнению с ADC, содержащими альтернативный линкер и/или фрагмент, представляющий собой лекарственное средство (например, альтернативный модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена). В некоторых вариантах осуществления конструкции, представляющие собой ADC, раскрытые в данном документе, демонстрируют превосходную стабильность, активность, эффективность или другой эффект (измеренный in vivo или in vitro) по сравнению с ADC, в которых применяется альтернативный линкер и/или фрагмент, представляющий собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления конструкции, представляющие собой ADC, раскрытые в данном документе, проявляют эффективность лечения in vivo при введении в виде одиночной дозы. В некоторых вариантах осуществления конструкции, представляющие собой ADC, раскрытые в данном документе, являются неожиданно стабильными по сравнению с ADC, в которых применяется альтернативный линкер и/или фрагмент, представляющий собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена.
[205] Соединения, представляющие собой ADC по настоящему изобретению, способны селективно доставлять эффективную дозу цитотоксического или цитостатического средства к раковым клеткам или к опухолевой ткани. Было обнаружено, что раскрытые ADC обладают мощной цитотоксической и/или цитостатической активностью в отношении клеток, экспрессирующих соответствующий антиген-мишень (например, HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 или STEAP1). В некоторых вариантах осуществления цитотоксическая и/или цитостатическая активность ADC зависит от экспрессии антигена-мишени в клетке. В некоторых вариантах осуществления раскрытые ADC являются особенно эффективными в уничтожении раковых клеток, экспрессирующих антиген-мишень, при минимизации нецелевого уничтожения. В некоторых вариантах осуществления раскрытые ADC не проявляют цитотоксический и/или цитостатический эффект в отношении раковых клеток, которые не экспрессируют антиген-мишень.
[206] Иллюстративные виды рака, при которых экспрессируется HER2, включают без ограничения рак молочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, уротелиальную клеточную карциному, рак пищевода, рак легкого (например, аденокарциному легкого), рак матки (например, серозную карциному эндометрия матки), карциному слюнных протоков, рак шейки матки, рак эндометрия и рак яичника (English et al. (2013) Mol Diagn Ther. 17:85-99).
[207] Иллюстративные виды рака, при которых экспрессируется CD138, включают без ограничения рак внутригрудной локализации (например, рак легкого, мезотелиому), рак кожи (например, базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному), рак головы и шеи (например, гортани, гортанной части глотки, носоглотки), рак молочной железы, урогенитальный рак (например, рак шейки матки, рак яичника, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, уротелиальный рак), гематологические злокачественные новообразования (например, миелому, такую как множественная миелома, B-клеточные злокачественные новообразования, лимфома Ходжкина) и рак щитовидной железы (Szatmári et al. (2015) Dis Markers 2015:796052).
[208] Иллюстративные виды рака, при которых экспрессируется EPHA2, включают рак молочной железы, рак головного мозга, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак легкого, рак предстательной железы, меланому, рак пищевода и рак желудка (Tandon et al. (2011) Expert Opin Ther Targets 15(1):31-51).
[209] В некоторых вариантах осуществления расщепление ADC обеспечивает высвобождение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена от антитела или антигенсвязывающего фрагмента и линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер и/или модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена разработан для облегчения неспецифического уничтожения (уничтожения соседних клеток). В некоторых вариантах осуществления линкер и/или модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена разработан для облегчения неспецифического уничтожения за счет расщепления после интернализации в клетку и диффузии фрагмента, представляющего собой линкер-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена как таковой, в соседние клетки. В некоторых вариантах осуществления линкер способствует интернализации в клетку. В некоторых вариантах осуществления разработан линкер для минимизации расщепления во внеклеточной среде и, таким образом, снижения токсичности в отношении нецелевой ткани (например, ткани, не являющейся раковой), при этом сохраняющий способность к связыванию ADC с тканью-мишенью и к неспецифическому уничтожению раковой ткани, которая не экспрессирует антиген, на который целенаправленно воздействует антитело или антигенсвязывающий фрагмент ADC, но которая окружает раковую ткань-мишень, экспрессирующую данный антиген. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, представляющий собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, или катаболит фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, получаемый при расщеплении ADC, разработан для облегчения захвата клетками-мишенями или соседними клетками (т.е. способные к проникновению в клетку). Такие фрагменты, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, и катаболиты могут называться в данном документе "неспецифически активными", при этом фрагменты, представляющие собой лекарственное средство, или катаболиты со сниженной способностью к проникновению в клетку могут называться "неспецифически неактивными".
[210] В некоторых вариантах осуществления раскрытые ADC также демонстрируют активность неспецифического уничтожения, но низкую нецелевую цитотоксичность. Не ограничиваясь теорией, активность неспецифического уничтожения у ADC может быть особенно полезной, если его проникновение в солидную опухоль ограничено, и/или экспрессия антигена-мишени среди опухолевых клеток является неоднородной. В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий расщепляемый линкер, является особенно эффективным при неспецифическом уничтожении и/или демонстрирует улучшенную активность неспецифического уничтожения по сравнению с сопоставимым лечением с помощью ADC, содержащего нерасщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления ADC, раскрытые в данном документе, проявляют улучшенную растворимость и проникновение в клетки-мишени по сравнению с фрагментами, представляющими собой лекарственное средство, при применении отдельно. В некоторых вариантах осуществления ADC, раскрытые в данном документе, проявляют улучшенную цитотоксичность по сравнению с цитотоксичностью фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, при применении отдельно. В некоторых вариантах осуществления в ADC, раскрытых в данном документе, применяются фрагменты, представляющие собой лекарственные средства, которые проявляют более низкую цитотоксичность при оценке в качестве отдельного модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, в то же время они неожиданно лучше, чем ADC, содержащие другие фрагменты, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, которые характеризуются более высокой цитотоксичностью при оценке в качестве отдельного модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления расщепление и высвобождение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена улучшают цитотоксичность ADC относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего нерасщепляемый линкер. В других вариантах осуществления расщепление и высвобождение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена не требуются для того, чтобы ADC обладал требуемой биологической активностью. В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий нерасщепляемый линкер, характеризующийся увеличенной длиной спейсера (например, ADL12), обеспечивает такую же или сходную цитотоксичность относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего расщепляемый линкер (например, ADL1, ADL5), и неожиданно превосходную цитотоксичность относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего более короткий нерасщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий нерасщепляемый линкер, характеризующийся увеличенной длиной спейсера без карбонильной группы (например, ADL12), обеспечивает такую же или сходную цитотоксичность относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего расщепляемый линкер (например, ADL1, ADL5), и неожиданно превосходную цитотоксичность относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего нерасщепляемый линкер, предусматривающий спейсер такой же или сходной длины с карбонильной группой (например, ADL10). В некоторых вариантах осуществления удаление карбонильной группы из нерасщепляемого MC-линкера (например, ADL12) может приводить к повышению цитотоксичности в более чем 50 раз, более чем 75 раз, более чем 100 раз, более чем 150 раз или более чем 200 раз относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего немодифицированный нерасщепляемый MC-линкер (например, ADL10). В некоторых вариантах осуществления удаление карбонильной группы из нерасщепляемого MC-линкера (например, ADL12) и увеличение длины спейсера (например, добавление по меньшей мере одного спейсерного звена) могут приводить к повышению цитотоксичности в более чем 50 раз, более чем 75 раз, более чем 100 раз, более чем 150 раз или более чем 200 раз относительно сопоставимого лечения с помощью ADC, содержащего немодифицированный нерасщепляемый MC-линкер (например, ADL10).
[211] В данном документе представлены соединения, представляющие собой ADC, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (Ab), которые целенаправленно воздействуют на опухолевую клетку, фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга (D), и линкерный фрагмент (L), который ковалентно присоединяет Ab к D. В определенных аспектах антитело или антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с антигеном, ассоциированным с опухолью (например, HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4, STEAP1), с высокой специфичностью и высокой аффинностью. В определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент подвергается интернализации в клетку-мишень после связывания, например, в компартмент клетки, в котором происходит разложение. В различных вариантах осуществления для уничтожения раковых клеток могут применяться ADC, которые подвергаются интернализации после связывания с клеткой-мишенью, подвергаются разложению и высвобождению фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. Фрагмент, представляющий собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, может высвобождаться от антитела и/или линкерного фрагмента из ADC в результате действия ферментов, гидролиза, окисления или любого другого механизма.
[212] Иллюстративный ADC имеет формулу (I):
Ab-(L-H)p (I),
где Ab = антитело или антигенсвязывающий фрагмент, L = линкерный фрагмент, H = фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, и p = число фрагментов, представляющих собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга, на антитело или антигенсвязывающий фрагмент.
[213] В определенных вариантах осуществления фрагмент, обеспечивающий целенаправленное воздействие модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, для применения в описанных ADC и композициях представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент. другие иллюстративные фрагменты, обеспечивающие целенаправленное воздействие лекарственного средства, для применения в описанных ADC и композициях также представлены и описаны в данном документе. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, обеспечивающий целенаправленное воздействие модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, может представлять собой любое из множества средств, связывающихся с клеткой, и остовов молекул, отличных от антител. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, обеспечивающий целенаправленное воздействие модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, представляет собой средство, связывающееся с клеткой. Используемый в данном документе термин "средство, связывающееся с клеткой", означает любое средство, которое способно к связыванию с клеткой животного (например, человека) и доставке фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (например, фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, раскрытый в данном документе). Термин охватывает иллюстративные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе (например, моноклональные антитела и их фрагменты, такие как Fab и scFV). Термин дополнительно охватывает иллюстративные средства, связывающиеся с клеткой, такие как DARPины, дуотела, бициклические пептиды, нанотела, центирины, MSH (меланоцитстимулирующий гормон), слитые молекулы рецептор-Fc, T-клеточные рецепторные структуры, стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены, факторы роста, колониестимулирующие факторы, такие как EGF, и другие остовы молекул, отличных от антител. В различных вариантах осуществления остовы молекул, отличных от антител, в широком смысле можно разделить на два структурных класса, а именно соединения, имеющие размер домена (примерно 6-20 кДа), и ограниченные пептиды (примерно 2-4 кДа). Иллюстративные остовы, имеющие размер домена, включают без ограничения аффитела, аффилины, антикалины, атримеры, DARPины, остовы FN3 (например, аднектины и центирины), финомеры, домены Кунитца, пронектины, O-тела и слитые белки рецептор-Fc, при этом иллюстративные ограниченные пептиды включают авимеры, бициклические пептиды и Cys-узлы. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, обеспечивающий целенаправленное воздействие лекарственного средства, применяемый в описанных ADC и композициях, выбран из аффитела, аффилина, антикалина, атримера, DARPина, остова FN3, такого как аднектин или центирин, финомера, домена Кунитца, пронектина, O-тела, авимера, бициклического пептида и Cys-узла. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, обеспечивающий целенаправленное воздействие лекарственного средства, применяемый в описанных ADC и композициях, представляет собой слитый белок рецептор-Fc, например, химерный слитый белок HER2-Fc. Обзор остовов молекул, отличных от антител, приведен, например, в Vazquez-Lombardi et al. (2015) Drug Dis Today 20(10):1271-83.
Антитела
[214] Антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) формулы (I) включает в пределах своего объема любые антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с антигеном-мишенью на раковой клетке. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с антигеном-мишенью с константой диссоциации (KD), составляющей ≤1 мМ, ≤100 нМ или ≤10 нМ или любое значение между ними, измеренной, например, с помощью анализа BIAcore®. В определенных вариантах осуществления KD составляет от 1 пМ до 500 пМ. В некоторых вариантах осуществления KD составляет от 500 пМ до 1 мкМ, от 1 мкМ до 100 нМ или от 100 мМ до 10 нМ.
[215] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой четырехцепочечное антитело (также называемое иммуноглобулином или полноразмерным или интактным антителом), содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой двухцепочечное полуантитело (одна легкая цепь и одна тяжелая цепь) или антигенсвязывающий фрагмент иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент иммуноглобулина, который сохраняет способность связывать раковый антиген-мишень и/или обеспечивать функцию иммуноглобулина.
[216] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или его интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления интернализующееся антитело или его интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент связываются с раковым антигеном-мишенью, экспрессированным на поверхности клетки, и попадают в клетку после связывания. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ADC, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, высвобождается от антитела или антигенсвязывающего фрагмента из ADC после того, как ADC попадет в клетку, экспрессирующую раковый антиген-мишень, и будет присутствовать в ней (т.е. после того, как ADC подвергся интернализации), например, в результате отщепления, в результате разложения антитела или антигенсвязывающего фрагмента или в результате любого другого подходящего механизма высвобождения.
[217] Аминокислотные последовательности иллюстративных антител по настоящему изобретению представлены в таблицах 2-4.
(AB185)
(AB185)
(AB205)
(AB205)
(AB206)
(AB206)
[218] В различных вариантах осуществления ADC, раскрытый в данном документе, может содержать любой набор из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, перечисленных в таблицах выше, или набор из последовательностей шести CDR из набора тяжелой и легкой цепей, например, введенный посредством переноса шести CDR в выбранный каркас донорного антитела человека. В различных вариантах осуществления ADC, раскрытый в данном документе, может содержать аминокислотные последовательности, которые гомологичны последовательностям, перечисленным в таблицах выше, при условии, что ADC сохраняет способность связываться со своим раковым антигеном-мишенью (например, с KD, составляющей менее 1×10−8 М) и сохраняет одно или несколько функциональных свойств ADC, раскрытых в данном документе (например, способность к интернализации, модулированию сплайсинга РНК, подавлению клеточного роста и т.д.).
[219] В некоторых вариантах осуществления ADC дополнительно содержит константные домены тяжелой и легкой цепей человека или их фрагменты. Например, ADC может содержать константный домен тяжелой цепи IgG человека (такого как IgG1) и константный домен легких каппа- или лямбда-цепей человека. В различных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент описанных ADC содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина G подтипа 1 человека (IgG1) и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека.
[220] В различных других вариантах осуществления раковый антиген-мишень для ADC представляет собой рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2).
[221] В различных вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи, указанные ниже: CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), состоящий из SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), состоящий из SEQ ID NO: 2, CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), состоящий из SEQ ID NO: 3; CDR1 легкой цепи (LCDR1), состоящий из SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи (LCDR2), состоящий из SEQ ID NO: 5, и CDR3 легкой цепи (LCDR3), состоящий из SEQ ID NO: 6, как определено по системе нумерации по Kabat.
[222] В различных вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент предусматривает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 19 и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO: 20 или последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны раскрытым последовательностям. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент имеет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 19, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 20.
[223] В различных вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В различных вариантах осуществления антитело к HER2 содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека.
[224] В различных вариантах осуществления антитело к HER2 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 19, и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 20 или последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 20. В конкретных вариантах осуществления антитело к HER2 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 19 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 20 или последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны раскрытым последовательностям. В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 19, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 20. В различных вариантах осуществления антитело к HER2 представляет собой трастузумаб или его антигенсвязывающий фрагмент.
[225] В различных вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи трастузумаба, или где CDR содержат не более одного, двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислотных добавлений, делеций или замен в HCDR1 (SEQ ID NO: 1), HCDR2 (SEQ ID NO: 2), HCDR3 (SEQ ID NO: 3); LCDR1 (SEQ ID NO: 4), LCDR2 (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 (SEQ ID NO: 6).
[226] В различных других вариантах осуществления раковый антиген-мишень для ADC представляет собой синдекан-1 человека (CD138).
[227] В различных вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи, указанные ниже: CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), состоящий из SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), состоящий из SEQ ID NO: 8, CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), состоящий из SEQ ID NO: 9; CDR1 легкой цепи (LCDR1), состоящий из SEQ ID NO: 10, CDR2 легкой цепи (LCDR2), состоящий из SEQ ID NO: 11, и CDR3 легкой цепи (LCDR3), состоящий из SEQ ID NO: 12, как определено по системе нумерации по Kabat.
[228] В различных вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент предусматривает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 21 и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO: 22 или последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны раскрытым последовательностям. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент имеет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 21, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 22.
[229] В различных вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В различных вариантах осуществления антитело к CD138 содержит константный домен тяжелой цепи IgG2a мыши и константный домен легкой каппа-цепи Ig мыши. В различных вариантах осуществления антитело к CD138 содержит константный домен тяжелой цепи IgG2a человека и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека.
[230] В различных вариантах осуществления антитело к CD138 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 21 или последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 21, и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 22 или последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 22. В конкретных вариантах осуществления антитело к CD138 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 21 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 22 или последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны раскрытым последовательностям. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 21, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 22. В различных вариантах осуществления антитело к CD138 представляет собой B-B4 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[231] В различных вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи B-B4, или где CDR содержат не более одного, двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислотных добавлений, делеций или замен в HCDR1 (SEQ ID NO: 7), HCDR2 (SEQ ID NO: 8), HCDR3 (SEQ ID NO: 9); LCDR1 (SEQ ID NO: 10), LCDR2 (SEQ ID NO: 11) и LCDR3 (SEQ ID NO: 12).
[232] В различных других вариантах осуществления раковый антиген-мишень для ADC представляет собой рецептор 2 эфрина типа A человека (EPHA2).
[233] В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи, указанные ниже: CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), состоящий из SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), состоящий из SEQ ID NO: 14, CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), состоящий из SEQ ID NO: 15; CDR1 легкой цепи (LCDR1), состоящий из SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи (LCDR2), состоящий из SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи (LCDR3), состоящий из SEQ ID NO: 18, как определено по системе нумерации по Kabat.
[234] В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент предусматривает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 23 и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO: 24 или последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны раскрытым последовательностям. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент имеет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 23, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 24.
[235] В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека.
[236] В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 23 или последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 24 или последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 24. В конкретных вариантах осуществления антитело к EPHA2 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 23 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 24 или последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны раскрытым последовательностям. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая на по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 содержит тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 23; и легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 24. В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 представляет собой 1C1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[237] В различных вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 1C1, или где CDR содержат не более одного, двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислотных добавлений, делеций или замен в HCDR1 (SEQ ID NO: 13), HCDR2 (SEQ ID NO: 14), HCDR3 (SEQ ID NO: 15); LCDR1 (SEQ ID NO: 16), LCDR2 (SEQ ID NO: 17) и LCDR3 (SEQ ID NO: 18).
[238] В различных вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой замены одиночных остатков. Вставки обычно будут иметь порядок от приблизительно 1 до приблизительно 20 аминокислотных остатков, хотя могут допускаться значительно более длинные вставки при условии, что сохраняется биологическая функция (например, связывание с антигеном-мишенью). Делеции обычно находится в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 20 аминокислотных остатков, хотя в некоторых случаях делеции могут быть намного более длинными. Замены, делеции, вставки или любые их комбинации могут применяться для достижения конечного производного или варианта. Обычно такие изменения выполняют на небольшом числе аминокислот, чтобы свести к минимуму изменение молекулы, в частности, иммуногенности и специфичности антигенсвязывающего белка. Однако в некоторых обстоятельствах могут допускаться более крупные изменения. Консервативные замены обычно выполняются в соответствии со следующей схемой, изображенной как таблица 6.
[239] Значительные изменения функции или иммунологической идентичности осуществляются путем выбора замен, которые являются менее консервативными, чем показанные в таблице 6. Например, можно осуществлять замены, которые в более значительной степени воздействуют на структуру полипептидного остова в области изменения, например, структуру типа альфа-спираль или бета-лист; заряд или гидрофобность молекулы в сайте-мишени или объем боковой цепи. Замены, которые в общем случае могут приводить к самым большим изменениям свойств полипептида, являются такими, при которых (a) гидрофильный остаток, например серил или треонил, замещен (или заменен) гидрофобным остатком, например лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аллилом; (b) цистеин или пролин замещены (или заменены) любым другим остатком; (c) остаток с электроположительной боковой цепью, например лизил, аргинил или гистидил, замещен (или заменен) электроотрицательным остатком, например глутамилом или аспартилом; или (d) остаток с объемной боковой цепью, например фенилаланин, замещен (или заменен) остатком, не имеющим боковой цепи, например глицином.
[240] В различных вариантах осуществления, где в ADC применяются варианты последовательностей антител, варианты, как правило, проявляют такую же качественную биологическую активность и будут вызывать такой же иммунный ответ, хотя при необходимости также могут быть выбраны варианты для модификации характеристик антигенсвязывающих белков. В качестве альтернативы вариант может быть разработан таким образом, чтобы биологическая активность антигенсвязывающего белка изменилась. Например, могут быть изменены или удалены сайты гликозилирования.
[241] Различные антитела могут применяться с ADC, применяемыми в данном документе, для целенаправленного воздействия на раковые клетки. Как показано ниже, конструкции линкер-полезная нагрузка в ADC, раскрытых в данном документе, являются неожиданно эффективными с антителами, целенаправленно воздействующими на разные опухолевые антигены. Подходящие антигены, экспрессируемые на опухолевых клетках, но не на здоровых клетках, или экспрессируемые на опухолевых клетках на более высоком уровне, чем на здоровых клетках, известны из уровня техники, также как и антитела, направленные против них. Эти антитела можно применять с линкерами и полезными нагрузками, представляющими собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, раскрытыми в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на HER2, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, целенаправленно воздействующие на HER2, представляют собой трастузумаб. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействуют на CD138, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, целенаправленно воздействующие на CD138, представляют собой B-B4. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на EPHA2, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, целенаправленно воздействующие на EPHA2, представляют собой 1C1. В некоторых вариантах осуществления помимо того, что раскрытые линкеры и полезные нагрузки, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, являются неожиданно эффективными с несколькими антителами, целенаправленно воздействующими на разные опухоли, при этом антитела, целенаправленно воздействующие на HER2, такие как трастузумаб, антитела, целенаправленно воздействующие на CD138, такие как B-B4, и антитела, целенаправленно воздействующие на EPHA2, такие как 1C1, обеспечивали особенно улучшенное соотношение лекарственного средства и антитела, уровень агрегации, стабильность (т.е. стабильность in vitro и in vivo), целенаправленное воздействие на опухоль (т.е. цитотоксичность, активность) и/или эффективность лечения. Улучшенная эффективность лечения может быть измерена in vitro или in vivo и может включать снижение скорости роста опухоли и/или уменьшение объема опухоли.
[242] В определенных вариантах осуществления применяются альтернативные антитела к одним и тем же мишеням или антитела к разным антигенам-мишеням, и они обеспечивают по меньшей мере некоторые из благоприятных функциональных свойств, описанных выше (например, улучшенную стабильность, улучшенное целенаправленное воздействие на опухоль, улучшенную эффективность лечения и т.д.). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих благоприятных функциональных свойств наблюдаются, если раскрытые линкеры и полезные нагрузки, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгированы с альтернативным антителом или антигенсвязывающим фрагментом, которые целенаправленно воздействуют на HER2, CD138 или EPHA2. В некоторых других вариантах осуществления некоторые или все из этих благоприятных функциональных свойств наблюдаются, если раскрытые линкеры и полезные нагрузки, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгированы с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, которые целенаправленно воздействуют на HER2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на HER2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, целенаправленно воздействующие на HER2, представляют собой трастузумаб. В некоторых других вариантах осуществления некоторые или все из этих благоприятных функциональных свойств наблюдаются, если раскрытые линкеры и полезные нагрузки, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгированы с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, которые целенаправленно воздействуют на CD138. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на CD138. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, целенаправленно воздействующие на CD138, представляют собой B-B4. В некоторых других вариантах осуществления некоторые или все из этих благоприятных функциональных свойств наблюдаются, если раскрытые линкеры и полезные нагрузки, представляющие собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгированы с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, которые целенаправленно воздействуют на EPHA2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на EPHA2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, целенаправленно воздействующие на EPHA2, представляют собой 1C1.
Линкеры
[243] В различных вариантах осуществления линкер в ADC является стабильным вне клетки в достаточной степени, чтобы быть терапевтически эффективным. В некоторых вариантах осуществления линкер является стабильным за пределами клетки, так что ADC остается интактным, когда он находится во внеклеточных условиях (например, до транспорта или доставки в клетку). Термин "интактный", используемый в контексте ADC, означает, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент остаются присоединенными к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство (например, к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена). Используемый в данном документе термин "стабильный" в контексте линкера или ADC, содержащего линкер, означает, что не более чем 20%, не более чем приблизительно 15%, не более чем приблизительно 10%, не более чем приблизительно 5%, не более чем приблизительно 3% или не более чем приблизительно 1% линкеров (или любой процент между ними) в образце ADC являются расщепленными (или в случае всего ADC иным образом не являются интактными), если ADC находится во внеклеточных условиях. В некоторых вариантах осуществления линкеры и/или ADC, раскрытые в данном документе, являются неожиданно стабильными по сравнению с альтернативными линкерами, и/или с ADC с альтернативными линкерами, и/или с полезными нагрузками, представляющими собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления ADC, раскрытые в данном документе, могут оставаться интактными в течение более чем приблизительно 48 часов, более чем 60 часов, более чем приблизительно 72 часов, более чем приблизительно 84 часов или более чем приблизительно 96 часов.
[244] Является ли линкер стабильным вне клетки, можно определить, например, путем помещения ADC в плазму крови на предварительно заданный период времени (например, 2, 4, 6, 8, 16, 24, 48 или 72 часа) и затем количественного определения количества свободного фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, присутствующего в плазме крови. Стабильность может обеспечивать для ADC время для локализации опухолевых клеток для целенаправленного воздействия и предотвращать преждевременное высвобождение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, что может снижать терапевтический индекс ADC при неизбирательном повреждении как нормальных, так и опухолевых тканей. В некоторых вариантах осуществления линкер является стабильным за пределами клетки-мишени и обеспечивает высвобождение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, из ADC после попадания внутрь клетки таким образом, что лекарственное средство может связываться с его мишенью (например, с комплексом сплайсосомы SF3b). Таким образом, эффективный линкер будет: (i) поддерживать свойства специфического связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента; (ii) обеспечивать доставку, например, внутриклеточную доставку фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, за счет стабильного присоединения к антителу или антигенсвязывающему фрагменту; (iii) сохранять стабильность и интактность до тех пор, пока ADC не будет транспортирован или доставлен к своему сайту-мишени; и (iv) обеспечивать терапевтический эффект, например, цитотоксический эффект фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, после расщепления или высвобождения по альтернативному механизму.
[245] Линкеры могут влиять на физико-химические свойства ADC. Поскольку многие цитотоксические средства являются гидрофобными по природе, связывание их с антителом с дополнительным гидрофобным фрагментом может приводить к агрегации. Агрегаты ADC являются нерастворимыми и зачастую ограничивают достижимую нагрузку лекарственным средством на антителе, что может отрицательно воздействовать на активность ADC. Белковые агрегаты биологических веществ, в целом, также связывались с повышенной иммуногенностью. Как показано ниже, линкеры, раскрытые в данном документе, приводят к получению ADC с низкими уровнями агрегации и требуемыми уровнями нагрузки лекарственным средством.
[246] Линкер может быть "расщепляемым" или "нерасщепляемым" (Ducry and Stump (2010) Bioconjugate Chem. 21:5-13). Расщепляемые линкеры разработаны для высвобождения фрагмента, представляющего собой лекарственное средство (например, модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена), при воздействии определенных факторов среды, например, при интернализации в клетку-мишень, при этом нерасщепляемые линкеры обычно зависят от разложения антитела или антигенсвязывающего фрагмента как таковых.
[247] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой нерасщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ADC, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, высвобождается при разложении антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Нерасщепляемые линкеры обычно остаются ковалентно ассоциированными с по меньшей мере одной аминокислотой антитела и лекарственным средством после интернализации в клетку-мишень и подвергаются разложению внутри нее. Многочисленные иллюстративные нерасщепляемые линкеры описаны в данном документе, а другие известны из уровня техники. Иллюстративные нерасщепляемые линкеры могут содержать тиоэфир, циклогексил, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) или N-гидроксисукцинимид (NHS), один или несколько полиэтиленгликолевых (PEG) фрагментов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 PEG-фрагментов, или один или несколько алкильных фрагментов.
[248] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. Расщепляемый линкер означает любой линкер, который содержит расщепляемый фрагмент. Используемый в данном документе термин "расщепляемый фрагмент" означает любую химическую связь, которая может расщепляться. Подходящие расщепляемые химические связи широко известны из уровня техники и включают без ограничения кислотолабильные связи, протеаза/пептидаза-лабильные связи, фотолабильные связи, дисульфидные связи и эстераза-лабильные связи. Линкеры, содержащие расщепляемый фрагмент, могут обеспечивать высвобождение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, из ADC посредством расщепления в конкретном сайте в линкере.
[249] В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется во внутриклеточных условиях таким образом, что расщепление линкера достаточным образом обеспечивает высвобождение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, из антитела или антигенсвязывающего фрагмента во внутриклеточной среде, чтобы активировать лекарственное средство и/или сделать лекарственное средство терапевтически эффективным. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, не отщепляется от антитела или антигенсвязывающего фрагмента до тех пор, пока ADC не попадет в клетку, которая экспрессирует антиген, специфический для антитела или антигенсвязывающего фрагмента из ADC, и фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, отщепляется от антитела или антигенсвязывающего фрагмента после попадания в клетку. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает расщепляемый фрагмент, который расположен таким образом, что никакая часть линкера, или антитела, или антигенсвязывающего фрагмента не остается связанной с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, после расщепления. Иллюстративные расщепляемые линкеры включают кислотолабильные линкеры, протеаза/пептидаза-чувствительные линкеры, фотолабильные линкеры, диметил-, дисульфид- или сульфонамид-содержащие линкеры.
[250] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой pH-чувствительный линкер, он является чувствительным к гидролизу при определенных значениях pH. Как правило, pH-чувствительный линкер расщепляется при кислотных условиях. Данная стратегия расщепления обычно использует преимущество более низкого pH в эндосомальном (pH~5-6) и лизосомальном (pH~4,8) внутриклеточных компартментах по сравнению с цитозолем (pH~7,4) для запуска гидролиза кислотолабильной группы в линкере, такой как гидразон (Jain et al. (2015) Pharm Res 32:3526-40). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой кислотолабильный и/или гидролизуемый линкер. Например, можно применять кислотолабильный линкер, который является гидролизуемым в лизосоме и содержит кислотолабильную группу (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, амид цис-аконитовой кислоты, сложный ортоэфир, ацеталь, кеталь или т.п.). См., например, патенты США №№5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik and Walker (1999) Pharm Therapeutics 83:67-123; Neville et al. (1989) Biol Chem. 264:14653-61. Такие линкеры являются относительно стабильными в условиях нейтрального pH, таких как условиях в крови, но являются нестабильными при pH ниже 5,5 или 5,0, приблизительном значении pH в лизосоме. В определенных вариантах осуществления гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, присоединенный к терапевтическому средству посредством ацилгидразоновой связи) (см., например, патент США №5622929).
[251] В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется в восстанавливающих условиях. В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется в присутствии восстановителя, такого как глутатион или дитиотреитол. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый дисульфидный линкер или расщепляемый сульфонамидный линкер.
[252] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый дисульфидный линкер. Из уровня техники известно множество дисульфидных линкеров, включая, например, линкеры, которые могут образовываться с применением SATA (N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)толуол), SPDB и SMPT. См., например, Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924-31; Wawrzynczak et al., в Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C.W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987). См. также патент США №4880935. Дисульфидные линкеры, как правило, применяются для использования обилия внутриклеточных тиолов, которые могут облегчать расщепление их дисульфидных связей. Внутриклеточные концентрации наиболее распространенного внутриклеточного тиола, восстановленного глутатиона, обычно находятся в диапазоне 1-10 нМ, что приблизительно в 1000 раз превышает концентрацию наиболее распространенного низкомолекулярного тиола в крови (т.е. цистеина) на уровне приблизительно 5 мкМ (Goldmacher et al., в Cancer Drug Discovery and Development: Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins (G. L. Phillips ed., Springer, 2013)). Внутриклеточные ферменты семейства протеиндисульфид-изомераз также могут участвовать во внутриклеточном расщеплении дисульфидного линкера. Используемый в данном документе расщепляемый дисульфидный линкер означает любой линкер, который содержит расщепляемый дисульфидный фрагмент. Термин "расщепляемый дисульфидный фрагмент" означает дисульфидную связь, которая может быть расщеплена и/или восстановлена, например, с помощью тиола или фермента.
[253] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый сульфонамидный линкер. Используемый в данном документе расщепляемый сульфонамидный линкер означает любой линкер, который содержит расщепляемый сульфонамидный фрагмент. Термин "расщепляемый сульфонамидный фрагмент" означает сульфонамидную группу, т.е. сульфонильную группу, присоединенную к аминогруппе, где связь сера-азот может быть расщеплена.
[254] В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой линкер дендритного типа для ковалентного присоединения более чем одного фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, к антителу или антигенсвязывающему фрагменту с помощью разветвленного мультифункционального линкерного фрагмента. См., например, Sun et al. (2002) Bioorg Med Chem Lett. 12:2213-5; Sun et al. (2003) Bioorg Med Chem. 11:1761-8. Дендритные линкеры могут повышать молярное соотношение лекарственного средства и антитела, т.е. нагрузку лекарственным средством, что связано с активностью ADC. Таким образом, если антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат только одну реакционноспособную тиольную группу цистеина, то, например, множество фрагментов, представляющих собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, можно присоединить посредством дендритного линкера. В некоторых вариантах осуществления линкерный фрагмент или линкер-фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, можно присоединять к антителу или антигенсвязывающему фрагменту путем химической реакции восстановления дисульфидных мостиков или технологии ограниченного использования лизина. См., например, публикации международных заявок №№ WO 2013/173391 и WO 2013/173393.
[255] В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляемым под действием расщепляющего средства, например, фермента, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в пределах лизосомы, или эндосомы, или кавеолы). Линкер может представлять собой, например, пептидный линкер, который расщепляется под действием внутриклеточного фермента пептидазы или протеазы, включая без ограничения лизосомальную или эндосомальную протеазу.
[256] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый пептидный линкер. Используемый в данном документе расщепляемый пептидный линкер означает любой линкер, который содержит расщепляемый пептидный фрагмент. Термин "расщепляемый пептидный фрагмент" означает любую химическую связь, связывающую аминокислоты (природные аминокислоты или синтетические производные аминокислот), которая может расщепляться по действием средства, которое присутствует во внутриклеточной среде. Например, линкер может содержать последовательность валин-аланин (Val-Ala) или последовательность валин-цитруллин (Val-Cit), которые являются расщепляемыми под действием пептидазы, такой как катепсин, например, катепсин B. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать последовательность глутаминовая кислота-валин-цитруллин (Glu-Val-Cit). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый ферментом линкер, и расщепляемый пептидный фрагмент в линкере является расщепляемым под действием фермента. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент является расщепляемым под действием лизосомального фермента, например, катепсина. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый катепсином линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент в линкере является расщепляемым под действием лизосомального цистеин-катепсина, такого как катепсин B, C, F, H, K, L, O, S, V, X или W. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент является расщепляемым под действием катепсина B. Иллюстративный дипептид, который может расщепляться под действием катепсина B, представляет собой валин-цитруллин (Val-Cit) (Dubowchik et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:855-69).
[257] В некоторых вариантах осуществления линкер или расщепляемый пептидный фрагмент в линкере содержит аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено обеспечивает расщепление линкера под действием протеазы, с облегчением, таким образом, высвобождения фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, из ADC после воздействия одной или нескольких внутриклеточных протеаз, таких как один или несколько лизосомальных ферментов (Doronina et al. (2003) Nat Biotechnol. 21:778-84; Dubowchik and Walker (1999) Pharm Therapeutics 83:67-123). Иллюстративные аминокислотные звенья включают без ограничения дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и пентапептиды. Иллюстративные дипептиды включают без ограничения, валин-аланин (Val-Ala), валин-цитруллин (Val-Cit), аланин-аспарагин (Ala-Asn), аланин-фенилаланин (Ala-Phe), фенилаланин-лизин (Phe-Lys), аланин-лизин (Ala-Lys), аланин-валин (Ala-Val), валин-лизин (Val-Lys), лизин-лизин (Lys-Lys), фенилаланин-цитруллин (Phe-Cit), лейцин-цитруллин (Leu-Cit), изолейцин-цитруллин (Ile-Cit), триптофан-цитруллин (Trp-Cit) и фенилаланин-аланин (Phe-Ala). Иллюстративные трипептиды включают без ограничения аланин-аланин-аспарагин (Ala-Ala-Asn), глицин-валин-цитруллин (Gly-Val-Cit), глицин-глицин-глицин (Gly-Gly-Gly), фенилаланин-фенилаланин-лизин (Phe-Phe-Lys), глутаминовая кислота-валин-цитруллин (Glu-Val-Cit) (см. Anami et al. (2018) Nat Comm. 9:2512) и глицин-фенилаланин-лизин (Gly-Phe-Lys). Другие иллюстративные аминокислотные звенья включают без ограничения Gly-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 34), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 35), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 36), Phe-N9-тозил-Arg и Phe-N9-нитро-Arg, описанные, например, в патенте США №6214345. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено в линкере содержит Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено в линкере содержит Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено в линкере содержит Glu-Val-Cit. Аминокислотное звено может содержать остатки аминокислот, которые встречаются в природе, и/или минорных аминокислот, и/или не встречающихся в природе аналогов аминокислот, таких как цитруллин. Аминокислотные звенья могут быть разработаны и оптимизированы для ферментативного расщепления под действием конкретного фермента, например, протеазы, ассоциированной с опухолью, лизосомальной протеазы, такой как катепсин B, C, D или S, или протеазы плазмина.
[258] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый β-глюкуронидный линкер. Используемый в данном документе расщепляемый β-глюкуронидный линкер означает любой линкер, который содержит расщепляемый β-глюкуронидный фрагмент. Иллюстративный расщепляемый β-глюкуронидный линкер предусматривает структуру:
[259] Термин "расщепляемый β-глюкуронидный фрагмент" означает гликозидную связь, которая может расщепляться под действием средства, характеризующегося β-глюкуронидазной активностью. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает гликозидную связь, которая может расщепляться под действием β-глюкуронидазы. β-глюкуронидаза представляет собой UDP-глюкуронозилтрансферазу, которая катализирует гидролиз гликозидной связи глюкуронидов с β-конфигурацией.
[260] В некоторых вариантах осуществления ADC, раскрытый в данном документе, содержит расщепляемый β-глюкуронидный фрагмент в линкере, который является расщепляемым под действием фермента. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый β-глюкуронидный фрагмент в линкере является расщепляемым под действием лизосомального фермента, например, β-глюкуронидазы. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый β-глюкуронидазой линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый β-глюкуронидный фрагмент в линкере обеспечивает расщепление линкера β-глюкуронидазой после интернализации ADC, таким образом облегчая высвобождение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, из ADC в клеточной среде.
[261] В некоторых вариантах осуществления линкер в любом из ADC, раскрытых в данном документе, может содержать по меньшей мере одно спейсерное звено, присоединяющее антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство (например, к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена). В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено между антителом или антигенсвязывающим фрагментом и расщепляемым фрагментом, если оно присутствует, соединяет сайт расщепления (например, расщепляемый пептидный фрагмент) в линкере с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено между фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, и расщепляемым фрагментом, если оно присутствует, соединяет сайт расщепления (например, расщепляемый пептидный фрагмент) в линкере с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления отсутствует, и спейсерное звено применяется для связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство.
[262] В некоторых вариантах осуществления линкер и/или спейсерное звено в линкере являются в значительной степени гидрофильными. Гидрофильный линкер можно применять для снижения степени, с которой лекарственное средство может быть выведено из устойчивых раковых клеток с помощью белка множественной лекарственной устойчивости (MDR) или функционально сходных транспортеров. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный линкер может содержать один или несколько полиэтиленгликолевых (PEG) фрагментов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 PEG-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает 2 PEG-фрагмента.
[263] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено в линкере содержит один или несколько PEG-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает один или несколько -(PEG)m-, и m представляет собой целое число от 1 до 10 (т.е. m может равняться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). В некоторых вариантах осуществления m находится в диапазоне от 1 до 10; от 2 до 8; от 2 до 6; от 2 до 5; от 2 до 4 или от 2 до 3. В некоторых вариантах осуществления m равняется 2. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9 или (PEG)10. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает (PEG)2.
[264] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено в линкере содержит алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает один или несколько -(CH2)n-, и n представляет собой целое число от 1 до 10 (т.е. n может равняться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). В некоторых вариантах осуществления n находится в диапазоне от 1 до 10; от 2 до 8; от 2 до 6; от 2 до 5; от 2 до 4 или от 2 до 3. В некоторых вариантах осуществления n равняется 2. В некоторых вариантах осуществления n равняется 5. В некоторых вариантах осуществления n равняется 6. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает (CH2)2, (CH2)3, (CH2)4, (CH2)5, (CH2)6, (CH2)7, (CH2)8, (CH2)9 или (CH2)10. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает (CH2)2 ("Et"). В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает (CH2)6 ("Hex"). В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает (CH2)2-O-(CH2)2 ("Et-O-Et").
[265] Спейсерное звено может применяться, например, для связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, либо непосредственно, либо опосредованно. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено непосредственно связывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент и фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, соединены посредством спейсерного звена, содержащего один или несколько PEG-фрагментов (например, (PEG)2) или один или несколько алкильных фрагментов (например, (CH2)2, (CH2)6 или (CH2)2-O-(CH2)2). В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено опосредованно связывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено связывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, опосредованно посредством расщепляемого фрагмента (например, расщепляемого пептида или расщепляемого β-глюкуронида) и/или фрагмента для присоединения, чтобы присоединить спейсерное звено к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, например, к малеимидному фрагменту.
[266] В различных вариантах осуществления спейсерное звено присоединяется к антителу или антигенсвязывающему фрагменту (т.е. к антителу или антигенсвязывающему фрагменту) посредством малеимидного (Mal) фрагмента.
[267] Спейсерное звено, которое присоединяется к антителу или антигенсвязывающему фрагменту с помощью Mal, называется в данном документе "Mal-спейсерным звеном". Используемый в данном документе термин "Mal" или "малеимидный фрагмент" означает соединение, которое содержит малеимидную группу и которое является реакционноспособным в отношении сульфгидрильной группы, например, сульфгидрильной группы остатка цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. Другие функциональные группы, которые являются реакционноспособными в отношении сульфгидрильных групп (тиолов), включают без ограничения йодацетамид, бромацетамид, винилпиридин, дисульфид, пиридилдисульфид, изоцианат и изотиоцианат. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено является реакционноспособным в отношении остатка цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединено к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством остатка цистеина. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает PEG-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает алкильный фрагмент.
[268] В определенных вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено предусматривает Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и Val-Cit, где Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и Val-Ala, где Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено и расщепляемый β-глюкуронидный фрагмент.
[269] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру MC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-(CH2)2 ("Mal-Et"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-(CH2)6 ("Mal-Hex"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-(CH2)2-O-(CH2)2 ("Mal-Et-O-Et"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-(PEG)2. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-(PEG)2-CO.
[270] В различных вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к расщепляемому пептидному фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено-пептид. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-спейсерное звено-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру MC-Val-Cit.
[271] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру Mal-спейсерное звено-Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает структуру MC-Val-Ala.
[272] В различных вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к расщепляемому β-глюкуронидному фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено-β-глюкуронид. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-β-глюкуронид.
[273] В различных вариантах осуществления расщепляемый фрагмент в линкере непосредственно присоединен к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В других вариантах осуществления спейсерное звено применяется для присоединения расщепляемого фрагмента в линкере к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В различных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью спейсерного звена.
[274] Спейсерное звено может быть "саморасщепляемым" или "несаморасщепляемым". "Несаморасщепляемое" спейсерное звено представляет собой спейсерное звено, в котором часть или все спейсерное звено остается связанным с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, после расщепления линкера. Примеры несаморасщепляемых спейсерных звеньев включают без ограничения глициновое спейсерное звено и глицин-глициновое спейсерное звено. Несаморасщепляемые спейсерные звенья иногда могут разлагаться со временем, но это не приводит к легкому высвобождению связанного нативного фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, целиком в условиях клетки. "Саморазрушающееся" спейсерное звено обеспечивает высвобождение нативного фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, во внутриклеточных условиях. "Нативное лекарственное средство" или "нативный фрагмент, представляющий собой лекарственное средство", представляет собой средство, в котором никакая часть спейсерного звена или другая химическая модификация не остается после расщепления/разложения спейсерного звена.
[275] Саморазрушающиеся химические структуры известны из уровня техники и могут быть легко выбраны для раскрытых ADC. В различных вариантах осуществления спейсерное звено, присоединяющее расщепляемый фрагмент в линкере к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, является саморасщепляемым и подвергается саморасщеплению незадолго перед расщеплением/после расщепления расщепляемого фрагмента во внутриклеточных условиях или одновременно с ним. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью саморасщепляемого спейсерного звена. В определенных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью саморасщепляемого спейсерного звена, при этом расщепляемый фрагмент предусматривает Val-Cit, а малеимидокапроил (MC) присоединяет расщепляемый фрагмент к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В определенных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью саморасщепляемого спейсерного звена, при этом расщепляемый фрагмент предусматривает Val-Ala, а малеимидокапроил (MC) присоединяет расщепляемый фрагмент к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В определенных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью саморасщепляемого спейсерного звена, при этом расщепляемый фрагмент предусматривает Glu-Val-Cit, а малеимидокапроил (MC) присоединяет расщепляемый фрагмент к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В определенных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством Mal-спейсерного звена (например, MC) в линкере, присоединенном к расщепляемому фрагменту Val-Cit и саморасщепляемому спейсерному звену pABC или pAB. В определенных других вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством Mal-спейсерного звена (например, MC) в линкере, присоединенном к расщепляемому фрагменту Val-Ala и саморасщепляемому спейсерному звену pABC или pAB. В определенных других вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством Mal-спейсерного звена (например, MC) в линкере, присоединенном к расщепляемому фрагменту Glu-Val-Cit и саморасщепляемому спейсерному звену pABC или pAB.
[276] В определенных вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено в линкере содержит п-аминобензильное звено. В некоторых вариантах осуществления п-аминобензиловый спирт (pABOH) присоединен к аминокислотному звену или другому расщепляемому фрагменту в линкере с помощью амидной связи, и между pABOH и фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, образуется карбамат, метилкарбамат или карбонат (Hamann et al. (2005) Expert Opin Ther Patents 15:1087-103). В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено представляет собой или содержит п-аминобензилоксикарбонил (pABC). Не ограничиваясь теорией, считается, что саморасщепление pABC включает спонтанную реакцию 1,6-элиминирования (Jain et al. (2015) Pharm Res. 32:3526-40).
[277] В различных вариантах осуществления структура п-аминобензилоксикарбонила (pABC), применяемого в раскрытых ADC, показана ниже:
[278] В различных вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено представляет собой pABC. В некоторых вариантах осуществления pABC присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления pABC подвергается саморасщеплению после расщепления расщепляемого фрагмента, и модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена высвобождается из ADC в его нативной активной форме.
[279] В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Cit-pABC. В других вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Ala-pABC.
[280] В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Cit-pABC. В других вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Ala-pABC.
[281] В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Cit-pABC. В других вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Ala-pABC.
[282] В некоторых вариантах осуществления pABC подвергается саморасщеплению после расщепления расщепляемого пептидного фрагмента в линкере. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает аминокислотное звено-pABC. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Glu-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pABC. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Ala-Ala-Asn-pABC.
[283] В некоторых вариантах осуществления pABC подвергается саморасщеплению после расщепления расщепляемого β-глюкуронидного фрагмента в линкере. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид-pABC.
[284] В определенных вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено в линкере содержит п-аминобензильное звено. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено в линкере содержит п-аминобензил (pAB). В некоторых вариантах осуществления саморасщепление pAB включает спонтанную реакцию 1,6-элиминирования.
[285] В различных вариантах осуществления структура п-аминобензила (pAB), применяемого в раскрытых ADC, показана ниже:
[286] В различных вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено представляет собой pAB. В некоторых вариантах осуществления pAB присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления pAB подвергается саморасщеплению после расщепления расщепляемого фрагмента, и модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена высвобождается из ADC в его нативной активной форме.
[287] В некоторых вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Cit-pAB. В других вариантах осуществления антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Ala-pAB.
[288] В некоторых вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Cit-pAB. В других вариантах осуществления антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Ala-pAB.
[289] В некоторых вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Cit-pAB. В других вариантах осуществления антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент присоединены к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена посредством линкера, содержащего MC-Val-Ala-pAB.
[290] В некоторых вариантах осуществления pAB подвергается саморасщеплению после расщепления расщепляемого пептидного фрагмента в линкере. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает аминокислотное звено-pAB. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pAB. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pAB. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Glu-Val-Cit-pAB. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено представляет собой Ala-Ala-Asn. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Ala-Ala-Asn-pAB.
[291] В некоторых вариантах осуществления pAB подвергается саморасщеплению после расщепления расщепляемого β-глюкуронидного фрагмента в линкере. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид-pAB.
[292] В некоторых других вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью несаморасщепляемого спейсерного звена. В определенных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью несаморасщепляемого спейсерного звена, при этом расщепляемый фрагмент предусматривает Val-Cit, а малеимидокапроил (MC) присоединяет расщепляемый фрагмент к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В определенных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена присоединен к расщепляемому фрагменту в линкере с помощью несаморасщепляемого спейсерного звена, при этом расщепляемый фрагмент предусматривает Val-Ala, а малеимидокапроил (MC) присоединяет расщепляемый фрагмент к антителу или антигенсвязывающему фрагменту.
[293] В различных аспектах антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC конъюгированы с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, посредством линкера, где линкер предусматривает Mal-спейсерное звено (например, MC), расщепляемое аминокислотное звено и pABC. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено-аминокислотное звено-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-аминокислотное звено-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Glu-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Ala-Ala-Asn-pABC.
[294] В различных других аспектах антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC конъюгированы с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, посредством линкера, где линкер предусматривает Mal-спейсерное звено (например, MC), расщепляемое аминокислотное звено и pAB. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено-аминокислотное звено-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-аминокислотное звено-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Glu-Val-Cit-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Ala-Ala-Asn-pAB.
[295] В различных других аспектах антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC конъюгированы с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, посредством линкера, где линкер предусматривает Mal-спейсерное звено (например, MC), расщепляемый β-глюкуронид и pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено-β-глюкуронид-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-β-глюкуронид-pABC.
[296] В еще одних аспектах антитело или антигенсвязывающий фрагмент из ADC конъюгированы с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, посредством линкера, где линкер предусматривает Mal-спейсерное звено (например, MC), расщепляемый β-глюкуронид и pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено-β-глюкуронид-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-β-глюкуронид-pAB.
[297] В различных вариантах осуществления соединение ADC имеет формулу (I):
Ab-(L-H)p (I),
где Ab представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку;
H представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена;
L представляет собой линкер, который ковалентно присоединяет Ab к D; и
p представляет собой целое число от 1 до 15.
[298] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) из ADC конъюгированы с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, посредством линкера, где линкер представляет собой любой из линкеров, раскрытых в данном документе или включенных в него посредством ссылки, или содержит один или несколько компонентов любого из линкеров, раскрытых в данном документе или включенных в него посредством ссылки.
[299] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает расщепляемый фрагмент, который расположен таким образом, что никакая часть линкера, или антитела, или антигенсвязывающего фрагмента не остается связанной с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена после расщепления. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый пептидный фрагмент, например, аминокислотное звено, такое как Val-Cit или Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено или линкер предусматривает Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено или линкер предусматривает Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено или линкер предусматривает Glu-Val-Cit.
[300] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает по меньшей мере одно спейсерное звено, соединяющее антитело или антигенсвязывающий фрагмент с расщепляемым фрагментом. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает по меньшей мере одно спейсерное звено, соединяющее антитело или антигенсвязывающий фрагмент с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено или линкер предусматривает по меньшей мере один алкильный фрагмент.
[301] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено в линкере присоединяется к антителу или антигенсвязывающему фрагменту с помощью Mal-фрагмента ("Mal-спейсерное звено"). В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено предусматривает по меньшей мере один алкильный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает малеимидокапроил (MC). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-(CH2)2 ("Mal-Et"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-(CH2)6 ("Mal-Hex"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-(CH2)2-O-(CH2)2 ("Mal-Et-O-Et"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-(PEG)2-CO. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство.
[302] В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(PEG)2, Mal-(PEG)3, Mal-(PEG)4, Mal-(PEG)5, Mal-(PEG)6, Mal-(PEG)7 или Mal-(PEG)8. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(PEG)2. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(PEG)2-CO, Mal-(PEG)3-CO, Mal-(PEG)4-CO, Mal-(PEG)5-CO, Mal-(PEG)6-CO, Mal-(PEG)7-CO или Mal-(PEG)8-CO. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(PEG)2-CO. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(PEG)2-CO и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления Mal-(PEG)2-CO присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-(PEG)2-CO или состоит из него. Пример линкера "Mal-(PEG)2-CO" также называется в данном документе "ADL2" или линкером "ADL2".
[303] В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает MC. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает MC и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления MC присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC или состоит из него. Пример линкера "MC" также называется в данном документе "ADL10" или линкером "ADL10".
[304] В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(CH2)6 ("Mal-Hex"). В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-Hex и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления Mal-Hex присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-Hex. Пример линкера "Mal-Hex" также называется в данном документе "ADL12" или линкером "ADL12".
[305] В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(CH2)2 ("Mal-Et"). В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-Et и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления Mal-Et присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-Et. Пример линкера "Mal-Et" также называется в данном документе "ADL14" или линкером "ADL14".
[306] В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-(CH2)2-O-(CH2)2 ("Mal-Et-O-Et"). В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает Mal-Et-O-Et и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления Mal-Et-O-Et присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-Et-O-Et. Пример линкера "Mal-Et-O-Et" также называется в данном документе "ADL15" или линкером "ADL15".
[307] В некоторых других вариантах осуществления Mal-спейсерное звено присоединяет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к расщепляемому фрагменту в линкере. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент в линкере представляет собой расщепляемый пептидный фрагмент, например, аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый пептидный фрагмент представляет собой Val-Cit или Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления Mal-спейсерное звено или линкер предусматривает MC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Glu-Val-Cit. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Ala-Ala-Asn.
[308] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено присоединяет расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено, которое присоединяет расщепляемый фрагмент к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена, является саморасщепляемым.
[309] В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает pABC. В некоторых вариантах осуществления pABC присоединяет расщепляемый фрагмент к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый пептидный фрагмент, например, аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает аминокислотное звено-pABC.
[310] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pABC и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit-pABC и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример линкера MC-Val-Cit-pABC также называется в данном документе "ADL1" или линкером "ADL1".
[311] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pABC и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala-pABC и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример линкера MC-Val-Ala-pABC также называется в данном документе "ADL6" или линкером "ADL6".
[312] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Glu-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Glu-Val-Cit-pABC и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Glu-Val-Cit-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Glu-Val-Cit-pABC и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример линкера MC-Glu-Val-Cit-pABC также называется в данном документе "ADL23" или линкером "ADL23".
[313] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Ala-Ala-Asn-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Ala-Ala-Asn-pABC и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Ala-Ala-Asn-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Ala-Ala-Asn-pABC и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример линкера MC-Ala-Ala-Asn-pABC также называется в данном документе "ADL21" или линкером "ADL21".
[314] В некоторых других вариантах осуществления спейсерное звено предусматривает pAB. В некоторых вариантах осуществления pAB присоединяет расщепляемый фрагмент к модулятору сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый пептидный фрагмент, например, аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает аминокислотное звено-pAB.
[315] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Ala-pAB и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Ala-pAB и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример линкера MC-Val-Ala-pAB также называется в данном документе "ADL5" или линкером "ADL5".
[316] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Val-Cit-pAB и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-Val-Cit-pAB и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример линкера MC-Val-Cit-pAB также называется в данном документе "ADL7" или линкером "ADL7".
[317] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид-pABC и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-β-глюкуронид-pABC. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-β-глюкуронид-pABC и по меньшей мере одно дополнительное спейсерное звено. Пример MC-β-глюкуронид-pABC также называется в данном документе "ADL13" или линкером "ADL13".
[318] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид-pAB. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид-pAB и MC-Mal-спейсерное звено, присоединяющее линкер к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает MC-β-глюкуронид-pAB.
[319] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, посредством линкера ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23. В различных вариантах осуществления было обнаружено, что ADC, содержащие линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23 и раскрытый в данном документе фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, демонстрируют свойства, требуемые для терапевтического ADC. В различных вариантах осуществления эти свойства включают без ограничения эффективные уровни нагрузки лекарственным средством, низкие уровни агрегации, стабильность при условиях хранения или при нахождении в кровотоке в организме (например, стабильность в сыворотке крови), сохранение аффинности в отношении клеток, экспрессирующих мишень, сравнимой с аффинностью неконъюгированного антитела, сильную цитотоксичность в отношении клеток, экспрессирующих мишень, низкие уровни нецелевого уничтожения клеток, высокие уровни неспецифического уничтожения и/или эффективную противораковую активность in vivo, все из них по сравнению с ADC, в которых применяются другие конструкции линкер-полезная нагрузка. Например, в различных вариантах осуществления ADC, содержащие линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23 и раскрытый в данном документе фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, проявляют повышенную способность к подавлению роста и/или пролиферации клеток, экспрессирующих мишень, по сравнению с ADC, в которых применяются другие конструкции линкер-полезная нагрузка (например, линкер ADL10 и фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена). В различных вариантах осуществления ADC, содержащие линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23 и раскрытый в данном документе фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, проявляют неожиданно повышенную стабильность in vivo (например, стабильность в плазме крови) по сравнению с ADC на основе другого модулятора сплайсинга (например, ADC на основе тайланстатина A, например, как сообщается в Puthenveetil et al. Bioconjugate Chem. (2016) 27:1880-8).
[320] В некоторых вариантах осуществления надлежащие или превосходные функциональные свойства, обеспечиваемые конкретной комбинацией линкера ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23 и раскрытого в данном документе фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на гербоксидиена, можно наблюдать, если конструкция линкер-полезная нагрузка конъюгирована, например, с антителом к HER2, таким как трастузумаб; антителом к CD138, таким как B-B4; или антителом к EPHA2, таким как 1C1.
[321] В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL1-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL2-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL5-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL6-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL7-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL12-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL13-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL14-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL15-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют способность к целенаправленному воздействию на неопластическую клетку и интернализации в нее.
[322] В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL1-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL2-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL5-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL6-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL7-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL12-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL13-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL14-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL15-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2.
[323] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2, представляют собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2, содержат три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 1 (HCDR1), SEQ ID NO: 2 (HCDR2) и SEQ ID NO: 3 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 4 (LCDR1), SEQ ID NO: 5 (LCDR2) и SEQ ID NO: 6 (LCDR3).
[324] В некоторых вариантах осуществления ADC имеет формулу (I):
Ab-(L-H)p (I),
где:
(i) Ab представляет собой антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 1 (HCDR1), SEQ ID NO: 2 (HCDR2) и SEQ ID NO: 3 (HCDR3); и определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 4 (LCDR1), SEQ ID NO: 5 (LCDR2) и SEQ ID NO: 6 (LCDR3);
(ii) H представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена;
(iii) L представляет собой линкер, предусматривающий ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23; и
(iv) p представляет собой целое число от 1 до 15.
[325] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую HER2, содержат константный домен тяжелой цепи IgG1 человека и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой трастузумаб. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 1 до 10, от 2 до 8 или от 4 до 8. В некоторых вариантах осуществления p равняется 4. В некоторых вариантах осуществления p равняется 8.
[326] В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL1-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL2-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL5-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL6-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL7-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL12-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL13-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL14-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL15-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138.
[327] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138, представляют собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138, содержат три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) и SEQ ID NO: 9 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) и SEQ ID NO: 12 (LCDR3).
[328] В некоторых вариантах осуществления ADC имеет формулу (I):
Ab-(L-H)p (I),
где:
(i) Ab представляет собой антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) и SEQ ID NO: 9 (HCDR3); и определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) и SEQ ID NO: 12 (LCDR3);
(ii) H представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена;
(iii) L представляет собой линкер, предусматривающий ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23; и
(iv) p представляет собой целое число от 1 до 15.
[329] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138, содержат константный домен тяжелой цепи IgG2a мыши и константный домен легкой каппа-цепи Ig мыши. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую CD138, содержат константный домен тяжелой цепи IgG2a человека и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой B-B4. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 1 до 10, от 2 до 8 или от 4 до 8. В некоторых вариантах осуществления p равняется 4. В некоторых вариантах осуществления p равняется 8.
[330] В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL1-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL2-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL5-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL6-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL7-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL12-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL13-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL14-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления ADC содержит ADL15-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2.
[331] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2, представляют собой интернализующееся антитело или интернализующийся антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2, содержат три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO: 14 (HCDR2) и SEQ ID NO: 15 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 16 (LCDR1), SEQ ID NO: 17 (LCDR2) и SEQ ID NO: 18 (LCDR3).
[332] В некоторых вариантах осуществления ADC имеет формулу (I):
Ab-(L-H)p (I),
где:
(i) Ab представляет собой антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO: 14 (HCDR2) и SEQ ID NO: 15 (HCDR3); и определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 16 (LCDR1), SEQ ID NO: 17 (LCDR2) и SEQ ID NO: 18 (LCDR3);
(ii) H представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена;
(iii) L представляет собой линкер, предусматривающий ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23; и
(iv) p представляет собой целое число от 1 до 15.
[333] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку, экспрессирующую EPHA2, содержат константный домен тяжелой цепи IgG1 человека и константный домен легкой каппа-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой 1C1. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 1 до 10, от 2 до 8 или от 4 до 8. В некоторых вариантах осуществления p равняется 4. В некоторых вариантах осуществления p равняется 8.
Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена
[334] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства формулы (I): Ab-(L-H)p, где Ab представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку; H представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена; L представляет собой линкер, который ковалентно присоединяет Ab к H; и p представляет собой целое число от 1 до 15.
[335] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (I): (I), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
Y выбран из O, S, NR6 и CR6R7;
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
R4 выбран из водорода, C1-C6алкильных групп, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил) и -C(=O)-NR6R7;
R5 выбран из водорода, гидроксила, -CH2-OH, -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), -C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8, -O-C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8 и -NR6-C(=O)-NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил), и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[336] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (Ia): (Ia), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R9 выбран из C3-C8гетероциклильных групп;
R10 выбран из H и C1-C6алкильных групп,
где каждый из R9 и R10 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, -NH2, -NH-(C1-C3алкил) и -N-(C1-C3алкил)2, и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[337] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (Ib): (Ib), или его фармацевтически
[338] приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R11 выбран из , и , где * обозначает точку присоединения R11 к остальной части соединения;
каждый из R12 и R13 независимо выбран из H и метила; и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[339] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (II): (II), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
X представляет собой гидроксил или NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8, -C(=O)-O-R8, -(C1-C6алкил)-O-C(=O)-R8 и -(C1-C6алкил)-NH-C(=O)-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0-1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил), и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[340] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (IIa): (II), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
Z выбран из NR9 и O;
R9 выбран из водорода и C1-C6алкильных групп;
каждый из R10 и R11 независимо выбран из водорода, галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп;
R12 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп, C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R9, R10, R11 и R12 независимо замещен 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп и C1-C3галогеналкильных групп;
t представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[341] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (IIb): (IIb), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R13 выбран из , , , , , , , , , и , где * обозначает точку присоединения R13 к остальной части соединения;
каждый из R14 и R15 независимо выбран из водорода и метила; и
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена.
[342] В некоторых вариантах осуществления H, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, предусматривает соединение формулы (III): (III), или его фармацевтически приемлемую соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8;
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп; и
R9 выбран из H, , , , , , , , , и ;
где каждый из R1, R2, R3, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил),
где валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена; и
где * обозначает точку присоединения R9 к остальной части соединения.
[343] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 и/или STEAP1.
[344] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую HER2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 1 (HCDR1), SEQ ID NO: 2 (HCDR2) и SEQ ID NO: 3 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 4 (LCDR1), SEQ ID NO: 5 (LCDR2) и SEQ ID NO: 6 (LCDR3). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig человека.
[345] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую CD138. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) и SEQ ID NO: 9 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) и SEQ ID NO: 12 (LCDR3). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG2a мыши. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig мыши. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG2a человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig человека.
[346] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую EPHA2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO: 14 (HCDR2) и SEQ ID NO: 15 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 16 (LCDR1), SEQ ID NO: 17 (LCDR2) и SEQ ID NO: 18 (LCDR3). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig человека.
[347] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую MSLN. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к MSLN или его антигенсвязывающий фрагмент.
[348] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую FOLH1. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к FOLH1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[349] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую CDH6. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к CDH6 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[350] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую CEACAM5. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к CEACAM5 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[351] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую CFC1B. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к CFC1B или его антигенсвязывающий фрагмент.
[352] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую ENPP3. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к ENPP3 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[353] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую FOLR1. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к FOLR1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[354] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую HAVCR1. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к HAVCR1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[355] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую KIT. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к KIT или его антигенсвязывающий фрагмент.
[356] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую MET. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к MET или его антигенсвязывающий фрагмент.
[357] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую MUC16. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[358] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую SLC39A6. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к SLC39A6 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[359] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую SLC44A4. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к SLC44A4 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[360] В некоторых других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент целенаправленно воздействует на клетку, экспрессирующую STEAP1. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к STEAP1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[361] В некоторых вариантах осуществления L выбран из любого из линкеров, раскрытых в данном документе, или любой комбинации линкерных компонентов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер, предусматривающий MC-Val-Cit-pABC, Mal-(PEG)2-CO, MC-Val-Ala-pAB, MC-Val-Ala-pABC, MC-Val-Cit-pAB, Mal-Hex, Mal-Et или Mal-Et-O-Et. В некоторых вариантах осуществления линкер также может предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой линкер ADL12, ADL14 или ADL15. В некоторых вариантах осуществления линкер ADL1, ADL2, ADL5, ADL6, ADL7, ADL12, ADL13, ADL14, ADL15, ADL21 или ADL23 может также предусматривать одно или несколько дополнительных спейсерных звеньев.
[362] В определенных вариантах осуществления промежуточное соединение, которое является предшественником линкерного фрагмента, подвергают реакции с фрагментом, представляющим собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, в подходящих условиях. В определенных вариантах осуществления применяются реакционноспособные группы в модуляторе сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или в промежуточном соединении, или в линкере. Продукт реакции между модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена и промежуточным соединением, или дериватизированный модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена плюс линкер), впоследствии подвергают реакции с антителом или антигенсвязывающим фрагментом в подходящих условиях. В качестве альтернативы, промежуточное соединение или линкер можно сначала подвергать реакции с антителом или антигенсвязывающим фрагментом или дериватизированным антителом или антигенсвязывающим фрагментом, а затем подвергать реакции с лекарственным средством или дериватизированным лекарственным средством.
[363] Ряд различных реакций доступен для ковалентного присоединения фрагмента, представляющего собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или линкерного фрагмента к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. Это часто осуществляется посредством реакции одного или нескольких аминокислотных остатков антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включая аминогруппы лизина, свободные группы карбоновой кислоты глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильные группы цистеина и различные фрагменты ароматических аминокислот. Например, неспецифическое ковалентное присоединение можно осуществлять с применением карбодиимидной реакции для связывания карбокси- (или амино-) группы во фрагменте, представляющем собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, с амино- (или карбокси-) группой в антителе или антигенсвязывающем фрагменте. Дополнительно, для связывания аминогруппы во фрагменте, представляющем собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, с аминогруппой в антителе или антигенсвязывающем фрагменте можно также применять бифункциональные средства, такие как диальдегиды или сложные имидоэфиры. Для присоединения лекарственных средств (например, модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена) к связывающим средствам также подходит реакция с образованием основания Шиффа. Данный способ предусматривает перйодатное окисление лекарственного средства, которое содержит гликолевые или гидроксигруппы, в результате чего образуется альдегид, который затем подвергают реакции со связывающим средством. Присоединение происходит путем образования основания Шиффа с аминогруппами связывающего средства. Изотиоцианаты также можно применять в качестве средств для сочетания для ковалентного присоединения лекарственных средств к связывающим средствам. Другие методики известны специалисту в данной области техники и находятся в пределах объема настоящего изобретения. Примеры фрагментов, представляющих собой лекарственное средство, которые могут быть получены и связаны с антителом или антигенсвязывающим фрагментом с применением различных химических структур, известных из уровня техники, включают модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена, например, модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена, описанные и приведенные в качестве примера в данном документе.
Соединения, представляющие собой конструкцию линкер-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена/модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена
[364] В данном документе дополнительно раскрыты иллюстративные соединения, представляющие собой конструкцию линкер-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (L-H), а также композиции, содержащие множество копий таких соединений. В различных вариантах осуществления соединения, представляющие собой конструкцию линкер-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, раскрытые в данном документе, могут определяться общей формулой L-H, где L = линкерный фрагмент, а H = модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. В некоторых вариантах осуществления раскрытые соединения L-H подходят для применения в ADC, описанных в данном документе.
[365] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты соединения формулы (I): (I), или их фармацевтически приемлемая соль, где
Y выбран из O, S, NR6 и CR6R7;
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
R4 выбран из водорода, C1-C6алкильных групп, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил) и -C(=O)-NR6R7;
R5 выбран из водорода, гидроксила, -CH2-OH, -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), -C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8, -O-C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8 и -NR6-C(=O)-NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил).
[366] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (Ia): (Ia), или их фармацевтически приемлемая соль, которые ковалентно присоединены к L посредством любого атома, где
R9 выбран из C3-C8гетероциклильных групп; и
R10 выбран из H и C1-C6алкильных групп,
где каждый из R9 и R10 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, -NH2, -NH-(C1-C3алкил) и -N-(C1-C3алкил)2.
[367] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (Ib): (Ib), или их фармацевтически приемлемая соль, где
R11 выбран из , и , где * обозначает точку присоединения R11 к остальной части соединения;
каждый из R12 и R13 независимо выбран из H и метила.
[368] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (II): (II), или их фармацевтически приемлемая соль, где
X представляет собой гидроксил или NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8, -C(=O)-O-R8, -(C1-C6алкил)-O-C(=O)-R8 и -(C1-C6алкил)-NH-C(=O)-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0-1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил).
[369] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (IIa): (IIa), или их фармацевтически приемлемая соль, где
Z выбран из NR9 и O;
R9 выбран из водорода и C1-C6алкильных групп;
каждый из R10 и R11 независимо выбран из водорода, галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп;
R12 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп, C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R9, R10, R11 и R12 независимо замещен 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп и C1-C3галогеналкильных групп; и
t представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5 и 6.
[370] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (IIb): (IIb), или их фармацевтически приемлемая соль, где
R13 выбран из , , , , , , , , , и , где * обозначает точку присоединения R13 к остальной части соединения; и
каждый из R14 и R15 независимо выбран из водорода и метила.
[371] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены соединения формулы (III): (III), или их фармацевтически приемлемая соль, где
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8;
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп; и
R9 выбран из H, , , , , , , , и
,
где каждый из R1, R2, R3, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил); и
где * обозначает точку присоединения R9 к остальной части соединения.
[372] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H1 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H4 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H5 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H6 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H7 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H8 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H9 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H10 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H2 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H3 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H12 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H13 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H14 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H15 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H16 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H17 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H18 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H19 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H20 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H21 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H22 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H23 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H24 или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение H25 или его фармацевтически приемлемая соль.
[373] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлено соединение, выбранное из:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
, и его фармацевтически приемлемые соли,
где L представляет собой линкер, который ковалентно присоединен к антителу.
[374] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает по меньшей мере один расщепляемый пептидный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один расщепляемый пептидный фрагмент является расщепляемым под действием фермента. В некоторых вариантах осуществления линкер или расщепляемый пептидный фрагмент предусматривает по меньшей мере одно аминокислотное звено. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено выбрано из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, пролина, аланина, валина, изолейцина, метионина, фенилаланина, тирозина, триптофана и цитруллина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено выбрано из аланина, цитруллина и валина. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает цитруллин и валин. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает аланин и валин.
[375] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает фрагмент, выбранный из сульфонамида, β-глюкуронида, дисульфида и карбонила. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает сульфонамид. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает β-глюкуронид. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает дисульфид. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает карбонил.
[376] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления спейсерное звено выбрано из алкильных групп и полиэтиленгликолевых (PEG) фрагментов. В некоторых вариантах осуществления алкильных группа представляет собой C1-C12алкильную группу. В некоторых вариантах осуществления алкильных группа представляет собой C1-C6алкильную группу. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой метилен. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой этилен. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой н-пропилен. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой н-бутилен. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой н-пентилен. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой н-гексилен. В некоторых вариантах осуществления PEG-фрагмент предусматривает -(PEG)m-, где m представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления m равняется 1. В некоторых вариантах осуществления m равняется 2. В некоторых вариантах осуществления m равняется 3. В некоторых вариантах осуществления m равняется 4. В некоторых вариантах осуществления m равняется 5. В некоторых вариантах осуществления m равняется 6.
[377] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает малеимидный (Mal) фрагмент ("Mal-спейсерное звено"). В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает саморасщепляемое спейсерное звено. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемое спейсерное звено выбрано из п-аминобензилоксикарбонила (pABC) и п-аминобензила (pAB).
[378] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено, алкильную группу, по меньшей мере одно аминокислотное звено и саморасщепляемый спейсер. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено выбрано из аланина, цитруллина и валина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено предусматривает аланин и валин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено предусматривает цитруллин и валин. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемый спейсер выбран из pAB и pABC. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемый спейсер содержит pAB. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемый спейсер содержит pABC. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа предусматривает C1-C6алкильную группу.
[379] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает Mal-спейсерное звено, PEG-фрагмент, по меньшей мере одно аминокислотное звено и саморасщепляемый спейсер. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено выбрано из аланина, цитруллина и валина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено предусматривает аланин и валин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно аминокислотное звено предусматривает цитруллин и валин. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемый спейсер выбран из pAB и pABC. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемый спейсер содержит pAB. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляемый спейсер содержит pABC. В некоторых вариантах осуществления PEG-фрагмент предусматривает -(PEG)m-, где m представляет собой целое число от 1 до 6.
Нагрузка лекарственным средством
[380] Нагрузка лекарственным средством выражается в p, и в данном документе она также упоминается как соотношение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена и антитела (HAR). Нагрузка лекарственным средством может находиться в диапазоне от 1 до 10 фрагментов лекарственного средства на антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 1 до 8. В некоторых вариантах осуществления, p представляет собой целое число от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления p представляет собой целое число от 2 до 4. В некоторых вариантах осуществления, p представляет собой целое число от 3 до 4. В других вариантах осуществления p представляет собой целое число от 4 до 8. В других вариантах осуществления p равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, предпочтительно 4 или 8.
[381] Нагрузка лекарственным средством может быть ограничена числом сайтов прикрепления на антителе или антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления линкерный фрагмент (L) ADC прикрепляется к антителу или антигенсвязывающему фрагменту посредством химически активной группы на одном или нескольких аминокислотных остатков на антителе или антигенсвязывающем фрагменте. Например, линкер может быть прикреплен к антителу или антигенсвязывающему фрагменту через свободную амино-, имино-, гидроксильную, тиольную или карбоксильную группу (например, к N- или C-концу, эпсилон-аминогруппе одного или нескольких остатков лизина, к свободной карбоксильной группе одного или нескольких остатков глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или к сульфгидрильной группе одного или нескольких остатков цистеина). Сайт, к которому прикрепляется линкер, может представлять собой природный остаток в аминокислотной последовательности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, или его можно встраивать в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, например, посредством технологии рекомбинантных ДНК (например, путем введения остатка цистеина в аминокислотную последовательность) или посредством изменения биохимических свойств белка (например, путем восстановления, изменения показателя pH или гидролиза).
[382] В некоторых вариантах осуществления число фрагментов-лекарственных средств, которое может быть конъюгировано с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, ограничено числом остатков цистеина. Например, в случае если прикрепление осуществляется за счет тиольной группы цистеинового остатка, антитело может содержать лишь одну или несколько тиольных групп цистеиновых остатков или может содержать одну или несколько в достаточной степени реакционноспособных тиольных групп, посредством которых может быть прикреплен линкер. Обычно антитела не содержат много свободных и реакционноспособных тиольных групп цистеиновых остатков, которые могут быть связаны с фрагментом-лекарственным средством. В действительности, большинство тиольных групп цистеиновых остатков в антителе вовлечены в образование или межцепочечной, или внутрицепочечной дисульфидных связей. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления конъюгация с цистеинами может потребовать по меньшей мере частичного восстановления антитела. Избыточное прикрепление линкера-токсина к антителу может дестабилизировать антитело за счет восстановления доступных остатков цистеина с образованием дисульфидных связей. Следовательно, оптимальное соотношение лекарственное средство:антитело должно увеличивать активность ADC (за счет увеличения числа прикрепляемых фрагментов-лекарственных средств на антитело) без дестабилизации антитела или антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления оптимальное соотношение может составлять 2, 4, 6 или 8.
[383] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент подвергают воздействию восстанавливающих условий перед конъюгацией с целью образования одного или нескольких свободных остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления антитело может быть подвергнуто восстановлению с помощью восстанавливающего средства, такого как дитиотреитол (DTT) или трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), в условиях частичного или полного восстановления с образованием реакционноспособных тиольных групп цистеина. Неспаренные цистеины могут быть получены посредством частичного восстановления с ограниченными молярными эквивалентами TCEP, который может восстанавливать внутрицепочечные дисульфидные связи, которые соединяют легкую цепь и тяжелую цепь (одна пара на спаривание H-L) и две тяжелые цепи в шарнирной области (две пары на спаривание H-H в случае IgG1 человека), при этом внутрицепочечные дисульфидные связи остаются нетронутыми (Stefano et al. (2013) Methods Mol Biol. 1045:145-71). В одном варианте осуществления дисульфидные связи в антителе восстанавливают электрохимическим способом, например, посредством использования рабочего электрода, который прикладывает восстанавливающее и окисляющее электрическое напряжение. Данный подход может обеспечивать возможность последовательного объединения восстановления дисульфидной связи с аналитическим устройством (например, электрохимическим детектором, ЯМР-спектрометром или масс-спектрометром), или устройством для химического разделения (например, жидкостным хроматографом (например, HPLC), или устройством для электрофореза (см., например, публикацию заявки на патент США № 20140069822)). В некоторых вариантах осуществления антитело подвергают воздействию денатурирующих условий для выявления реакционноспособных нуклеофильных групп на остатках аминокислот, таких как цистеин.
[384] Нагрузку лекарственным средством ADC можно контролировать разными способами, например, посредством: (i) ограничения молярного избытка промежуточного соединения, представляющего собой лекарственное средство-линкер, или реагента, представляющего собой линкер, относительно антитела; (ii) ограничения времени реакции конъюгации или температуры; (iii) частичных или ограничивающих восстановительных условий для модификации тиольных групп цистеина; и/или (iv) конструирования посредством рекомбинантных методик аминокислотной последовательности антитела так, чтобы число и положение остатков цистеина подвергалось модификации для контроля количества и/или положения сайтов прикрепления для линкера-лекарственного средства.
[385] В некоторых вариантах осуществления свободные остатки цистеина вводят в аминокислотную последовательность антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, могут быть получены антитела, модифицированные цистеином, где одна или несколько аминокислот в родительском антителе заменены аминокислотой цистеином. Любая форма антитела может быть таким образом сконструирована, то есть мутирована. Например, Fab-фрагмент родительского антитела может быть сконструирован с получением Fab, модифицированного цистеином, называемого как "ThioFab". Аналогично родительское моноклональное антитело может быть сконструировано с получением "ThioMab". Мутация в одном сайте дает один модифицированный остаток цистеина в ThioFab, тогда как мутация в одном сайте дает два модифицированных остатка цистеина в ThioMab вследствие димерной природы антитела IgG. ДНК, кодирующая вариант аминокислотной последовательности родительского полипептида, может быть получена посредством множества способов, известных из уровня техники (см., например, способы, описанные в международной публикации № WO 2006/034488). Такие способы включают без ограничения, получение посредством сайт-направленного (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза предварительно полученной ДНК, кодирующей полипептид. Варианты рекомбинантных антител также могут быть сконструированы посредством манипуляции с рестриктазами или посредством ПЦР с перекрывающимися праймеры с использованием синтетических олигонуклеотидов. ADC формулы (I) включают без ограничения антитела, которые имеют 1, 2, 3 или 4 модифицированные аминокислоты цистеин (Lyon et al. (2012) Methods Enzymol. 502:123-38). В некоторых вариантах осуществления один или несколько свободных цистеиновых остатков уже присутствуют в антителе или антигенсвязывающем фрагменте без использования генной инженерии, в этом случае существующие цистеиновые остатки могут использоваться для конъюгации антитела или антигенсвязывающего фрагмента с фрагментом-лекарственным средством.
[386] При этом более одной нуклеофильной группы вступают в реакцию с промежуточным соединением, представляющим собой лекарственное средство-линкер, или реагентом, представляющим собой линкерный фрагмент, а затем с реагентом, представляющим собой фрагмент-лекарственное средство, в реакционной смеси, содержащей множество копий антитела или антигенсвязывающего фрагмента и линкерного фрагмента, затем полученный продукт может представлять собой смесь соединений ADC с распределением одного или нескольких фрагментов-лекарственных средств, прикрепленных к каждой копии антитела или антигенсвязывающего фрагмента в смеси. В некоторых вариантах осуществления нагрузка лекарственным средством в смеси ADC, полученная в результате реакции конъюгации, находится в диапазоне от 1 до 10 фрагментов-лекарственных средств, прикрепленных на антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент (т.е. среднюю нагрузку лекарственным средством или среднее p) можно рассчитать посредством любого общепринятого способа, известного в данной области техники, например, посредством масс-спектрометрии (например, LC-MS с обращенной фазой), и/или высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, HIC-HPLC). В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент определяют посредством хроматографии с гидрофобным взаимодействием - высокоэффективной жидкостной хроматографии (HIC-HPLC). В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент определяют посредством жидкостной хроматографии с обращенной фазой - масс-спектрометрии (LC-MS). В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 3,5, от приблизительно 2,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 3,5 до приблизительно 5,5, от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5 или от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,5. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент составляет от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 4 до приблизительно 6, от приблизительно 5 до приблизительно 7, от приблизительно 6 до приблизительно 8, от приблизительно 7 до приблизительно 9, от приблизительно 2 до приблизительно 8 или от приблизительно 4 до приблизительно 8.
[387] В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент равняется приблизительно 2. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент составляет приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4 или приблизительно 2,5. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент равняется 2.
[388] В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент равняется приблизительно 4. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент составляет приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9, приблизительно 4, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4 или приблизительно 4,5. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент равняется 4.
[389] В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент равняется приблизительно 8. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент составляет приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9, приблизительно 8, приблизительно 8,1, приблизительно 8,2, приблизительно 8,3, приблизительно 8,4 или приблизительно 8,5. В некоторых вариантах осуществления среднее число фрагментов-лекарственных средств на антитело или антигенсвязывающий фрагмент равняется 8.
[390] В различных вариантах осуществления термин "приблизительно" при использовании в отношении среднего количества фрагментов, представляющих собой лекарственное средство, на антитело или антигенсвязывающий фрагмент, означает плюс или минус 10%.
[391] Отдельные соединения, представляющие собой ADC, или "молекулы" могут быть идентифицированы в смеси с помощью масс-спектрометрии и разделены с помощью UPLC или HPLC, например, хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC-HPLC). В некоторых вариантах осуществления однородный или практически однородный продукт ADC с одним значением нагрузки может быть выделен из конъюгационной смеси, например, посредством электрофореза или хроматографии.
[392] В некоторых вариантах осуществления более высокая нагрузка лекарственным средством (например, p > 8) может приводить к агрегации, нерастворимости, токсичности и потере способности проникать в клетку у определенных конъюгатов антитела и лекарственного средства. Более высокая нагрузка лекарственным средством также может отрицательно влиять на фармакокинетику (например, клиренс) определенных ADC. В некоторых вариантах осуществления более низкая нагрузка лекарственным средством (например, p < 2) может снижать активность определенных ADC в отношении клеток, экспрессирующих мишени, и/или нецелевых клеток. В некоторых вариантах осуществления нагрузка лекарственным средством для ADC по настоящему изобретению находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 8; от приблизительно 2 до приблизительно 6; от приблизительно 2 до приблизительно 5; от приблизительно 3 до приблизительно 5; от приблизительно 2 до приблизительно 4 или от приблизительно 4 до приблизительно 8.
[393] В некоторых вариантах осуществления обеспечивается нагрузка лекарственным средством и/или средняя нагрузка лекарственным средством, составляющая приблизительно 2, например, посредством частичного восстановления внутрицепочечных дисульфидов на антителе или антигенсвязывающем фрагменте, что обеспечивает полезные свойства. В некоторых вариантах осуществления обеспечивается нагрузка лекарственным средством и/или средняя нагрузка лекарственным средством, составляющая приблизительно 4, например, посредством частичного восстановления внутрицепочечных дисульфидов на антителе или антигенсвязывающем фрагменте, что обеспечивает полезные свойства. В некоторых вариантах осуществления обеспечивается нагрузка лекарственным средством и/или средняя нагрузка лекарственным средством, составляющая приблизительно 8, например, посредством частичного восстановления внутрицепочечных дисульфидов на антителе или антигенсвязывающем фрагменте, что обеспечивает полезные свойства. В некоторых вариантах осуществления нагрузка лекарственным средством и/или средняя нагрузка лекарственным средством, составляющая менее приблизительно 2, может давать неприемлемо высокий уровень неконъюгированных фрагментов антител, которые могут конкурировать с ADC за связывание с антигеном-мишенью и/или обусловливать низкую эффективность лечения. В некоторых вариантах осуществления нагрузка лекарственным средством и/или средняя нагрузка лекарственным средством, составляющая более приблизительно 8, может давать неприемлемо высокий уровень неоднородности продукта и/или агрегации ADC. Нагрузка лекарственным средством и/или средняя нагрузка лекарственным средством, составляющая более приблизительно 8, также может оказывать влияние на стабильность ADC вследствие потери одной или нескольких химических связей, требующихся для стабилизации антитела или антигенсвязывающего фрагмента.
[394] В настоящее изобретение включены способы получения описанных ADC. Вкратце, ADC содержат антитело или антигенсвязывающий фрагмент в качестве антитела или антигенсвязывающего фрагмента, фрагмент, представляющий собой лекарственное средство (например, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена), и линкер, который соединяет фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления ADC могут быть получены с применением линкера, содержащего реакционноспособные функциональные группы для ковалентного присоединения к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, и к антителу или антигенсвязывающему фрагменту. Например, в некоторых вариантах осуществления тиольная группа цистеина в антителе или антигенсвязывающем фрагменте способна образовывать связь с реакционноспособной функциональной группой линкера или промежуточного соединения, представляющего собой лекарственное средство-линкер (например, с малеимидным фрагментом), с получением ADC. Получение ADC можно осуществлять посредством любой методики, известной специалисту в данной области техники.
[395] В некоторых вариантах осуществления ADC получают путем последовательного приведения в контакт антитела или антигенсвязывающего фрагмента с линкером и фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена), таким образом, чтобы антитело или антигенсвязывающий фрагмент сначала ковалентно связывались с линкером, а затем предварительно образованное промежуточное соединение, представляющее собой антитело-линкер, реагировало с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство. Промежуточное соединение, представляющее собой антитело-линкер, может быть подвергнуто или может не быть подвергнуто стадии очистки до приведения в контакт с фрагментом-лекарственным средством. В других вариантах осуществления ADC получают путем приведения антитела или антигенсвязывающего фрагмента в контакт с соединением, представляющим собой линкер-лекарственное средство, предварительно образованным путем осуществления реакции линкера с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство. Предварительно образованное соединение, представляющее собой линкер-лекарственное средство, можно подвергать или не подвергать стадии очистки до приведения в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. В других вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент приводят в контакт с линкером и фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, в одной реакционной смеси, что обеспечивает одновременное образование ковалентных связей между антителом или антигенсвязывающим фрагментом и линкером и между линкером и фрагментом, представляющим собой лекарственное средство. Данный способ получения ADC может включать реакцию, в которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент приводят в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом перед добавлением линкер в реакционную смесь и наоборот. В некоторых вариантах осуществления ADC получают путем осуществления реакции антитела или антигенсвязывающего фрагмента с линкером, присоединенным к фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, такому как ADL1-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (например, ADL1-79392) или ADL5-модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (например, ADL5-0349), в условиях, которые обеспечивают конъюгацию.
[396] ADC, полученные в соответствии со способами, описанными выше, могут быть подвергнуты стадии очистки. Стадия очистки может включать любые биохимические способы, известные в данной области техники, предназначенные для проведения очистки белков, или любую комбинацию данных способов. Такие способы включают без ограничения фильтрацию с тангенциальным потоком (TFF), аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, любую хроматографию с переносом заряда или хроматографию на основе изоэлектрического фокусирования, хроматографию со смешанными режимами, например с использованием CHT (керамического гидроксиапатита), хроматографию с гидрофобным взаимодействием, эксклюзионную хроматографию, диализ, фильтрацию, селективное осаждение или любую их комбинацию.
Варианты терапевтического применения и композиции
[397] В данном документе раскрыты способы применения ADC и композиций в лечении у субъекта нарушения, например неопластического нарушения. ADC можно вводить отдельно или в комбинации со вторым терапевтическим средством, и может вводиться в любом фармацевтически приемлемых составе, дозировке и схеме введения. Эффективность лечения с использованием ADC может быть оценена на токсичность, а также показатели эффективность, и, соответственно, скорректирована. Показатели эффективности включают без ограничения цитостатический и/или цитотоксический эффект, наблюдаемые in vitro или in vivo, уменьшение объема опухоли, торможение роста опухоли и/или длительное выживание.
[398] Известны способы определения того, оказывает ли ADC цитостатический и/или цитотоксический эффект на клетку. Например, цитотоксическая или цитостатическая активность ADC может быть измерена путем: воздействия ADC на клетки млекопитающих, экспрессирующих целевой белок, в среде для культивирования клеток; культивирование клеток в течение периода времени от приблизительно 6 часов до приблизительно 6 дней и измерение жизнеспособности клеток. Клеточные анализы in vitro также можно использовать для измерения жизнеспособности (пролиферации), цитотоксичности и индуцирования апоптоза (активации каспаз) посредством ADC.
[399] Для определения того, оказывает ли ADC цитостатический эффект, можно использовать анализ встраивания тимидина. Например, раковые клетки, экспрессирующие целевой антиген при плотности 5000 клеток/лунка в 96-луночном планшете можно культивировать в течение 72-часового периода и подвергать воздействию 0,5 мкКи 3H-тимидина в течение последних 8 часов 72-часового периода. Встраивание 3H-тимидина в клетки культуры измеряют в присутствии и при отсутствии ADC.
[400] Для определения цитотоксичности можно измерить некроз или апоптоз (запрограммированную гибель клеток). Некроз обычно сопровождается повышенной проницаемостью плазматической мембраны; набуханием клетки и разрывом плазматической мембраны. Апоптоз можно определить количественно, например, посредством измерения фрагментации ДНК. Доступны коммерческие фотометрические методы для количественного определения фрагментации ДНК in vitro. Примеры таких анализов, включая TUNEL (который определяет встраивание меченых нуклеотидов во фрагментированную ДНК) и анализы на основе ELISA, описаны в Biochemica (1999) No. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
[401] Апоптоз также можно определить путем измерения морфологических изменений в клетке. Например, как и в случае некроза, нарушение целостности плазматической мембраны может быть определено путем измерения поглощения определенных красителей (например, флуоресцентного красителя, такого как, например, акридиновый оранжевый или этидия бромид). Способ измерения числа апоптотических клеток был описан Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al., Eds. (1992) pp. 3.17.1-3.17.16). Клетки также могут быть мечены ДНК-красителем (например, акридиновым оранжевым, этидия бромидом или пропидия йодидом), и клетки визуально анализируют на предмет конденсации хроматина и краев вдоль внутренней ядерной мембраны. В некоторых вариантах осуществления апоптоз также можно определить путем скрининга активности каспаз. В некоторых вариантах осуществления можно использовать анализ Caspase-Glo® для измерения активности каспазы-3 и каспазы-7. В некоторых вариантах осуществления анализ предоставляет люминогенный субстрат каспазы-3/7 в реагенте, оптимизированном для активности каспазы, активности люциферазы и лизиса клеток. В некоторых вариантах осуществление добавление реагента Caspase-Glo® 3/7 в формате "добавить-смешать-измерить" может привести к лизису клеток с последующими расщеплением субстрата каспазами и генерацией люминесцентного сигнала "типа свечения", продуцируемого люциферазой. В некоторых вариантах осуществления люминесценция может быть пропорциональна количеству присутствующей каспазной активности и может служить показателем апоптоза. Другие морфологические изменения, которые можно измерить для определения апоптоза, включают, например, конденсацию цитоплазмы, усиление пузырения мембраны и сморщивание клеток. Определение любого из данных эффектов в отношении раковых клеток указывает на то, что ADC применим в лечении рака.
[402] Жизнеспособность клеток может быть измерена, например, путем определения поглощения клетками красителя, такого как нейтральный красный, трипановый синий, кристаллический фиолетовый или синий ALAMAR™ (см., например, Page et al. (1993) Intl J Oncology 3:473-6). В таком анализе клетки инкубируют в средах, содержащих краситель, клетки промывают, а оставшийся краситель, отражающий поглощение красителя клетками, измеряют спектрофотометрически. Жизнеспособность клеток также может быть измерена, например, путем количественного определения АТФ, - показателя метаболически активных клеток. В определенных вариантах осуществления in vitro активность и/или влияние полученных ADC или соединений, представляющих собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, на жизнеспособность клеток можно оценивать с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®, как описано в примерах, представленных в данном документе. В данном анализе, в определенных вариантах осуществления, один реагент (реагент CellTiter-Glo®) добавляют непосредственно к клеткам, культивируемым в среде с добавлением сыворотки крови. Добавление реагента приводит к лизису клеток и генерированию люминесцентного сигнала, пропорционального количеству присутствующего АТФ. Количество АТФ прямо пропорционально количеству клеток, присутствующих в культуре. Белок-связывающий краситель сульфородамин B (SRB) также можно использовать для измерения цитотоксичности (Skehan et al. (1990) J Natl Cancer Inst. 82:1107-12).
[403] Раскрытые ADC также могут быть оценены на предмет киллинг-активности. Активность уничтожения нецелевых клеток может быть определена, например, с помощью анализа с использованием двух клеточных линий, одной - положительной по антигену-мишени, и другой - отрицательной по антигену-мишени. В определенных вариантах осуществления дизайн анализа позволяет регистрировать только отрицательные по мишени клетки. В определенных вариантах осуществления клетки высевают в трех условиях: (i) только отрицательные по мишени клетки (маркированные или меченные); (ii) только положительные по мишени клетки; и (iii) совместная культура отрицательных по мишени клеток и положительных по мишени клеток. Затем клетки обрабатывают с использованием ADC с последующим контролем цитотоксичности. Если анализ реакции в планшетах проводят посредством считывания с использованием реагента CellTiter-Glo®, то можно контролировать жизнеспособность всех популяций клеток. Когда планшеты считывают с использованием реагента OneGlo®, только маркированные или меченые отрицательные по мишени клетки генерируют сигнал. Уничтожение отрицательных по мишени клеток при смешивании с положительными по мишени клетками указывает на уничтожение нецелевых клеток, тогда как уничтожение отрицательных по мишени клеток при отсутствии положительных по мишени клеток указывает на нецелевое уничтожение.
[404] В определенных аспектах настоящего изобретения представлен способ уничтожения, подавления или модуляции роста или вмешательства в метаболизм раковой клетки или ткани посредством нарушения сплайсинга РНК. Способ можно использовать у любого субъекта, у которого нарушение сплайсинга РНК обеспечивает терапевтический эффект. Субъекты, для которых может быть полезным нарушение сплайсинга РНК, включают без ограничения тех, у кого имеется неопластическое нарушение или кто подвержен риску его развития, такое как гематологическое злокачественное новообразование или солидная опухоль. В определенных вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование представляет собой B-клеточное злокачественное новообразование, рак крови (лейкоз), рак плазматических клеток (миелому, например, множественную миелому) или рак лимфатических узлов (лимфому). В определенных вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из миелогенного лейкоза или множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления лейкоз представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML) или острый моноцитарный лейкоз (AMO). В некоторых вариантах осуществления лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому. В определенных вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование представляет собой миелодиспластический синдром (МДС). В определенных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой карциному, такую как рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак толстой кишки или колоректальный рак, рак легкого, рак желудка, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичника, холангиокарциному, глиому или меланому. В определенных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак желудка, рак предстательной железы, рак яичника, рак легкого (например, аденокарциному легкого), рак матки (например, серозную карциному эндометрия матки), карциному слюнных протоков, меланому, рак толстой кишки, рак шейки матки, рак поджелудочной железы, рак почки, колоректальный рак или рак пищевода. В некоторых вариантах осуществления рак легкого представляет собой аденокарциному. В некоторых вариантах осуществления рак матки представляет собой серозную карциному эндометрия матки.
[405] В различных вариантах осуществления раскрытые ADC можно вводить в любую клетку или ткань, которая экспрессирует HER2, в такую как неопластическая клетка или ткань, экспрессирующая HER2. Иллюстративный вариант осуществления включает способ подавления передачи сигналов в клетке, опосредованной HER2, или способ уничтожения клетки. Способ может быть использован с любой клеткой или тканью, экспрессирующей HER2, такой как раковая клетка или метастатический очаг. Неограничивающие примеры видов рака, экспрессирующих HER2, включают рак молочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, уротелиальную клеточную карциному, рак пищевода, рак легкого (например, аденокарциному легкого), рак матки (например, серозную карциному эндометрия матки), карциному слюнных протоков, рак шейки матки, рак эндометрия и рак яичника (English et al. (2013) Mol Diagn Ther. 17:85-99). Неограничивающие примеры клеток, экспрессирующих HER2, включают HCC1954 и SKBR3, клетки протоковой карциномы молочной железы человека, N87, клетки карциномы желудка человека и клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую HER2 или его часть.
[406] В различных вариантах осуществления раскрытые ADC можно вводить в любую клетку или ткань, которая экспрессирует CD138, в такую как неопластическая клетка или ткань, экспрессирующая CD138. Иллюстративный вариант осуществления включает способ подавления передачи сигналов в клетке, опосредованной CD138, или способ уничтожения клетки. Способ может быть использован с любой клеткой или тканью, экспрессирующей CD138, такой как раковая клетка или метастатический очаг. Неограничивающие примеры видов рака, при которых экспрессируется CD138, включают рак внутригрудной локализации (например, рак легкого, мезотелиому), рак кожи (например, базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному), рак головы и шеи (например, гортани, гортанной части глотки, носоглотки), рак молочной железы, урогенитальный рак (например, рак шейки матки, рак яичника, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, уротелиальный рак), гематологические злокачественные новообразования (например, миелому, такую как множественная миелома, лимфома Ходжкина) и рак щитовидной железы (Szatmári et al. (2015) Dis Markers 2015:796052). Неограничивающие примеры клеток, экспрессирующих CD138, включают MOLP8, клетки множественной миеломы человека, и клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую CD138 или его часть.
[407] В различных вариантах осуществления раскрытые ADC можно вводить в любую клетку или ткань, которая экспрессирует EPHA2, в такую как неопластическая клетка или ткань, экспрессирующая EPHA2. Иллюстративный вариант осуществления включает способ подавления передачи сигналов в клетке, опосредованной EPHA2, или способ уничтожения клетки. Способ может быть использован с любой клеткой или тканью, экспрессирующей EPHA2, такой как раковая клетка или метастатический очаг. Неограничивающие примеры видов рака, экспрессирующих EPHA2, включают рак молочной железы, рак головного мозга, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак легкого, рак предстательной железы, меланому, рак пищевода и рак желудка (Tandon et al. (2011) Expert Opin Ther Targets 15(1):31-51. Неограничивающие примеры клеток, экспрессирующих EPHA2, включают PC3, клетки рака предстательной железы человека, и клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую EPHA2 или его часть.
[408] Иллюстративные способы включают стадии приведения в контакт клетки с ADC, описанным в данном документе, в эффективном количестве, т.е. количестве, достаточном для уничтожения клетки. Способ можно использовать по отношению к клеткам к культуре, например in vitro, in vivo, ex vivo или in situ. Например, клетки, которые экспрессируют HER2 (например, клетки, полученные посредством биопсии опухоли или метастатического очага, клетки из развившейся линии раковых клеток или рекомбинантные клетки), можно культивировать in vitro в культуральной среде, при этом на стадию приведения в контакт может оказывать влияние добавление ADC в питательную среду Данный способ приведет к уничтожению клеток, экспрессирующих HER2, в том числе, в частности, опухолевых клеток, экспрессирующих HER2. Альтернативно ADC можно вводить субъекту посредством любого подходящего способа введения (например, внутривенного, подкожного или непосредственного контакта с опухолевой тканью) для оказания воздействия in vivo. Данный подход можно использовать для антител, целенаправленно воздействующих на другие антигены клеточной поверхности (например, CD138, EPHA2).
[409] Эффект in vivo описанной терапевтической композиции на основе ADC можно оценивать на подходящей модели животного. Например, могут быть использованы ксеногенные модели рака, в которых эксплантаты злокачественных опухолей или пассированные ксенотрансплантатные ткани вводят животным с ослабленным иммунитетом, таким как голые мыши или мыши SCID (Klein et al. (1997) Nature Med. 3:402-8). Эффективность можно спрогнозировать, используя анализы, которые измеряют подавление онкогенеза, регрессии опухоли или метастазов и т.п.
[410] Также можно использовать анализы in vivo, которые оценивают стимуляцию смерти опухоли посредством таких механизмов, как апоптоз. В одном варианте осуществления ксенотрансплантаты от мышей, несущих опухоль, обработанных терапевтической композицией, можно оценивать на присутствие апоптотических очагов и сравнивать с необработанными контрольными мышами, несущими ксенотрансплантат. Степень, при которой апоптотические очаги обнаруживают в опухолях обработанных мышей, является показателем терапевтической эффективности композиции.
[411] Кроме того, в данном документе представлены способы лечения неопластического нарушения, например рака. Описанные в данном документе ADC можно вводить млекопитающему, отличному от человека, или человеку с целью терапии. Терапевтические способы предусматривают введение субъекту, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, терапевтически эффективного количества ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, связанный с целенаправленно воздействующим антителом, которое связывается с экспрессируемым антигеном, доступным для связывания или локализованным на поверхности раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления лечение с помощью конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует неспецифическое уничтожение неопластических клеток, которые не экспрессируют антиген-мишень, но являются смежными с неопластическими клетками, которые экспрессируют антиген-мишень.
[412] Иллюстративный вариант осуществления представляет собой способ доставки модулятора сплайсинга в клетку, экспрессирующую HER2, предусматривающий конъюгацию модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена с антителом, которое иммуноспецифически связывается с эпитопом HER2 и подвергает клетку воздействию ADC. Иллюстративные опухолевые клетки, которые экспрессируют HER2, для которых приведены ADC по настоящему изобретению, включают клетки карциномы желудка и клетки протоковой карциномы молочной железы.
[413] Другой иллюстративный вариант осуществления представляет собой способ доставки модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена в клетку, экспрессирующую CD138, предусматривающий конъюгацию модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена с антителом, которое иммуноспецифически связывается с эпитопом CD138 и подвергает клетку воздействию ADC. Иллюстративные опухолевые клетки, которые экспрессируют CD138, для которых указаны ADC по настоящему изобретению, включают клетки множественной миеломы.
[414] Другой иллюстративный вариант осуществления представляет собой способ доставки модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена в клетку, экспрессирующую EPHA2, предусматривающий конъюгацию модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена с антителом, которое иммуноспецифически связывается с эпитопом EPHA2 и подвергает клетку воздействию ADC. Иллюстративные опухолевые клетки, которые экспрессируют EPHA2, для которых указаны ADC по настоящему изобретению, включают клетки рака предстательной железы.
[415] Другой иллюстративный вариант осуществления представляет собой способ уменьшения или подавления роста опухоли (например, опухоли, экспрессирующей HER2, опухоли, экспрессирующей CD138, опухоли, экспрессирующей EPHA2), предусматривающий введение терапевтически эффективного количества ADC или композиции, содержащей ADC. В некоторых вариантах осуществления данного лечения достаточно для уменьшения или подавления роста опухоли у пациента, уменьшения количества или размера метастатических очагов, уменьшения опухолевой нагрузки, уменьшения первичной опухолевой нагрузки, уменьшения инвазивности, продления времени выживания и/или поддержания или улучшения качества жизни. В некоторых вариантах осуществления опухоль является устойчивой или рефрактерной к лечению с помощью антитела или антигенсвязывающего фрагмента ADC (например, антитела к HER2, антитела к CD138, антитела к EPHA2) при введении по отдельности, и/или опухоль является устойчивой или рефрактерной к лечению с помощью фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, представляющее собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, при введении по отдельности.
[416] В определенных аспектах настоящего изобретения представлен способ уменьшения или подавления роста опухоли, экспрессирующей HER2. В определенных вариантах осуществления лечение с помощью конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует неспецифическое уничтожение опухолевых клеток, которые не экспрессируют HER2, но являются смежными с неопластическими опухолевыми клетками, которые экспрессируют HER2. Иллюстративные типы рака, экспрессирующие HER2, включают без ограничения опухоли, полученные из рака молочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, уротелиальной клеточной карциномы, рака пищевода, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), карциномы слюнных протоков, рака шейки матки, рака эндометрия и рака яичника, экспрессирующих HER2. В некоторых вариантах осуществления опухоль, экспрессирующая HER2, представляет собой опухоль, полученную из рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), остеосаркомы или карциномы слюнных протоков, экспрессирующих HER2. В некоторых вариантах осуществления опухоль, экспрессирующая HER2, представляет собой аденокарциному легкого или серозную карциному эндометрия матки.
[417] В определенных аспектах настоящего изобретения представлен способ уменьшения или подавления роста опухоли, экспрессирующей CD138. В определенных вариантах осуществления лечение с помощью конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует неспецифическое уничтожение опухолевых клеток, которые не экспрессируют CD138, но являются смежными с неопластическими опухолевыми клетками, которые экспрессируют CD138. Иллюстративные типы опухолей, экспрессирующих CD138, включают без ограничения опухоли, полученные из рака внутригрудной локализации (например, рака легкого, мезотелиомы), рака кожи (например, базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы), рака головы и шеи (например, гортани, гипофаринкса, носоглотки), рака молочной железы, урогенитального рака (например, рака шейки матки, рака яичника, рака эндометрия, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака) и рака щитовидной железы, экспрессирующих CD138.
[418] В определенных аспектах настоящего изобретения представлен способ уменьшения или подавления роста опухоли, экспрессирующей EPHA2. В определенных вариантах осуществления лечение с помощью конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует неспецифическое уничтожение опухолевых клеток, которые не экспрессируют EPHA2, но являются смежными с неопластическими опухолевыми клетками, которые экспрессируют EPHA2. Иллюстративные типы опухолей, экспрессирующие EPHA2, включают без ограничения опухоли, полученные из рака молочной железы, рака головного мозга, рака яичника, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака легкого, рака предстательной железы, меланомы, рака пищевода и рака желудка, экспрессирующих EPHA2. В определенных вариантах осуществления опухоль, экспрессирующая EPHA2, представляет собой опухоль, полученная из рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, меланомы, рака толстой кишки или рака пищевода, экспрессирующих EPHA2.
[419] Более того, антитела по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему, отличному от человека, у которого экспрессируется антиген, с которым ADC способен связываться, для ветеринарных целей или для использования в качестве модели на животном заболевания человека. Что касается последнего, то такие модели на животных могут быть применимы для оценки терапевтической эффективности раскрытых ADC (например, тестирования дозировок и сроков введения).
[420] Дополнительно в данном документе представлены варианты терапевтического применения раскрытых ADC и композиций. В одном иллюстративном варианте осуществления представлено применение ADC в лечении неопластического нарушения (например, рака, экспрессирующего HER2, рака, экспрессирующего CD138, рака, экспрессирующего EPHA2). В другом иллюстративном варианте осуществления представлен ADC для применения в лечении неопластического нарушения (например, рака, экспрессирующего HER2, рака, экспрессирующего CD138, рака, экспрессирующего EPHA2). Способы идентификации субъектов, страдающих видами рака, при которых экспрессируется антиген-мишень (например, HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 или STEAP1), известны из уровня техники и могут применяться для идентификации подходящих пациентов для лечения с помощью раскрытого ADC.
[421] В другом иллюстративном варианте осуществления представлено применение ADC в способе изготовления лекарственного препарата для лечения неопластического нарушения (например, рака, экспрессирующего HER2, рака, экспрессирующего CD138, рака, экспрессирующего EPHA2).
[422] Терапевтические композиции, используемые в практической реализации вышеупомянутых способов, могут быть составлены в фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для требуемого способа доставки. В иллюстративном варианте осуществления представлена фармацевтическая композиция, содержащая ADC по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители включают любой материал, который в сочетании с терапевтической композицией сохраняет противоопухолевую функцию терапевтической композиции и, как правило, не взаимодействует с иммунной системой пациента. Фармацевтически приемлемые носители включают любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие абсорбцию, и им подобные, которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или несколько из следующих компонентов: воду, физиологический солевой раствор, фосфатно-буферный физиологический солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол, мезилатную соль и им подобные, а также их комбинации. Во многих случаях в композицию включают изотонические средства, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность ADC.
[423] Терапевтические составы можно солюбилизировать и вводить посредством любого пути, обеспечивающего доставку терапевтической композиции к месту опухоли. Потенциально эффективные пути введения включают без ограничения внутривенный, парентеральный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутриопухолевый, внутрикожный, внутрь органа, ортотопический и т.п. Терапевтические препараты на основе белков можно лиофилизировать и хранить в виде стерильных порошков, например, под вакуумом, а затем восстановить в бактериостатической воде (содержащей, например, консервант бензиловый спирт) или в стерильной воде перед инъекцией. Терапевтические составы могут содержать ADC или его фармацевтически приемлемую соль, например мезилатную соль.
[424] В некоторых вариантах осуществления ADC вводят пациенту ежедневно, один раз в два месяца или в любой промежуточный период времени. Дозировки и протоколы введения для лечения рака с использованием вышеупомянутых способов будут варьироваться в зависимости от способа и целевого рака и, как правило, будут зависеть от ряда других факторов, учитываемых в данной области техники.
[425] Известны различные системы доставки, которые можно использовать для введения одного или нескольких ADC по настоящему изобретению. Способы введения ADC включают без ограничения парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, внутриопухолевое введение и чрезслизистое введение (например, интраназальный и пероральный пути). Кроме того, может использоваться легочное введение, например, с использованием ингалятора или небулайзера, а также состава с аэрозольным средством. См. например, композиции и способы для легочного введения, описанные в патентах США №№6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации международных заявок №№ WO 1992/019244, WO 1997/032572, WO 1997/044013, WO 1998/031346 и WO 1999/066903. ADC можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, или путем абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и слизистую оболочку кишечника и т.д.). Введение может быть системным или местным.
[426] Раскрытые в данном документе терапевтические композиции могут быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения В некоторых вариантах осуществления один или несколько ADC или одна или несколько фармацевтических композиций поставляются в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере и они могут быть восстановлены (например, водой или физиологическим солевым раствором) до концентрации, подходящей для введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько профилактических или терапевтических средств или одну или несколько фармацевтических композиций поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере в дозированной лекарственной форме, составляющей по меньшей мере 5 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг или по меньшей мере 100 мг или любое промежуточное количество. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированные ADC или фармацевтические композиции хранят при температуре от 2°C до 8°C в оригинальном контейнере. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ADC или одна или несколько фармацевтических композиций, описанных в данном документе, поставляют в жидкой форме в герметично закрытом контейнере, например, контейнере с указанием количества и концентрации средства. В некоторых вариантах осуществления жидкую форму вводимой композиции поставляют в герметично закрытом контейнере, содержащем по меньшей мере 0,25 мг/мл, по меньшей мере 0,5 мг/мл, по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл ADC. Жидкая форма может храниться при температуре от 2°C до 8°C в оригинальном контейнере.
[427] В некоторых вариантах осуществления раскрытые ADC могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Инъекционный раствор может состоять либо из жидкой, либо из лиофилизированной дозированной лекарственной формы в бесцветных или янтарно-желтых флаконе, ампуле или предварительно заполненном шприце или другом известном устройстве для доставки или хранения.
[428] Описанные в данном документе композиции могут быть в различных формах. К ним относятся, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.
[429] В различных вариантах осуществления лечение включает однократное болюсное или повторное введение препарата на основе ADC посредством приемлемого пути введения.
[430] Пациенты могут быть оценены в отношении уровней антигена-мишени в данном образце (например, уровней клеток, экспрессирующих целевой антиген) с тем, чтобы способствовать определению наиболее эффективной схемы введения и т.д. Иллюстративный вариант осуществления представляет собой способ определения того, будет ли пациент отвечать на лечение посредством ADC по настоящему изобретению, предусматривающий получение биологического образца от пациента и приведение биологического образца в контакт с ADC. Иллюстративные биологические образцы включают ткань или биологическую жидкость, такую как воспалительный экссудат, кровь, сыворотку крови, жидкость из кишечника, образец кала или биоптат опухоли (например, биоптат опухоли, полученный от пациента, имеющего рак, экспрессирующий антиген-мишень, например, рак, экспрессирующий HER2, рак, экспрессирующий CD138, рак, экспрессирующий EPHA2, или подверженного риску его развития). В некоторых вариантах осуществления образец (например, ткань и/или биологическая жидкость) может быть получен от субъекта, и подходящий иммунологический способ можно применять для выявления и/или измерения уровня экспрессии белка, представляющего собой антиген-мишень (например, HER2, CD138, EPHA2, MSLN, FOLH1, CDH6, CEACAM5, CFC1B, ENPP3, FOLR1, HAVCR1, KIT, MET, MUC16, SLC39A6, SLC44A4 или STEAP1). Такие оценки также используются с целью контроля на протяжении всей терапии и полезны для оценки терапевтического успеха в сочетании с оценкой других параметров.
[431] В некоторых вариантах осуществления эффективность ADC может быть оценена путем приведения в контакт образца опухоли от субъекта с ADC и оценки скорости роста или объема опухоли. В некоторых вариантах осуществления, если ADC был определен как эффективный, его можно вводить субъекту.
[432] Вышеупомянутые терапевтические подходы можно комбинировать с любым из множества дополнительных режимов хирургического вмешательства, химиотерапии или лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления ADC или композиции, раскрытые в данном документе, составляют и/или вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например, одним или несколькими химиотерапевтическими средствами. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, например, азотистые иприты, соединения этиленимина и алкилсульфонаты; антиметаболиты, например, антагонисты фолиевой кислоты, пурина или пиримидина; антимитотические средства, например ингибиторы тубулина, такие как эрибулин или эрибулина мезилат (Halaven™), алкалоиды барвинка и ауристатины; цитотоксические антибиотики; соединения, которые повреждают или препятствуют экспрессии или репликации ДНК, например, средства, связывающиеся с малой бороздкой ДНК; и антагонисты рецепторов фактора роста. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое средство может быть цитотоксическим или цитостатическим средством. Примеры цитотоксических средств включают без ограничения антимитотические средства, такие как эрибулин или эрибулина мезилат (Halaven™), ауристатины (например, монометилауристатин E (MMAE), монометилауристатин F (MMAF)), майтанзиноиды (например, майтанзин), доластатины, дуостатины, криптофицины, алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин), таксаны, таксолы и колхицины; антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин, дигидроксиантрациндион); цитотоксические антибиотики (например, митомицины, актиномицины, дуокармицины (например, CC-1065), ауромицины, дуомицины, калихеамицины, эндомицины, феномицины); алкилирующие средства (например, цисплатин); интеркалирующие средства (например, этидия бромид); ингибиторы топоизомераз (например, этопозид, тенопозид); радиоактивные изотопы, такие как At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 или 213, P32 и радиоактивные изотопы лютеция (например, Lu177); и токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения (например, рицин (например, А-цепь рицина), дифтерийный токсин, экзотоксин A Pseudomonas (например, PE40), эндотоксин, митогеллин, комбрестатин, рестриктоцин, гелонин, альфа-сарцин, абрин (например, А-цепь абрина), модекцин (например, А-цепь модекцина), курицин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, глюкокортикоид).
[433] В данном документе также раскрыты варианты применения одного или нескольких раскрытых ADC в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака, например, в соответствии со способами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления ADC, раскрытые в данном документе, применяют для лечения рака, например, в соответствии с способами, описанными выше.
[434] В различных вариантах осуществления наборы для исследовательских и терапевтических применений, описанных в данном документе, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Такие наборы могут содержать носитель, упаковку или контейнер, которые разделены на отсеки, чтобы вмещать один или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и им подобные, при этом каждый из контейнеров содержит один из отдельных элементов для использования в способе, раскрытом в данном документе, вместе с этикеткой или листовкой-вкладышем, содержащими инструкции по применению, например, по применению, описанному в данном документе. Наборы могут содержать контейнер, содержащий фрагмент-лекарственное средство. В настоящем изобретении также представлены один или несколько ADC или фармацевтических композиций на их основе, герметично упакованных в контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества средства.
[435] Наборы могут содержать контейнер, описанный выше, и один или несколько других контейнеров, связанных с ним, которые содержат материалы, необходимые в плане коммерции и с пользовательской точки зрения, включающие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы; носитель, упаковку, контейнер, флакон и/или тюбика с указанием на этикетке содержимого и/или инструкции по применению, а также листовки-вкладыши с инструкциями по применению.
[436] Этикетка может присутствовать на контейнере или вместе с ним для указания, что композиция используется для конкретного терапевтического применения или применения, отличного от терапевтического, для такого как прогностическое, профилактическое, диагностическое или лабораторное применение. На этикетке также может быть приведено предписание для применения in vivo или in vitro, как, например, описано в данном документе. Предписания и другая информация также могут быть включены в листовку-вкладыш (листовки-вкладыши) или в этикетку (этикетки), которые включены в состав комплекта или наклеены на него. Этикетка может быть на контейнере или быть связана с ним. Этикетка может быть на самом контейнере, если буквы, числа или другие символы, образующие этикетку, выпрессованы или выгравированы на самом контейнере. Этикетка может быть связана с контейнером, если он присутствует в емкости или носителе, которые также удерживают контейнер, например, в виде листовки-вкладыша. На этикетке может указываться, что композиция применяется для диагностики или лечения состояния, такого как рак, описанного в данном документе.
Неоантигены и способы их применения
[437] В различных вариантах осуществления в данном документе также раскрыты способы лечения пациента путем индуцирования образования неоантигенов в опухолевых клетках, на которые может целенаправленно воздействовать иммунная система пациента для клиренса. Не ограничиваясь теорией, в различных вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и/или в качестве части ADC или композиции может обеспечивать продуцирование неоантигенов, которые индуцируют иммунный ответ, индуцируют иммунный ответ на двухнитевую РНК, например, в результате повторной экспрессии эндогенных ретровирусов, присутствующих в интроне, и/или продуцирование неоантигенов, которые индуцируют иммуногенную гибель клеток.
[438] Используемый в данном документе термин "неоантиген" означает любой антиген, воздействию которого иммунная система ранее не подвергалась, который образуется в результате одной или нескольких опухолеспецифических мутаций и/или в результате воздействия на опухоль модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена (например, любого одного или нескольких из модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, раскрытых в данном документе, по отдельности и/или в качестве части ADC или композиции). Опухолеспецифические мутации могут включать миссенс-мутации, сдвиги рамки считывания, транслокации и варианты сплайсинга mRNA, а также мутации, которые влияют на посттрансляционный процессинг, такой как фосфорилирование и гликозилирование. В различных вариантах осуществления данные иллюстративные мутации могут быть получены в результате несинонимичных изменений в кодирующей последовательность и/или мутаций, которые изменяют процессинг mRNA (например, сплайсинг). В различных вариантах осуществления все из этих иллюстративных мутаций могут приводить к молекулярным изменениям, которые могут распознаваться соответствующим T-клеточным рецептором. В различных вариантах осуществления иллюстративный неоантиген представляет собой неоантиген, образование которого индуцировано доставкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и/или в качестве части ADC или композиции. В различных вариантах осуществления доставка модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена (например, любого одного или нескольких модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, раскрытых в данном документе) может индуцировать образование нового сплайс-варианта mRNA, который приводит к трансляции белков, содержащих один или несколько новых пептидных доменов, воздействию которых иммунная система ранее не подвергалась. В различных вариантах осуществления опухолеспецифические мутации могут представлять собой сплайс-варианты mRNA, возникающие в результате доставки или введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC.
[439] Не ограничиваясь теорией, в различных вариантах осуществления доставка модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и в качестве части ADC или композиции может индуцировать образование нового сплайс-варианта mRNA (например, пропуск экзона, удержание интрона), что приводит к изменению открытых рамок считывания и/или кодирующих последовательностей различных генов. В различных вариантах осуществления данные измененные гены транслируются в белки, содержащие один или несколько новых пептидных доменов, распознаваемых иммунной системой как чужеродные. В различных вариантах осуществления один или несколько новых пептидных доменов не существуют в белках или в любой другой части протеома человека при отсутствии лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена. В различных вариантах осуществления белки, содержащие один или несколько новых пептидных доменов, могут разлагаться под действием протеасомы с образованием новых пептидных фрагментов, которые выступают в качестве субстратов для механизма представления иммунопептидов, например, посредством представления с участием MHC. В различных вариантах осуществления новые пептидные фрагменты, представляющие неоантигены, могут быть презентированы в MHC1-связанном пептидоме, например, на опухолевых клетках.
[440] В различных вариантах осуществления доставка модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и в качестве части ADC или композиции может приводить к одному или нескольким событиям, свойственным опухолевым клеткам (например, к остановке роста клеток). В различных вариантах осуществления свойственное(-ые) опухолевым клеткам событие(-я) могут приводить к (1) усилению контакта с фагоцитами (Bracci et al. (2014) Cell Death Differ. 21(1):15-25); (2) транспорту новых пептидных фрагментов в дренирующий опухоль лимфатический узел для контакта с антигенпредставляющими клетками; (3) процессингу антигенпредставляющими клетками новых пептидных фрагментов из фагоцитированной опухолевой клетки и представлению фрагментов в качестве неоантигенов популяциям циркулирующих наивных T-клеток; (4) взаимодействию новых пептидных фрагментов с T-клетками, экспрессирующими рецепторы, которые распознают фрагменты в качестве неоантигенов; (5) созреванию и активации эффекторных T-клеток, обусловливающих ответы (например, CD4+ и/или CD8+ T-клеток); и/или (6) контакту T-клеток с дополнительными опухолевыми клетками, подвергнутыми обработке модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена и представляющими новые пептидные фрагменты, представляющие собой неоантигены, на своей поверхности в составе комплексов с молекулами MHC1. В различных вариантах осуществления свойственное(-ые) опухолевым клеткам событие(-я) может(-гут) приводить либо непосредственно, либо опосредованно к привлечению T-клеток с эффекторной функцией и/или уничтожению опухолевых клеток, презентирующих неоантиген.
[441] Также, не ограничиваясь теорией, в различных вариантах осуществления доставка модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и в качестве части ADC или композиции может вызывать повторную экспрессию эндогенных ретровирусов, присутствующих в интроне, что приводит к иммунному ответу на двухнитевую РНК.
[442] Кроме того, не ограничиваясь теорией, в различных вариантах осуществления доставка модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и в качестве части ADC или композиции может приводить к иммуногенной гибели клеток, вызванной индуцированным модулятором сплайсинга высвобождением неоантигенов, образованных в результате мутаций. В различных вариантах осуществления доставка модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и в качестве части ADC или композиции может индуцировать иммунный ответ на двухнитевую РНК. В различных вариантах осуществления иммунный ответ на двухнитевую РНК может возникать в результате повторной экспрессии эндогенных ретровирусов, присутствующих в интроне. В различных вариантах осуществления иммунный ответ на двухнитевую РНК может приводить к гибели опухолевых клеток. В различных вариантах осуществления доставка модуляторов сплайсинга по отдельности и в качестве части ADC или композиции может индуцировать иммуногенную гибель клеток. В различных вариантах осуществления иммуногенная гибель клеток может быть вызвана высвобождением образованных в результате мутации неоантигенов и/или иммунным ответом хозяина на опухолевые клетки.
[443] Соответственно, в различных вариантах осуществления раскрыты способы лечения, предусматривающие индуцирование неоантигенов путем введения одного или нескольких модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или ADC, и/или композиций, содержащих модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, например, любого модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, раскрытых в данном документе. В различных вариантах осуществления способ предусматривает введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в сниженной дозировке по сравнению с дозировкой, которая потребовалась бы при отсутствии индуцирования неоантигенов. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает введение одной или нескольких начальных индуцирующих доз для продуцирования неоантигенов и индуцирования иммунного ответа (например, превращения наивных T-клеток в клетки памяти) с последующим снижением дозировки или частоты введения (т.е. вследствие комбинированного эффекта модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и иммунного целенаправленного воздействия на неоантигены). В некоторых вариантах осуществления лечение может предусматривать введение комбинации из модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для индуцирования иммунного ответа на основе неоантигенов и по меньшей мере одного дополнительного средства терапии (например, второго средства противораковой терапии). Например, в некоторых вариантах осуществления лечение может предусматривать введение комбинации из модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для индуцирования иммунного ответа на основе неоантигенов и одного или нескольких ингибиторов контрольных точек иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления лечение может предусматривать введение комбинации из модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для индуцирования иммунного ответа на основе неоантигенов и одного или нескольких цитокинов или аналогов цитокинов. В некоторых вариантах осуществления лечение может предусматривать введение комбинации из модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для индуцирования иммунного ответа на основе неоантигенов и одной или нескольких неоантигенных вакцин. В некоторых других вариантах осуществления лечение может предусматривать введение комбинации из модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для индуцирования иммунного ответа на основе неоантигенов и одной или нескольких сконструированных Т-клеток, целенаправленно воздействующих на опухоль (например, CAR-T).
[444] В некоторых вариантах осуществления неоантигены можно применять для контроля эффективности лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. Например, после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции можно получить образец от пациента (например, биоптат опухоли) и провести скрининг в отношении неоантигенов или маркеров иммунного или воспалительного ответа. Если неоантиген и/или иммунный ответ обнаружены, может проводиться дополнительное лечение, например, при сниженной дозировке.
[445] В различных вариантах осуществления раскрыты способы лечения, предусматривающие индуцирование иммунного ответа на двухнитевую РНК путем введения одного или нескольких модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или ADC, и/или композиций, содержащих модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, например, любого модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, раскрытых в данном документе.
[446] В различных вариантах осуществления раскрыты способы лечения, предусматривающие индуцирование иммуногенной гибели клеток путем введения одного или нескольких модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, и/или ADC, и/или композиций, содержащих модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, например, любого модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, раскрытых в данном документе.
[447] В различных вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, можно комбинировать с любым известным средством противораковой терапии. Примеры существующих в настоящее время стратегий активации иммунитета, доступных для лечения онкологических заболеваний, включают без ограничения лечение с помощью молекул, являющихся ингибиторами контрольных точек иммунного ответа (ICI), лечение с помощью цитокинов или аналогов цитокина, вакцинацию с помощью противоопухолевых вакцин и конструирование T-клеток, целенаправленно воздействующих на опухоль (например, размножения инфильтрирующих опухоли лимфоцитов или CAR-T). Эти технологии преимущественно направлены на усиление или индуцирование иммунного ответа на уже существующие опухолевые антигены (либо мутации, либо аберрантную экспрессию белков клеточной поверхности). Одна или несколько из этих стратегий могут предусматривать одну или несколько мутаций, которые способны индуцировать развитие T-клеточного ответа на антиген. Например, ответы пациента на ингибирование контрольных точек могут коррелировать с мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями. Кроме того, могут применяться подходы с использованием противораковой вакцины, которые основаны на предварительно существующих мутациях и антигенности этих мутаций.
[448] Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена и/или ADC, содержащие такие модуляторы, способны индуцировать обширные изменения в транскриптоме, которые происходят во множестве линий дифференцировки. Трансляция этих измененных mRNA может обеспечивать стабильные и воспроизводимые измененные белки, которые продуцируют MHC1-связываемые неопептиды, характеризующиеся высокой аффинностью с различными изотипами молекул HLA. Не ограничиваясь теорией, вследствие большого количества изменений в транскриптоме и протеоме лечение с помощью модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена и/или ADC может повышать количество потенциально реакционноспособных неоантигенов для улучшенного вовлечения их в адаптивный иммунный ответ.
[449] Описанные в данном документе термины "модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена", "модулятор сплайсинга", "модулятор сплайсосомы" или "сплайс-модулятор" означают соединения, которые проявляют противораковую активность за счет взаимодействия с компонентами сплайсосомы. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга изменяет скорость или форму сплайсинга в клетке-мишени. Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена, которые функционируют как ингибирующие средства, например, способны к снижению неконтролируемой клеточной пролиферации. В частности, в некоторых вариантах осуществления модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена могут действовать путем подавления комплекса сплайсосомы SF3b. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена выбран из любого одного или нескольких модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления применяемый модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена доставляется в клетку и/или вводится субъекту как отдельное средство. В некоторых других вариантах осуществления применяемый модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена доставляется в клетку и/или вводится субъекту как часть ADC (например, ADC, выбранного из любого из иллюстративных ADC, раскрытых в данном документе). В некоторых других вариантах осуществления применяемый модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена доставляется в клетку и/или вводится субъекту как часть композиции, содержащей множество копий модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или множество копий ADC, несущего модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена. Такие композиций раскрываются в данном документе.
[450] В некоторых вариантах осуществления применяемый модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, который доставляется в клетку и/или вводится субъекту как часть ADC (например, ADC, выбранного из любого из иллюстративных ADC, раскрытых в данном документе), обеспечивает дополнительные терапевтические преимущества по сравнению с применяемым модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, который доставляется в клетку и/или вводится субъекту как отдельное средство. Например, в некоторых вариантах осуществления применяемый модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, который доставляется в клетку и/или вводится субъекту как часть ADC, обеспечивает направленную доставку модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена к неопластической клетке, экспрессирующей антиген-мишень (т.е. антиген, на который целенаправленно воздействует фрагмент антитела из ADC). В некоторых вариантах осуществления такая направленная доставка модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена снижает нецелевое лечение и/или нецелевую цитотоксичность. В некоторых вариантах осуществления такая целенаправленная доставка способствует опухолеселективной презентации неоантигена на неопластических клетках, но не на здоровых клетках, которые не экспрессируют антиген-мишень. В некоторых вариантах осуществления такая целенаправленная доставка приводит, например, к по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% альтернативного сплайсинга и индуцированию новых mRNA и пептидов, ассоциированных с молекулами MHC, повторно презентирующих неоантигены в целевых неопластических клетках, но не в нецелевых клетках. Таким образом, не ограничиваясь теорией, в некоторых вариантах осуществления после примирования и/или размножения эффекторных Т-клеток (например, с использованием неоантигенной вакцины) иммунная система может предпочтительно атаковать неопластические клетки, презентирующие неоантиген, но не здоровые клетки из-за предпочтительной экспрессии неоантигенов на опухолевых клетках после обработки с помощью ADC, описанного в данном документе.
Индуцирование иммунного ответа и схема лечения:
[451] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ индуцирования образования по меньшей мере одного неоантигена путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства (ADC) на основе модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ индуцирования иммунного ответа на двухнитевую РНК путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства на основе модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена (ADC) или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ индуцирования иммуногенной гибели клеток путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства (ADC) на основе модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC.
[452] В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в культуре клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в организме субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена из гематологического злокачественного новообразования или солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза, лимфомы и миеломы. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака молочной железы (например, HER2-положительного рака молочной железы), рака желудка (например, аденокарциномы желудка), рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого (например, аденокарциномы легкого), рака матки (например, серозной карциномы эндометрия матки), карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из HER2-положительного рака молочной железы, аденокарциномы желудка, рака предстательной железы и остеосаркомы.
[453] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно представлен способ индуцирования образования по меньшей мере одного неоантигена и/или развития T-клеточного ответа у субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC. Также в различных вариантах осуществления в данном документе представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, где введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует образование по меньшей мере одного неоантигена и/или T-клеточного ответа.
[454] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ индуцирования иммунного ответа на двухнитевую РНК у субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC. Также в различных вариантах осуществления в данном документе представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, где введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует иммунный ответ на двухнитевую РНК.
[455] В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ индуцирования иммуногенной гибели клеток у субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC. Дополнительно в различных вариантах осуществления в данном документе представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, где введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует иммуногенную гибель клеток.
[456] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, где введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции в комбинации с одним или несколькими дополнительными средствами терапии, содержащими второе средство, индуцирует иммуногенную гибель клеток.
[457] В некоторых вариантах осуществления терапевтических способов, описанных в данном документе, вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции или второго средства уменьшено вследствие индуцирования образования по меньшей мере одного неоантигена и/или T-клеточного ответа по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции или второго средства. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции или второго средства уменьшено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции или второго средства. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгат антитела и лекарственного средства, композицию или второе средство вводят на по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% менее часто по сравнению со стандартной схемой ведения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции или второго средства. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество и/или дозировка модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции или второго средства приводят к более низкой системной токсичности и/или улучшенной переносимости.
[458] Используемый в данном документе термин "стандартная дозировка" или "стандартная схема введения" означает любую обычную или общепринятую схему введения терапевтического средства, например, схему, предложенную производителем, одобренную регулирующими органами или иным образом протестированную на субъектах-людях для удовлетворения потребностей среднестатистического пациента. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, антитело или конъюгат антитела и лекарственного средства с противораковой активностью.
[459] Например, стандартная схема введения трастузумаба, иллюстративного антитела к HER2, раскрытого в данном документе, может предусматривать внутривенное введение 8 мг/кг за 90 мин. (неделя 1), а затем внутривенное введение 6 мг/кг за 30-90 мин. через каждые 3 недели (от недели 4 до конца цикла терапии) (Herceptin® (трастузумаб), дополнение к маркировке, соответствующей требованиям FDA, 2017).
[460] В качестве другого примера, стандартная схема введения ипилимумаба, иллюстративного антитела к CTLA4, являющегося ингибитором контрольных точек, может предусматривать внутривенное введение 3 мг/кг за 90 мин. через каждые 3 недели в виде 4 доз (Yervoy® (ипилимумаб), дополнение к маркировке, соответствующей требованиям FDA, 2018). Другая стандартная схема введения ипилимумаба может предусматривать внутривенное введение 10 мг/кг за 90 мин. через каждые 3 недели в виде 4 доз, а затем 10 мг/кг через каждые 12 недель в течение не более 3 лет (Yervoy® (ипилимумаб), дополнение к маркировке, соответствующей требованиям FDA, 2018).
[461] В качестве другого примера, стандартная схема введения ниволумаба, иллюстративного антитела к PD1, являющегося ингибитором контрольных точек, может предусматривать внутривенное введение 3 мг/кг за 60 мин. через каждые 2 недели (Opdivo® (ниволумаб), маркировка, соответствующая требованиям FDA, 2015).
[462] В качестве другого примера, стандартная схема введения атезолизумаба, иллюстративного антитела к PDL1, являющегося ингибитором контрольных точек, может предусматривать внутривенное введение 1200 мг за 60 мин. через каждые 3 недели (Tecentriq® (атезолизумаб), дополнение к маркировке, соответствующей требованиям FDA, 2018).
[463] В качестве еще одного примера, стандартная схема введения T-DM1, иллюстративного конъюгата антитела к HER2 и лекарственного средства, может предусматривать внутривенное введение 3,6 мг/кг за 90 мин. через каждые 3 недели (Kadcyla® (T-DM1), дополнение к маркировке, соответствующей требованиям FDA, 2016).
[464] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать введение по меньшей мере одного дополнительного средства терапии (например, ингибитора контрольных точек, неоантигенной вакцины, цитокина или аналога цитокина, CAR-T и т.д.). В некоторых вариантах осуществления вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии уменьшено вследствие индуцирования образования по меньшей мере одного неоантигена и/или T-клеточного ответа по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии уменьшено вследствие индуцирования иммунного ответа на двухнитевую РНК по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии уменьшено вследствие индуцирования иммуногенной гибели клеток по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии уменьшено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгат антитела и лекарственного средства, композицию и/или по меньшей мере одно дополнительное средство терапии вводят на по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% менее часто по сравнению со стандартной схемой введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество и/или дозировка модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, композиции и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии приводят к более низкой системной токсичности и/или улучшенной переносимости.
[465] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции начинают до введения по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В других вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции начинают после введения по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В еще других вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции начинают одновременно с введением по меньшей мере одного дополнительного средства терапии.
[466] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, применяемое для повторного введения, снижено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой или начальной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции.
[467] В некоторых вариантах осуществления введение по меньшей мере одного дополнительного средства терапии повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество по меньшей мере одного дополнительного средства терапии, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество по меньшей мере одного дополнительного средства терапии, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению со стандартной дозировкой по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления количество по меньшей мере одного дополнительного средства терапии, применяемое для повторного введения, снижено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой или начальной дозировкой по меньшей мере одного дополнительного средства терапии.
[468] В некоторых вариантах осуществления повторное введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции осуществляют одновременно с повторным введением по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции осуществляют последовательно или с разнесением во времени с повторным введением по меньшей мере одного дополнительного средства терапии.
[469] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает введение ингибитора контрольных точек, например, любого ингибитора контрольных точек, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к ингибитору контрольных точек при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на PD1/PDL1, CTLA4, OX40, CD40, LAG3, TIM3, GITR и/или KIR. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CTLA4, OX40, CD40 и/или GITR. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек представляет собой антитело, обладающее активностью ингибитора или агониста в отношении своей мишени. В некоторых вариантах осуществления целенаправленное воздействие ингибитора контрольных точек обеспечивается с помощью ингибиторного антитела или другой подобной ингибиторной молекулы. В других вариантах осуществления целенаправленное воздействие ингибитора контрольных точек обеспечивается с помощью антитела-агониста или другой подобной молекулы-агониста.
[470] В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает введение неоантигенной вакцины, например, любой неоантигенной вакцины, раскрытой в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят до введения неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят после введения неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят одновременно с введением неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения.
[471] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит одну или более чем одну неоантигенную последовательность.
[472] В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность и/или антигенная часть непосредственно не перекрываются с канонической пептидной последовательностью (например, с любой из иллюстративных канонических пептидных последовательностей, подчеркнутых в таблице 8) или не состоят из нее.
[473] Используемый в данном документе термин "антигенная часть" или "антигенный фрагмент" неоантигенной последовательности означает один или несколько фрагментов неоантигенной последовательности, которые сохраняют способность индуцировать T-клеточный ответ (например, антигенспецифическое размножение и/или созревание популяции(популяций) эффекторных T-клеток). В некоторых вариантах осуществления антигенная часть может также сохранять способность к интернализации, процессингу и/или презентированию антигенпрезентирующими клетками (например, дендритными клетками). В некоторых вариантах осуществления антигенная часть также сохраняет функцию примирования T-клеток. В некоторых вариантах осуществления длина антигенной части неоантигенной последовательности находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина антигенной части неоантигенной последовательности находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина антигенной части неоантигенной последовательности находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина антигенной части неоантигенной последовательности находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антигенную часть неоантигенной последовательности (например, антигенная часть под любым из SEQ ID NO: 66-93) или кодирующую ее mRNA составляют в виде неоантигенной вакцины.
[474] Иллюстративный вариант осуществления антигенной части представляет собой участок(участки), фланкирующий(-ие) аминокислоты 45-53 из SEQ ID NO: 66. Другой иллюстративный вариант осуществления антигенной части представляет собой участок(участки), фланкирующий(-ие) аминокислоты 82-90 из SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления антигенная часть способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у субъекта (например, HLA-A*02:01). В некоторых других вариантах осуществления антигенная часть способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% субъектов в популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением. В некоторых вариантах осуществления антигенная часть способна вызывать T-клеточный ответ в отношении опухоли, присутствующей у по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10% популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением.
[475] В некоторых вариантах осуществления антигенная часть непосредственно не перекрывается с канонической пептидной последовательностью или не состоит из нее. Используемый в данном документе термин "каноническая пептидная последовательность" означает любую непрерывную пептидную последовательность, присутствующую в протеоме человека при отсутствии контакта с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена (например, при отсутствии контакта с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена по отдельности и/или как частью ADC или композиции), и/или воздействию которой иммунная система ранее подвергалась. В некоторых вариантах осуществления каноническая пептидная последовательность происходит из открытой рамки считывания канонического транскрипта и/или кодируется ею. Иллюстративные канонические пептидные последовательности подчеркнуты в таблице 8.
[476] В некоторых вариантах осуществления, если вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена (например, по отдельности и/или как часть ADC или композиции), каноническая пептидная последовательность может быть получена из 24 нуклеотидов, расположенных непосредственно на 5'-конце рамки до события аберрантного сплайсинга, индуцированного модулятором сплайсинга, и/или может кодироваться ими. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления каноническая пептидная последовательность содержит 8 аминокислот, располагающихся непосредственно с N-конца неоантигенной последовательности, образование которой индуцировано модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления, если последовательность 5'-экзона заканчивается концевым нуклеотидом кодона, то каноническая пептидная последовательность заканчивается в конце экзона. В некоторых других вариантах осуществления, если последовательность 5'-экзона заканчивается одним или двумя из трех нуклеотидов кодона, то каноническая пептидная последовательность получена из 24 нуклеотидов, предшествующих неполному кодону, и/или кодируется ими. В некоторых вариантах осуществления 3'-последовательности mRNA при событии аберрантного сплайсинга могут транслироваться в той же открытой рамке считывания, полученной из 5'-экзона до достижения стоп-кодона, после чего трансляция может терминироваться. В некоторых вариантах осуществления, если событие аберрантного сплайсинга (например, пропуск экзона) приводит к сохранению открытой рамки считывания канонического транскрипта, C-концевая последовательность может транслироваться в дополнительные 24 нуклеотида, кодирующие 8 C-концевых аминокислот. В некоторых вариантах осуществления в данном контексте только участок вдоль аберрантного соединения экзонов может кодировать неоантигенную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, если открытая рамка считывания сдвинута (например, при сохранении интрона), то полная C-концевая последовательность (кодируемая 3'-концевой mRNA) может кодировать неоантигенную последовательность.
[477] В некоторых вариантах осуществления антигенная часть неоантигенной последовательности выбрана посредством сравнения неоантигенной последовательности с канонической пептидной последовательностью и выбора части неоантигенной последовательности, которая непосредственно не перекрывается с канонической пептидной последовательностью, не состоит из нее и/или не выравнивается с ней. В некоторых вариантах осуществления антигенную часть неоантигенной последовательности можно подвергать скринингу в отношении антигенности и/или функции примирования T-клеток таким же образом, как и полноразмерные неоантигенные последовательности (например, неоантигенную последовательность, из которой получена антигенная часть). В некоторых вариантах осуществления антигенную часть неоантигенной последовательности оценивают в отношении антигенности и/или функции примирования T-клеток с применением анализа примирования T-клеток, такого как иллюстративные эксперименты с примированием T-клеток, описанные в данном документе.
[478] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой неоантигенную последовательность, специфическую для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой персонализированную неоантигенную вакцину для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность, применяемая для создания персонализированной неоантигенной вакцины для субъекта, способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у субъекта. В некоторых вариантах осуществления персонализированную неоантигенную вакцину выбирают путем идентификации неоантигенов, экспрессируемых в опухоли субъекта, например, после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC и выбора вакцины, содержащей неоантигенную последовательность, обнаруженную в опухоли пациента.
[479] Термин "персонализированная", при использовании для описания неоантигенной вакцины, означает вакцину, созданную путем идентификации одного или нескольких неоантигенов, продуцируемых у пациента, предпочтительно неоантигена, идентифицированного у пациента после воздействия модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, и затем применения одного или нескольких из этих неоантигенов в качестве основы для вакцины для того же пациента. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления пациенту вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, а затем проводят скрининг в отношении присутствия неоантигенов, продуцируемых в результате лечения. В некоторых вариантах осуществления выбранная неоантигенная вакцина содержит неоантигенный пептид или mRNA, раскрытые в данном документе, и присутствие которых у пациента подтверждено после воздействия модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию и/или пептид или mRNA-вакцину можно вводить пациенту однократно или повторно. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления один или несколько из таких неоантигенов применяют для создания персонализированной вакцины, которую вводят пациенту. В некоторых вариантах осуществления один или несколько неоантигенов, применяемых для создания персонализированной вакцины, обладают аффинностью связывания с одним или несколькими специфическими для пациента аллелями HLA. В некоторых вариантах осуществления у пациента экспрессируется один или несколько аллелей MHC1, которые связываются с одним или несколькими неоантигенами. Прогнозирование того, будет ли неоантиген связываться со специфическим аллелем MHC1, можно осуществлять с применением любого способа вычислительного прогнозирования, известного из уровня техники. Иллюстративные способы вычислительного прогнозирования раскрыты, например, в Meydan et al. (2013) BMC Bioinformatics 14(Suppl. 2):S13, который включен в данный документ посредством ссылки для таких способов.
[480] В некоторых других вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную последовательность. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную вакцину.
[481] Термин "универсальная", при использовании для описания неоантигенной вакцины, означает вакцину, содержащую пептидную последовательность или последовательность mRNA, которые основаны на обычном(обычных) или известном(известных) неоантигене(неоантигенах), обнаруживаемом(обнаруживаемых) посредством секвенирования неоантигенов, продуцируемых у многих пациентов и/или в образцах ткани пациентов, предпочтительно после воздействия модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. Пептидная последовательность или последовательность mRNA, применяемые в вакцине, необязательно должны присутствовать у каждого пациента, а обнаруживаются у по меньшей мере нескольких пациентов или в образцах ткани пациентов. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию и/или пептид или mRNA-вакцину можно вводить пациенту однократно или повторно. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления данную пептидную последовательность или последовательность mRNA применяют для вакцинирования дополнительных пациентов. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, а затем вводят пептидную или mRNA-вакцину на основе известного неоантигена для усиления иммунного ответа на неоантигены, продуцируемые под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят универсальную пептидную или mRNA-вакцину, а затем однократно или повторно вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность (или последовательности), применяемая для создания универсальной неоантигенной вакцины, выбрана на основе общей встречаемости аллеля MHC1 в приведенной популяции пациентов (Maiers et al. (2007) Hum. Immunol. 68(9):779-88).
[482] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность (например, универсальный неоантиген) способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% субъектов в популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна вызывать T-клеточный ответ на опухоль, присутствующую у по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10% популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением.
[483] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность была идентифицирована посредством секвенирования по меньшей мере одного неоантигенного пептида или кодирующей его mRNA, образование которых индуцировано у субъекта путем введения эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит неоантигенную последовательность, образование которой индуцировано путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в культуре клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в организме субъекта.
[484] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель (например, любой из иллюстративных носителей, описанных в данном документе). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантигенный пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель выбран из пептида, сывороточного альбумина, гемоцианина фисуреллы, иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, анатоксина или аттенуированного производного анатоксина, цитокина и хемокина. В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель ковалентно связаны через линкер. В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель экспрессируются в виде слитого белка. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый адъювант.
[485] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неоантигенная mRNA кодирует одну или более одной неоантигенной последовательности.
[486] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой неоантигенную последовательность, специфическую для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой персонализированную неоантигенную вакцину для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у субъекта.
[487] В некоторых других вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную последовательность. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную вакцину. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% субъектов в популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна вызывать T-клеточный ответ на опухоль, присутствующую у по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10% популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением.
[488] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность была идентифицирована посредством секвенирования белковой последовательности по меньшей мере одного неоантигена. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность была идентифицирована посредством секвенирования по меньшей мере одной mRNA, кодирующей неоантиген, образование которой индуцировано у субъекта путем введения эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неоантигенная mRNA кодирует неоантигенную последовательность, образование которой индуцировано путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в культуре клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в организме субъекта.
[489] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA и фармацевтически приемлемый носитель (например, любой из иллюстративных носителей, описанных в данном документе). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неоантигенная mRNA связана с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель выбран из пептида, сывороточного альбумина, гемоцианина фисуреллы, иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, анатоксина или аттенуированного производного анатоксина, цитокина и хемокина. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA и фармацевтически приемлемый адъювант. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная mRNA инкапсулирована с помощью инкапсулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующее средство представляет собой липосому. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующее средство представляет собой наночастицу.
[490] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает введение цитокина или аналога цитокина, например, любого цитокина или аналога цитокина, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к цитокину или аналогу цитокина при введении их по отдельности. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает средство усиления для T-клеток. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IFNγ и/или TNFα. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-2, IL-10, IL-12 и/или IL-15. В некоторых вариантах осуществления введение цитокина или аналога цитокина усиливает примирование T-клеток после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции вследствие индуцирования образования и представления неоантигенов.
[491] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает введение сконструированных T-клеток, целенаправленно воздействующих на опухоль (т.е. CAR-T), например, любое средство терапии на основе CAR-T, раскрытое в данном документе.
[492] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут дополнительно предусматривать выявление одного или нескольких неоантигенов и/или T-клеточного ответа у субъекта после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции и необязательно продолжение введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, если выявлены один или несколько неоантигенов и/или T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления выявление одного или нескольких неоантигенов и/или T-клеточного ответа у субъекта указывает на эффективность лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления лечение с помощью дополнительного средства терапии вместе с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгатом антитела и лекарственного средства или композицией продолжают в случае, если выявлены один или несколько неоантигенов и/или T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления лечение продолжают при сниженной дозировке и/или частоте, если обнаружены один или несколько неоантигенов и/или T-клеточный ответ.
[493] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут дополнительно предусматривать выявление иммунного ответа на двухнитевую РНК у субъекта после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции и необязательно продолжение введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, если выявлен иммунный ответ на двухнитевую РНК. В некоторых вариантах осуществления выявление иммунного ответа на двухнитевую РНК у субъекта указывает на эффективность лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления лечение с помощью дополнительного средства терапии вместе с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгатом антитела и лекарственного средства или композицией продолжают в случае, если выявлен иммунный ответ на двухнитевую РНК. В некоторых вариантах осуществления лечение продолжают при сниженной дозировке и/или частоте, если обнаружен иммунный ответ на двухнитевую РНК.
[494] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут дополнительно предусматривать выявление иммуногенной гибели клеток у субъекта после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции и необязательно продолжение введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, если выявлена иммуногенная гибель клеток. В некоторых вариантах осуществления выявление иммуногенной гибели клеток у субъекта указывает на эффективность лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления лечение с помощью дополнительного средства терапии вместе с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгатом антитела и лекарственного средства или композицией продолжается в случае, если выявлена иммуногенная гибель клеток. В некоторых вариантах осуществления лечение продолжают при сниженной дозировке и/или частоте, если обнаружена иммуногенная гибель клеток.
[495] В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 150 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 100 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 50 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет неопластическое нарушение, например, гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль, или имеет подозрение на его наличие. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза, лимфомы и миеломы. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака молочной железы, рака желудка, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, рака матки, карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из HER2-положительного рака молочной железы, аденокарциномы желудка, рака предстательной железы и остеосаркомы.
[496] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретение дополнительно предусмотрен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, предусматривающий: (a) введение субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, где введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции индуцирует образование по меньшей мере одного неоантигена и/или T-клеточного ответа; (b) выявление одного или нескольких неоантигенов и/или T-клеточного ответа у субъекта после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции; и (c) продолжение введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, если выявлены один или несколько неоантигенов и/или T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления выявление одного или нескольких неоантигенов и/или T-клеточного ответа у субъекта указывает на эффективность лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления один или несколько неоантигенов содержат аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 37-65. В некоторых вариантах осуществления один или несколько неоантигенов содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления один или несколько неоантигенов содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления один или несколько неоантигенов содержат аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 46-49.
Комбинация модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена/ADC и средства для ингибирования контрольных точек иммунного ответа
[497] В различных вариантах осуществления пациент, у которого имеется рак, описанный в данном документе, может быть подвергнут лечению с применением комбинации модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и средства терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа. Контрольные точки иммунного ответа представляют собой ингибиторные пути, которые замедляют или останавливают иммунные реакции и предотвращают избыточное повреждение тканей вследствие неконтролируемой активности иммунных клеток. Применяемый в данном документе термин "ингибитор контрольных точек" означает любое терапевтическое средство, в том числе любое низкомолекулярное химическое соединение, антитело, молекулу нуклеиновой кислоты или полипептид или любые их фрагменты, которое ингибирует один или несколько ингибиторных путей, за счет чего обеспечивается более функциональная иммунная активность.
[498] Как было показано, лечение пациентов с помощью ингибирования контрольных точек иммунного ответа имеет хорошую эффективность при определенных клинических показаниях. Недавно FDA одобрило применение ингибитора контрольных точек у пациентов с опухолями, проявляющими высокую микросателлитную нестабильность, независимо от происхождения ткани. Данная регистрация частично была основана на наблюдении того, что значения частоты ответа положительно коррелируют с мутационной нагрузкой (Rizvi et al. (2015) Science 348(6230):124-8; Hellmann et al. (2018) Cancer Cell 33(5):853-861). Оценки из литературы варьируют по абсолютным числам и в зависимости от происхождения, но в общем подтверждают, что выше порогового значения ~150-250 мутаций, вероятность ответа повышается. Анализ данных TCGA демонстрирует, что большой процент развивающихся у взрослых опухолей разного происхождения имеет сравнительно небольшую мутационную нагрузку с несинонимичными изменениями (Vogelstein et al. (2013) Science 339:1549-58). Большинство линий происхождения характеризуются средними значениями частоты несинонимичных мутаций ~30-80 на пациента, значительно ниже пороговых значений, требуемых для повышения вероятности ответа на ингибиторы контрольных точек.
[499] Например, как было показано, HER2-положительный рак молочной железы имеет в среднем ~60 несинонимичными мутаций, присутствующих в образце пациента. Однако пороговое значение для эффективности лечения с помощью ингибитора контрольных точек, как упомянуто выше, по оценками находится в диапазоне ~150-250 несинонимичных мутаций, т.е. пациенты со значением выше данного порогового значения более вероятно будут демонстрировать полную ремиссию, частичную ремиссию и/или стабилизацию заболевания, в то время как у пациентов со значением ниже данного порогового значения более вероятно проявляется прогрессирование заболевания. Следовательно, требуются стратегии для увеличения наблюдаемого числа несинонимичных мутаций и/или неоантигенов, присутствующих на опухолевых клетках, и они могут увеличивать общую вероятность ответа, например, на средство терапии на основе ингибитора контрольных точек. Поскольку цитокины (и их аналоги) действуют посредством подобного механизма действия, такие стратегии также могут повышать общую вероятность ответа на средства терапии на основе цитокинов.
[500] В настоящее время значения частоты ответа при HER2-положительном раке молочной железы составляют ~15-25% (CTI NCT02129556). В различных вариантах осуществления, раскрытых в данном документе, лечение с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в комбинации со средством терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа и/или цитокина может улучшать такие значения частоты ответа. В различных вариантах осуществления лечение с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в комбинации со средством терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа и/или цитокина можно применять в отношении любой опухоли, возникающей у взрослых, в частности у тех, у которых медианная частота мутаций с несинонимичными изменениями ниже рассчитанного порогового значения, составляющего ~150 мутаций. В некоторых вариантах осуществления иллюстративные типы рака, подходящие для лечения с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции по настоящему изобретению по отдельности или в комбинации с дополнительным средством терапии (например, со средством терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа, со средством терапии на основе цитокина), включают без ограничения рак пищевода, неходжкинскую лимфому, колоректальный рак, рак головы и шеи, рак желудка, рак эндометрия, аденокарциному поджелудочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, печеночноклеточный рак, глиобластому, рак молочной железы (например, HER2-положительный рак молочной железы), рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого), хронический лимфоцитарный лейкоз и острый миелоидный лейкоз. Другие иллюстративные подходящие типы рака определены, например, в Vogelstein et al. (2013) Science 339:1549-58, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[501] Поскольку применение многих средств терапии на основе ингибиторов контрольных точек иммунного ответа обусловлено постоянной экспрессией опухоль-ассоциированных антигенов, для эффективности и для "повторной стимуляции" популяций реактивных T-клеток необходимы регулярные бустерные введения средств лечения. Индуцибельная природа модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или неоантигенов, образующихся под действием ADC, описанных в данном документе, обеспечивает терапевтические схемы введения, которые могут быть разработаны для усиления иммунного ответа неоантиген-реактивных T-клеток, в то же время ограничивая истощение T-клеток, зачастую вызванное хронической стимуляцией антигеном. Например, в некоторых вариантах осуществления начальная доза модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции вводится субъекту для запуска аберрантного сплайсинга и продуцирования неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления по прошествии периода времени, необходимого для продуцирования белка и презентации антигена, затем субъекту вводят начальную дозу ингибитора контрольных точек для стимуляции и/или усиления примирования и размножения эффекторных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления период ожидания между введением доз модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и ингибитора контрольных точек иммунного ответа составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6 или приблизительно 7 дней. В некоторых вариантах осуществления период ожидания составляет от приблизительно 3 дней до приблизительно 5 дней. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CTLA4, OX40, CD40 и/или GITR. В некоторых вариантах осуществления комбинированный терапевтический благоприятный эффект модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и ингибитора контрольных точек иммунного ответа может быть аддитивным или сверхаддитивным.
[502] В некоторых вариантах осуществления после периода, обеспечивающего возможность примирования и размножения T-клеток, субъекту вводят вторую или последующую дозу модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для запуска повторного представления неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления период ожидания между введением начальной дозы ингибитора контрольных точек иммунного ответа и второй или последующей дозы модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель. В некоторых вариантах осуществления период ожидания составляет приблизительно 3 недели. После введения второй или последующей дозы модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в некоторых вариантах осуществления иммунная система может контактировать с опухолевыми клетками, представляющими неоантигены, и/или вызывать уничтожение опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления затем субъекту вводят вторую или последующую дозу ингибитора контрольных точек для дополнительного размножения популяции эффекторных T-клеток памяти после обеспечения вторичного примирования и размножения Т-клеток.
[503] В некоторых вариантах осуществления введение доз модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции после данной иллюстративной исходной схемы лечения может быть пульсирующим, т.е. модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию можно вводить в дозах с длительными интервалами (например, приблизительно каждые 4 недели, приблизительно каждые 5 недель, приблизительно каждые 6 недель) для обеспечения представления антигена, привлечения Т-клеток, и/или уничтожения опухолевых клеток, и/или восстановления популяции Т-клеток памяти. В более поздние временные точки в некоторых вариантах осуществления лечение с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции можно объединять с одним или несколькими ингибиторами контрольных точек иммунного ответа, направленными на восстановление эффекторной функциональности у популяций истощенных T-клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления в более поздние временные точки лечение с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции можно объединять с одним или несколькими ингибиторами контрольных точек иммунного ответа, целенаправленно воздействующими на PD1/PDL1, LAG3 и/или TIM3. В некоторых вариантах осуществления пульсирующий характер представления и примирования неоантигена может обеспечивать возможность для менее частого введения и/или введения в более низких дозах ингибитора контрольных точек иммунного ответа и/или модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, подлежащих введению. В некоторых вариантах осуществления пульсирующий характер представления неоантигена может обеспечивать один или несколько положительных эффектов лечения с помощью ингибитора контрольных точек иммунного ответа (например, антитела к CTLA4, такого как ипилимумаб) по сравнению с ингибитором контрольных точек иммунного ответа при введении без одновременного введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, например, за счет снижения потенциального риска нежелательных реакций, часто наблюдаемых в случае стандартной схемы введения ингибитора контрольных точек иммунного ответа.
[504] В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек представляет собой ингибитор пути антигена, ассоциированного с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA4). CTLA4, также известный как CD152, представляет собой белковый рецептор, который отрицательно регулирует иммунные ответы. CTLA4 конститутивно экспрессируется на регуляторных T-клетках, но его экспрессия повышается в обычных T-клетках только после активации. Подразумевается, что используемый в данном документе термин "ингибитор CTLA4" означает любой ингибитор CTLA4 и/или путь CTLA4. Иллюстративные ингибиторы CTLA4 включают без ограничения антитела к CTLA4. Антитела, блокирующие CTLA4, для применения у человека разрабатывали на основе активности в доклинических испытаниях, наблюдаемой на мышиных моделях противоопухолевого иммунитета. Иллюстративные антитела к CTLA4 включают без ограничения ипилимумаб (MDX-010) и тремелимумаб (CP-675,206), оба из которых являются полностью человеческими. Ипилимумаб представляет собой IgG1 со временем полужизни в плазме крови, составляющем примерно 12-14 дней; тремелимумаб представляет собой IgG2 со временем полужизни в плазме крови, составляющем примерно 22 дня. См., например, Phan et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100:8372-7; Ribas et al. (2005) J Clin Oncol. 23:8968-77; Weber et al. (2008) J Clin Oncol. 26:5950-6. В некоторых вариантах осуществления антитело к CTLA4 представляет собой ипилимумаб.
[505] В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек представляет собой ингибитор пути белка 1 программируемой клеточной гибели (PD1). Путь белка 1 программируемой клеточной гибели (PD1) представляет главный переключатель иммунного контроля, который может быть задействован опухолевыми клетками для преодоления активного иммунного надзора T-клеток. Лиганды для PD1 (PDL1 и PDL2) конститутивно экспрессируются или могут быть индуцированы в различных опухолях. Было обнаружено, что высокий уровень экспрессии PDL1 (и в меньшей степени PDL2) на опухолевых клетках коррелирует с плохим прогнозом и слабой выживаемостью при различных других типах солидных опухолей. Кроме того, было высказано предположение, что PD1 контролирует размножение опухолеспецифических T-клеток у пациентов со злокачественной меланомой. Эти наблюдения предполагают то, что путь PD1/PDL1 играет важнейшую роль в ускользании опухоли от распознавания иммунной системой и может считаться привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. Подразумевается, что используемый в данном документе термин "ингибитор PD1" означает любой ингибитор PD1 и/или путь PD1. Иллюстративные ингибиторы PD1 включают без ограничения антитела к PD1 и к PDL1. В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек представляет собой антитело к PD1. Иллюстративные антитела к PD1 включают без ограничения ниволумаб и пемпролизумаб (MK-3475). Ниволумаб, например, представляет собой полностью человеческое антитело к ингибитору контрольных точек иммунного ответа PD1 на основе иммуноглобулина G4 (IgG4), которое нарушает взаимодействие рецептора PD1 с его лигандами PDL1 и PDL2, обеспечивая тем самым ингибирование клеточного иммунного ответа (Guo et al. (2017) J Cancer 8(3):410-6). В некоторых вариантах осуществления антитело к PD1 представляет собой ниволумаб. Пембролизумаб, например, представляет собой эффективное и высокоселективное гуманизированное mAb, относящееся к изотипу IgG4/каппа, разработанное для непосредственного блокирования взаимодействия между PD1 и его лигандами: PDL1 и PDL2. Пембролизумаб значительно увеличивает опосредованные T-лимфоцитами иммунные ответы в культивируемых клетках крови от здоровых доноров-людей, пациентов с раком и приматов. Также сообщалось о том, что пембролизумаб модулирует уровень интерлейкина-2 (IL-2), фактора некроза опухоли альфа (TNFα), интерферона-гамма (IFNγ) и других цитокинов. Иллюстративные антитела к PDL1 включают без ограничения атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб. Атезолизумаб, например, представляет собой гуманизированное mAb на основе IgG1, которое, как сообщалось, блокирует взаимодействие PD1/PDL1 путем целенаправленного воздействия на экспрессированный PDL1 на различных видах злокачественных клеток. Данная блокировка пути PD1/PDL1 может стимулировать иммунные защитные механизмы против опухолей (Abdin et al. (2018) Cancers (Basel) 10(2):32). В некоторых вариантах осуществления антитело к PDL1 представляет собой атезолизумаб.
[506] В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на PD1/PDL1, CTLA4, OX40, CD40, LAG3, TIM3, GITR и/или KIR. В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CTLA4, OX40, CD40 и/или GITR. В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует в качестве ингибиторного антитела или другой подобной ингибиторной молекулы (например, ингибиторного антитела к CTLA4 или к PD1/PDL1). В других определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек оказывает целенаправленное воздействие в качестве агониста для мишени; примеры из данного класса включают молекулы, стимулирующие мишени OX40, CD40 и/или GITR. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек, который целенаправленно воздействует на OX40, CD40 и/или GITR, представляет собой антитело-агонист. Антитела-агонисты, направленные против OX40, могут выполнять двойную роль: подавлять супрессию под действием регуляторных T-клеток, при этом усиливать функции эффекторных T-клеток. Также было показано, что антитела-агонисты к GITR делают эффекторные T-клетки более устойчивыми к ингибированию, индуцированному регуляторными T-клетками (Karaki et al. (2016) Vaccines (Basel) 4(4):37). Подобным образом, антитела-агонисты к CD40 демонстрируют зависимую от T-клеток противоопухолевую активность. Активация CD40 на дендритных клетках увеличивает перекрестную презентацию опухолевых антигенов и, следовательно, число активированных эффекторных T-клеток, направленных на опухоль (Ellmark et al. (2015) Oncoimmunol. 4(7):e1011484).
[507] В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CTLA4 (например, является антителом к CTLA4). В определенных вариантах осуществления целенаправленное воздействие на CTLA4 облегчает примирование и активацию наивных T-клеток. В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на OX40 (например, является антителом к OX40). В определенных вариантах осуществления целенаправленное воздействие на OX40 усиливает размножение эффекторных T-клеток. В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CD40 (например, является антителом к CD40). В определенных вариантах осуществления целенаправленное воздействие на CD40 подавляет "толерогенное" примирование T-клеток и/или образование регуляторных T-клеток. В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на GITR (например, является антителом к GITR). В определенных вариантах осуществления целенаправленное воздействие на GITR подавляет активность регуляторных T-клеток. В определенных вариантах осуществления благоприятный эффект комбинированной терапии (например, влияние на по меньшей мере один симптом или риск/скорость прогрессирования заболевания) с применением модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и средства, целенаправленно воздействующего на CTLA4, OX40, CD40 и/или GITR, является аддитивным. В некоторых вариантах осуществления благоприятный эффект комбинированной терапии с применением модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и средства, целенаправленно воздействующего на CTLA4, OX40, CD40 и/или GITR, является сверхаддитивным (т.е. синергетическим).
[508] Стратегии лечения с применением ингибитора контрольных точек иммунного ответа основаны на гипотезе, что лечение облегчает и/или усиливает примирование T-клеток при ответах на опухоли, которые характеризуются слабой или недостаточной антигенностью (например, CTLA4), или что лечение восстанавливает и/или усиливает T-клетки, которые отвечают на опухолевые антигены, но истощились вследствие постоянного характера представления антигена (например, PD1, PDL1) (Chen and Mellman (2013) Immunity 39(1):1-10). Примеры подходящих средств терапии и средств для ингибирования контрольных точек, например, антитела к PD1, PDL1 или CTLA4, известны из уровня техники. См., например, WO 2001/014424, WO 2013/173223, WO 2016/007235.
[509] Комбинирование данных ответов за счет примированных T-клеток после терапии ингибитором контрольных точек с лечением для индуцирования неоантигенов в опухолевых клетках, на которые примированная иммунная система может реагировать, может обеспечивать благоприятный синергизм. Поскольку неоантигены, образующиеся под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, еще не представлены для примирования T-клеток, комбинация с ингибитором CTLA4 может быть особенно благоприятной. В некоторых вариантах осуществления лечение предусматривает введение одного или нескольких модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для индуцирования продуцирования неоантигенов, а также начальное введение ингибитора CTLA4 для стимуляции примирования CD8 Т-клеток, осуществляемое до этого введения, одновременно с ним или после него. В некоторых вариантах осуществления пациенту обеспечивают дополнительные введения ингибитора CTLA4, например, для дополнительной стимуляции примирования и/или активации популяций CD8, реактивных в отношении неоантигена. В некоторых вариантах осуществления дополнительные введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции можно назначать пациенту для повышения представления неоантигена опухолью. Повторные введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и средства терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа можно осуществлять одновременно или с разнесенными во времени интервалами. В некоторых вариантах осуществления лечение дополнительно включает совместное лечение с помощью ингибитора PD1/PDL1, например, для восстановления эффекторной функции истощенных T-клеток, целенаправленно воздействующих на неоантиген в пределах микроокружения опухоли.
[510] Используемые в данном документе термины "комбинация" или "комбинированная терапия" означают введение одного или нескольких из модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции вместе с дополнительным средством или средством терапии (например, с ингибитором контрольных точек иммунного ответа, с цитокином или аналогом цитокина, с неоантигенной вакциной, с CAR-T) в качестве части схемы лечения, предназначенной для обеспечения благоприятного (т.е. аддитивного или синергического) эффекта от совместного действия одного или нескольких вводимых средств. В некоторых вариантах осуществления комбинация также может включать одно или несколько дополнительных средств, в том числе без ограничения химиотерапевтических средств, средств, препятствующих ангиогенезу, и средств, которые снижают иммунную супрессию (например, второй ингибитор контрольных точек). Благоприятный эффект комбинации включает без ограничения фармакокинетическое или фармакодинамическое совместное действие, обеспечиваемое комбинацией терапевтических средств. Введение таких терапевтических средств в комбинации, как правило, осуществляют в течение определенного периода времени (например, минут, часов, дней или недель в зависимости от выбранной комбинации).
[511] Используемые в данном документе термины " вводимый в комбинации" или "совместное введение" означают, что два или более разных средств лечения доставляются в организм субъекта на протяжении времени, в течение которого субъект страдает патологическим состоянием (например, неопластическим нарушением). Например, в некоторых вариантах осуществления два или более средств лечения доставляются после того, как у субъекта было диагностировано заболевание или нарушение, и перед тем, как заболевание или нарушение были излечены или устранены, или когда субъект был идентифицирован как имеющий риск его развития, но до того как у субъекта развились симптомы заболевания. В некоторых вариантах осуществления все еще осуществляют доставку одного средства лечения, когда начинают доставку второго средства лечения, так что присутствует перекрывание. В некоторых вариантах осуществления доставку первого и второго средства лечения начинают в одно и то же время. Данные типы доставки иногда в данном документе называются "одновременной", "совместной" или "сопутствующей" доставкой. В других вариантах осуществления доставка одного средства лечения заканчивается перед началом доставки второго средства лечения. Данный тип доставки иногда в данном документе называется "поочередной" или "последовательной" доставкой.
[512] В некоторых вариантах осуществления два средства лечения (например, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиция и ингибитор контрольных точек иммунного ответа) содержатся в одной и той же композиции. Такие композиции можно вводить в любой подходящей форме и с помощью любого подходящего пути. В других вариантах осуществления два средства лечения (например, модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию и ингибитор контрольных точек иммунного ответа) вводят в отдельных композициях, в любой подходящей форме и с помощью любого подходящего пути. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, и композицию, содержащую ингибитор контрольных точек иммунного ответа, можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке в разные моменты времени; в любом случае их следует вводить достаточно близко по времени для обеспечения требуемого терапевтического или профилактического эффекта.
[513] В вариантах осуществления, предусматривающих либо одновременную, либо последовательную доставку, лечение может быть более эффективным вследствие комбинированного введения. В некоторых вариантах осуществления первое средство лечения является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдают с меньшим количеством первого средства лечения (например, при более низкой дозе), чем наблюдали бы, если первое средство лечения вводили при отсутствии второго средства лечения. В некоторых вариантах осуществления первое средство лечения является более эффективным, так что снижение тяжести симптома или другого параметра, ассоциированного с заболеванием или нарушением, является большим, чем наблюдали бы в случае доставки первого средства лечения при отсутствии второго средства лечения. В других вариантах осуществления аналогичную ситуацию наблюдают для второго средства лечения. В некоторых вариантах осуществления положительный эффект комбинированной терапии (например, эффект в отношении по меньшей мере одного симптома или риска/скорости прогрессирования заболевания) является аддитивным. В некоторых вариантах осуществления положительный эффект комбинированной терапия является супераддитивным.
[514] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и по меньшей мере одного дополнительного средства терапии (т.е. средства терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа, цитокина или аналога цитокина, неоантигенной вакцины, CAR-T). В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции индуцирует образование по меньшей мере одного неоантигена и/или T-клеточного ответа. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции индуцирует иммунный ответ на двухнитевую РНК. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции обеспечивает индуцирование иммуногенной гибели клеток. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии может предусматривать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять дополнительных средств терапии. Например, в некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию можно вводить в комбинации с двумя средствами терапии на основе ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, т.е. с применением двух разных ингибиторов контрольных точек иммунного ответа. В некоторых других вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию можно вводить в комбинации со средством терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа и неоантигенной вакциной.
[515] В некоторых вариантах осуществления комбинированной терапии вводимое количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, или композиции, и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии уменьшено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, или композиции, и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгат антитела и лекарственного средства, или композицию, и/или по меньшей мере одно дополнительное средство терапии вводят на по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% менее часто по сравнению со стандартной схемой введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, или композиции, и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления вводимое количество и/или дозировка модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства, или композиции, и/или по меньшей мере одного дополнительного средства терапии приводят к более низкой системной токсичности и/или улучшенной переносимости.
[516] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции начинают до введения по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции начинают после введения по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции начинают одновременно с введением по меньшей мере одного дополнительного средства терапии.
[517] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции, применяемое для повторного введения, снижено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции.
[518] В некоторых вариантах осуществления введение по меньшей мере одного дополнительного средства терапии повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество по меньшей мере одного дополнительного средства терапии, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество по меньшей мере одного дополнительного средства терапии, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению со стандартной дозировкой по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления количество по меньшей мере одного дополнительного средства терапии, применяемое для повторного введения, снижено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой по меньшей мере одного дополнительного средства терапии.
[519] В некоторых вариантах осуществления повторное введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции осуществляют одновременно с повторным введением по меньшей мере одного дополнительного средства терапии. В некоторых вариантах осуществления повторное введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции осуществляют последовательно или с разнесением во времени с повторным введением по меньшей мере одного дополнительного средства терапии.
[520] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и средства терапии на основе ингибитора контрольных точек иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления средство терапии на основе ингибитора контрольных точек предусматривает введение по меньшей мере одного ингибитора контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью по меньшей мере одного ингибитора контрольных точек при введении его по отдельности. В некоторых вариантах осуществления может считаться, что субъект характеризуется невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью по меньшей мере одного ингибитора контрольных точек, как определено с применением, например, иммунозависимых критериев ответа на иммунотерапию (irRC) и/или иммунозависимых критериев оценки ответа на иммунотерапию при солидных опухолях (irRECIST). См., например, Wolchok et al. (2009) Clin Cancer Res. 15(23):7412-20; Bohnsack et al. "Adaptation of the Immune-Related Response Criteria:irRECIST" (Abstract 4958) ESMO 2014. Иллюстративные критерии могут включать критерии, применяемые в данной области техники для определения того, когда состояние опухолей у пациентов, страдающих от рака, улучшается ("ответ"), остается таким же ("стабилизация") или ухудшается ("прогрессирование") в ходе лечения, если оцениваемое средство лечения представляет собой иммуноонкологическое лекарственное средство (например, ингибитор контрольных точек иммунного ответа). В некоторых вариантах осуществления может считаться, что субъект характеризуется непереносимостью по меньшей мере одного ингибитора контрольных точек, если у субъекта наблюдается одно или более чем одно нежелательное (степени 2+) явление, идентифицированное для соответствующего ингибитора контрольных точек (например, ипилимумаба). Например, в некоторых вариантах осуществления может считаться, что субъект характеризуется непереносимостью средства лечения на основе ипилимумаба, если у субъекта наблюдается одно или несколько нежелательных явлений, выбранных из энтероколита, гепатита, дерматита (в том числе токсичного эпидермального некролиза), нейропатии и эндокринопатии (Yervoy® (ипилимумаба), приложение к маркировке, соответствующей требованиям FDA, 2018).
[521] В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на PD1/PDL1, CTLA4, OX40, CD40, LAG3, TIM3, GITR и/или KIR. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CTLA4, OX40, CD40 и/или GITR. В некоторых вариантах осуществления целенаправленное воздействие ингибитора контрольных точек обеспечивается с помощью ингибиторного антитела или другой подобной ингибиторной молекулы. В некоторых других вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует в качестве антитела-агониста или другой подобной молекулы-агониста. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек предусматривает ингибитор пути антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA4). В некоторых вариантах осуществления ингибитор CTLA4 представляет собой антитело к CTLA4. В некоторых вариантах осуществления антитело к CTLA4 представляет собой ипилимумаб. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек предусматривает ингибитор пути белка 1 программируемой клеточной гибели (PD1). В некоторых вариантах осуществления ингибитор PD1 представляет собой антитело к PD1. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD1 представляет собой ниволумаб. В некоторых вариантах осуществления ингибитор PD1 представляет собой антитело к PDL1. В некоторых вариантах осуществления антитело к PDL1 представляет собой атезолизумаб. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек предусматривает ингибитор CTLA4 и ингибитор PD1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на OX40. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на CD40. В некоторых вариантах осуществления ингибитор контрольных точек целенаправленно воздействует на GITR. В некоторых вариантах осуществления благоприятный эффект комбинированной терапии (например, влияние на по меньшей мере один симптом или риск/скорость прогрессирования заболевания) с применением модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и ингибитора контрольных точек иммунного ответа (например, антитела или молекулы, целенаправленно воздействующих на CTLA4, PD1/PDL1, OX40, CD40 и/или GITR) является аддитивным. В некоторых вариантах осуществления благоприятный эффект комбинированной терапии с применением модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и ингибитора контрольных точек иммунного ответа (например, антитела или молекулы, целенаправленно воздействующих на CTLA4, PD1/PDL1, OX40, CD40 и/или GITR) является сверхаддитивным (т.е. синергетическим).
[522] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и средства терапии на основе цитокина или аналога цитокина. В некоторых вариантах осуществления средство терапии на основе цитокина или аналога цитокина предусматривает введение по меньшей мере одного цитокина или аналога цитокина. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью по меньшей мере одного цитокина или аналога цитокина при введении их по отдельности.
[523] В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает средство усиления для T-клеток. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IFNγ и/или TNFα. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-2, IL-10, IL-12 и/или IL-15. В некоторых вариантах осуществления введение цитокина или аналога цитокина усиливает примирование T-клеток после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции вследствие индуцирования образования и представления неоантигенов.
[524] В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-2. В некоторых вариантах осуществления IL-2 усиливает сигналы в эффекторных клетках, содействуя их размножению (Rosenberg (2014) J Immunol. 192(12):5451-8). В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-10. В некоторых вариантах осуществления IL-10 усиливает примирование и активацию CD8+ T-клеток (Mumm et al. (2011) Cancer Cell 20(6):781-96). В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-12. В некоторых вариантах осуществления IL-12 сопрягает врожденный и адаптивный иммунный ответы с усилением антиген-специфического примирования и целенаправленного воздействия (Tugues et al. (2015) Cell Death Differ. 22(2):237-46). В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IL-15. В некоторых вариантах осуществления IL-15 усиливает примирование и/или активацию эффекторных T-клеток (CD8). В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает IFNγ. В некоторых вариантах осуществления IFNγ дополняет секрецию IFNγ эффекторными T-клетками. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина предусматривает TNFα. В некоторых вариантах осуществления TNFα дополняет секрецию TNFα эффекторными T-клетками.
[525] В некоторых вариантах осуществления начальную дозу модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции вводят субъекту для запуска аберрантного сплайсинга и продуцирования неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления по прошествии периода времени, необходимого для продуцирования белка и презентации антигена, субъекту затем вводят начальную дозу цитокина или аналога цитокина для стимуляции и/или усиления примирования и размножения эффекторных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления период ожидания между введением доз модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и цитокина или аналога цитокина составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6 или приблизительно 7 дней. В некоторых вариантах осуществления период ожидания составляет от приблизительно 3 дней до приблизительно 5 дней. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина представляют собой IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IFNγ и/или TNFα. В некоторых вариантах осуществления комбинированный терапевтический благоприятный эффект модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и цитокина или аналога цитокина может быть аддитивным или сверхаддитивным.
[526] В некоторых других вариантах осуществления исходную дозу цитокина или аналог цитокина вводят субъекту для стимуляции и/или усиления примирования и размножения эффекторных T-клеток. После периода ожидания в некоторых вариантах осуществления субъекту затем вводят начальную дозу модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для запуска аберрантного сплайсинга и продуцирования неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления период ожидания между введением доз цитокина или аналога цитокина и модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6 или приблизительно 7 дней. В некоторых вариантах осуществления период ожидания составляет от приблизительно 3 дней до приблизительно 5 дней. В некоторых вариантах осуществления цитокин или аналог цитокина представляют собой IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IFNγ и/или TNFα. В некоторых вариантах осуществления комбинированный терапевтический благоприятный эффект цитокина или аналога цитокина и модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции может быть аддитивным или сверхаддитивным.
[527] В некоторых вариантах осуществления после периода, обеспечивающего возможность примирования и размножения T-клеток, субъекту вводят вторую или последующую дозу модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции для запуска повторного представления неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления период ожидания между введением начальной дозы цитокина или аналога цитокина и второй или последующей дозы модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель. В некоторых вариантах осуществления период ожидания составляет приблизительно 3 недели. В некоторых вариантах осуществления последующие дозы цитокина или аналога цитокина можно вводить, например, между последующими введениями доз модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. После введения второй или последующей дозы модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в некоторых вариантах осуществления иммунная система может контактировать с опухолевыми клетками, представляющими неоантигены, и/или вызывать уничтожение опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления введение доз модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции после данной иллюстративной исходной схемы лечения может быть пульсирующим, т.е. модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию можно вводить в дозах с длительными интервалами (например, приблизительно каждые 4 недели, приблизительно каждые 5 недель, приблизительно каждые 6 недель) для обеспечения представления антигена, привлечения Т-клеток, и/или уничтожения опухолевых клеток, и/или восстановления популяции Т-клеток памяти.
[528] В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 150 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 100 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 50 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет неопластическое нарушение, например, гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль, или имеет подозрение на его наличие. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза, лимфомы и миеломы. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака молочной железы, рака желудка, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, рака матки, карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из HER2-положительного рака молочной железы, аденокарциномы желудка, рака предстательной железы и остеосаркомы.
Комбинация модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена/ADC и неоантигенной вакцины:
[529] В различных вариантах осуществления пациент, у которого имеется рак, описанный в данном документе, может быть подвергнут лечению с применением комбинации модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и неоантигенной вакцины. Не ограничиваясь теорией, было показано, что вакцины, применяемые по отдельности или в комбинации с молекулами, представляющими собой ингибитор контрольных точек иммунного ответа (ICI), являются перспективными в ранее проведенных испытаниях (Ott et al. (2017) Nature 547(7662):217-21; Sahin et al. (2017) Nature 547(7662):222-6), но обычно требуется секвенирование мутаций в опухоли у пациента (Ott et al. (2017) Nature 547(7662):217-21; Aldous and Dong (2018) Bioorg. Med. Chem. 26(10):2842-9). Таким образом, действие вакцин зачастую зависит от достаточных количеств несинонимичных мутаций, которые являются антигенными. В целом, в опухолях с очень низкой мутационной нагрузкой имеется небольшое количество антигенов-кандидатов, и в случае опухолей с быстрым ростом имеется ограниченное время для идентификации и получения специфических для пациента вакцин.
[530] До настоящего времени попытки разработать вакцины, которые характеризовались бы широким охватом иммуногенности для большого процента пациентов, были сосредоточены на белках, которые либо часто мутируют, либо эктопически сверхэкспрессируются или амплифицируются, и/или которые существуют в виде "собственных" белков в организме. Кроме того, эти белки зачастую экспрессируются в тканях, на которые не оказывает воздействие иммунная система (например, нейронные маркеры, экспрессируемые в типах нейроэндокринных опухолей), в то же время другие белки могут в норме экспрессироваться во время эмбриогенеза (например, раковые эмбриональные антигены). Таким образом, применимость вакцин, использующих такие белки в качестве антигенов, зачастую ограничена специфическим линиями происхождения или подгруппами опухоли, в которых присутствуют один или несколько антигенов. Применимость вакцины также будет необходимо подтверждать посредством секвенирования образцов опухоли пациента, что может занимать много времени.
[531] Более того, если эти антигены существуют в виде "собственных" белков, иммунная система вероятно будет примирована для распознавания этих белков как "собственных" и, таким образом, не будет отвечать. Или, в качестве альтернативы, если иммунная система способна обеспечивать эффекторный ответ на такие антигены, он может приводить к побочным эффектам, связанным с воздействием на мишени, в тканях, где может экспрессироваться антиген. В обоих этих случаях одной из ключевых проблем является то, что большинство антигенных пептидов получают из "генов-пассажиров" (т.е. генов, которые мутируют или амплифицируются в ходе онкогенеза, но не играют важной роли в обеспечении продолжительного выживания или пролиферации опухоли как таковой). По этой причине эти гены могут быть подвергнуты сайленсингу без значительных последствий для прогрессирования опухоли и, таким образом, могут позволить опухоли "избежать" иммунного ответа на эти антигены. Без ограничения теорией, данный механизм может играть роль в эволюции опухоли, при которой случайные мутации, которые характеризуются сильной антигенностью, часто подвергаются "отсеивающему отбору" опухолью в ходе ранних стадий онкогенеза (Dunn et al. (2004) Annu. Rev. Immunol. 22:329-60).
[532] Кроме того, определенные свидетельства также указывают на то, что постоянная презентация антигена и иммунная стимуляция могут приводить к анергии и истощению иммунных клеток (Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12(4):252-64). Такие фенотипы лежат в основе терапевтического обоснования используемых в настоящее время средств лечения на основе ICI, поскольку, как было показано, ICI либо сдерживают фенотип истощения иммунных клеток (α-PD1/PD-L1), либо облегчают дополнительные иммунные клеточные ответы (α-CTLA4). Примечательно, что в случае средства терапии на основе α-CTLA4 сообщалось, что определенная подгруппа пациентов демонстрировала серьезные связанные с иммунной системой нежелательные явления, которые могут быть обусловлены содействием активации T-клеток и разрушением механизмов иммунной толерантности, ограничивающей аутореактивные иммунные ответы.
[533] Оба такие подхода (т.е. запуск или усиление de novo иммунных ответов на неоантигены или повторная активация при анергии или истощении существующих иммунных ответов) связаны с постоянной активацией иммунной системы. В связи с этим, эти подходы являются чувствительными к анергии, редактированию и другим опухоль-опосредованным механизмам, направленным на супрессию вовлечения иммунной системы.
[534] В противоположность этому, лечение с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, раскрытых в данном документе, может индуцировать иммунный ответ на последовательности, представляющие собой неоантигены. В некоторых вариантах осуществления презентация неоантигенов предоставляет адаптивной иммунной системе более разнообразные мишени, с которым она контактирует и активируется. В некоторых вариантах осуществления способность модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции быстро индуцировать альтернативный сплайсинг и образование неоантигенов может снижать риск истощения иммунной системы вследствие постоянного воздействия неоантигенов, образующихся в результате мутаций, и/или ограничивать способность опухолевых клеток адаптироваться к избеганию терапии. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в комбинации с неоантигенной вакциной усиливает иммунный ответ на неоантигены, продуцируемые под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят до, в ходе или после вакцинации. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию и/или вакцину можно вводить один раз или больше одного раза на протяжении курса лечения. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят однократно, а затем модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят несколько раз на протяжении курса лечения. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят один раз, а затем в течение курса лечения вводится одна или несколько бустерных доз.
[535] Используемый в данном документе термин "неоантигенная вакцина" означает объединенный образец одного или нескольких иммуногенных неоантигенных пептидов или mRNA, например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти или более неоантигенных пептидов. Термин "вакцина" означает композицию для развития иммунитета для профилактики и/или лечения заболевания (например, неопластического нарушения, например, гематологического злокачественного новообразования или солидной опухоли). Соответственно, вакцины представляют собой лекарственные препараты, которые содержат иммуногенные средства и предназначены для применения на человеке или животных для развития специфических механизмов иммунной защиты и образования защитных веществ после вакцинации. Неоантигенная вакцина может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, вспомогательное вещество и/или адъювант.
[536] Используемый в данном документе термин "иммуногенный" означает любое средство или композицию, которые могут вызывать иммунный ответ, например, T-клеточный ответ. Иммунный ответ может быть опосредован антителом, или клеткой, или обоими.
[537] В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, а затем вводят пептидную или mRNA-вакцину на основе известного неоантигена для усиления иммунного ответа на неоантигены, продуцируемые под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых других вариантах осуществления пациенту вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, а затем проводят скрининг в отношении присутствия неоантигенов, продуцируемых в результате обработки. Следовательно, один или несколько из данных неоантигенов применяют для создания персонализированной вакцины, которую вводят пациенту. В любом из этих вариантов осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию и/или пептид или mRNA-вакцину можно вводить пациенту однократно или повторно.
[538] В различных вариантах осуществления подходящий неоантиген для вакцины может быть идентифицирован посредством скрининга панели транскриптов с измененным сплайсингом и устойчивой экспрессией, полученных из одного или нескольких образцов ткани пациента (например, из биоптата опухоли). В некоторых вариантах осуществления последовательности вариантов белка идентифицируют в подвергнутом скринингу образце на основе трансляции вдоль соединения в подвергнутой аберрантному сплайсингу mRNA, при этом сохраняя части белковой последовательности (не более 12 аминокислот), фланкирующие изменения аминокислот, охватывающие соединение. В некоторых вариантах осуществления эти пептидные фрагменты, охватывающие границы сплайсинга, исследуют в отношении высокой аффинности связывания с аллелями MHC1, например, с применением такого средства, как NetMHC1 (Nielsen et al. (2003) Protein Sci 12(5):1007-17; Andreatta and Neilsen (2016) Bioinformatics 32(4):511-7). Эти результаты позволяют фильтровать неопептиды до неопептидов, которые, как прогнозируется, характеризуются с высокой аффинностью связывания с составом аллелей HLA, уникальным для пациента, а также собирать пулы неопептидов, которые, как прогнозируется, связываются с широким спектром аллелей HLA, присутствующих с высокой частотой в разных популяциях (Maiers et al. (2007) Hum Immunol 68(9):779-88). В различных вариантах осуществления идентифицированные неопептиды затем составляют в виде вакцины, например, посредством конъюгации с подходящим носителем или адъювантом (Ott et al. (2017) Nature 547(7662):217-21), или для доставки в виде mRNA (Sahin et al. (2017) Nature 547(7662):222-6).
[539] В некоторых вариантах осуществления выбор неоантигена основан на скрининге ответа опухоли у отдельного пациента на воздействие модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции с идентификацией одного или нескольких неоантигенов, образовавшихся в результате обработки, для применения в последующей вакцинации. В других вариантах осуществления неоантиген выбирают, например, на основании скрининга панели образцов, полученных от разных пациентов, для идентификации общих неоантигенов, продуцируемых под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, а затем его применяют в качестве универсальной вакцины для будущих пациентов.
[540] Не ограничиваясь теорией, в некоторых вариантах осуществления применение универсальной неоантигенной вакцины позволяет избежать необходимости в секвенировании и анализе уникального мутационного статуса опухоли каждого пациента, поскольку выбранные неоантигены не зависят от мутации в опухоли, а скорее имитируют неоантиген, продуцируемый под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, и обычно распознаваемый организмом как чужеродный. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления применение неоантигенной вакцины может быть особенно эффективным, поскольку опухолевые клетки пациента могут с большей вероятностью мутировать, не продуцируя один или несколько неоантигенов, которые зависят от мутации в опухоли, по сравнению с клетками, которые имитируют неоантиген, продуцируемый под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. Это может создавать возможность составления основной вакцины, которая будет характеризоваться широким охватом иммуногенности для большого процента пациентов, ускоряя начало схемы лечения. Пациентов можно вакцинировать в соответствии со схемами, изложенными в данном документе, и перед следующим завершением вакцинации можно дополнительно подвергать лечению с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, например, для индуцирования экспрессии неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления пациентам можно вводить модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию до вакцинации, одновременно с ней или после нее. В некоторых вариантах осуществления пациентам вводят модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, у них проводят скрининг в отношении одного или нескольких неоантигенов, обнаруженных в панели универсальных неоантигенов, и их вакцинируют универсальной неоантигенной вакциной, содержащей по меньшей мере один универсальный неоантиген, идентифицированный у субъекта. В некоторых вариантах осуществления пациентам можно вводить модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию один раз или больше одного раза после вакцинации. Модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, или ADC, или композицию и/или вакцину можно вводить один раз или больше одного раза на протяжении курса лечения.
[541] В некоторых вариантах осуществления вакцина может содержать один или более одного неоантигенного пептида или mRNA. В различных вариантах осуществления вакцина может содержать один или более одного длинного неоантигенного пептида. В различных вариантах осуществления такие "длинные" неоантигенные пептиды подвергаются эффективной интернализации, процессингу и перекрестному представлению в специализированных антигенпредставляющих клетках, таких как дендритные клетки. Подобным образом, в других контекстах было показано, что длинные вакцинные пептиды индуцируют цитотоксические T-клетки у человека (Melief and van der Burg (2008) Nat Rev Cancer 8(5):351-60). В различных вариантах осуществления неоантигенный пептид является удлиненным с включением собственно последовательности неоантигенного пептида в дополнение к фланкирующим аминокислотным последовательностям. В различных вариантах осуществления удлиненная пептидная последовательность облегчает захват белка антигенпрезентирующими клетками, например, дендритными клетками. В различных вариантах осуществления удлиненная пептидная последовательность обеспечивает эффективную презентацию антигена и примирование T-клеток в моделях с разными изотипами HLA. В различных вариантах осуществления более длинный неоантигенный пептид и/или удлиненная пептидная последовательность проявляют повышенным захват антигенпрезентирующими клетками (например, дендритными клетками), повышенную презентацию антигена и/или повышенное примирование T-клеток по сравнению с более коротким неоантигенным пептидом и/или более короткой пептидной последовательностью (например, с пептидной последовательностью, длина которой составляет менее приблизительно 10 или менее приблизительно 5 аминокислот). В некоторых вариантах осуществления длина длинного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина длинного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина длинного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот.
[542] В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность и/или антигенная часть непосредственно не перекрываются с канонической пептидной последовательностью (например, с любой из иллюстративных канонических пептидных последовательностей, подчеркнутых в таблице 8) или не состоят из нее.
[543] Аминокислотные последовательности иллюстративных длинных неоантигенных пептидов представлены в таблице 8.
[544] Эти иллюстративные неоантигенные пептиды образуются после введения ADC, содержащих модуляторы сплайсинга на основе пладиенолида, однако, учитывая сходный механизм действия (т.е. сходные механизмы модуляции сплайсинга), сходные неоантигенные пептиды могут быть получены под действием модуляторов сплайсинга на основе гербоксидиена.
[545] Белковые последовательности двадцати девяти неопептидов, перечисленных в таблице 7, могут быть удлинены. Удлиненная белковая последовательность включает одновременно собственно неопептидную последовательность в дополнение к фланкирующим аминокислотным последовательностям. Удлиненная белковая последовательность лучше облегчает захват белка дендритными клетками и содействует презентации антигена и примированию T-клеток в моделях с разными изотипами HLA. Аминокислотные последовательности двадцати девяти удлиненных неопептидов представлены в таблице 8.
[546] Применяемые в данном документе "неоантигенный пептид" или "mRNA-вакцина" охватывают применение фрагмента неоантигенного пептида или кодирующей его mRNA, при условии, что данный фрагмент сохраняет иммуногенный потенциал.
[547] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенного(-ых) пептида(-ов) находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенного(-ых) пептида(-ов) находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенного(-ых) пептида(-ов) находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот.
[548] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и неоантигенной вакцины. Неоантигенная вакцина может представлять собой, например, пептидную неоантигенную вакцину или неоантигенную mRNA-вакцину. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят до введения неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят после введения неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию вводят одновременно с введением неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения.
[549] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно представлена комбинация, содержащая модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, содержащую модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и неоантигенную вакцину (например, универсальную неоантигенную вакцину) для применения для лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина представляет собой пептидную неоантигенную вакцину или неоантигенную mRNA-вакцину. В некоторых вариантах осуществления комбинация дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное средство терапии. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять дополнительных средств терапии.
[550] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении дополнительно представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем (a) введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; (b) выявления одного или нескольких неоантигенов у субъекта после введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции; (c) сравнения одного или нескольких неоантигенов с панелью универсальных неоантигенов и (d) введения субъекту универсальной неоантигенной вакцины, содержащей по меньшей мере один универсальный неоантиген, присутствующий у субъекта. В некоторых вариантах осуществления универсальную неоантигенную вакцину вводят по отдельности или в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным средством терапии. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять дополнительных средств терапии.
[551] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления повторное введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции начинают до введения универсальной неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления повторное модулятора сплайсинга, ADC или композиции начинают после введения универсальной неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления повторное введение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции начинают одновременно с введением универсальной неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, применяемое для начального и/или повторного введения, снижено по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции при применении при отсутствии лечения с помощью вакцины. В некоторых вариантах осуществления количество модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, применяемое для начального и/или повторного введения, снижено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции.
[552] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное средство терапии предусматривает введение ингибитора контрольных точек (например, любого из иллюстративных ингибиторов контрольных точек, описанных в данном документе). В некоторых вариантах осуществления введение ингибитора контрольных точек иммунного ответа начинают до введения универсальной неоантигенной вакцины и/или повторного введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления введение ингибитора контрольных точек иммунного ответа начинают после введения универсальной неоантигенной вакцины и/или повторного модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления введение ингибитора контрольных точек иммунного ответа начинают одновременно с введением универсальной неоантигенной вакцины и/или с повторным введением модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. В некоторых вариантах осуществления введение ингибитора контрольных точек повторяют по меньшей мере один раз после начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество ингибитора контрольных точек, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению с количеством, применяемым для начального введения. В некоторых вариантах осуществления количество ингибитора контрольных точек, применяемое для повторного введения, снижено по сравнению со стандартной дозировкой ингибитора контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления количество ингибитора контрольных точек иммунного ответа, применяемое для повторного введения, снижено на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75% или 90% по сравнению со стандартной дозировкой ингибитора контрольных точек иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется непереносимостью, невосприимчивостью или недостаточной восприимчивостью к ингибитору контрольных точек при введении его по отдельности.
[553] В различных вариантах осуществления в данном документе также представлены неоантигенные вакцины, содержащие по меньшей мере один неоантигенный пептид или по меньшей мере одну неоантигенную mRNA. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид. В некоторых других вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA.
[554] Также в данном документе в различных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицию, содержащую модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и неоантигенную вакцину (например, универсальную неоантигенную вакцину). В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина представляет собой пептидную неоантигенную вакцину или неоантигенную mRNA-вакцину. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит один или несколько дополнительных компонентов, включающих без ограничения инструкции для применения; другие средства, например, одно или несколько дополнительных терапевтических средств; устройства, контейнеры или другие материалы для получения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC, композиции и/или неоантигенной вакцины для терапевтического введения; фармацевтически приемлемые носители и устройства, контейнеры или другие материалы для введения модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC, композиции и/или неоантигенной вакцины пациенту. Инструкции по применению могут включать руководство для терапевтических применений, в том числе предполагаемые дозировки и/или режимы введения, например, для пациента, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие. В различных вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по терапевтическому применению, например, по применению модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и неоантигенной вакцины для лечения или предупреждения неопластического нарушения у пациента. В различных вариантах осуществления набор дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство (например, для введения вместе с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицией и неоантигенной вакциной, например, с ингибитором контрольных точек иммунного ответа). В различных вариантах осуществления модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC, композицию и/или неоантигенную вакцину составляют в фармацевтическую композицию.
[555] В некоторых вариантах осуществления способов и композиций, раскрытых в данном документе, неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот.
[556] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит одну или более одной неоантигенной последовательности, раскрытой в данном документе.
[557] В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность и/или антигенная часть непосредственно не перекрываются с канонической пептидной последовательностью (например, с любой из иллюстративных канонических пептидных последовательностей, подчеркнутых в таблице 8) или не состоят из нее.
[558] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой неоантигенную последовательность, специфическую для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой персонализированную неоантигенную вакцину для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у субъекта.
[559] В некоторых других вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную последовательность. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную вакцину. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% субъектов в популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна вызывать T-клеточный ответ на опухоль, присутствующую у по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10% популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением.
[560] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность была идентифицирована посредством секвенирования по меньшей мере одного неоантигенного пептида, образование которого индуцировано у субъекта путем введения эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит неоантигенную последовательность, образование которой индуцировано путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в культуре клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в организме субъекта.
[561] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид или mRNA и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид или mRNA могут быть присоединены к подходящему носителю, что способствует развитию иммунного ответа. Иллюстративные носители для связывания с иммуногенными средствами (например, неоантигенным пептидом или mRNA) включают сывороточные альбумины, гемоцианин фисуреллы, молекулы иммуноглобулина, тиреоглобулин, овальбумин, столбнячный анатоксин или анатоксин из других патогенных бактерий, таких как бактерии, вызывающие дифтерию, E. coli, бактерии, вызывающие холеру, или H. pylori, или аттенуированное производное токсина. Другие носители для стимуляции или усиления иммунного ответа включают цитокины, такие как IL-1, α- и β-пептиды IL-1, IL-2, γINF, IL-10, GM-CSF и хемокины, такие как M1P1α и β и RANTES. Иммуногенные средства также можно присоединять к пептидам, которые усиливают транспорт через ткани, как описано, например, в WO 97/17613 и WO 97/17614. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель выбран из пептида, сывороточного альбумина, гемоцианина фисуреллы, иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, анатоксина или аттенуированного производного анатоксина, цитокина и хемокина.
[562] В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид или mRNA могут быть присоединены к фармацевтически приемлемому носителю. Иммуногенные средства могут быть присоединены к носителями с помощью химической сшивки. Методики присоединения иммуногенного пептида к носителю включают образование дисульфидных связей с применением N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионата (SPDP) и сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (если в пептиде отсутствует сульфгидрильная группа, это можно осуществлять посредством добавления остатка цистеина). Эти реагенты образуют дисульфидную связь между собой и остатками цистеина в пептиде на одном белке и амидную связь через эпсилон-аминогруппу на лизине или другую свободную аминогруппу в других аминокислотах. Целый ряд таких образующих дисульфидные/амидные связи средств описано в Jansen et al. ((1982) Immun Rev. 62:185). Другие бифункциональные средства для сочетания образуют тиоэфирную связь, вместо дисульфидной связи. Множество этих средств, образующих тиоэфирную связь, коммерчески доступны и включают реакционноспособные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты, 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновую кислоту. Карбоксильные группы могут быть активированными посредством объединения их с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель ковалентно связаны через линкер.
[563] Неоантиген и другие такие иммуногенные пептиды также могут экспрессироваться в виде слитых белков с носителями. Иммуногенный пептид может быть присоединен по амино-концу, карбокси-концу или в любом участке в пределах пептида (внутреннем) к носителю. В некоторых вариантах осуществления в слитом белке могут присутствовать несколько повторов иммуногенного пептида. В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель экспрессируются в виде слитого белка.
[564] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид или кодирующую его mRNA и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид или кодирующую его mRNA и фармацевтически приемлемый адъювант (например, адъювант, описанный в данном документе).
[565] В некоторых вариантах осуществления способов и композиций, раскрытых в данном документе, неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неоантигенная mRNA кодирует одну или более одной неоантигенной последовательности.
[566] В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина неоантигенной последовательности и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность и/или антигенная часть непосредственно не перекрываются с канонической пептидной последовательностью (например, с любой из иллюстративных канонических пептидных последовательностей, подчеркнутых в таблице 8) или не состоят из нее.
[567] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой неоантигенную последовательность, специфическую для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой персонализированную неоантигенную вакцину для субъекта. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у субъекта.
[568] В некоторых других вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную последовательность. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность представляет собой универсальную неоантигенную вакцину. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна связываться с по меньшей мере одним аллелем HLA, экспрессируемым у по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% субъектов в популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность способна вызывать T-клеточный ответ на опухоль, присутствующую у по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10% популяции субъектов, страдающих неопластическим нарушением.
[569] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная последовательность была идентифицирована посредством секвенирования по меньшей мере одной неоантигенной mRNA, образование которой индуцировано у субъекта путем введения эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неоантигенная mRNA кодирует неоантигенную последовательность, образование которой индуцировано путем приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, конъюгата антитела и лекарственного средства или композиции. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в культуре клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в организме субъекта.
[570] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неоантигенная mRNA связана с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель выбран из пептида, сывороточного альбумина, гемоцианина фисуреллы, иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, анатоксина или аттенуированного производного анатоксина, цитокина и хемокина.
[571] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах осуществления неоантигенная вакцина содержит по меньшей мере одну неоантигенную mRNA и фармацевтически приемлемый адъювант (например, адъювант, описанный в данном документе).
[572] В некоторых вариантах осуществления неоантигенная mRNA инкапсулирована с помощью инкапсулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующее средство защищает неоантигенную mRNA от разложения и улучшает доставку вакцины (McNamara et al. (2015) J Immunol Res. 2015:794528). В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующее средство представляет собой липосому. В некоторых вариантах осуществления липосома представляет собой катионную липосому, такую как N-[1-(2,3-диолеолокси)пропил]-N, N,N-триметиламмония хлорид 1 (DOTAP). В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующее средство представляет собой наночастицу. В некоторых вариантах осуществления наночастица защищает неоантигенную mRNA от разложения нуклеазой и/или улучшает захват клеткой и/или эффективность доставки. В некоторых вариантах осуществления наночастица может быть сконструирована таким образом, что она является полностью разлагаемой. В некоторых вариантах осуществления наночастица представляет собой биоразлагаемую наночастицу со структурой ядро-оболочка, содержащую pH-чувствительное ядро из сложного поли(b-аминоэфира) (PBAE), заключенного в фосфолипидную оболочку (Su et al. (2011) Mol Pharm. 8(3):774-87). В некоторых вариантах осуществления такие наночастицы являются особенно эффективными в доставке mRNA in vivo и развитии противоопухолевого иммунного ответа.
[573] В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 150 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 100 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект характеризуется мутационной нагрузкой с несинонимичными изменениями, составляющей приблизительно 50 мутаций или меньше. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет неопластическое нарушение, например, гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль, или имеет подозрение на его наличие. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза, лимфомы и миеломы. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование выбрано из острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака молочной железы, рака желудка, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, рака матки, карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из HER2-положительного рака молочной железы, аденокарциномы желудка, рака предстательной железы и остеосаркомы.
[574] Используемый в данном документе термин "адъювант" означает вещество, которое способно повышать, усиливать или модулировать иммунный ответ на сопутствующее иммуногенное средство, например, неоантигенный пептид или mRNA. В определенных вариантах осуществления неоантиген по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с адъювантами, т.е. веществами, которые сами по себе не вызывают адаптивные иммунные ответы, но усиливают или модулируют ответ на сопутствующий неоантиген. Целый ряд адъювантов может применяться в комбинации с раскрытыми неоантигенами, чтобы обеспечивать развитие иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления адъювант(-ы) выбран(-ы) для повышения свойственного ответа на неоантиген, при этом они не вызывают конформационные изменения неоантигена, которые будут влиять на качественную форму ответа. В некоторых вариантах осуществления адъювант(-ы) выбран(-ы) для усиления примирования и/или активации эффекторных T-клеток (например, CD8).
[575] В определенных вариантах осуществления адъювант представляет собой соль алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и сульфат алюминия. Такие адъюванты можно применять с другими специфическими иммуностимулирующими средствами, такими как 3-O-деацилированный монофосфориллипид A (MPL) или 3-DMP, полимерные или мономерные аминокислоты, такие как полиглутаминовая кислота или полилизин, или без них. Такие адъюванты могут применяться с другими конкретными иммуностимулирующими средствами, такими как мурамилпептиды (например, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1′-2′-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE), N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Al-D-изоглю-L-Ala-дипальмитоксипропиламид (DTP-DPP)), или другими компонентами бактериальной клеточной стенки, или без них. Другие адъюванты представляют собой эмульсии типа "масло в воде" и включают (a) MF59 (WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (необязательно содержащий различные количества MTP-PE), составленный в субмикронные частицы с применением микрофлюидайзера, такого как микрофлюидайзер модели 110Y (Microfluidics), (b) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блок-полимера Pluronic L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный на вортексе с образованием эмульсии с частицами большего размера, и (c) адъювантную систему Ribi™ (RAS), (Ribi ImmunoChem), содержащую 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и каркаса клеточной стенки (CWS), например MPL-FCWS (Detox™). В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой сапонин, такой как Stimulon™ (QS21), или частицы, образованные из него, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы) и ISCOMATRIX. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда(IFA), цитокины, такие как интерлейкины (IL-1, IL-2 и IL-12), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF) и фактор некроза опухоли (TNF).
[576] Адъювант можно вводить с иммуногенным средством (например, неоантигенным пептидом или mRNA) в виде одной композиции или его можно вводить до введения иммуногенного средства, одновременно с ним или после него. В некоторых вариантах осуществления иммуногенное средство и адъювант могут быть упакованы и поставлены в одном и том же флаконе или могут быть упакованы в отдельные флаконы и смешиваться перед применением. В некоторых вариантах осуществления иммуногенное средство и адъювант могут быть упакованы с маркировкой, указывающей на предполагаемое терапевтическое применение. В некоторых вариантах осуществления, если иммуногенное средство и адъювант упакованы по отдельности, упаковка может включать инструкции по смешиванию перед применением. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от стабильности иммуногенного состава, содержащего адъювант, пути введения, схемы дозирования, эффективности адъюванта для вида животных, подлежащего вакцинации, и для человека, при этом фармацевтически приемлемый адъювант представляет собой адъювант, который был одобрен или может быть одобрен соответствующими регулирующими органами для введения человеку. Например, полный адъювант Фрейнда не подходит для введения человеку. Однако квасцы, MPL или неполный адъювант Фрейнда (Chang et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev. 32:173-186) по отдельности или необязательно в комбинации с любыми из квасцов, QS21 и MPL и все их комбинации подходят для введения человеку.
[577] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении дополнительно представлены способы скрининга и идентификации по меньшей мере одного неоантигена. Более конкретно, в различных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ идентификации по меньшей мере одного неоантигена путем (a) приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; (b) выявления по меньшей мере одного подвергнутого альтернативному сплайсингу mRNA-транскрипта после приведения неопластической клетки в контакт с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицией; (c) прогнозирования трансляции по меньшей мере одного подвергнутого альтернативному сплайсингу mRNA-транскрипта в по меньшей мере один пептид и (d) сравнения по меньшей мере одного пептида с эталонным протеомом, где по меньшей мере один неоантиген идентифицируют, если по меньшей мере один пептид не совпадает с какими-либо пептидами в эталонном протеоме. В различных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает приведение одной или нескольких дополнительных неопластических клеток в контакт для идентификации по меньшей мере одного универсального неоантигена. В различных вариантах осуществления способ повторяют для одной или нескольких дополнительных неопластических клеток или одного или нескольких образцов (например, биоптата ткани) для подтверждения подходящих неоантигенов (например, для применения в неоантигенной вакцине) и/или для идентификации одного или нескольких универсальных неоантигенов.
[578] В различных других вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ идентификации по меньшей мере одного неоантигена путем (a) приведения неопластической клетки в контакт с эффективным количеством модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; (b) выявления по меньшей мере одного пептида, содержащего потенциальную неоантигенную последовательность, после приведения неопластической клетки в контакт с модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композицией и (c) сравнения по меньшей мере одного пептида с эталонным протеомом, где по меньшей мере один неоантиген идентифицируют, если по меньшей мере один пептид не совпадает с какими-либо пептидами в эталонном протеоме. В различных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает приведение одной или нескольких дополнительных неопластических клеток в контакт для идентификации по меньшей мере одного универсального неоантигена. В различных вариантах осуществления способ повторяют для одной или нескольких дополнительных неопластических клеток или одного или нескольких образцов (например, биоптата ткани) для подтверждения подходящих неоантигенов (например, для применения в неоантигенной вакцине) и/или для идентификации одного или нескольких универсальных неоантигенов.
[579] В некоторых вариантах осуществления способов идентификации неоантигена, описанных в данном документе, обнаружение по меньшей мере одно подвергнутого альтернативному сплайсингу транскрипта mRNA предусматривает RNAseq. В некоторых вариантах осуществления прогнозирование трансляции по меньшей мере одного подвергнутого альтернативному сплайсингу транскрипта mRNA предусматривает количественное определение изменения в виде значения процента успешного включения при сплайсинге (dPSI) для по меньшей мере одного транскрипта. В некоторых вариантах осуществления прогнозирование трансляции по меньшей мере одного подвергнутого альтернативному сплайсингу транскрипта mRNA предусматривает RiboSeq и/или рибосомный профилинг.
[580] В некоторых вариантах осуществления способов идентификации неоантигена, описанных в данном документе, способы дополнительно включают оценку по меньшей мере одного пептида в отношении прогнозируемого связывания с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). В некоторых вариантах осуществления прогнозируемое связывание с молекулами MHC определяют путем измерения прогнозируемой прочности связывания на основе исходной аффинности для по меньшей мере одного пептида. В некоторых вариантах осуществления прогнозируемая прочность связывания на основе исходной аффинности, которая составляет приблизительно 500 нМ или больше, указывает на связывание с молекулами MHC. В некоторых вариантах осуществления прогнозируемое связывание с молекулами MHC определяют посредством идентификации распределения значений прогнозируемой прочности связывания для серии случайных пептидов и сравнения прогнозируемой прочности связывания по меньшей мере одного пептида с данным распределением. В некоторых вариантах осуществления прогнозируемая прочность связывания в верхних 2% распределения указывает на слабое связывание с молекулами MHC. В некоторых вариантах осуществления прогнозируемая прочность связывания в верхних 0,5% распределения указывает на сильное связывание с молекулами MHC.
[581] В некоторых вариантах осуществления способов идентификации неоантигена, описанных в данном документе, неопластическая клетка находится в культуре клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления неопластическая клетка находится в организме субъекта.
[582] В различных вариантах осуществления в данном документе также представлены способы получения неоантигенной вакцины посредством (a) идентификации по меньшей мере одного неоантигена (например, по меньшей мере одного неоантигенного пептида или кодирующей его mRNA) с применением любого из иллюстративных способов идентификации, раскрытых в данном документе и (b) составления по меньшей мере одного неоантигена вместе с фармацевтически приемлемыми носителем, разбавителем или адъювантом (например, любым из фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или адъювантов, описанных в данном документе).
[583] В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигена и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигена и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного неоантигена и/или антигенной части находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантиген и/или антигенная часть непосредственно не перекрываются с канонической пептидной последовательностью (например, с любой из иллюстративных канонических пептидных последовательностей, подчеркнутых в таблице 8) или не состоят из нее.
[584] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один неоантиген, применяемый в вакцине, присоединен к фармацевтически приемлемому носителю. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель выбран из пептида, сывороточного альбумина, гемоцианина фисуреллы, иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, анатоксина или аттенуированного производного анатоксина, цитокина и хемокина.
Комбинация модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена/ADC и сконструированных T-клеток (CAR-T)
[585] в различных вариантах осуществления пациент, у которого имеется рак, описанный в данном документе, может быть подвергнут лечению с применением комбинации модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции и одной или нескольких сконструированных Т-клеток, целенаправленно воздействующих на опухоль (т.е. CAR-T). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, путем введения субъекту эффективного количества модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, содержащей модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC; и сконструированных Т-клеток, целенаправленно воздействующих на опухоль (т.е. CAR-T). В различных вариантах осуществления химерный T-клеточный рецептор может быть сконструирован с применением антигенраспознающих последовательностей, которые являются реактивными в отношении идентифицированного неоантигена.
[586] Например, в различных вариантах осуществления для целенаправленного воздействия на изменения, индуцированные модулятором сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC, во внеклеточных доменах белков клеточной поверхности химерный антигенреактивный T-клеточный рецептор (CAR) может быть сконструирован в результате первоначальной идентификации антител, которые распознают домен неоантигенного белка, экспрессируемый на клеточной поверхности. Затем антигенраспознающие последовательности таких антител могут быть слиты с доменом T-клеточного рецептора для осуществления селективного целенаправленного воздействия и активации.
[587] В различных других вариантах осуществления используется стратегия встраивания антигенпредставляющего механизма опухолевых клеток вместе с неоантигенами, образованными под действием модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена или ADC. В некоторых вариантах осуществления клетки, содержащие известные и часто представленные аллели HLA (например, HLA-A*02:01), могут быть подвергнуты обработке с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции, а MHC1-связанные неоантигены идентифицируются посредством лигандомики. В некоторых вариантах осуществления эти пептиды можно применять для примирования и/или размножения T-клеток от здоровых доноров, экспрессирующих такой же аллель HLA. В некоторых вариантах осуществления такие T-клетки можно выделять и секвенировать α- и β-цепи T-клеточного рецептора (TCR) для идентификации когнатных антигенраспознающих/вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления затем может быть сконструирован когнатный CAR.
[588] В некоторых вариантах осуществления последовательности CAR клонируют в популяции полученных от пациента T-клеток и обеспечивают размножение клеток с применением доступных в настоящее время протоколов. Затем в некоторых вариантах осуществления осуществляют трансфузию сконструированных T-клеток обратно в кровоток пациента с последующей обработкой с помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции. После обработки c помощью модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена, ADC или композиции в некоторых вариантах осуществления может начаться представление антигена опухолевыми клетками. В некоторых вариантах осуществления популяция сконструированных T-клеток может контактировать с презентирующими антиген опухолевыми клетками и уничтожать их.
[589] Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что другие подходящие модификации и адаптации описанных в данном документе способов по настоящему изобретению очевидны и могут быть выполнены с использованием подходящих эквивалентов, не выходя за рамки объема настоящего изобретения или раскрытых в данном документе вариантов осуществления. После подробного описания настоящего изобретения то же самое будет более понятно со ссылкой на следующие примеры, которые включены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
[589] Описаны способы синтеза полезных нагрузок, линкеров и соединений на основе конъюгируемой конструкции линкер-полезная нагрузка (линкер-лекарственное средство, L-H), характеризующихся структурой, показанной в таблицах 9-11. Конъюгируемые конструкции линкер-полезная нагрузка применяли при получении конъюгатов антитела и лекарственного средства (ADC). Иллюстративные ADC описаны в примерах 3-5.
1.1 Реагенты и материалы
[590] Исходные материалы, применяемые в следующих способах синтеза, либо коммерчески доступны, либо их можно легко получить с помощью стандартных способов из известных материалов. Раскрытые конъюгируемые конструкции линкер-полезная нагрузка могут быть получены с применением реакций и методик, описанных в данном документе. В описании способов синтеза, описанных ниже, следует понимать, что все предложенные условия реакции, в том числе выбор растворителя, атмосфера реакционной смеси, температура реакции, продолжительность эксперимента и процедура обработки, могут быть выбраны как стандартные условия для данной реакции, если не указано иное. Специалисту в области органического синтеза понятно, что функциональные группы, присутствующие в различных частях молекулы, должны быть совместимы с предлагаемыми реагентами и реакциями. Заместители, несовместимые с условиями реакции, являются очевидными для специалиста в данной области техники, и поэтому в данном документе указаны альтернативные способы.
[591] Проводили препаративную жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (LC/MS) с применением системы самоочищения от Waters и колонки XTerra MS C18 (5 мкм, 19 мм x 100 мм) в условиях кислотной подвижной фазы. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) записывали при 400 МГц с применением прибора от Varian (Agilent Technologies). Нагревание под воздействием микроволн осуществляли с применением микроволнового реактора Biotage Emrys Liberator или Initiator. Колоночную хроматографию проводили с применением Teledyne Isco Combiflash Rf200d. Удаление растворителя осуществляли с применением либо роторного испарителя от Büchi, либо центробежного испарителя от Genevac.
[592] Термины/аббревиатуры. Применяемый в данном документе термин “с созданной инертной атмосферой” относится к замещению воздуха в реакторе (например, реакционном сосуде, колбе, стеклянном реакторе) инертным газом, практически не содержащим влаги, таким как азот или аргон. В данном документе используют следующие сокращения: DCM = дихлорметан, DMF = диметилформамид, HPLC = высокоэффективная жидкостная хроматография, KHMDS = бис(триметилсилил)амид калия, LC/MS = жидкостная хроматография-масс-спектрометрия, MeOH = метанол, к.т. = комнатная температура, TBSCl = трет-бутилдиметилсилилхлорид, THF = тетрагидрофуран, TLC = тонкослойная хроматография. Мультиплетность указана с применением следующих аббревиатур: s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, quint = квинтет, sxt = секстет, m = мультиплет, dd = дублет дублетов, ddd = дублет дублетов дублетов, dt = дублет триплетов, br s = широкий синглет.
[593] LC/MS. Подвижные фазы = A (0,1% муравьиная кислота в H2O) и B (0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Градиент = B от 5% до 95% за 1,8 мин. Колонка = колонка Waters Acquity BEH C18 (1,7 мкм, 2,1×50 мм).
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
H17
H18
H19
H20
H21
H22
H23
H24
H25
Таблица 10. Структура иллюстративных линкеров
(название по IUPAC)
ADL1 / “MC-Val-Cit-pABC”
({4-[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо]-3-метилбутанамидо]пентанамидо]фенил}метилформиат)
ADL2 / “MC-(PEG)2-CO”
(3-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси]этокси}пропаналь)
ADL5 / “MC-Val-Ala-pAB”
(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-[(1S)-2-метил-1-{[(1S)-1-[(4-метилфенил)карбамоил]этил]карбамоил}пропил]гексанамид)
ADL6 / “MC-Val-Ala-pABC”
({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо]-3-метилбутанамидо]пропанамидо]фенил}метилформиат)
ADL7 / “MC-Val-Cit-pAB”
(N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(карбамоиламино)-1-[(4-метилфенил)карбамоил]бутил]карбамоил}-2-метилпропил]-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид)
ADL10 / “MC”
(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаналь)
ADL12 / “Mal-Hex”
(1-гексил-2,5-дигидро-1H-пиррол-2,5-дион)
ADL13 / “MC-β-глюкуронид”
((2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-{3-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо]пропанамидо}-4-[(формилокси)метил]фенокси)-3,4,5-тригидроксиоксан-2-карбоновая кислота)
ADL14 / “Mal-Et”
(1-этил-2,5-дигидро-1H-пиррол-2,5-дион)
ADL15 / “Mal-Et-O-Et”
(1-(2-этоксиэтил)-2,5-дигидро-1H-пиррол-2,5-дион)
ADL21 / “MC-Ala-Ala-Asp-pABC”
ADL22 / “MC-(PEG)2-Val-Cit-pABC”
ADL23 / “MC-Glu-Val-Cit-pABC”
ADL1-H1
ADL1-H2
ADL1-H3
ADL1-H4
ADL1-H5
ADL1-H6
ADL1-H7
ADL1-H8
ADL1-H9
ADL1-H10
ADL2-H11
ADL2-H1
1.2 Получение ADL1-H1, ADL1-H2, ADL1-H3 и ADL1-H4
1.2.1 Краткое описание. Общая процедура 1
Схема 1
[594] Стадия 1. Ферментация и биологическое превращение
[595] Двадцатипроцентный исходный раствор Saccharothrix sp. EAS-AB4564, выделенных из почвы в Японии, в глицерине инокулировали в первую культуру для посева в пробирке для исследований, содержащей 10 мл среды SY-32 (1% D-глюкозы, 1% растворимого крахмала, 0,5% Bactosoytone, 0,5% экстракта дрожжей, 0,2% сульфата аммония, 0,2% NaCl и 2,3% TES, при pH 8,0). Первую культуру для посева встряхивали в течение 2 дней при 28°C на шейкере с возвратно-поступательным движением при 200 об./мин. После ферментации первую культуру для посева инокулировали в стерильную вторую культуру для посева в колбах Эрленмейера с 1% объем/объем, при это каждая содержала 100 мл новой среды SY-32. Вторые культуры для посева встряхивали в течение 2 дней при 28°C на роторном шейкере (Iwashiya bioscience SC-144-GR) при 200 об./мин. После ферментации 250 мл второй культуры инокулировали в 15 л ферментаторе (Sanki seiki MAT-15), содержащем 10 л новой среды SY-32 и 2 мл противовспенивателя PE-M. Ферментацию проводили при 28°C в условиях перемешивания и аэрации (450 об./мин., 10 л/мин.). Через 48 часов бульонную культуру центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 минут.после удаления супернатанта к микробному осадку добавляли 10 л 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) для промывания микробных клеток. Суспензию центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 минут.после удаления промывочного буфера к микробному осадку добавляли 10 л реакционного буфера (1% D-глюкозы, 0,2% гексагидрата хлорида магния, 2,3% TES и 1,3 г гербоксидиена, pH 8,0) и суспензию переносили в 15 л ферментатор. Биологическое превращение проводили в течение 6 часов при 28°C при перемешивании и аэрации (450 об./мин., 10 л/мин.).
[596] Выделение 5-гидроксигербоксидиена
[597] XAD-7HP (400 г) добавляли к вышеуказанной смеси (10 л) и смесь перемешивали (EYELA MAZELA Z) в течение 30 минут при 300 об./мин. После взбалтывания разделение XAD-7HP осуществляли с применением окрашивания и сита для испытания (0,25 мм отверстие и 0,16 мм диаметр проволоки). Ту же операцию повторяли. Собранный XAD-7HP экстрагировали с помощью 1 л ацетона и растворитель удаляли in vacuo. Экстракт очищали с помощью MPLC с обращенной фазой (Yamazen EPCLC-W-prep 2XY) с градиентным элюированием (YMC-DispoPack AT ODS-25, 120 г, от 25 до 55% ацетонитрила в воде с добавлением 0,1% муравьиной кислоты, в течение 15 минут) с получением 5-OH-гербоксидиена (397,47 мг), с выходом превращения 29,5%. Данные 1H ЯМР и масс-спектрометрии соответствовали таковым, известным из литературы. См., например, EP0781772 B1 и Ghosh et al. (2014) Org. Lett. 16:3154-57.
[598] Стадия 2. Синтез метил-2-((2R,4R,5S,6S)-4-гидрокси-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетата
[599] К раствору 2-((2R,4R,5S,6S)-4-гидрокси-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусной кислоты (45 мг, 0,099 ммоль) в THF (2 мл) и MeOH (0,5 мл) при 0°C по каплям добавляли триметилсилилдиазометан (2,0 М в гексанах, 0,148 мл, 0,297 ммоль). Полученную смесь затем постепенно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. перед охлаждением до 0°C. Затем добавляли уксусную кислоту (0,017 мл, 0,297 ммоль) и перемешивали в течение 30 минут. Затем смесь разбавляли с помощью AcOEt и насыщенного водного раствора бикарбоната натрия. Органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Выделенный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле с получением метил-2-((2R,4R,5S,6S)-4-гидрокси-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетата в виде бесцветного масла (36,1 мг, выход 78%).
[600] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,86 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 1,20-1,24 (m, 1H) 1,26 (s, 3H) 1,31- 1,34 (m, 3 H) 1,40-1,59 (m, 2 H) 1,63 (br. s., 2 H) 1,69 (s, 3 H) 1,87 (dd, J=13,66, 4,88 Гц, 1 H) 2,03 (ddd, J=10,37, 4,02, 2,20 Гц, 1 H) 2,42 (dd, J=15,61, 6,34 Гц, 2 H) 2,54 (d, J=9,8 Гц, 2 H) 2,62 (dd, J=15,6, 6,3 Гц, 1 H) 2,95 (t, J=5,37 Гц, 1 H) 3,33-3,44 (m, 2 H) 3,52 (s, 3 H) 3,65 (s, 3 H) 3,79-3,90 (m, 2 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,88 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,21 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
[601] Стадия 3. Синтез карбамата
[602] К смеси метил-2-((2R,4R,5S,6S)-4-гидрокси-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетата (1,0 экв., 0,075 ммоль), 4-нитрофенилкарбонилхлорида (2 экв.), основания Хунига (0,065 мл, 4,5 экв.) в дихлорметане (0,04 М) при 0°C добавляли DMAP (0,05 экв.). Затем смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 ч. К смеси добавляли пиперазин (10 экв.) и полученную смесь перемешивали в течение дополнительного 1 ч. Затем смесь разбавляли с помощью DCM и органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на силикагеле и затем с помощью хроматографии на амино-функционализированном силикагеле с получением необходимого продукта.
[603] Стадия 4. Синтез карбоновой кислоты
[604] К смеси сложного метилового эфира, полученного на стадии 3 (1,0 экв., 0,039 ммоль), в MeOH (0,02 М мл) добавляли водный раствор гидроксида натрия (1,0 экв., 2 н.). Смесь нагревали до 40°C и перемешивали при данной температуре в течение 4 ч. Полученную смесь затем охлаждали до 0°C и нейтрализовали с помощью водного раствора хлористоводородной кислоты (200 мкл, 2 н.). Затем смесь концентрировали in vacuo и полученный осадок очищали с помощью препаративной HPLC (H2O/MeCN/HCOOH=от 80/20/0,1 до 60/40/0,1) с получением необходимого продукта.
1.2.2 Синтез H1
[605] (2S,3S,4R,6R)-2-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-6-(2-метокси-2-оксоэтил)-3-метилтетрагидро-2H-пиран-4-илпиперазин-1-карбоксилат
[606] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 3 раздела 1.2.1 с получением бледно-желтого масла (22,3 мг, выход 52%).
[607] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,71 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,20-1,25 (m, 1H) 1,26 (s, 3H) 1,37 (q, J=11,55 Гц, 1 H) 1,51 (dt, J=8,90, 6,52 Гц, 1 H) 1,63-1,67 (m, 1 H) 1,69 (s, 3H) 1,83-2,07 (m, 10 H) 2,11-2,17 (m, 1 H) 2,36-2,45 (m, 2 H) 2,51-2,62 (m, 2 H) 2,81 (s, 4 H) 2,95 (t, J=5,12 Гц, 1 H) 3,40-3,49 (m, 4 H) 3,52 (s, 3 H) 3,65 (s, 3 H) 3,80-3,94 (m, 2 H) 4,56 (td, J=10,98, 4,39 Гц, 1 H) 5,46 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,24 Гц, 1 H) 6,21 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
[608] 2-((2R,4R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метил-4-((пиперазин-1-карбонил)окси)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусная кислота (H1)
[609] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 4 раздела 1.2.1 с получением бесцветного масла (16,0 мг, выход 73%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 567,77 [M+H]+.
[610] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,72 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 1,17 (dd, J=13,2, 11,2 Гц, 1 H) 1,25 (s, 3H) 1,36 (q, J=11,4 Гц, 1 H) 1,45-1,50 (m, 2 H) 1,68 (s, 3 H) 1,90 (dd, J=13,42, 4,15 Гц, 1 H) 2,14 (dd, J=11,71, 3,90 Гц, 1 H) 2,36-2,52 (m, 3 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,95 (dd, J=5,85, 4,39 Гц, 1 H) 3,17 (br. s, 4 H) 3,46-3,53 (m, 4 H) 3,56-3,60 (m, 1 H) 3,69 nr. s, 4 H) 3,74-3,82 (m, 2 H) 3,85-3,92 (m, 1 H) 4,58 (td, J=10,49, 4,39 Гц, 1 H) 5,49 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,94 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
1.2.3 Синтез H2
[611] (2S,3S,4R,6R)-2-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-6-(2-метокси-2-оксоэтил)-3-метилтетрагидро-2H-пиран-4-ил-1,4-диазепан-1-карбоксилат
[612] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 3 раздела 1.2.1 (30,3 мг, выход 60%).
[613] 1H ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,71 (d, J=6,11 Гц, 3 H) 0,84 (d, J=6,73 Гц, 3 H) 1,00-1,05 (m, 4 H) 1,16 (d, J=6,11 Гц, 3 H) 1,19-1,24 (m, 1 H) 1,26 (s, 3 H) 1,32-1,40 (m, 1 H) 1,51 (dt, J=9,17, 6,42 Гц, 1 H) 1,63-1,67 (m, 1 H) 1,69 (s, 3 H) 1,73-1,81 (m, 3 H) 1,83-1,90 (m, 2 H) 2,07-2,18 (m, 1 H) 2,41 (dd, J=15,28, 6,11 Гц, 2 H) 2,51-2,60 (m, 2 H) 2,82-2,95 (m, 5 H) 3,41-3,49 (m, 4 H) 3,51 (s, 3 H) 3,64 (s, 3 H) 3,79-3,95 (m, 2 H) 4,57 (td, J=10,70, 4,28 Гц, 1 H) 5,45 (dd, J=14,98, 8,86 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=11,00 Гц, 1 H) 6,20 (dd, J=14,98, 10,70 Гц, 1 H).
[614] 2-((2R,4R,5S,6S)-4-((1,4-Диазепан-1-карбонил)окси)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусная кислота (H2)
[615] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 4 раздела 1.2.1 с получением бесцветного масла (20,9 мг, выход 71%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 581,81 [M+H]+.
[616] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,74 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,12-1,23 (m, 1 H) 1,25 (s, 3 H) 1,31-1,41 (m, 1 H) 1,41-1,53 (m, 1 H) 1,63-1,74 (m, 4 H) 1,84-1,93 (m, 1 H) 2,04 (br. s., 2 H) 2,11-2,21 (m, 1 H) 2,34-2,54 (m, 3 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,90-2,98 (m, 2 H) 3,21-3,36 (m, 7 H) 3,50 (s, 3 H) 3,53-3,66 (m, 2 H) 3,69-3,79 (m, 3 H) 3,83-3,95 (m, 1 H) 4,57 (br. s., 1 H) 5,49 (dd, J=14,88, 9,03 Гц, 1 H) 5,94 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,24-6,36 (m, 1 H).
1.2.4 Синтез H3
[617] (2S,3S,4R,6R)-2-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-6-(2-метокси-2-оксоэтил)-3-метилтетрагидро-2H-пиран-4-ил-3-(метиламино)пирролидин-1-карбоксилат
[618] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 3 раздела 1.2.1 с получением бесцветного масла (9,6 мг, выход 19%).
[619] 1H ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,71 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,73 Гц, 3 H) 0,99-1,05 (m, 4 H) 1,17 (d, J=6,11 Гц, 4 H) 1,27 (s, 3 H) 1,32-1,45 (m, 1 H) 1,49-1,68 (m, 6 H) 1,70 (s, 3 H) 1,88 (dd, J=13,45, 4,89 Гц, 1 H) 2,00-2,08 (m, 1 H) 2,10-2,17 (m, 1 H) 2,38-2,47 (m, 5 H) 2,52-2,61 (m, 2 H) 2,94 (t, J=5,50 Гц, 1 H) 3,17-3,26 (m, 1 H) 3,43 (d, J=10,4 Гц, 2 H) 3,52 (s, 4 H) 3,65 (s, 3 H) 3,78-3,86 (m, 1 H) 3,87-3,95 (m, 1 H) 4,51-4,57 (m, 1 H) 5,45 (dd, J=14,98, 8,86 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,39 Гц, 1 H) 6,21 (dd, J=14,98, 10,70 Гц, 1 H).
[620] 2-((2R,4R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метил-4-((3-(метиламино)пирролидин-1-карбонил)окси)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусная кислота (H3)
[621] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 4 раздела 1.2.1 с получением бесцветного масла (9,8 мг, количественный выход). LC/MS (ESI, масса/заряд), 581,81 [M+H]+.
[622] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,71 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,22-1,24 (m, 1 H) 1,26 (s, 3 H) 1,31-1,42 (m, 1 H) 1,45-1,66 (m, 4 H) 1,69 (s, 3 H) 1,87 (dd, J=13,66, 4,88 Гц, 1 H) 2,02-2,20 (m, 2 H) 2,38-2,51 (m, 4 H) 2,51-2,60 (m, 2 H) 2,94 (t, J=5,12 Гц, 1 H) 3,08-3,26 (m, 2 H) 3,33-3,40 (m, 1 H) 3,43 (d, J=9,76 Гц, 2 H) 3,51 (s, 3 H) 3,64 (s, 3 H) 3,83-3,94 (m, 1 H) 4,51-4,59 (m, 1 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,89 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,20 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
1.2.5 Синтез H12
[623] Указанное в заголовке соединение синтезировали в соответствии со стадией 3 (13,8 мг, выход 91%) и стадией 4 раздела 1.2.1 с получением белого аморфного твердого вещества (4,58 мг, выход 76%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 581,55 [M+H]+.
[624] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,71 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,26 (s, 4 H) 1,48-1,57 (m, 1 H) 1,61-1,68 (m, 1 H) 1,89 (dd, J=13,66, 4,39 Гц, 1 H) 2,20 (br d, J=8,29 Гц, 1 H) 2,30 (s, 4 H) 2,33-2,51 (m, 6 H) 2,52-2,57 (m, 2 H) 2,57-2,63 (m, 1 H) 2,78-3,21 (m, 9 H) 3,35-3,66 (m, 9 H) 3,70-3,99 (m, 2 H) 4,52 (br d, J=3,90 Гц, 1 H) 5,41-5,58 (m, 1 H) 5,92 (br d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,13-6,29 (m, 1 H).
1.2.6 Синтез H4
[625] H4 синтезировали в соответствии со схемой 2.
Схема 2
[626] Стадия 1. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетат
[627] К смеси 2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусной кислоты (гербоксидиен, 300 мг, 0,684 ммоль) в DCM (10 мл) при 0°C добавляли DCC (310 мг, 1,505 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 15 минут. Затем к смеси добавляли N-гидроксисукцинамид (173 мг, 1,505 ммоль). Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Затем смесь фильтровали через целит и осадок на фильтре промывали с помощью DCM. Фильтрат концентрировали in vacuo и полученный осадок очищали с помощью хроматографии на силикагеле (12 г, гептан/AcOEt=от 50/50 до 0/100) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (357 мг, выход 97%).
[628] 1H ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,66 (d, J=6,73 Гц, 3 H) 0,83-0,89 (m, 3 H) 1,03 (d, J=6,73 Гц, 3 H) 1,17 (d, J=6,1 Гц, 3 H) 1,19-1,25 (m, 4 H) 1,27 (s, 3H) 1,39-1,56 (m, 3 H) 1,59 (s, 3H) 1,70 (s, 3 H) 1,79-1,93 (m, 3 H) 2,36-2,43 (m, 1 H) 2,52-2,55 (m, 2 H) 2,70 (dd, J=15,28, 7,34 Гц, 1 H) 2,81 (br. s., 3 H) 2,83-2,90 (m, 1 H) 2,95 (t, J=5,50 Гц, 1 H) 3,34 (d, J=9,78 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,79-3,87 (m, 2 H) 5,43 (dd, J=15,28, 9,17 Гц, 1 H) 5,88 (d, J=11,00 Гц, 1 H) 6,21-6,26 (m, 1 H).
[629] Стадия 2. (S)-5-Гидрокси-2-(2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамидо)пентановая кислота
[630] К смеси соединения, полученного на стадии 1 (40 мг, 0,075 ммоль), и (S)-2-амино-5-гидроксипентановой кислоты (19,88 мг, 0,149 ммоль) в DMF (2 мл) добавляли DIPEA (0,065 мл, 0,373 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и затем разбавляли с помощью AcOEt. Органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок применяли на стадии 3 без дополнительной очистки.
[631] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,66 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,15 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 1,19-1,23 (m, 2 H) 1,27 (s, 3H) 1,40-1,61 (m, 6H) 1,72 (s, 3H) 1,82-1,93 (m, 3 H) 2,37-2,43 (m, 2 H) 2,56 (d, J=9,8 Гц, 1 H) 2,99 (t, J=5,3 Гц, 1 H) 3,33 (d, J=9,8 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3H) 3,54-3,70 (m, 4 H) 3,81-3,87 (m, 2 H) 4,56 (d, J=5,4 Гц, 1 H) 5,48 (dd, J=15,12, 8,29 Гц, 1 H) 5,89 (d, J=11,2 Гц, 1 H) 6,22 (dd, J=15,1, 10,7 Гц, 1 H) 7,30 (d, J=7,3 Гц 1 H).
[632] Стадия 3. Метил-(S)-5-гидрокси-2-(2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамидо)пентаноат
[633] К смеси соединения, полученного на стадии 2 (35 мг, 0,063 ммоль), в THF (2 мл) и метаноле (0,5 мл) при 0°C добавляли триметилсилилдиазометан (2,0 М в гексанах, 0,095 мл, 0,19 ммоль). Затем смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Затем смесь охлаждали до 0°C и гасили путем добавления уксусной кислоты. Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут и затем концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на силикагеле (12 г, гептан/AcOEt = от 90/10 до 30/70) с получением указанного в заголовке соединения (15,7 мг, выход 44%).
[634] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,66 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,19-1,23 (m, 3 H) 1,27 (s, 3 H) 1,47-1,70 (m, 7 H) 1,73 (s, 3 H) 1,77-1,94 (m, 6 H) 2,34-2,59 (m, 5 H) 2,96 (t, J=5,4 Гц 1 H) 3,29-3,40 (m, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,56-3,66 (m, 3 H) 3,70 (s, 3 H) 3,77-3,89 (m, 1 H) 4,61 (td, J=8,05, 4,88 Гц, 1 H) 5,46 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,89 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,23 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H) 7,10 (d, J=8,29 Гц, 1 H).
[635] Стадия 4. (S)-4-(2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамидо)-5-метокси-5-оксопентилпиперазин-1-карбоксилат
[636] К смеси соединения, полученного на стадии 3 (15,7 мг, 0,028 ммоль), 4-нитрофенилхлорформиата (11,15 мг, 0,055 ммоль) и основания Хунига (0,024 мл, 0,138 ммоль) в DCM (1 мл) при комнатной температуре добавляли DMAP (1,689 мг, 0,014 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем добавляли пиперазин (23,82 мг, 0,277 ммоль) и смесь перемешивали в течение еще 1 ч. Затем смесь разбавляли с помощью DCM и органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенный остаток применяли на следующей стадии без очистки.
[637] Стадия 5. (S)-2-(2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамидо)-5-((пиперазин-1-карбонил)окси)пентановая кислота (H4)
[638] К смеси остатка, полученного на стадии 4 (15 мг, 0,022 ммоль), и MeOH (1 мл) добавляли водный раствор гидроксида натрия (2 н., 100 мкл, 0,20 ммоль). Смесь нагревали до 40°C и перемешивали в течение 2 ч. Затем смесь охлаждали до 0°C и добавляли водный раствор хлористоводородной кислоты (100 мкл, 2 н.). Полученную смесь затем концентрировали in vacuo и полученный осадок очищали с помощью препаративной HPLC (H2O/MeCN/NH3водн. = от 60/40/0,1 до 30/70/0,1) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (7,0 мг, выход 48% за стадии 4 и 5). LC/MS (ESI, масса/заряд), 666,90 [M+H]+.
[639] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,81 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 0,98-1,04 (m, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,17 (d, J=11,71 Гц, 1 H) 1,22-1,28 (m, 4 H) 1,35 (d, J=6,83 Гц, 1 H) 1,46-1,66 (m, 10 H) 1,70 (s 3 H) 1,82-1,94 (m, 3 H) 2,25-2,31 (m, 1 H) 2,36-2,45 (m, 2 H) 2,61-2,65 (m, 1 H) 2,95 (dd, J=6,10, 4,15 Гц, 1 H) 3,14 (br. s., 2 H) 3,50 (s, 3 H) 3,62-3,71 (m, 4 H) 3,76 (t, J=6,3 Гц, 1 H) 4,03 (dd, J=4,15, 1,71 Гц, 1 H) 4,29 (br. s., 1 H) 5,45 (d, J=6,34 Гц, 1 H) 5,87 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,27 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
1.2.7 Общая процедура синтеза конструкции линкер MC-Val-Cit-pABC-полезные нагрузки
[640] Общая процедура синтеза конструкций линкер-полезная нагрузка MC-Val-Cit-pABC указана на схеме 3.
Схема 3
[641] К смеси полезной нагрузки (например, соединения, синтезированного в соответствии с вышеуказанными стадиями; 1,0 экв.) и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил(4-нитрофенил)карбоната (1,0 экв.) в DMF (0,028 М) добавляли DIPEA (3,03 экв.) при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч., концентрировали in vacuo и полученный осадок очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой (H2O/MeCN/HCOOH = от 60/40/0,1 до 40/60/0,1) с получением необходимого соединения.
1.2.8 Синтез ADL1-H1
[642] ADL1-H1 (2-((2R,4R,5S,6S)-4-((4-(((4-((R)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)пиперазин-1-карбонил)окси)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусную кислоту) синтезировали в соответствии с общей процедурой, указанной в разделе 1.2.7, и получали в виде бесцветного масла (12,7 мг, выход 39%).
[643] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,71 (d, J=5,85 Гц, 4 H) 0,80 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,94 (dd, J= 6,1, 3,2 Гц, 6H) 1,01 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,6 Гц, 3 H) 1,13-1,19 (m, 1H) 1,25 (s, 4 H) 1,29-1,36 (m, 2 H) 1,46-1,65 (m, 7H) 1,68 (s, 3H) 1,71-1,76 (m, 1H) 1,84-1,93 (m, 2 H) 2,02-2,15 (m, 2 H) 2,25 (t, J=7,32 Гц, 2 H) 2,37-2,51 (m, 3 H) 2,58-2,67 (m, 2 H) 2,79 (s, 4 H) 2,82-2,96 (m, 2 H) 3,08-3,23 (m, 8 H) 3,39-3,54 (m, 15 H) 3,76 (t, J=6,34 Гц, 1 H) 3,85-3,97 (m, 2 H) 4,13 (d, J=7,32 Гц, 1 H) 4,46-4,58 (m, 2 H) 5,07 (s, 2 H) 5,48 (dd, J=14,88, 9,03 Гц, 1 H) 5,93 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 7,30 (d, J=7,81 Гц, 2 H) 7,57 (d, J=7,81 Гц, 2 H).
1.2.9 ADL1-H4
[644] ADL1-H4 ((S)-5-((4-(((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)пиперазин-1-карбонил)окси)-2-(2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамидо)пентановую кислоту) синтезировали в соответствии с общей процедурой, указанной в разделе 1.2.7, и получали в виде бесцветного масла (2,4 мг, выход 44%).
[645] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,64 (d, J=6,50 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,80 Гц, 3 H) 0,84-0,89 (m, 1 H) 0,89-0,97 (m, 6 H) 0,97-1,03 (m, 2 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,10-1,16 (m, 1 H) 1,22-1,25 (m, 3 H) 1,25-1,32 (m, 6 H) 1,49-1,66 (m, 9 H) 1,69 (s, 3 H) 1,80-1,95 (m, 3 H) 1,95-2,15 (m, 2 H) 2,25 (t, J=7,20 Гц, 2 H) 2,33-2,48 (m, 1 H) 2,62 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,91-2,98 (m, 1 H) 3,04-3,13 (m, 1 H) 3,39-3,47 (m, 7 H) 3,49 (s, 3 H) 3,63 (s, 1 H) 3,76 (t, J=6,50 Гц, 1 H) 3,99 (br. s, 1 H) 4,14 (d, J=7,20 Гц, 1 H) 4,44-4,51 (m, 1 H) 4,44-4,51 (m, 1 H) 5,07 (br. s, 2 H) 5,43 (dd, J=15,37, 9,03 Гц, 1 H) 5,82-5,90 (m, 1 H) 6,19-6,36 (m, 1 H) 6,77 (s, 1 H) 7,30 (d, J=8,29 Гц, 2 H) 7,57 (d, J=8,78 Гц, 2 H).
1.2.10 ADL1-H2
[646] ADL1-H2 (2-((2R,4R,5S,6S)-4-((4-(((4-((R)-2-((R)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-1,4-диазепан-1-карбонил)окси)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусную кислоту) синтезировали в соответствии с общей процедурой, указанной в разделе 1.2.7, и получали в виде бесцветного масла (10,4 мг, выход 34%).
[647] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,61-0,68 (m, 3 H) 0,79 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,94 (t, J=6,10 Гц, 6 H) 1,02 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,04-1,10 (m, 3 H) 1,10-1,17 (m, 1 H) 1,19-1,31 (m, 8 H) 1,42-1,49 (m, 2 H) 1,51-1,65 (m, 8 H) 1,67 (s, 3 H) 1,69-1,78 (br. s, 3 H) 1,83-1,93 (m, 2 H) 1,94 (s, 1 H) 2,00-2,10 (m, 2 H) 2,25 (t, J=7,32 Гц, 2 H) 2,30-2,38 (m, 1 H) 2,38-2,49 (m, 2 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,94 (t, J=5,12 Гц, 1 H) 3,05-3,21 (m, 2 H) 3,39-3,48 (m, 7 H) 3,49 (s, 3 H) 3,52-3,63 (m, 5 H) 3,67-3,81 (m, 2 H) 3,90 (br. s., 1 H) 4,17 (t, J=7,30 Гц, 1 H) 4,45-4,55 (m, 2 H) 5,00-5,08 (m, 2 H) 5,48 (dd, J=14,88, 9,51 Гц, 1 H) 5,87-5,95 (m, 1 H) 6,23-6,32 (m, 1 H) 6,76 (s, J=4,01 Гц, 2 H) 7,28 (q, J=7,81 Гц, 2 H) 7,58 (t, J=7,07 Гц, 2 H).
1.2.11 ADL1-H3
[648] ADL1-H3 (2-((2R,4R,5S,6S)-4-((3-((((4-((R)-2-((R)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)пирролидин-1-карбонил)окси)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусную кислоту) синтезировали в соответствии с общей процедурой, указанной в разделе 1.2.7, и получали в виде бесцветного масла (18,8 мг, выход 37%).
[649] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,72 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,90-0,97 (m, 6 H) 1,02 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,16 (dd, J=12,93, 11,46 Гц, 1 H) 1,22-1,28 (m, 4 H) 1,28-1,37 (m, 2 H) 1,44-1,67 (m, 8 H) 1,68 (s, 3 H) 1,90 (dd, J=13,42, 4,15 Гц, 2 H) 2,00-2,15 (m, 4 H) 2,25 (t, J=7,32 Гц, 2 H) 2,38-2,52 (m, 3 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,84 (s, 3 H) 2,93-2,97 (m, 1 H) 3,08 (d, J=6,34 Гц, 1 H) 3,16 (d, J=6,83 Гц, 1 H) 3,42-3,47 (m, 3 H) 3,49 (s, 3 H) 3,51-3,57 (m, 2 H) 3,76 (t, J=6,34 Гц, 1 H) 3,85-3,92 (m, 1 H) 4,14-4,19 (m, 1 H) 4,47-4,55 (m, 2 H) 4,71 (d, J=7,32 Гц, 1 H) 5,06 (s, 2 H) 5,48 (dd, J=14,88, 9,03 Гц, 1 H) 5,93 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,76 (s, J=5,13 Гц, 2 H) 7,30 (d, J=8,29 Гц, 2 H) 7,56 (d, J=8,29 Гц, 2 H).
1.3 Получение ADL1-H5, ADL1-H6 и ADL1-H7
1.3.1 Краткое описание. Общая процедура 2
Схема 3
[650] Стадия 1. 2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамид
[651] К смеси 2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусной кислоты (гербоксидиен, 750 мг, 1,71 ммоль) и триэтиламина (1,192 мл, 8,55 ммоль) в THF (15 мл) добавляли этилхлорформиат (0,767 мл, 5,13 ммоль) при 0°C. Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. и затем добавляли аммиак в метаноле (7 М, 3,66 мл, 25,65 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение дополнительных 30 минут при той же температуре перед концентрированием in vacuo и проведением очистки полученного осадка с помощью хроматографии на силикагеле (гептан/AcOEt = от 50/50 до 0/100, затем AcOEt = 80/20) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (632 мг, выход 85%).
[652] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,67 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,7 Гц, 3 H) 1,05 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,7 Гц, 3 H) 1,20-1,25 (m, 3 H) 1,27 (s, 3 H) 1,34-1,45 (m, 1 H) 1,49-1,65 (m, 7 H) 1,71 (s, 3 H) 1,82-1,97 (m, 2 H) 2,01-2,05 (m, 1 H) 2,33-2,48 (m, 3 H) 2,54 (d, J=9,27 Гц, 2 H) 2,95-2,99 (m, 1 H) 3,34 (d, J=10,0 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,63-3,70 (m, 1 H) 3,80-3,87 (m, 1 H) 4,08-4,14 (m, 1 H) 5,24-5,33 (m, 1 H) 5,47 (dd, J=15,12, 9,27 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,22 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,61 (br. s, 1 H).
[653] Стадия 2. 2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-Метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетамид
[654] К смеси соединения, выделенного на стадии 1 (719 мг, 1,446 ммоль), в DCM (15 мл) и триэтиламина (2,015 мл, 14,458 ммоль) при 0°C добавляли хлортриэтилсилан (1090 мг, 7,229 ммоль) и N, N-диметилпиридин-4-амин (177 мг, 1,446 ммоль). Полученную смесь затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. После перемешивания смесь разбавляли с помощью DCM (100 мл) и смесь промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок объединяли с в AcOEt (100 мл) и амино-функционализированным диоксидом кремния (50 г). Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и затем фильтровали. Фильтрат промывали с помощью AcOEt/MeOH (9/1, 150 мл). Объединенный исходный раствор концентрировали in vacuo и выделенный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г, гептан/AcOEt=от 70/30 до 0/100) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (807 мг, колич.).
[655] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,60 (q, J=7,8 Гц, 6 H) 0,67 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 0,76 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 0,95 (t, J=7,8 Гц, 9 H) 1,04 (td, J=3,3, 1,7 Гц, 6 H) 1,17-1,20 (m, 1 H) 1,24 (s, 3 H) 1,34-1,46 (m, 2 H) 1,50-1,58 (m, 1 H) 1,61 (s, 3 H) 1,70 (s, 3 H) 1,82-1,92 (m, 2 H) 2,33-2,45 (m, 3 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 3,05-3,09 (m, 1 H), 3,34 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,50 (s, 3 H) 3,62-3,70 (m, 1 H) 3,85 (t, J=6,59 Гц, 1 H) 5,29 (br. s., 1 H) 5,48 (dd, J=14,88, 8,54 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,21 (dd, J=14,64, 11,22 Гц, 1 H) 6,63 (br. s., 1 H).
[656] Стадия 3. Аллил-(((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)карбамат
[657] Смесь соединения, выделенного на стадии 2 (807 мг, 1,462 ммоль), и диацетата йодбензола (1413 мг, 4,387 ммоль) в аллиловом спирте (20 мл) нагревали до 60°C и перемешивали в течение 3 часов. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и к ней добавляли AcOEt и водный раствор бикарбоната натрия (100 мл каждого). Органическую фазу выделяли и водную фазу экстрагировали с помощью AcOEt. Объединенные органические экстракты промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г, гептан/AcOEt = от 90/10 до 50/50) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (663 мг, выход 75%).
[658] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,55-0,67 (m, 9 H) 0,77 (d, J=6,7 Гц, 3 H) 0,87 (t, J=6,5 Гц, 2 H) 0,95 (t, J=7,8 Гц, 9 H) 1,04 (t, J=5,5 Гц, 6 H) 1,16-1,32 (m, 9 H) 1,39-1,53 (m, 2 H) 1,58 (s, 3 H) 1,69 (s, 3 H) 1,80-1,91 (m, 2 H) 2,40 (br. s, 1 H) 2,64 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 3,01-3,10 (m, 2 H) 3,26 (d, J=10,24 Гц, 1 H) 3,35-3,44 (m, 2 H) 3,50 (s, 3 H) 3,85 (t, J=6,5 Гц, 1 H) 4,54 (d, J=5,37 Гц, 2 H) 5,12 (br. s., 1 H) 5,19 (dt, J=10,49, 1,10 Гц, 1 H) 5,25-5,33 (m, 1 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,85-5,97 (m, 2 H) 6,22 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
[659] Стадия 4. ((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-Метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метанамин
[660] К смеси соединения, полученного на стадии 3 (663 мг, 1,091 ммоль), и THF (15 мл, 183,065 ммоль) добавляли комплекс боран-диметиламин (643 мг, 10,906 ммоль). После продувания емкости азотом добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (37,8 мг, 0,033 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем смесь разбавляли с помощью AcOEt и насыщенного водного раствора бикарбоната натрия (100 мл каждого) и фазы разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью AcOEt (50 мл × 3) и затем объединенные органические фракции промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на амино-функционализированном силикагеле (40 г, гептан/AcOEt = от 70/30 до 0/100) с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (525 мг, выход 92%).
[661] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,60 (q, J=7,80 Гц, 6 H) 0,65 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 0,77 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,95 (t, J=7,8 Гц, 9 H) 1,03 (dd, J=9,0, 6,6 Гц, 6 H) 1,14-1,21 (m, 1 H) 1,23 (s, 3 H), 1,30-1,34 (m, 1 H) 1,42 (ddd, J=9,4, 7, 2,7 Гц, 1 H) 1,48-1,59 (m, 6 H) 1,70 (s, 3 H) 1,81-1,91 (m, 2 H) 2,34-2,44 (m, 1 H) 2,62-2,74 (m, 3 H) 3,06 (dd, J=6,83, 2,93 Гц, 1 H) 3,25-3,31 (m, 2 H) 3,50 (s, 3 H) 3,81-3,89 (quin, J=6,5 Гц, 1 H) 5,44 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,88 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,22 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
[662] Стадия 5. 6-Гидрокси-N-(((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-N-метилгексанамид
[663] К смеси соединения, выделенного на стадии 5 (133 мг, 0,254 ммоль), и 6-метокси-6-оксогексановой кислоты (0,056 мл, 0,381 ммоль) в THF (2 мл) добавляли HATU (145 мг, 0,381 ммоль) и смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем добавляли AcOEt и полученную смесь промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный остаток объединяли с THF (2 мл) и охлаждали до 0°C. Затем добавляли борогидрид лития (22,1 мг, 1,016 ммоль) и смесь перемешивали при той же температуре в течение 30 минут. Затем смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение дополнительного 1 часа. К смеси добавляли насыщенный водный раствор аммония хлорида с последующим добавлением AcOEt и воды. Органическую фазу выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок затем растворяли в THF (5 мл, 61,02 ммоль) и добавляли TBAF (1 М раствор в THF, 0,508 мл, 0,508 ммоль) при 0°C. Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут, затем нагревали до комнатной температуры с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение дополнительных 2 часов. Затем смесь разбавляли с помощью AcOEt и органическую фазу выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г диоксида кремния, 0-100% гептан/EtOAc) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (113 мг, выход 85%).
[664] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,64 (d, J=6,3 Гц, 3 H) 0,84 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,3 H, 3 H) 1,14 (d, J=6,3 H, 3 H) 1,17-1,21 (m, 3 H) 1,25 (s, 3 H) 1,27-1,40 (m, 3 H) 1,46-1,60 (m, 6 H) 1,60-1,67 (m, 2 H) 1,69 (s, 3 H) 1,77-1,92 (m, 3 H) 2,15 (t, J=7,3 Гц, 2 H) 2,40 (br. s, 1 H) 2,53 (d, J=9,76 Гц, 2 H) 2,92-3,02 (m, 2 H) 3,26 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,34-3,45 (m, 1 H) 3,50 (s, 3 H) 3,52-3,62 (m, 3 H) 3,80-3,83 (m, 1 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,89 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 5,96 (br. s, 1 H) 6,23 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
[665] Стадия 6. Общая процедура синтеза карбамата
[666] К смеси соединения, выделенного на стадии 5 (28,3 мг, 0,054 ммоль), 4-нитрофенилхлорформиата (2,0 экв.) и основания Хунига (5 экв.) в DCM (0,05 М) добавляли DMAP (0,5 экв.). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем добавляли амин (2,0 экв.) и смесь перемешивали в течение дополнительного 1 часа. Затем смесь разбавляли дихлорметаном и органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок затем очищали с помощью хроматографии на амино-функционализированном силикагеле с получением необходимого соединения.
1.3.2 Синтез ADL1-H5
1.3.2.1 Синтез H5
[667] 6-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-6-оксогексилпиперазин-1-карбоксилат (H5)
[668] Стадии 1-6, указанные в разделе 1.3.1, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (24,5 мг, выход 71%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 636,89 [M+H]+.
[669] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,95 (dd, J=16,8, 6,6 Гц, 1 H) 1,03 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,15 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,18-1,25 (m, 2 H) 1,26 (s, 3 H) 1,29-1,40 (m, 3 H) 1,47-1,69 (m, 8 H) 1,70 (s, 3 H) 1,79-1,92 (m, 2 H) 1,92-2,07 (m, 4 H) 2,15 (t, J=7,56 Гц, 2 H) 2,36-2,45 (m, 1 H) 2,54 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,80 (br. s., 4 H) 2,89-3,04 (m, 2 H) 3,27 (d, J=10,24 Гц, 1 H) 3,35-3,46 (m, 5 H) 3,51 (s, 3 H) 3,52-3,58 (m, 2 H) 3,83 (t, J=6,34 Гц, 1 H) 4,05 (t, J=6,34 Гц, 2 H) 5,46 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,82-5,95 (m, 2 H) 6,24 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
1.3.2.2 Синтез ADL1-H5
[670] 1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)-4-(6-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-6-оксогексил)пиперазин-1,4-дикарбоксилат (ADL1-H5)
[671] Процедуру, указанную в разделе 1.2.7, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (25,8 мг, выход 54%).
[672] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,94 (dd, J=6,34, 4,39 Гц, 7 H) 1,01 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,07 (d, J=6,30 Гц, 4 H) 1,11-1,38 (m, 14 H) 1,45-1,66 (m, 14 H) 1,69 (s, 3 H) 1,70-1,79 (m, 1 H) 1,80-1,92 (m, 3 H) 2,00-2,09 (m, 1 H) 2,17 (t, J=7,07 Гц, 2 H) 2,25 (t, J=7,32 Гц, 3 H) 2,42 (br. s., 1 H) 2,63 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,95 (dd, J=5,85, 4,39 Гц, 1 H) 3,02-3,11 (m, 2 H) 3,17 (d, J=6,83 Гц, 1 H) 3,37-3,48 (m, 14 H) 3,50 (s, 4 H) 3,53 (t, J=4,50 Гц, 2 H) 3,63-3,67 (m, 2 H) 3,76 (t, J=6,34 Гц, 1 H) 4,05 (t, J=6,34 Гц, 3 H) 4,14 (d, J=7,32 Гц, 1 H) 4,48 (dd, J=8,78, 4,88 Гц, 1 H) 5,06 (s, 2 H) 5,46 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,20-6,38 (m, 1 H) 6,76 (s 2 H) 7,30 (d, J=8,29 Гц, 2 H) 7,57 (d, J=8,29 Гц, 2 H).
1.3.3 Синтез ADL1-H6
1.3.3.1 Синтез H6
[673] 6-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-6-оксогексил-1,4-диазепан-1-карбоксилат (H6)
[674] Стадии 1-6, указанные в разделе 1.3.1, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (15,3 мг, выход 43%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 650,92[M+H]+.
[675] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,93-1,00 (m, 1 H) 1,03 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,18-1,24 (m, 2 H) 1,27 (s, 3 H) 1,29-1,41 (m, 3 H) 1,49-1,55 (m, 2 H) 1,59-1,68 (m, 5 H) 1,71 (s, 3 H) 1,73-1,92 (m, 7 H) 2,16 (t, J=7,56 Гц, 2 H) 2,36-2,46 (m, 1 H) 2,54 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,81-2,93 (m, 4 H) 2,93-3,04 (m, 2 H) 3,27 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,37-3,49 (m, 4 H) 3,52 (s, 3 H) 3,54-3,59 (m, 2 H) 3,79-3,88 (m, 1 H) 4,05 (t, J=6,34 Гц, 2 H) 5,46 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,82-5,96 (m, 2 H) 6,24 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
1.3.3.2 Синтез ADL1-H6
[676] 1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)-4-(6-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-6-оксогексил)-1,4-диазепан-1,4-дикарбоксилат (ADL-H6)
[677] Процедуру, указанную в разделе 1.2.7, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (11,6 мг, выход 52%).
[678] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц , 2 H) 0,94 (dd, J=6,83, 4,39 Гц, 6 H) 0,98-1,16 (m, 9 H) 1,19-1,36 (m, 9 H) 1,44-1,65 (m, 14 H) 1,69 (s, 3 H) 1,71-1,78 (m, 4 H) 1,80-1,92 (m, 3 H) 2,00-2,10 (m, 1 H) 2,11-2,19 (m, 2 H) 2,25 (t, J=7,56 Гц, 3 H) 3,03-3,21 (m, 4 H) 3,36-3,49 (m, 10 H) 3,49-3,51 (m, 3 H) 3,51-3,57 (m, 12 H) 3,62-3,67 (m, 8 H) 3,70-3,82 (m, 1 H) 3,97-4,05 (m, 2 H) 4,14 (d, J=7,32 Гц, 1 H) 4,46-4,52 (m, 1 H) 5,00-5,08 (m, 3 H) 5,35-5,52 (m, 1 H) 5,35-5,52 (m, 1 H) 5,87-5,95 (m, 1 H) 6,24-6,33 (m, 1 H) 6,76 (s, 2 H) 7,26-7,37 (m, 3 H) 7,57 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 8,19-8,24 (m, 1 H).
1.3.4 Синтез ADL1-H7
1.3.4.1 Синтез H7
[679] 6-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-6-оксогексил-3-(метиламино)пирролидин-1-карбоксилат (H7)
[680] Стадии 1-6, указанные в разделе 1.3.1, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (26,6 мг, выход 76%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 650,88[M+H]+.
[681] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,93-0,99 (m, 1 H) 1,04 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,16 (dd, J=6,34, 0,98 Гц, 3 H) 1,19-1,22 (m, 2 H) 1,27 (s, 3 H) 1,31-1,41 (m, 3 H) 1,47-1,67 (m, 8 H) 1,70 (s, 4 H) 1,80-1,87 (m, 2 H) 1,89 (d, J=3,90 Гц, 1 H) 2,03 (dd, J=12,68, 6,34 Гц, 1 H) 2,15 (t, J=7,32 Гц, 2 H) 2,41 (m, 3 H) 2,54 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,94-3,13 (m, 2 H) 3,20 (m, 1 H) 3,27 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,35-3,50 (m, 3 H) 3,51 (s, 3 H) 3,53-3,60 (m, 2 H) 3,79-3,88 (m, 1 H) 4,04 (t, J=6,34 Гц, 2 H) 5,46 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,82-5,96 (m, 2 H) 6,24 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
1.3.4.2 Синтез ADL1-H7
[682] 6-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-6-оксогексил-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)пирролидин-1-карбоксилат (ADL1-H7)
[683] Процедуру, указанную в разделе 1.2.7, использовали (смесь перемешивали в течение 16 часов вместо 2 часов) для получения указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (20,1 мг, выход 54%).
[684] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,30 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,94 (dd, J=6,59, 4,63 Гц, 7 H) 1,01 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 4 H) 1,11-1,23 (m, 4 H) 1,23-1,27 (m, 6 H) 1,27-1,38 (m, 5 H) 1,43-1,65 (m, 14 H) 1,69 (s, 3 H) 1,70-1,77 (m, 1 H) 1,80-1,92 (m, 3 H) 2,00-2,09 (m, 3 H) 2,17 (t, J=7,32 Гц, 2 H) 2,25 (t, J=7,30 Гц, 3 H) 2,38-2,46 (m, 1 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,83 (s, 3 H) 2,84 (s, 3 H) 2,92-2,96 (m, 1 H) 2,97 (s, 3 H) 3,02-3,21 (m, 4 H) 3,30-3,42 (m, 3 H) 3,45 (t, J=7,07 Гц, 3 H) 3,50 (s, 3 H) 3,51-3,58 (m, 3 H) 3,72-3,80 (m, 1 H) 4,03 (t, J=6,34 Гц, 2 H) 4,15 (d, J=7,32 Гц, 1 H) 4,49 (dd, J=9,03, 5,12 Гц, 1 H) 5,06 (s, 2 H) 5,46 (dd, J=14,88, 9,03 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,76 (s, 2 H) 7,30 (d, J=5,90 Гц, 2 H) 7,57 (d, J=8,29 Гц, 2 H) 7,95 (s, 1 H).
1.4 Синтез ADL1-H8, ADL1-H9 и ADL1-H10
1.4.1 Краткое описание. Общая процедура 4
Схема 4
[685] Стадия 1. трет-Бутил-3-гидроксипропаноат
[686] К смеси гидрида натрия (269 мг, 6,157 ммоль) в DMF (30 мл) добавляли трет-бутил-3-гидроксипропаноат (0,909 мл, 6,157 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа и затем добавляли по каплям метилбромацетат (0,624 мл, 6,157 ммоль). Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и смесь экстрагировали с помощью AcOEt. Затем объединенные органические экстракты промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Выделенный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г, гептан/AcOEt = от 80/20 до 50/50) с получением указанного в заголовке соединения (97 мг, выход 7%) в виде бесцветного масла.
[687] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 1,42 (s, 9 H) 2,49-2,58 (m, 2 H) 3,41 (s, 3 H) 3,69-3,79 (m, 2 H) 4,05-4,13 (m, 2 H).
[688] Стадия 2. 3-(2-Метокси-2-оксоэтокси)пропановая кислота
[689] Смесь трет-бутил-3-(2-метокси-2-оксоэтокси)пропаноата (66 мг, 0,302 ммоль) в дихлорметане (2 мл) и TFA (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем смесь концентрировали до сухого состояния с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (58 мг, 100%).
[690] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 2,62-2,78 (m, 2 H) 3,76 (s, 3 H) 3,78-3,85 (m, 2 H) 4,14 (d, J=1,95 Гц, 2 H).
[691] Стадия 3. N-(((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-3-(2-гидроксиэтокси)пропенамид
[692] К смеси ((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метанамина (133 мг, 0,254 ммоль) и 3-(2-метокси-2-оксоэтокси)пропановой кислоты (61,7 мг, 0,381 ммоль) в THF (5 мл) добавляли HATU (145 мг, 0,381 ммоль) и DIPEA (221 мкл, 1,27 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 16 часов и затем разбавляли с помощью AcOEt. Органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo.
[693] Выделенный остаток растворяли в THF (5 мл) и охлаждали до 0°C и затем добавляли борогидрид лития (22,12 мг, 1,016 ммоль). Полученную смесь перемешивали при той же температуре в течение 30 минут и затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 2 часов. Затем добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и воду и водный слой экстрагировали с помощью AcOEt. Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, и концентрировали in vacuo. Выделенный остаток затем растворяли в THF (5 мл) и добавляли TBAF (1 М раствор в THF, 0,508 мл, 0,508 ммоль) при 0°C. После перемешивания при 0°C в течение 30 минут смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 часов. Затем смесь разбавляли с помощью AcOEt и органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на силикагеле (24 г, гептан/AcOEt = от 70/30 до 0/100, затем AcOEt/MeOH=80/20) с получением указанного в заголовке соединения (68 мг, выход 51%) в виде бесцветного масла.
[694] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,04 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,8 Гц, 4 H) 1,19-1,22 (m, 2 H) 1,27 (s, 3 H) 1,42-1,65 (m, 4 H) 1,71 (s, 3 H) 1,79-1,92 (m, 2 H) 2,37-2,50 (m, 4 H) 2,54 (d, J=9,27 Гц, 2 H) 2,89-3,05 (m, 2 H) 3,28 (d, J=10,24 Гц, 1 H) 3,41 (td, J=8,54, 2,44 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,54-3,59 (m, 2 H) 3,61-3,68 (m, 2 H) 3,69-3,76 (m, 2 H) 3,78-3,91 (m, 2 H) 5,43-5,52 (m, 1 H) 5,92 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,24 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H) 6,77 (m, 1 H).
[695] Стадия 4. Синтез карбамата
[696] К смеси N-(((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-3-(2-гидроксиэтокси)пропанамида (1,0 экв., 0,043 ммоль), 4-нитрофенилхлорформиата (2,0 экв., 0,086 ммоль) и DIPEA (5,0 экв.) в DCM (0,04 М) добавляли DMAP (5,0 экв.) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре и затем добавляли пиперазин (10,0 экв.) и смесь перемешивали в течение еще 1 часа. Полученную смесь затем разбавляли дихлорметаном и органический слой выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали с помощью хроматографии на амино-функционализированном силикагеле (гептан/AcOEt=от 50/50 до 0/100) с получением необходимого соединения.
1.4.2 Синтез ADL1-H8
1.4.2.1 Синтез H8
[697] 2-(3-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-3-оксопропокси)этилпиперазин-1-карбоксилат (H8)
[698] Стадии 1-4, указанные в разделе 1.4.1, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого масла (19,2 мг, выход 70%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 638,78[M+H]+.
[699] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,96 (dd, J=18,54, 6,34 Гц, 1 H) 1,03 (d, J=5,85 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=5,85 Гц, 4 H) 1,18-1,25 (m, 2 H) 1,27 (s, 3 H) 1,29-1,39 (m, 1 H) 1,41-1,63 (m, 4 H) 1,70 (s, 3 H) 1,77-1,97 (m, 7 H) 2,44 (t, J=5,61 Гц, 2 H) 2,47-2,57 (m, 1 H) 2,80 (br. s., 4 H) 2,85-2,99 (m, 1 H) 2,99-3,09 (m, 1 H) 3,27 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,36-3,48 (m, 5 H) 3,52 (s, 3 H) 3,54-3,59 (m, 1 H) 3,59-3,68 (m, 2 H) 3,68-3,74 (m, 2 H) 3,77-3,90 (m, 1 H) 4,15-4,23 (m, 2 H) 4,36 (t, J=6,10 Гц, 1 H) 5,44 (dd, J=14,88, 8,54 Гц, 1 H) 5,88 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,23 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,41 (br. s., 1 H).
1.4.2.2 Синтез H8
[700] 1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)-4-(2-(3-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-3-оксопропокси)этил)пиперазин-1,4-дикарбоксилат (ADL1-H8)
[701] Процедуру, подобную указанной в разделе 1.2.7, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (18,3 мг, выход 60%).
[702] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,30 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,94 (dd, J=6,59, 4,15 Гц, 7 H) 1,01 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,10-1,23 (m, 4 H) 1,25 (s, 3 H) 1,26-1,32 (m, 3 H) 1,44-1,65 (m, 10 H) 1,68 (s, 3 H) 1,70-1,75 (m, 1 H) 1,80-1,92 (m, 3 H) 2,00-2,09 (m, 1 H) 2,25 (t, J=7,56 Гц, 2 H) 2,41 (t, J=5,85 Гц, 2 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,95 (dd, J=6,34, 4,39 Гц, 1 H) 3,08 (dt, J=13,05, 6,40 Гц, 1 H) 3,14-3,21 (m, 1 H) 3,38-3,48 (m, 14 H) 3,49 (s, 4 H) 3,58-3,65 (m, 2 H) 3,69 (t, J=6,10 Гц, 2 H) 3,72-3,80 (m, 1 H) 4,13-4,19 (m, 3 H) 4,48 (dd, J=9,02, 5,12 Гц, 1 H) 5,07 (s, 2 H) 5,46 (dd, J=15,12, 9,27 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,24 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,76 (s, 2 H) 7,30 (d, J=8,78 Гц, 2 H) 7,57 (d, J=7,25 Гц, 2 H).
1.4.3 Синтез ADL1-H9
1.4.3.1 Синтез H9
[703] 2-(3-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-3-оксопропокси)этил-1,4-диазепан-1-карбоксилат (H9)
[704] Стадии 1-4, указанные в разделе 1.4.1, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (21,1 мг, выход 75%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 652,86[M+H]+.
[705] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 0,92-1,00 (m, 1 H) 1,03 (d, J=6,8 H, 3 H) 1,16 (d, J=6,8 H, 3 H) 1,20-1,24 (m, 1 H) 1,27 (s, 4 H) 1,47-1,60 (m, 4 H) 1,70 (s, 3 H) 1,73-1,90 (m, 8 H) 2,37-2,47 (m, 3 H) 2,53 (d, J=9,8 Гц, 1 H) 2,81-2,86 (m, 2 H) 2,87-2,92 (m, 2 H) 2,94-2,97 (m, 1 H) 2,99-3,07 (m, 1 H) 3,27 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,38-3,50 (m, 4 H) 3,52 (s, 3 H) 3,55-3,59 (m, 1 H) 3,61-3,68 (m, 2 H) 3,68-3,74 (m, 2 H) 3,77-3,91 (m, 1 H) 4,19 (br. s., 2 H) 4,37 (t, J=6,10 Гц, 1 H) 5,41-5,50 (m, 1 H) 5,89 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,23 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,46 (dd, J=3,17, 1,22 Гц, 1 H).
1.4.3.2 Синтез ADL1-H9
[706] 1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)-4-(2-(3-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-3-оксопропокси)этил)-1,4-диазепан-1,4-дикарбоксилат (ADL1-H9)
[707] Процедуру, подобную указанной в разделе 1.2.7, проводили с получением указанного в заголовке соединения (25,2 мг, выход 72%).
[708] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,30 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,93 (t, J=5,85 Гц, 7 H) 1,01 (d, J=6,30 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,30 Гц, 3 H) 1,11-1,21 (m, 2 H) 1,21-1,32 (m, 7 H) 1,43-1,65 (m, 10 H) 1,69 (s, 3 H) 1,70-1,91 (m, 5 H) 2,05 (q, J=6,8 Гц, 1 H) 2,25 (t, J=7,32 Гц, 2 H) 2,36-2,48 (m, 3 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,95 (dd, J=5,85, 4,39 Гц, 1 H) 3,03-3,13 (m, 2 H) 3,13-3,21 (m, 1 H) 3,37-3,48 (m, 7 H) 3,48-3,59 (m, 8 H) 3,62-3,70 (m, 2 H) 3,76 (quin, J=6,46 Гц, 1 H) 4,11-4,22 (m, 2 H) 4,47-4,53 (m, 1 H) 5,02-5,09 (m, 2 H) 5,45 (dd, J=14,88, 9,03 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,64, 11,22 Гц, 1 H) 6,76 (s, 2 H) 7,26-7,37 (m, 2 H) 7,57 (d, J=7,81 Гц, 2 H).
1.4.4 Синтез ADL1-H10
1.4.4.1 Синтез H10
[709] 2-(3-((((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-Гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)амино)-3-оксопропокси)этил-3-(метиламино)пирролидин-1-карбоксилат (H10)
[710] Стадии 1-4, указанные в разделе 1.4.1, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (24,8 мг, выход 88%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 652,91 [M+H]+.
[711] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,96 (dd, J=18,78, 6,59 Гц, 1 H) 1,03 (d, J=6,8 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,18-1,25 (m, 3 H) 1,27 (s 3 H) 1,20-1,32 (m, 5 H) 1,41-1,63 (m, 4 H) 1,70 (s, 3 H) 1,72-1,90 (m, 4 H) 2,02 (dd, J=12,44, 6,10 Гц, 2 H) 2,41 (s 3 H) 2,43-2,50 (m, 2 H)2,54 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,95 (t, J=5,37 Гц, 1 H) 3,01-3,14 (m, 1 H) 3,18-3,24 (m, 1 H) 3,27 (d, J=9,7 Гц, 1 H) 3,38-3,49 (m, 2 H) 3,52 (s, 6 H) 3,61-3,65 (m, 2 H) 3,69-3,74 (m, 2 H) 3,83 (quin, J=5,98 Гц, 1 H) 4,15-4,22 (m, 1 H) 4,34 (t, J=6,10 Гц, 1 H) 5,44 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,88 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,23 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,43 -6,51 (m, 1 H).
1.4.4.2 Синтез ADL1-H10
[712] Процедуру, подобную указанной в разделе 1.2.7, проводили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (22,1 мг, выход 57%).
[713] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,65 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,94 (dd, J=6,34, 4,88 Гц, 8 H) 1,01 (dd, J=3,90, 2,93 Гц, 4 H) 1,08 (d, J=6,30 Гц, 3 H) 1,11-1,22 (m, 3 H) 1,22-1,31 (m, 7 H) 1,44-1,65 (m, 10 H) 1,68 (s 3 H) 1,71-1,91 (m, 4 H) 1,99-2,09 (m, 3 H) 2,25 (t, J=7,56 Гц, 2 H) 2,41 (t, J=5,85 Гц, 2 H) 2,62 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,84 (m, 4 H) 2,93-2,99 (m, 2 H) 3,04-3,13 (m, 2 H) 3,13-3,21 (m, 1 H) 3,43 (t, J=7,07 Гц, 2 H) 3,50 (s, 3 H) 3,52-3,56 (m, 2 H) 3,61 (t, J=4,39 Гц, 2 H) 3,69 (t, J=5,37 Гц, 2 H) 3,73-3,79 (m, 1 H) 4,15 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 4,49 (dd, J=9,03, 5,12 Гц, 1 H) 5,06 (s, 2 H) 5,45 (dd, J=14,88, 9,03 Гц, 1 H) 5,90 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H) 6,76 (s, J=4,56 Гц, 2 H) 7,30 (d, J=8,29 Гц, 2 H) 7,57 (d, J=8,29 Гц, 2 H).
1.5 Синтез ADL2-H1
[714] 2-((2R,4R,5S,6S)-4-((4-(3-(2-(2-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)пропаноил)пиперазин-1-карбонил)окси)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)уксусная кислота (ADL2-H1)
[715] К смеси H1 (см., например, раздел 1.2.2; 22,5 мг, 0,03 ммоль) в DMF (1 мл) добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси]этокси}пропаноат (10,55 мг, 0,03 ммоль) и DIPEA (0,016 мл, 0,089 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем растворитель удаляли in vacuo и полученный осадок очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (ODS, 24 г, H2O/MeCN = от 95/5 до 60/40) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (15,7 мг, выход 65%).
[716] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,73 (d, J=6,34 Гц, 4 H) 0,97-1,15 (m, 13 H) 1,21 (s, 2 H) 1,28-1,41 (m, 1 H) 1,42-1,62 (m, 2 H) 1,69 (d, J=4,39 Гц, 4 H) 2,08-2,20 (m, 1 H) 2,33-2,39 (m, 1 H) 2,42-2,58 (m, 3 H) 2,63 (t, J=5,30 Гц, 2 H) 2,91-2,94 (m, 1 H) 3,33 (d, J=3,41 Гц, 1 H) 3,36 (d, J=1,95 Гц, 2 H) 3,44-3,60 (m, 18 H) 3,60-3,67 (m, 4 H) 3,69 (t, J=5,37 Гц, 2 H) 3,75-3,78 (m, 1 H) 3,81-4,00 (m, 2 H) 4,22-4,31 (m, 1 H) 4,52-4,60 (m, 1 H) 5,58-5,72 (m, 1 H) 5,89-6,00 (m, 1 H) 6,13-6,31 (m, 1 H) 6,71-6,89 (m, 2 H).
1.6 Синтез ADL2-H11
[717] Стадия 1. Синтез (2R,3R,4R)-4-((2R,3R)-3-((S,3E,5E)-6-((2S,3S,6R)-6-(аминометил)-3-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)-2-метилгепта-3,5-диен-1-ил)-3-метилоксиран-2-ил)-3-метоксипентан-2-ола (H11)
[718] К смеси ((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метанамина (32 мг, 0,061 ммоль) в THF (1 мл) добавляли TBAF (1 М раствор в THF, 0,183 мл, 0,183 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и затем разбавляли с помощью AcOEt. Органическую фазу выделяли, промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Выделенный остаток очищали с помощью хроматографии на амино-функционализированном силикагеле (24 г, гептан/AcOEt = от 50/50 до 0/100, затем AcOEt/MeOH=80/20) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (15,1 мг, выход 60,4%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 410,07 [M+H]+.
[719] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (d, J=6,80 Гц, 3 H) 0,86 (d, J=6,80 Гц, 3 H) 1,03 (d, J=6,80 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,30 Гц, 4 H) 1,19-1,24 (m, 2 H) 1,27 (s, 3 H) 1,29-1,38 (m, 1 H) 1,44-1,57 (m, 3 H) 1,62-1,66 (m, 1 H) 1,71 (s, 5 H) 1,74-1,93 (m, 3 H) 2,34-2,45 (m, 1 H) 2,54 (d, J=9,00 Гц, 1 H) 2,62-2,74 (m, 2 H) 2,92-2,98 (m, 1 H) 3,24-3,32 (m, 2 H) 3,52 (s, 3 H) 3,79-3,88 (m, 1 H) 5,39-5,48 (m, 1 H) 5,88 (d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,23 (ddd, J=14,64, 11,22, 3,41 Гц, 1 H).
[720] Стадия 2. Синтез 3-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропокси)этокси)-N-(((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)пропанамида (ADL2-H11)
[721] К смеси соединения, полученного на стадии 1 (15,1 мг, 0,037 ммоль), в DMF (1 мл, 12,915 ммоль) добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси]этокси}пропаноат (13,1 мг, 0,037 ммоль) и DIPEA (0,019 мл, 0,111 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем смесь концентрировали in vacuo и полученный осадок очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (ODS, 24 г, H2O/MeCN = от 95/5 до 60/40) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (14,9 мг, выход 62%).
1.7 Синтез H18, H20, H23, H16, H15, H24, H13, H14, H17, H19 и H21
[722] H18, H20, H23, H16, H15, H24, H13, H14, H17, H19 и H21 получали с помощью общей процедуры, указанной ниже (общая процедура 1.7).
[723] К раствору 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксипентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)ацетата (1,0 экв.) в DMF (0,028 М) добавляли амин (16 мг, 0,056 ммоль) и DIPEA (2,0 экв). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, затем смесь очищали с помощью HPLC с получением необходимого продукта.
1.7.1 Синтез H20
[724] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H20 в виде бесцветного аморфного продукта (15,7 мг, 0,022 ммоль, выход 79%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 707,99 [M+H]+.
[725] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,66 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,85 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,04 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,16 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,18-1,25 (m, 2 H) 1,27 (s, 4 H) 1,30-1,59 (m, 8 H) 1,71-1,80 (m, 2 H) 1,81-1,89 (m, 2 H) 2,35 (br d, J=3,90 Гц, 2 H) 2,38-2,44 (m, 1 H) 2,52-2,60 (m, 4 H) 2,79-2,86 (m, 4 H) 2,96 (t, J=5,37 Гц, 1 H) 3,06-3,16 (m, 1 H) 3,24-3,30 (m, 1 H) 3,32 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,64 (br d, J=4,39 Гц, 5 H) 3,71 (s, 3 H) 3,83 (t, J=5,85 Гц, 1 H) 4,30-4,42 (m, 1 H) 5,40-5,53 (m, 3 H) 5,89 (br d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,16-6,28 (m, 1 H) 6,75 (br t, J=5,85 Гц, 1 H).
1.7.2 Синтез H23
[726] H23 (6,9 мг, выход 37%) получали с помощью общей процедуры 1.7. LC/MS (ESI, масса/заряд), 665,96 [M+H]+.
[727] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,66 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,12-1,23 (m, 2 H) 1,25 (s, 4 H) 1,31-1,37 (m, 1 H) 1,43-1,55 (m, 2 H) 1,63 (br d, J=13,17 Гц, 1 H) 1,67 (s, 3 H) 1,81-1,93 (m, 3 H) 2,21-2,40 (m, 1 H) 2,63 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,74 (s, 2 H) 2,92-2,97 (m, 1 H) 3,05 (br s, 3 H) 3,12-3,22 (m, 1 H) 3,31-3,38 (m, 2 H) 3,50 (s, 3 H) 3,63 (br s, 4 H) 3,68-3,78 (m, 2 H) 4,23 (br d, J=4,39 Гц, 1 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,89 (br d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,27 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
1.7.3 Синтез H16
[728] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H16 в виде бесцветного аморфного продукта (6,4 мг, выход 34%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 679,86[M+H]+.
[729] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,67 (br d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (br d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,01-1,06 (m, 3 H) 1,14-1,19 (m, 3 H) 1,19-1,28 (m, 5 H) 1,43 (br dd, J=12,20, 9,76 Гц, 1 H) 1,47-1,55 (m, 1 H) 1,61-1,64 (m, 1 H) 1,71 (br d, J=7,32 Гц, 3 H) 1,83-1,90 (m, 2 H) 2,03-2,20 (m, 1 H) 2,37-2,44 (m, 3 H) 2,49-2,56 (m, 5 H) 2,75 (br s, 1 H) 2,78-2,84 (m, 3 H) 2,87-2,94 (m, 1 H) 2,94-2,98 (m, 1 H) 3,35 (br dd, J=13,41, 10,00 Гц, 2 H) 3,52 (s, 4 H) 3,60 (br s, 4 H) 3,69 (br s, 3 H) 3,71 (s, 4 H) 3,83 (td, J=12,56, 6,59 Гц, 2 H) 4,06-4,20 (m, 1 H) 4,57-4,68 (m, 1 H) 5,47 (td, J=15,98, 8,54 Гц, 1 H) 5,81-5,96 (m, 1 H) 6,14-6,36 (m, 1 H).
1.7.4 Синтез H15
[730] Общая процедура 1.7 обеспечивала получение H15 в виде побочного продукта во время синтеза H16 (6,6 мг, выход 35%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 665,46 [M+H]+.
[731] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,66 (br d, J=6,34 Гц, 4 H) 0,81 (br d, J=5,85 Гц, 3 H) 0,99-1,04 (m, 4 H) 1,07-1,10 (m, 4 H) 1,17 (br s, 1 H) 1,19-1,27 (m, 5 H) 1,46-1,55 (m, 2 H) 1,65 (br s, 1 H) 1,68 (s, 4 H) 1,82-1,95 (m, 2 H) 2,00-2,18 (m, 1 H) 2,29-2,49 (m, 4 H) 2,61-2,67 (m, 4 H) 2,92-3,03 (m, 5 H) 3,34 (br d, J=10,24 Гц, 1 H) 3,50 (s, 3 H) 3,58-3,77 (m, 8 H) 4,28 (t, J=9,76 Гц, 1 H) 5,40-5,53 (m, 1 H) 5,83-5,99 (m, 1 H) 6,28 (dd, J=14,63, 10,73 Гц, 1 H).
1.7.5 Синтез H24
[732] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H24 в виде бесцветного аморфного продукта (12,1 мг, выход 94%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 693,72 [M+H]+.
[733] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,66 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,80 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (d, J=6,83 Гц, 4 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 4 H) 1,32-1,37 (m, 8 H) 1,44-1,50 (m, 4 H) 1,65-1,68 (m, 5 H) 1,75-1,96 (m, 4 H) 2,19-2,39 (m, 3 H) 2,40-2,52 (m, 2 H) 2,63 (d, J=9,27 Гц, 1 H) 2,80 (s, 3 H) 2,95 (dd, J=6,34, 4,39 Гц, 1 H) 3,06-3,15 (m, 1 H) 3,31-3,40 (m, 2 H) 3,50 (s, 3 H) 3,65-3,72 (m, 7 H) 3,73-3,80 (m, 2 H) 4,10-4,24 (m, 1 H) 5,47 (dd, J=15,12, 9,27 Гц, 1 H) 5,89 (d, J=10,24 Гц, 1 H) 6,28 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
1.7.6 Синтез H18
[734] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H18 в виде бесцветного аморфного продукта (8,1 мг, выход 53%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 678,68[M-H]+.
[735] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,67 (br d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,87 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,03 (br d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,15-1,24 (m, 5 H) 1,28 (s, 3 H) 1,50-1,67 (m, 5 H) 1,75 (br s, 1 H) 1,82-1,94 (m, 3 H) 2,37-2,44 (m, 3 H) 2,56-2,60 (m, 4 H) 2,71-2,93 (m, 3 H) 3,00 (br t, J=5,12 Гц, 1 H) 3,37 (br d, J=10,24 Гц, 1 H) 3,53 (s, 3 H) 3,55-3,63 (m, 1 H) 3,65-3,76 (m, 3 H) 3,83-3,91 (m, 1 H) 4,04 (br d, J=4,39 Гц, 1 H) 4,08-4,16 (m, 1 H) 4,41-4,53 (m, 2 H) 5,42-5,55 (m, 1 H) 5,91 (br d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,14-6,28 (m, 1 H) 7,21 (br d, J=7,32 Гц, 1 H).
1.7.7 Синтез H13
[736] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H13 в виде бесцветного аморфного продукта (6,7 мг, выход 36,7%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 652,86 [M+H]+.
[737] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,66 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,81 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,02 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,05-1,10 (m, 3 H) 1,14-1,23 (m, 2 H) 1,26 (s, 4 H) 1,34-1,52 (m, 2 H) 1,52-1,59 (m, 1 H) 1,65 (br s, 1 H) 1,70 (s, 4 H) 1,82-1,92 (m, 2 H) 2,41 (qd, J=14,39, 6,10 Гц, 3 H) 2,63 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,73 (br d, J=4,39 Гц, 3 H) 2,95 (br t, J=5,12 Гц, 2 H) 2,99-3,09 (m, 3 H) 3,30-3,36 (m, 1 H) 3,50 (s, 3 H) 3,53-3,65 (m, 2 H) 3,65-3,78 (m, 4 H) 4,24-4,42 (m, 2 H) 4,55 (br s, 1 H) 5,36-5,55 (m, 1 H) 5,89 (br d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,21-6,43 (m, 1 H).
1.7.8 Синтез H14
[738] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H14 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (15,5 мг, выход 83%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 666,90 [M+H]+.
[739] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,65 (br d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (br d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (br d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,14-1,28 (m, 8 H) 1,38-1,57 (m, 2 H) 1,57-1,65 (m, 2 H) 1,81-1,89 (m, 2 H) 2,04-2,19 (m, 2 H) 2,41 (br d, J=4,88 Гц, 3 H) 2,54 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 2,65 (s, 3 H) 2,91-3,03 (m, 5 H) 3,33 (br d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,70 (br s, 5 H) 3,81-3,87 (m, 1 H) 4,08-4,18 (m, 2 H) 4,52 (br d, J=6,34 Гц, 1 H) 5,45 (br dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,89 (br d, J=10,73 Гц, 1 H) 6,21 (br dd, J=14,88, 10,98 Гц, 2 H) 7,15 (br d, J=7,32 Гц, 1 H).
1.7.9 Синтез H17
[740] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H17 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (12,94 мг, выход 68%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 680,66 [M+H]+.
[741] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,66 (d, J=6,83 Гц, 4 H) 0,81 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 0,97-1,04 (m, 5 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 5 H) 1,10-1,16 (m, 2 H) 1,20-1,23 (m, 1 H) 1,25 (s, 4 H) 1,69 (d, J=0,98 Гц, 4 H) 1,83 (br d, J=3,41 Гц, 1 H) 1,87 (br d, J=4,39 Гц, 1 H) 1,90 (br d, J=4,39 Гц, 1 H) 2,24-2,30 (m, 1 H) 2,40 (br dd, J=13,90, 9,02 Гц, 2 H) 2,58-2,62 (m, 5 H) 2,64 (s, 1 H) 2,84 (br t, J=4,88 Гц, 5 H) 2,95 (dd, J=6,34, 4,39 Гц, 1 H) 3,30-3,32 (m, 1 H) 3,50 (s, 3 H) 3,56-3,64 (m, 6 H) 3,74-3,79 (m, 1 H) 4,02 (br t, J=5,37 Гц, 3 H) 4,32-4,35 (m, 1 H) 4,35-4,37 (m, 1 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,85-5,91 (m, 1 H) 6,27 (dd, J=15,12, 10,73 Гц, 1 H).
1.7.10 Синтез H19
[742] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H19 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (5,53 мг, выход 56,4%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 694,08 [M+H]+.
[743] 1H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ ppm 0,66 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,81 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 0,95-0,95 (m, 1 H) 1,02 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,08 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,12-1,22 (m, 2 H) 1,26 (s, 4 H) 1,34-1,52 (m, 7 H) 1,62 (br d, J=13,66 Гц, 2 H) 1,68 (s, 4 H) 1,81-1,93 (m, 3 H) 2,08-2,08 (m, 1 H) 2,20-2,39 (m, 2 H) 2,39-2,50 (m, 1 H) 2,61-2,68 (m, 4 H) 2,90-2,97 (m, 5 H) 3,11-3,15 (m, 2 H) 3,30-3,34 (m, 1 H) 3,50 (s, 3 H) 3,56-3,62 (m, 4 H) 3,76 (t, J=6,34 Гц, 1 H) 4,11-4,22 (m, 1 H) 5,45 (dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,90 (br d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,29 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
1.7.11 Синтез H21
[744] Общую процедуру 1.7 проводили с получением H21 с его получением в виде бесцветного аморфного твердого вещества (12,3 мг, выход 62,1%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 708,03 [M+H]+.
[745] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,67 (br d, J=6,34 Гц, 3 H) 0,85 (br d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (br d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,15-1,29 (m, 9 H) 1,29-1,42 (m, 3 H) 1,47-1,63 (m, 6 H) 1,74-1,79 (m, 1 H) 1,86 (br dd, J=13,17, 3,90 Гц, 2 H) 2,40 (br d, J=5,37 Гц, 3 H) 2,51-2,55 (m, 4 H) 2,78 (br s, 4 H) 2,96 (br t, J=5,12 Гц, 1 H) 3,18 (td, J=12,07, 6,10 Гц, 2 H) 3,37 (br d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,52 (s, 3 H) 3,57 (br s, 4 H) 3,69 (s, 4 H) 3,84 (br t, J=5,85 Гц, 1 H) 4,50-4,57 (m, 1 H) 4,85-4,93 (m, 2 H) 5,44 (br dd, J=15,12, 8,78 Гц, 1 H) 5,92 (br d, J=10,24 Гц, 1 H) 6,15-6,38 (m, 1 H) 7,24-7,29 (m, 2 H) 8,24 (br s, 1 H).
1.8 Синтез H22 и H25
[746] H22 и H25 получали с помощью общей процедуры, описанной ниже.
[747] Стадия 1. К раствору ((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-l)метанамина (16,6 мг, 0,027 ммоль) и 4-карбокси-1-циклогексанметанола (смесь цис- и транс-изомеров, 5,11 мг, 0,032 ммоль) в дихлорметане (2 мл) добавляли EDC (6,20 мг, 0,032 ммоль) и HOBT (4,54 мг, 0,03 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем смесь разбавляли дихлорметаном и органический слой промывали водой и солевым раствором, затем высушивали над безводным сульфатом натрия. Твердое вещество фильтровали и фильтрат концентрировали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле с получением необходимого продукта в виде бесцветного масла (8,3 мг, выход 47%)
[748] Стадия 2. К раствору смеси цис-, транс-изомеров 4-(гидроксиметил)-N-(((2R,5S,6S)-6-((S,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2R,3R,4R)-3-метокси-4-((триэтилсилил)окси)пентан-2-ил)-2-метилоксиран-2-ил)-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-5-метилтетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)циклогексанкарбоксамида (21 мг, 0,032 ммоль) и DIPEA (0,028 мл, 0,158 ммоль) в дихлорметане (1 мл) при комнатной температуре порциями добавляли 4-нитрофенилкарбонилхлорид (12,75 мг, 0,063 ммоль) и DMAP (1,932 мг, 0,016 ммоль). Полученную смесь перемешивали при той же температуре в течение 16 часов. Затем добавляли 1-метилпиперазин (31,7 мг, 0,316 ммоль) и перемешивали в течение еще 1 часа. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органический слой промывали водой и солевым раствором, затем высушивали над Na2SO4. Твердое вещество фильтровали и фильтрат концентрировали до сухого состояния. Полученный остаток растворяли в 1,0 мл MeOH и 10 мг p-TsOH и перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили путем добавления 100 мкл DIPEA и затем растворитель удаляли in vacuo. Полученный остаток очищали с помощью хроматографии на NH-силикагеле (гептан/AcOEt = от 50/50 до 0/100) с получением H25 и H22.
1.8.1 Синтез H25
[749] H25 получали в виде бесцветного аморфного продукта (7,0 мг, выход 32,7%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 676,94 [M+H]+.
[750] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,68 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 1,10 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,17 (d, J=6,34 Гц, 4 H) 1,25 (s, 3 H) 1,47-1,62 (m, 11 H) 1,71 (s, 3 H) 1,80-1,86 (m, 4 H) 2,13 (s, 1 H) 2,27-2,36 (m, 10 H) 2,49-2,65 (m, 1 H) 2,99-3,12 (m, 1 H) 3,29 (d, J=10,20 Гц, 1 H) 3,32 (s, 4 H) 3,47 (br t, J=4,88 Гц, 4 H) 3,72-3,73 (m, 1 H) 3,73-3,74 (m, 1 H) 3,99 (d, J=6,83 Гц, 2 H) 4,21-4,36 (m, 1 H) 5,56-5,71 (m, 1 H) 5,92 (s, 1 H) 6,18-6,31 (m, 1 H).
1.8.2 Синтез H22
[751] H22 получали в виде бесцветного аморфного продукта (5,6 мг, выход 26,2%). LC/MS (ESI, масса/заряд), 676,89[M+H]+.
[752] 1H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ ppm 0,68 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,02 (d, J=6,83 Гц, 3 H) 1,10 (d, J=7,32 Гц, 3 H) 1,14 (d, J=6,34 Гц, 3 H) 1,17 (s, 3 H) 1,21-1,41 (m, 2 H) 1,49-1,55 (m, 5 H) 1,58-1,62 (m, 6 H) 1,70 (s, 3 H) 1,80-1,86 (m, 4 H) 2,26-2,30 (m, 4 H) 2,35 (br s, 4 H) 2,46-2,57 (m, 1 H) 2,89 (dd, J=3,66, 2,20 Гц, 1 H) 3,01-3,11 (m, 1 H) 3,27 (d, J=9,76 Гц, 1 H) 3,38 (s, 3 H) 3,47 (br t, J=4,88 Гц, 4 H) 3,53 (ddd, J=10,24, 6,83, 3,41 Гц, 1 H) 3,76 (d, J=5,37 Гц, 1 H) 3,89 (dd, J=6,34, 1,95 Гц, 1 H) 3,99 (d, J=7,32 Гц, 2 H) 5,68-5,77 (m, 1 H) 5,91 (d, J=11,22 Гц, 1 H) 6,18 (dd, J=14,88, 10,98 Гц, 1 H).
ПРИМЕР 2
[753] Проводили профилирование иллюстративных полезных нагрузок в виде модуляторов сплайсосомы на основе гербоксидиена, применяемых в получении ADC. Полезные нагрузки оценивали в отношении связывания с комплексом SF3b, in vitro активности в отношении сплайсинга и способности ингибировать рост клетки.
2.1 In Vitro сплайсинг (IVS)
[754] Для оценки активности полезной нагрузки в бесклеточной системе проводили анализ in vitro сплайсинга. Полезные нагрузки инкубировали c ядерными экстрактами и конструкцией на основе pre-mRNA в качестве субстрата и минигенов.
[755] Получение ядерного экстракта из HeLa: осадки, содержащие клетки HeLa S3, ресуспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ HEPES, pH 7,9, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0,2 мМ PMSF и 0,5 мМ DTT) и суспензию доводили до всего 5 объемов осажденных клеток (PCV). После центрифугирования супернатант отбрасывали и клетки доводили до 3 PCV с помощью гипотонического буфера и инкубировали на льду в течение 10 минут. Клетки лизировали с использованием гомогенизатора Даунса, а затем центрифугировали. Супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали с помощью ½ объема осажденных ядер (PNV) буфера с низким содержанием солей (20 мМ HEPES, pH 7,9, 1,5 мМ MgCl2, 20 мМ KCl, 0,2 мМ EDTA, 25% глицерина, 0,2 мМ PMSF, 0,5 мМ DTT), затем ½ PNV буфера с высоким содержанием солей (такой же, как буфер с низким содержанием солей, за исключением того, что использовали 1,4 М KCl). Ядра осторожно перемешивали в течение 30 мин. перед центрифугированием. Затем супернатант (ядерный экстракт) диализировали в буфер для хранения (20 мМ HEPES, pH 7,9, 100 мМ KCl, 0,2 мМ EDTA, 20% глицерина, 0,2 мМ PMSF, 0,5 мМ DTT). Концентрацию белка определяли с применением спектрофотометра NanoDrop 8000 UV-Vis (ThermoFisher Scientific).
[756] IVS: все последовательности, полученные из Ad2 (Pellizzoni et al. (1998) Cell 95(5):615-24), клонировали в вектор pcDNA3.1(+) (Promega) с использованием сайтов рестрикции на 5'-конце для EcoRI и 3'-конце для XbaI. Плазмиды линеаризовали с использованием XbaI и применяли в качестве ДНК-матриц в реакциях транскрипции in vitro. Плазмиду без интрона FtzΔi (Luo and Reed (1999) 96(26):14937-42) линеаризовали с использованием EcoRI. Все РНК транскрибировали in vitro и затем очищали с применением наборов MEGAScript T7 (Invitrogen) и MegaClear (Invitrogen) соответственно. Для реакций сплайсинга с использованием вариантов pre-mRNA Ad2 готовили 1 мкл реакционной смеси с использованием 8 мкг ядерных экстрактов, полученных из клеток HeLa S3, 2 нг pre-mRNA, 0,2 нг FTZΔi и варьируемых концентраций соединений или DMSO. После 15-мин. предварительной инкубации при 30°C добавляли 1 мкл буфера для активации сплайсинга (0,5 мМ ATP, 20 мМ креатинфосфата, 1,6 мМ MgCl2) и реакционные смеси инкубировали в течение 90 мин. при 30°C. Затем реакционные смеси гасили с использованием 13 мкл DMSO, и по 25 нл использовали для RT-qPCR. Реакционные смеси для RT-qPCR готовили с использованием 1-стадийного набора TaqMan RNA-to-CT (Life Technologies), РНК из реакций сплайсинга, наборов праймеры-зонд для mRNA Ad2 (прямой: ACTCTCTTCCGCATCGCTGT; обратный: CCGACGGGTTTCCGATCCAA; зонд: CTGTTGGGCTCGCGGTTG) и Ftz (прямой: TGGCATCAGATTGCAAAGAC; обратный: ACGCCGGGTGATGTATCTAT; зонд: CGAAACGCACCCGTCAGACG). Для аппроксимации данных по образованного сплайсированного продукта к кривой нелинейной регрессии применяли Prism 7 (Graphpad) и нормализовали относительно контрольного образца (DMSO).
[757] С учетом того, что все тестируемые полезные нагрузки специфически связываются с комплексом SF3b и демонстрируют аналогичные профили связывания, выдвинули гипотезу о том что все также должны модулировать сплайсинг в сопоставимой степени. Все полезные нагрузки в значительной степени модулировали сплайсинг pre-mRNA Ad2.2 (см. таблицу 13). В присутствии полезной нагрузки наблюдали уменьшение количества сплайсированного продукта.
2.2 Жизнеспособность клеток
[758] Линию HCC1954 (Американская коллекция типовых культур (ATCC)) из клеток протоковой карциномы молочной железы высевали при 2000 клеток/лунка в плоскодонные 96-луночные планшеты для культур тканей (Corning) при общем объеме 90 мкл среды для культур тканей, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (ThermoFisher Scientific). Клетки обрабатывали с использованием 3-кратного последовательного разведения соединения от 200 нМ до 0,03 нМ. Каждую концентрацию тестировали в трех повторностях. В момент времени обработки планшет с необработанными клетками оценивали с применением анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®2.0 Luminescent Cell Viability Assay в соответствии с рекомендациями изготовителя (Promega; № G9241). Реагент CellTiter-Glo® 2.0 добавляли в среду, инкубировали и проводили анализ на многоканальном ридере EnVision (PerkinElmer). Значения представлены с нулевым моментом времени (T0). Число жизнеспособных клеток через 144 часа (T144) обработки соединением также определяли с применением люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®2.0. Значение люминесценции в нулевой момент времени (T0), DMSO в качестве контроля роста (C) и рост в присутствии тестируемого соединения (T144) использовали для расчета роста в процентах для каждого из уровней концентрации соединения. Процент ингибирования роста рассчитывали как: [(T144-T0)/(C-T0)] x 100 - для концентраций, для которых T144>/=T0, или [(T144-T0)/T0] x 100 для концентраций, для которых T144<T0. Кривые зависимости доза-эффект строили на графике с применением Prism 7 (Graphpad) и аппроксимировали с использованием нелинейного регрессионного анализа и логарифма (ингибитор) в зависимости от ответа - переменного углового коэффициента (четыре параметра).
[759] Зависимость доза-ответ в отношении жизнеспособности клеток определяли для всех полезных нагрузок в клетках рака молочной железы HCC1954 с амплификацией HER2. Большая часть тестируемых полезных нагрузок демонстрировала значения GI50 (т.е. концентрацию соединения, которая вызывает 50% уменьшение пролиферации клеток) в низком наномолярном диапазоне (см. таблицу 13).
ПРИМЕР 3
[760] Иллюстративные соединения, представляющие собой полезные нагрузки, которые оценивали в примере 2, конъюгировали с иллюстративным антителом к HER2 (трастузумабом) посредством остатков цистеина на антителе. Получение и оценка иллюстративных ADC на основе антитела к HER2 описаны ниже.
3.1 Антитело
[761] Антитело трастузумаб (“AB185”) (Molina et al. (2001) Cancer Res. 61(12):4744-9) использовали для получения ADC на основе антитела к HER2 (также называемого в данном документе как SMLA).
3.2 Биоконъюгация
[762] Антитело (трастузумаб) при 10 мг/мл в буфере PBS (pH 7,0) смешивали с 5 мМ TCEP (2-4 молярные эквиваленты) (ThermoFisher Scientific; №77720) для расщепления межцепочечных дисульфидных связей. Реакционную смесь осторожно перемешивали при 22oC в течение 3 часов. Затем добавляли пропиленгликоль (15% объем/объем) с последующим добавлением 8 молярных эквивалентов конструкции линкер-полезная нагрузка (6 мМ исходный раствор в DMSO) и раствор тщательно перемешивали. Реакционную смесь помещали на вращающуюся подставку в термостате при 22oC. После 2-часовой конъюгации реакционную смесь очищали для удаления неконъюгированной полезной нагрузки с использованием AKTA GE M150 (колонки для обессоливания HiTrapTM 26/10; скорость потока: 3 мл/мин.) (GE Healthcare Bio-Sciences) в DPBS (pH 7,5). Полученный конъюгат концентрировали посредством ультрафильтрации через Amicon (30 кДа, Ultra-4) (EMD Millipore) и подвергали стерильной фильтрации через 0,22-мкм одноразовый фильтр из PVDF (EMD Millipore). Проводили оценку полученного прозрачного раствора посредством UV-VIS для определения концентрации антитела ([mAb]; моль/л) и концентрации конъюгированной полезной нагрузки ([LD]; моль/л) в соответствии с законом Бера-Ламберта (A=E*c*l) и согласно следующим уравнениям:
A280 нм=EmAb280 нм * [mAb] * l+ELD280 нм * [LD] * l
A252 нм=EmAb252 нм * [mAb] * l+ELD252 нм * [LD] * l
EmAb280 нм: трастузумаб=213,380 см-1M-1
EmAb252 нм: трастузумаб=79,112 см-1M-1
ELD280 нм=800 см-1M-1
ELD252 нм=31,000 см-1M-1
Аббревиатуры: c - молярная концентрация; l - оптическая длина пути (Nanodrop: 0,1 см); E - молярный коэффициент светопоглощения; A - абсорбция.
3.3 Определение биофизических характеристик
[763] Соотношение модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена и антитела (HAR), процент агрегации и процент неконъюгированной полезной нагрузки определяли для иллюстративных ADC на основе антитела к HER2 посредством жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS), эксклюзионной хроматографии (SEC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с обращенной фазой соответственно. В целом, конъюгаты содержат менее 2% лекарственного средства в свободной форме и содержат менее 10% агрегатов.
3.3.1 Анализ LC/MS - HAR
[764] Анализ LC/MS проводили с использованием системы Agilent 1290 UPLC, соединенной с времяпролетным масс-спектрометром Agilent G6224A Accurate Mass TOF. Конъюгат подвергали дегликозилированию с использованием PNGase F (New England Biolabs; № P0705L) в течение 4 часов при 37oC, денатурировали с использованием 8 М Gdn-HCl (Sigma; № G9284), а в завершении разделяли на домены легкой и тяжелой цепей с применением DTT (конечная концентрация 5 мМ) (Promega; № V3151). Полученный образец загружали в колонку Agilent PLRP-S (2,1×150 мм, 8 мкм) и элюировали в градиенте от 25% B до 50% B в течение 28 мин. при комнатной температуре (к. т.). Подвижная фаза A представляла собой воду с 0,05% TFA, подвижная фаза B представляла собой ацетонитрил с 0,04% TFA, при этом скорость потока составляла 1 мл/мин. HAR рассчитывали по масс-спектру после деконволюции с помощью взвешенных средних значений интенсивности пиков неконъюгированного и конъюгированного лекарственного средства для легкой цепи (L0 или L1) и тяжелой цепи (H0, H1, H2 и H3). Общее HAR для интактного конъюгата рассчитывали с применением уравнения: (HARLC* 2) + (HARHC*2) = общее HAR. Значения HAR для иллюстративных ADC на основе антитела к HER2 приведены в таблице 12.
3.3.2 Анализ SEC - агрегация
[765] Эксклюзионную хроматографию проводили с использованием колонки TOSON-G3000SWXL (№ 008541) в 0,2 М калия фосфате (pH 7) с 0,25 мМ калия хлоридом и 15% (объем/объем) IPA при скорости потока 0,75 мл/мин. Площадь пиков поглощения при 280 нм определяли для высокомолекулярных и мономерных компонентов конъюгата по интегрированию площади под кривой. Процентная доля мономеров для иллюстративных ADC на основе антитела к HER2 приведена в таблице 12.
3.3.3 Анализ HPLC - модулятор сплайсинга на основе гербоксидиена в свободной форме
[766] Конъюгат, представляющий интерес, осаждали с использованием 10 объемов ацетонитрила на льду в течение 2 часов и осаждали центрифугированием. Затем супернатанты, содержащие остаточную неконъюгированную полезную нагрузку, загружали в колонку Agilent Poroshell 120 SB-C18 120A (4,6×100 мм, 2,7 мкм) и элюировали в градиенте от 45% B до 70% B в течение 10 мин. при к. т.подвижная фаза A представляла собой 100% воды, подвижная фаза B представляла собой 100% ацетонитрила, и при этом скорость потока составляла 0,6 мл/мин. с обнаружением при 252 нм. Количество остаточного модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена в свободной форме определяли количественно посредством УФ-детекции, сравнивая с кривой внешнего стандарта для неконъюгированной конструкции линкер-полезная нагрузка. Процентная доля модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена в свободной форме для иллюстративных ADC на основе антитела к HER2 приведена в таблице 12.
3.4 Определение характеристики связывания
3.4.1 Определение посредством FACS характеристик связывания с положительными по мишени клетками
[767] Связывание неконъюгированного антитела к HER2 и ADC на основе антитела к HER2 с положительными по мишени клетками оценивали посредством проточной цитометрии с применением непрямой иммунофлуоресценции. Клетки JIMT1 (DSMZ), клеточной линии рака молочной железы, которые эндогенно экспрессируют HER2, высевали (5×104 клеток/лунка) в 96-луночный планшет с v-образным дном (Greiner Bio-One) и инкубировали в течение 2 часов при 4°C с тестируемыми соединениями, разбавленными до различных концентраций в среде для анализа (RPMI-1640, дополненной 10% (вес/объем) эмбрионального бычьего сывороточного альбумина (Thermo Fisher Scientific)). Затем клетки промывали с использованием PBS+2% FBS (буфер для FACS) и окрашивали фикоэритрин-меченным (PE) козьим антителом к иммуноглобулину G (IgG) (Invitrogen) в течение 40 мин. при 4°C в темноте. Клетки промывали холодным буфером для FACS и фиксировали с использованием буфера FluroFix (Biolegend) в течение 30 мин. при комнатной температуре. Фиксированные клетки отмывали с использованием буфера для FACS. Фиксированные клетки анализировали по среднему геометрическому интенсивности флуоресценции PE с применением проточного цитометра LSRFortessa (BD Bioscience). Трастузумаб и T-DM1 (DM1, конъюгированное с трастузумабом) включали в качестве контролей.
3.5 In vitro анализ
3.5.1 Жизнеспособность клеток
[768] ADC на основе антитела к HER2 тестировали на нескольких клеточных линиях с амплификацией HER2 в отношении их способности ингибировать рост клеток. Применяли клеточную линию HCC1954 (ATCC), (2000 клеток/лунка). Анализ жизнеспособности клеток проводили так, как это описано в разделе 2.3.
[769] Неожиданно, но не все ADC были активными на клетках HCC1954, несмотря на то, что они имеют сходные профили связывания (см. таблицу 13) и полезные нагрузки со сходными биохимическими свойствами. Например, ADC с линкером ADL2 были в меньшей мере способны к ингибированию роста клеток (например, сравнивая активность ADL1-H1 и ADL2-H1).
проникающей способности,
проник. A-B в отношении Caco-2 (10-6 см/с)
проникающей способности
стабильности,
стабильность, t1/2, pH 5,5 (дн.)
стабильности,
стабильность, %, pH 5,5, t24 ч. (%)
сред. геом.
GI50 (нМ),
скрининг HER2 SMLA,
HCC
1954.1
сред. геом.
LD50 (нМ),
скрининг HER2 SMLA,
HCC
1954.1
сред. геом.
IC50 (нМ),
SF3B1 (WT),
HE
LA.2
сред. геом.
IC50 (нМ),
Ad2.1,
HE
LA.2
сред. геом.
IC50 (нМ),
Ad2.2,
HE
LA.2
-ATS,
сред. геом.
GI50 (нМ),
72 ч.,
THP1.1
сред. геом.
LD50 (нМ),
72 ч.,
THP1.1
среднее значение
минимального ответа, %
72 ч.,
THP1.1
сред. геом.
GI50 (нМ),
72 ч.,
NCIH
1650.1
сред. геом.
LD50 (нМ),
72 ч.,
NCIH
1650.1
среднее значение
минимального ответа, %
72 ч.,
NCIH
1650.1
среднее значение
минимального ответа, %
72 ч.,
OPM2.1
н. о. = не определено
3.5.2 Проникающая способность ADC с полезной нагрузкой в отношении клеток Caco-2
[770] Клетки Caco-2 культивировали в течение 21 дня в 24-луночных планшетах со вставками Transwell при 37°C, 95% влажности, 5% CO2. Целостность клеточного монослоя подтверждали по TEER (трансэпителиальному электрическому сопротивлению) и с помощью красителя люцифер желтый. Полезные нагрузки вносили в двух повторностях при 10 мкм по отдельности с каждой стороны клеточного монослоя. Показатели проникающей способности от апикального к базолатеральному (A-B) направлению и от базолатерального к апикальному (B-A) направлению определяли посредством отбора аликвот из обеих камер сразу после обработки (t=0) и после инкубации в течение 2 часов. Образцы представляли собой белок, осажденный с органическим растворителем, содержащим внутренний стандарт, и их анализировали посредством LC-MS/MS (SCIEX; API 5500). Соотношение значений площади пика полезной нагрузки/внутреннего стандарта в зависимости от времени в обоих направлениях использовали для получения значений проникающей способности (см/сек.). Коэффициент эффлюкса рассчитывали путем деления B-A/A-B. Контрольные соединения для низких и высоких значений проникающей способности и эффлюкса проявляли свою функцию так, как и ожидалось. Значения проникающей способности приведены в таблице 12.
3.5.3 Химическая стабильность ADC с полезной нагрузкой
[771] Модуляторы сплайсинга на основе гербоксидиена инкубировали в буфере McIlvaine (цитратно-фосфатном), pH 5,5 (Boston Bioproducts; № BB-2466) с конечной концентрацией 20 мкМ (менее 0,5% DMSO из исходного раствора). Раствор модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена и внутреннего стандарта с помощью пипетки вносили в 96-луночные планшеты, проводили цикл UPLC (Waters Aquity H-класс) и анализировали по исходному хроматографическому сигналу (t=0). Колонка представляла собой колонку UPLC HSS T3, 1,8 мкм, 2,1×50 мм (№ 186003538). Градиент подвижной фазы A от 95% до 10% использовали в течение 1 мин., где A представляла собой 0,1% муравьиную кислоту в воде, а подвижная фаза B представляла собой 0,1% муравьиную кислоту в ацетонитриле (скорость потока 0,9 мл/мин.). Остальную часть раствора модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена во встряхивателе для планшетов при 37°C (Eppendorf ThermoMixer). Анализы образцов посредством UPLC повторяли в моменты времени 24, 72 и 96 часов после инкубации при 37°C. Соотношение значений площади пика для модулятора сплайсинга на основе гербоксидиена и внутреннего стандарта определяли для трех моментов времени: для момента времени 0, дня 1 и либо дня 3, либо дня 4. Момент времени 0 определяли как 100. Соотношение значений площади пика для более поздних моментов времени сравнивали с моментом времени 0. Процент оставшегося модулятора рассчитывали следующим образом: (соотношение значений площади пика в день X/соотношение значений площади пика в момент времени 0) * 100 = % оставшегося модулятора. Угловой коэффициент прямой рассчитывали в Excel, сравнивали с логарифмом % оставшегося модулятора и моментом времени. Значения времени полужизни рассчитывали в Excel с помощью натурального логарифма(2)/углового коэффициента, и они приведены в таблице 12.
ПРИМЕР 4
[772] Иллюстративные соединения, представляющие собой полезные нагрузки, оценивали как описано ниже.
4.1 In Vitro анализ
4.1.1 Жизнеспособность клеток
[773] Зависимость доза-ответ в отношении жизнеспособности клеток определяли для иллюстративных соединений, представляющих собой полезные нагрузки, в клетках рака молочной железы HCC1954 и клетках рака желудка NCI-N87 с амплификацией HER2.
[774] Клетки протоковой карциномы молочной железы HCC1954 (Американская коллекция типовых культур (ATCC)) или клетки карциномы желудка NCI-N87 (ATCC) высевали при 500 клеток/лунка в плоскодонные 384-луночные планшеты для культур тканей (Corning) при общем объеме 30 мкл среды для культур тканей, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (ThermoFisher Scientific). Клетки обрабатывали с использованием 4-кратного последовательного разведения соединения от 10000 нМ до 0,01 нМ. Каждую концентрацию тестировали в трех повторностях. В момент времени обработки планшет с необработанными клетками оценивали с применением люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® 2.0 в соответствии с рекомендациями изготовителя (Promega; № G9241). Реагент CellTiter-Glo® 2.0 добавляли в среду, инкубировали и проводили анализ на многоканальном ридере EnVision (PerkinElmer). Значения представлены с нулевым моментом времени (T0). Число жизнеспособных клеток через 72 (T72) или 144 часа (T144) после обработки соединением также определяли с применением люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®2.0. Значение люминесценции в нулевой момент времени (T0), DMSO в качестве контроля роста (C) и рост в присутствии тестируемого соединения (T72 или T144) использовали для расчета роста в процентах для каждого из уровней концентрации соединения. Процент ингибирования роста рассчитывали как (например): [(T144-T0)/(C-T0)] x 100 - для концентраций, для которых T144>/=T0, или [(T144-T0)/T0] x 100 для концентраций, для которых T144<T0. Кривые зависимости доза-эффект строили на графике с применением Prism 8 (Graphpad) и аппроксимировали с использованием нелинейного регрессионного анализа и логарифма (ингибитор) в зависимости от ответа - переменного углового коэффициента (четыре параметра).
[775] На фиг. 1A-1D показаны дозозависимые эффекты иллюстративных соединений, представляющих собой полезные нагрузки, в отношении жизнеспособности клеток рака молочной железы (HCC1954) и клеток рака желудка (NCI-N87) с амплификацией HER2. На фиг. 1A показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток HCC1954 после 72-часовой инкубации. На фиг. 1B показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток NCI-N87 после 72-часовой инкубации. На фиг. 1C показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток HCC1954 после 144-часовой инкубации. На фиг. 1D показан дозозависимый эффект в отношении жизнеспособности клеток NCI-N87 после 144-часовой инкубации. В таблице 14 показаны значения GI50, LD50 и Rmin для всех тестируемых соединений.
4.1.2 PD-анализ сплайсинга в клетке
[776] Сплайсинг зрелого транскрипта SLC25A19 также исследовали в клетках HCC1954 и NCI-N87, обработанных иллюстративными соединениями, представляющими собой полезную нагрузку, в возрастающих концентрациях.
[777] Клетки HCC1954 или NCI-N87 (ATCC) высевали в среде RPMI+10%FBS (ATCC) при 1000 клеток на лунку в количестве 20 мкл на лунку. Клетки обрабатывали соединениями дозозависимым образом в 4-кратном разведении. Через 6 часов клетки промывали с помощью PBS и лизировали с использованием 30 мкл буфера CL (IgePal CA-630, 5 М NaCl, 1 М трис-HCl 1 М, pH 7,4 в воде), содержащего 25 мкл/мл RNasin® (Promega), и инкубировали в течение 20 мин. при к. т. на встряхивателе-качалке. Полученную смесь (1 мкл) использовали для оценки модуляции сплайсинга в ПЦР-реакции с обратной транскрипцией, используя Taqman Fast Virus 1-Step MasterMix (Applied Biosystems) и следующие праймеры Taqman в соответствии с рекомендациями изготовителя: SLC25A19 (Invitrogen, Hs00222265_m1); RPLPO (Invitrogen, Hs99999902_m1).
[778] На фиг. 2A и фиг. 2B показаны результаты анализа сплайсинга в клетках рака молочной железы (HCC1954) (фиг. 2A) и клетках рака желудка (NCI-N87) с амплификацией HER2 (фиг. 2B). В таблице 14 показаны значения IC50 для всех тестируемых соединений.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD.
<120> КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, СОДЕРЖАЩИЕ
МОДУЛЯТОР СПЛАЙСИНГА НА ОСНОВЕ ГЕРБОКСИДИЕНА,И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 12636.0011-00304
<140> PCT/US2019/066029
<141> 2019-12-12
<150> 62/941,220
<151> 2019-11-27
<150> 62/779,406
<151> 2018-12-13
<150> 62/779,400
<151> 2018-12-13
<160> 113
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 2
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 3
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 5
Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 6
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 7
Asn Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 8
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 8
Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 9
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 9
Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 10
Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 11
Thr Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 12
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg Thr
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 13
His Tyr Met Met Ala
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 14
Arg Ile Gly Pro Ser Gly Gly Pro Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 15
Tyr Asp Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Phe Gln His
<210> 16
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 16
Arg Ala Ser Trp Ser Ile Ser Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 17
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 18
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg Thr
1 5
<210> 19
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105
<210> 21
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala
50 55 60
Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp
85 90 95
Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 128
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Met Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Gly Pro Ser Gly Gly Pro Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asp Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Val Ala Gly Pro Ala
100 105 110
Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 451
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 26
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 441
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala
50 55 60
Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp
85 90 95
Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
435 440
<210> 28
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 29
<211> 457
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Met Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Gly Pro Ser Gly Gly Pro Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asp Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Val Ala Gly Pro Ala
100 105 110
Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 30
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 1255
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1100 1105 1110
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1205 1210 1215
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 32
<211> 310
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 32
Met Arg Arg Ala Ala Leu Trp Leu Trp Leu Cys Ala Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gln Pro Ala Leu Pro Gln Ile Val Ala Thr Asn Leu Pro Pro Glu
20 25 30
Asp Gln Asp Gly Ser Gly Asp Asp Ser Asp Asn Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Gln Gln Thr Pro Ser Thr
50 55 60
Trp Lys Asp Thr Gln Leu Leu Thr Ala Ile Pro Thr Ser Pro Glu Pro
65 70 75 80
Thr Gly Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ser Thr Ser Thr Leu Pro Ala Gly
85 90 95
Glu Gly Pro Lys Glu Gly Glu Ala Val Val Leu Pro Glu Val Glu Pro
100 105 110
Gly Leu Thr Ala Arg Glu Gln Glu Ala Thr Pro Arg Pro Arg Glu Thr
115 120 125
Thr Gln Leu Pro Thr Thr His Leu Ala Ser Thr Thr Thr Ala Thr Thr
130 135 140
Ala Gln Glu Pro Ala Thr Ser His Pro His Arg Asp Met Gln Pro Gly
145 150 155 160
His His Glu Thr Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ser Gln Ala Asp Leu His
165 170 175
Thr Pro His Thr Glu Asp Gly Gly Pro Ser Ala Thr Glu Arg Ala Ala
180 185 190
Glu Asp Gly Ala Ser Ser Gln Leu Pro Ala Ala Glu Gly Ser Gly Glu
195 200 205
Gln Asp Phe Thr Phe Glu Thr Ser Gly Glu Asn Thr Ala Val Val Ala
210 215 220
Val Glu Pro Asp Arg Arg Asn Gln Ser Pro Val Asp Gln Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ser Gln Gly Leu Leu Asp Arg Lys Glu Val Leu Gly Gly Val
245 250 255
Ile Ala Gly Gly Leu Val Gly Leu Ile Phe Ala Val Cys Leu Val Gly
260 265 270
Phe Met Leu Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Ser Leu
275 280 285
Glu Glu Pro Lys Gln Ala Asn Gly Gly Ala Tyr Gln Lys Pro Thr Lys
290 295 300
Gln Glu Glu Phe Tyr Ala
305 310
<210> 33
<211> 976
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 33
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
20 25 30
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
35 40 45
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
50 55 60
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65 70 75 80
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
85 90 95
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
115 120 125
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
130 135 140
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145 150 155 160
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
165 170 175
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
180 185 190
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
195 200 205
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
210 215 220
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225 230 235 240
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245 250 255
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
260 265 270
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
275 280 285
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
290 295 300
Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro
305 310 315 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr
325 330 335
Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln
340 345 350
Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln
355 360 365
Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg
370 375 380
Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn
405 410 415
Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val
420 425 430
Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser
435 440 445
Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser
450 455 460
Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn
465 470 475 480
Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp
485 490 495
Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln
500 505 510
Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser
515 520 525
Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly
530 535 540
Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg
545 550 555 560
Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe
565 570 575
Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
580 585 590
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
595 600 605
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
610 615 620
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
625 630 635 640
Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
645 650 655
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
660 665 670
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
675 680 685
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
690 695 700
Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
705 710 715 720
Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
725 730 735
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
740 745 750
Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
755 760 765
Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr
770 775 780
Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val
785 790 795 800
Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
805 810 815
Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp
820 825 830
Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
835 840 845
Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
850 855 860
Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865 870 875 880
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
885 890 895
Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp
900 905 910
Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala
915 920 925
Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile
930 935 940
Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr
945 950 955 960
Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
965 970 975
<210> 34
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 34
Gly Phe Gly Gly
1
<210> 35
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 35
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 36
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 36
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 37
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 37
Ser Pro Thr Leu Pro Pro Arg Ser Leu
1 5
<210> 38
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 38
His Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Ser Ser Leu
1 5 10
<210> 39
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 39
Leu Leu Leu Pro His His Val Leu
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 40
Arg Thr Ala Pro Gly Val Arg Pro Pro Phe
1 5 10
<210> 41
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 41
Arg Pro Gln Lys Ser Ile Gln Ala Leu
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 42
Ala Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Ala
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 43
Arg Pro Arg Pro Ser Phe Pro Val Ser Leu
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 44
Arg Pro Lys His Gly Asp Gly Phe Ser Leu
1 5 10
<210> 45
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 45
Gly Pro Ala Pro Gly Lys Thr Gly Leu
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 46
Glu Ala Ala Arg Lys Gly Asn Ser Leu
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 47
Arg Ile Lys Glu Lys Ile Glu Glu Leu
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 48
Glu Ile Lys Lys Arg Phe Arg Gln Phe
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 49
His Glu Ser Ala Ala Met Ala Glu Thr
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 50
Ala Leu Lys Leu Lys Gln Val Gly Val
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 51
Asp Leu Lys Lys Arg His Ile Thr Phe
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 52
Asp Val Lys Arg Asn Asp Ile Ala Met
1 5
<210> 53
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 53
Ile Pro Ser Asp His Ile Leu Thr Pro Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 54
Thr Val Phe Ser Thr Ser Ser Leu Lys
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 55
Ile Thr Ser Cys Leu Leu Asn Phe
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 56
Arg Ala Ser Pro Val Arg Gly Gln Leu
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 57
Val Val Arg Lys Pro Val Ile Ala Leu
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 58
Leu Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ile Ser
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 59
Ala Pro Ala Ser Lys Pro Arg Pro Arg Leu
1 5 10
<210> 60
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 60
Arg Tyr Gly Gln Leu Ser Glu Lys Phe
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 61
Val Tyr Ile Ser Asn Val Ser Lys Leu
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 62
Leu Pro Thr Lys Glu Thr Pro Ser Phe
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 63
Gly Glu Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 64
Leu Glu Glu Ile Ser Lys Gln Glu Ile
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 65
Ile Tyr Asn His Ile Thr Val Lys Ile
1 5
<210> 66
<211> 160
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 66
Val Asp Leu Glu Pro Thr Val Ile Gly Glu Leu Thr Ser Val Thr Gln
1 5 10 15
Val Arg Ser Gln Gly Ala Gly Thr Gly Gly Leu Ser Trp Gly Gly Ser
20 25 30
Ala Gly His Ser Pro Thr Leu Pro Pro Arg Ser Leu Ser Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Pro His His Val Leu Gln Met Lys Phe Ala Leu Ala Leu Thr Ala
50 55 60
Ser Ser Ser Thr Leu Ser Asn Ser Ser Gln Ala Arg Lys Met Leu Pro
65 70 75 80
Ile Thr Met Pro Glu Gly Thr Thr Pro Leu Ala Arg Arg Ser Leu Thr
85 90 95
Ser Cys Trp Thr Glu Phe Ala Ser Trp Leu Thr Ser Ala Pro Val Phe
100 105 110
Arg Ala Ser Trp Phe Ser Thr Ala Leu Val Gly Glu Leu Val Leu Gly
115 120 125
Ser Pro Arg Cys Ser Trp Asn Val Ser Gln Leu Ile Met Ala Arg Ser
130 135 140
Pro Ser Trp Ser Ser Pro Phe Thr Arg Arg Pro Arg Phe Pro Gln Leu
145 150 155 160
<210> 67
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 67
Ala Pro Pro Arg Ser His Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Ser Ser Leu
1 5 10 15
<210> 68
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 68
Met Val Arg Arg Ala Arg Trp Pro Gly Gly Arg Gly Glu Ala Arg Lys
1 5 10 15
Ala Pro Arg Thr Ala Pro Gly Val Arg Pro Pro Phe
20 25
<210> 69
<211> 199
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 69
Trp Val Asn Cys Leu Phe Val Ser Gly Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Val Pro Pro Tyr Leu Glu Leu Ala Gly Pro Pro Phe
20 25 30
Leu Leu Leu Thr Leu Ile Arg Ile Gly Leu Gly Arg Arg Ser Gly Arg
35 40 45
Ala Gly Gly Arg Ala Gly Thr Gln Cys Gly Gly Glu Arg Gly Pro Gly
50 55 60
Phe Ala Ala Phe Arg Pro Leu Arg Pro Phe Arg Arg Leu Arg Val Cys
65 70 75 80
Ala Val Cys Val Arg Gly Ser Ala Leu Gly Arg Ser Val Gly Leu Pro
85 90 95
Arg Gly Gly Ala Ala Gly Ala Pro Phe Ser Ser Ser Pro Ala Pro His
100 105 110
Pro Arg Arg Val Leu Cys Arg Cys Leu Leu Phe Leu Phe Phe Ser Cys
115 120 125
His Asp Arg Arg Gly Asp Ser Gln Pro Tyr Gln Val Pro Ala Glu Ala
130 135 140
Gly Val Glu Gly Leu Glu Gly Ala Gly Gly Gly Arg Glu Gly Leu Leu
145 150 155 160
Leu Glu Arg Arg Pro Gln Lys Ser Ile Gln Ala Leu Arg Cys Asn Thr
165 170 175
Ser Glu Thr Ser Thr Ala Asp Pro Leu Lys Ile Pro Gly Leu Val Pro
180 185 190
Leu Ala Leu Ser Ser Lys Val
195
<210> 70
<211> 101
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 70
Met Pro Leu Pro Val Gln Val Phe Asn Leu Gln Val Thr Ser Arg Gly
1 5 10 15
Arg Pro Gly Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro Arg His Trp Gly Arg Ala
20 25 30
Glu Val Glu Gln Gly Arg Gly Ala Cys Ala Arg Ser Arg Ser Gly Thr
35 40 45
Leu Arg Ala Gly Pro Pro Arg Ala Ala Arg Val Gly Gly Cys Arg Ala
50 55 60
Glu Gly Ala Ser Pro Pro Trp Leu Arg Ala Ala Ile Gly Gly Arg Arg
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Ala Ala His Gly Arg Gly Ser
85 90 95
Arg Pro Pro Arg Arg
100
<210> 71
<211> 162
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 71
Gln Pro Ala Gln Pro Arg Thr Gly Ala Pro Ala Arg Arg Pro Arg Pro
1 5 10 15
Arg Pro Ser Phe Pro Val Ser Leu Arg Ser Ala Ala Pro Pro Thr Gly
20 25 30
Thr Ala Gly Gly Thr Gly Arg Phe Val Leu Arg Pro Gly Glu Ser Gly
35 40 45
Ala Gly Gly Gly Gly Asp Ala Trp Asp Thr Gly Leu Gln Ala Arg Arg
50 55 60
Gly Thr Ala Ala Gly Thr Ser Gly Ala Pro Asn Arg Ser Gln Leu Ser
65 70 75 80
Ser Leu Thr Phe Pro Ala Gln Leu Arg Arg Ile Gly Val Ser Gly Arg
85 90 95
Lys Pro Gly Ala Gly Gly Arg Leu Gly Pro Gly Ser Arg Thr Cys Ala
100 105 110
Pro Arg Cys Leu Pro Arg Ala Arg Arg Gly Pro Gly Ala His Pro Arg
115 120 125
Gly Gly Arg Cys Pro Pro Ala Glu Thr Ala Leu Phe Arg Glu Ala Glu
130 135 140
Glu Gly Thr Gln Lys Tyr Ser Leu Pro Ser Asp Pro Ala Gly Gln Ala
145 150 155 160
Ala Phe
<210> 72
<211> 39
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 72
Phe Arg Leu His Thr Gly Pro Val Ser Pro Val Gly Gly Arg Arg Gln
1 5 10 15
Met Gly Arg Pro Lys His Gly Asp Gly Phe Ser Leu Gln Val Cys Ser
20 25 30
Phe Ile Met Glu Gln Asn Gly
35
<210> 73
<211> 71
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 73
Gly Val Val Glu Ile Thr Gly Glu Pro Pro Cys Ser Cys Arg Gly Glu
1 5 10 15
Glu Glu Ala Ser Arg Ala Gly Arg Ala Gly Gly Val Arg Leu Lys Arg
20 25 30
Gly Ser Arg Gly Pro Gly Glu Leu Asn Val Gly Pro Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Thr Gly Leu Leu Ile Pro Leu Leu Arg Asn Trp Glu Cys Gly Ser Leu
50 55 60
Leu Arg Ala Leu Ser Ala Leu
65 70
<210> 74
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 74
Lys Met Gly Phe Pro Glu Ala Ala Arg Lys Gly Asn Ser Leu
1 5 10
<210> 75
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 75
Leu Glu Ala Arg Ile Lys Glu Lys Ile Glu Glu Leu Gln Gln Ala Leu
1 5 10 15
Ile
<210> 76
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 76
Glu Ile Lys Lys Arg Phe Arg Gln Phe Lys Gln Ala Val Tyr Lys Gln
1 5 10 15
<210> 77
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 77
Ala His Glu Ser Ala Ala Met Ala Glu Thr Leu Gln His Val Pro Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 78
Asn Arg Pro Ser Val Gln Ala Ala Leu Lys Leu Lys Gln Val Gly Val
1 5 10 15
<210> 79
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 79
Lys Thr Asp Asp Leu Lys Lys Arg His Ile Thr Phe Thr Leu Gly Cys
1 5 10 15
Gly Ile Cys
<210> 80
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 80
Met Lys Leu Asp Glu Asp Val Lys Arg Asn Asp Ile Ala Met Ala Ile
1 5 10 15
<210> 81
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 81
Asn Ser Ile Ser Gln Ile Pro Ser Asp His Ile Leu Thr Pro Ala Leu
1 5 10 15
Phe Ile Thr Phe Met Thr Ile Leu Asp Leu
20 25
<210> 82
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 82
Thr Val Phe Ser Thr Ser Ser Leu Lys Leu Asn Gln Pro Gln Lys Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Met Lys Ser Trp Pro Cys
20
<210> 83
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 83
Ala Glu Glu Asp Arg Arg Lys Lys Val Ile Thr Ser Cys Leu Leu Asn
1 5 10 15
Phe Asn Leu Ser Lys Ala Gln Ser
20
<210> 84
<211> 34
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 84
Arg Ser Phe Ser Thr Ser Ala Gln Val Gly Gln Thr Arg Gly Gly Leu
1 5 10 15
Gln Ala Glu Ala Pro Arg Pro Gly Pro Arg Ala Ser Pro Val Arg Gly
20 25 30
Gln Leu
<210> 85
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 85
Arg Gly Tyr Val Val Arg Lys Pro Val Ile Ala Leu Ser Val Lys Ile
1 5 10 15
<210> 86
<211> 86
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 86
Val Asp Met Asp Phe Gly Thr Gly Gly Gln Gly Ala Gly Pro Val Gly
1 5 10 15
Arg Gly Lys Asp Trp Ser Cys Thr Leu Ala Val His Leu Leu Ser Glu
20 25 30
Lys Lys Lys Ile Ser Phe Ser Gln Ile Asp Arg Ala Trp Gly Gly Ser
35 40 45
Gln Gly Thr Val Leu Asp Lys Trp Gly Pro Gly Val Val Ser Glu Leu
50 55 60
His Pro Ser Ala Lys Glu Val Ser Val Gly Arg Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Leu Met Thr Trp Ala Ser
85
<210> 87
<211> 66
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 87
Glu Lys Gly Ser His Glu Glu Glu Val Arg Val Pro Ala Leu Ser Trp
1 5 10 15
Gly Arg Pro Arg Ala Pro Ala Pro Ala Ser Lys Pro Arg Pro Arg Leu
20 25 30
Asp Leu Asn Cys Leu Trp Leu Arg Pro Gln Pro Ile Phe Leu Trp Lys
35 40 45
Leu Arg Pro Arg Pro Val Pro Ala Ala Thr Pro Leu Thr Gly Pro Leu
50 55 60
Pro Leu
65
<210> 88
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 88
Arg Tyr Gly Gln Leu Ser Glu Lys Phe Asn Arg Arg Lys Val Met Asp
1 5 10 15
Ser
<210> 89
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 89
Met Val Tyr Ile Ser Asn Val Ser Lys Leu Cys Phe Ser Lys Met
1 5 10 15
<210> 90
<211> 48
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 90
Asn Thr Leu Pro Thr Lys Glu Thr Pro Ser Phe Leu Leu Asn Pro His
1 5 10 15
Thr Ser Trp Val Pro Arg Pro His Arg Glu Ala Pro Arg Leu Arg Val
20 25 30
Gly Val Ala Ala Pro Leu Gln Arg Pro Leu Pro Ala Leu His Ser His
35 40 45
<210> 91
<211> 58
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
полипептид"
<400> 91
Phe Gly Asp Ile Tyr Leu Gly Glu Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Cys Gly Cys Gln Asp Gln Ala Arg Ser Arg Lys
20 25 30
Glu Val Val Ala Pro Ala Gly Ser Pro Arg Lys Ser Arg His Arg Arg
35 40 45
Ile Val Ala Arg Thr Gln Arg Pro Leu Gly
50 55
<210> 92
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 92
Gly Ser Ala Ser Asp Leu Leu Glu Glu Ile Ser Lys Gln Glu Ile Ser
1 5 10 15
Phe
<210> 93
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
пептид"
<400> 93
Gln Leu Ile Tyr Asn His Ile Thr Val Lys Ile Asn Leu Gln Gly Asp
1 5 10 15
<210> 94
<211> 630
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 94
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln
20 25 30
Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu
35 40 45
Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu
65 70 75 80
Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu
85 90 95
Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro
100 105 110
Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro
115 120 125
Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile
130 135 140
Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu
165 170 175
Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu
180 185 190
Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu
195 200 205
Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg
210 215 220
Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp
225 230 235 240
Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly
245 250 255
Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg
260 265 270
Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile
275 280 285
Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser
290 295 300
Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys
305 310 315 320
Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met
325 330 335
Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu
340 345 350
Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val
355 360 365
Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu
385 390 395 400
Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Ala Pro Arg Arg Pro Leu
405 410 415
Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln
420 425 430
Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr
435 440 445
Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser
450 455 460
Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln
465 470 475 480
Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn
485 490 495
Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro
500 505 510
Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu
515 520 525
Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val
530 535 540
Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala
545 550 555 560
Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln
565 570 575
Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn
580 585 590
Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr
595 600 605
Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
610 615 620
Leu Ala Ser Thr Leu Ala
625 630
<210> 95
<211> 750
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 95
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 96
<211> 790
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 96
Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro
1 5 10 15
Tyr Pro Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro
20 25 30
Ala Lys Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu
35 40 45
Asn Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu
50 55 60
Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly
85 90 95
Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala
100 105 110
Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala
115 120 125
Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr
145 150 155 160
Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly Thr
165 170 175
Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly
180 185 190
Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe
195 200 205
Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met
210 215 220
Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp
225 230 235 240
Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile
245 250 255
Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr
260 265 270
Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly
275 280 285
Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu
290 295 300
Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe Asp Val Ile Thr
305 310 315 320
Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp
325 330 335
Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro
340 345 350
Tyr Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala
355 360 365
Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser
370 375 380
Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn Thr
385 390 395 400
Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro
405 410 415
Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn
420 425 430
Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg
435 440 445
Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn
450 455 460
Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp
465 470 475 480
Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val
485 490 495
Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu His Ala Val
500 505 510
Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala
515 520 525
Pro Glu Ala Ala Ser Gly Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp
530 535 540
Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu
545 550 555 560
Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro
565 570 575
Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp
580 585 590
His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro
595 600 605
Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val
610 615 620
Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg
625 630 635 640
Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile
645 650 655
Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe
660 665 670
Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Glu Ala Ile Glu Asp Asn Lys Leu
675 680 685
Arg Arg Asp Ile Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro
690 695 700
Thr Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Asn Gln Arg Leu
705 710 715 720
Lys Glu Asn Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala
725 730 735
Thr Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser
740 745 750
Leu Glu Ser Val Thr Thr Asp Ala Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Ser
755 760 765
Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Val
770 775 780
Asp Ser Asp Lys Asp Ser
785 790
<210> 97
<211> 702
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 97
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
195 200 205
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
210 215 220
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn
545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe
645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile
660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
690 695 700
<210> 98
<211> 223
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 98
Met Thr Trp Arg His His Val Arg Leu Leu Phe Thr Val Ser Leu Ala
1 5 10 15
Leu Gln Ile Ile Asn Leu Gly Asn Ser Tyr Gln Arg Glu Lys His Asn
20 25 30
Gly Gly Arg Glu Glu Val Thr Lys Val Ala Thr Gln Lys His Arg Gln
35 40 45
Ser Pro Leu Asn Trp Thr Ser Ser His Phe Gly Glu Val Thr Gly Ser
50 55 60
Ala Glu Gly Trp Gly Pro Glu Glu Pro Leu Pro Tyr Ser Trp Ala Phe
65 70 75 80
Gly Glu Gly Ala Ser Ala Arg Pro Arg Cys Cys Arg Asn Gly Gly Thr
85 90 95
Cys Val Leu Gly Ser Phe Cys Val Cys Pro Ala His Phe Thr Gly Arg
100 105 110
Tyr Cys Glu His Asp Gln Arg Arg Ser Glu Cys Gly Ala Leu Glu His
115 120 125
Gly Ala Trp Thr Leu Arg Ala Cys His Leu Cys Arg Cys Ile Phe Gly
130 135 140
Ala Leu His Cys Leu Pro Leu Gln Thr Pro Asp Arg Cys Asp Pro Lys
145 150 155 160
Asp Phe Leu Ala Ser His Ala His Gly Pro Ser Ala Gly Gly Ala Pro
165 170 175
Ser Leu Leu Leu Leu Leu Pro Cys Ala Leu Leu His Arg Leu Leu Arg
180 185 190
Pro Asp Ala Pro Ala His Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Val Leu Gln
195 200 205
Arg Glu Arg Arg Pro Cys Gly Arg Pro Gly Leu Gly His Arg Leu
210 215 220
<210> 99
<211> 875
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 99
Met Glu Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Glu Gln Pro Val Lys Lys Asn
1 5 10 15
Thr Leu Lys Lys Tyr Lys Ile Ala Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Val Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu
35 40 45
Glu Lys Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Asn Cys Arg Cys Asp Val Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp
65 70 75 80
Cys Cys Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Val Glu Ser Thr Arg Ile Trp
85 90 95
Met Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Arg Lys Asp Cys Cys Ala Asp
115 120 125
Tyr Lys Ser Val Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys
130 135 140
Asp Thr Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro
145 150 155 160
Val Ile Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr
165 170 175
Trp Asp Thr Leu Met Pro Asn Ile Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly Ile
180 185 190
His Ser Lys Tyr Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn
195 200 205
His Tyr Thr Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile
210 215 220
Asp Asn Asn Met Tyr Asp Val Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser
225 230 235 240
Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp
245 250 255
Leu Thr Ala Met Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro
260 265 270
Gly Ser Glu Val Ala Ile Asn Gly Ser Phe Pro Ser Ile Tyr Met Pro
275 280 285
Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Ser Thr Leu Leu Lys
290 295 300
Trp Leu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr
305 310 315 320
Phe Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Val Ser Ala
325 330 335
Arg Val Ile Lys Ala Leu Gln Val Val Asp His Ala Phe Gly Met Leu
340 345 350
Met Glu Gly Leu Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Val Asn Ile Ile
355 360 365
Leu Leu Ala Asp His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu
370 375 380
Tyr Met Thr Asp Tyr Phe Pro Arg Ile Asn Phe Phe Tyr Met Tyr Glu
385 390 395 400
Gly Pro Ala Pro Arg Ile Arg Ala His Asn Ile Pro His Asp Phe Phe
405 410 415
Ser Phe Asn Ser Glu Glu Ile Val Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys Pro
420 425 430
Asp Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Thr Pro Asp Leu Pro Lys Arg Leu
435 440 445
His Tyr Ala Lys Asn Val Arg Ile Asp Lys Val His Leu Phe Val Asp
450 455 460
Gln Gln Trp Leu Ala Val Arg Ser Lys Ser Asn Thr Asn Cys Gly Gly
465 470 475 480
Gly Asn His Gly Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala Ile Phe
485 490 495
Leu Ala His Gly Pro Ser Phe Lys Glu Lys Thr Glu Val Glu Pro Phe
500 505 510
Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Arg Ile Gln
515 520 525
Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys
530 535 540
Val Pro Phe Tyr Glu Pro Ser His Ala Glu Glu Val Ser Lys Phe Ser
545 550 555 560
Val Cys Gly Phe Ala Asn Pro Leu Pro Thr Glu Ser Leu Asp Cys Phe
565 570 575
Cys Pro His Leu Gln Asn Ser Thr Gln Leu Glu Gln Val Asn Gln Met
580 585 590
Leu Asn Leu Thr Gln Glu Glu Ile Thr Ala Thr Val Lys Val Asn Leu
595 600 605
Pro Phe Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Asn Val Asp His Cys Leu
610 615 620
Leu Tyr His Arg Glu Tyr Val Ser Gly Phe Gly Lys Ala Met Arg Met
625 630 635 640
Pro Met Trp Ser Ser Tyr Thr Val Pro Gln Leu Gly Asp Thr Ser Pro
645 650 655
Leu Pro Pro Thr Val Pro Asp Cys Leu Arg Ala Asp Val Arg Val Pro
660 665 670
Pro Ser Glu Ser Gln Lys Cys Ser Phe Tyr Leu Ala Asp Lys Asn Ile
675 680 685
Thr His Gly Phe Leu Tyr Pro Pro Ala Ser Asn Arg Thr Ser Asp Ser
690 695 700
Gln Tyr Asp Ala Leu Ile Thr Ser Asn Leu Val Pro Met Tyr Glu Glu
705 710 715 720
Phe Arg Lys Met Trp Asp Tyr Phe His Ser Val Leu Leu Ile Lys His
725 730 735
Ala Thr Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Ile Phe Asp
740 745 750
Tyr Asn Tyr Asp Gly His Phe Asp Ala Pro Asp Glu Ile Thr Lys His
755 760 765
Leu Ala Asn Thr Asp Val Pro Ile Pro Thr His Tyr Phe Val Val Leu
770 775 780
Thr Ser Cys Lys Asn Lys Ser His Thr Pro Glu Asn Cys Pro Gly Trp
785 790 795 800
Leu Asp Val Leu Pro Phe Ile Ile Pro His Arg Pro Thr Asn Val Glu
805 810 815
Ser Cys Pro Glu Gly Lys Pro Glu Ala Leu Trp Val Glu Glu Arg Phe
820 825 830
Thr Ala His Ile Ala Arg Val Arg Asp Val Glu Leu Leu Thr Gly Leu
835 840 845
Asp Phe Tyr Gln Asp Lys Val Gln Pro Val Ser Glu Ile Leu Gln Leu
850 855 860
Lys Thr Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Thr Thr Ile
865 870 875
<210> 100
<211> 257
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 100
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu
20 25 30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly
35 40 45
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala
50 55 60
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
85 90 95
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
130 135 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
165 170 175
Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180 185 190
Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210 215 220
Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
225 230 235 240
Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu
245 250 255
Ser
<210> 101
<211> 364
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 101
Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val
20 25 30
Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn
35 40 45
Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr
50 55 60
Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala
85 90 95
Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp
100 105 110
Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys
115 120 125
Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val
130 135 140
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Met Thr Thr
145 150 155 160
Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr
165 170 175
Thr Val Leu Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr
180 185 190
Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val
195 200 205
Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn His Glu Pro
210 215 220
Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr
225 230 235 240
Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr
245 250 255
Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly
260 265 270
Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu
275 280 285
Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Ile Tyr Ala Gly Val Cys Ile Ser Val
290 295 300
Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val Ile Ile Ala Lys Lys Tyr Phe
305 310 315 320
Phe Lys Lys Glu Val Gln Gln Leu Ser Val Ser Phe Ser Ser Leu Gln
325 330 335
Ile Lys Ala Leu Gln Asn Ala Val Glu Lys Glu Val Gln Ala Glu Asp
340 345 350
Asn Ile Tyr Ile Glu Asn Ser Leu Tyr Ala Thr Asp
355 360
<210> 102
<211> 976
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 102
Met Arg Gly Ala Arg Gly Ala Trp Asp Phe Leu Cys Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Arg Val Gln Thr Gly Ser Ser Gln Pro Ser Val Ser Pro Gly
20 25 30
Glu Pro Ser Pro Pro Ser Ile His Pro Gly Lys Ser Asp Leu Ile Val
35 40 45
Arg Val Gly Asp Glu Ile Arg Leu Leu Cys Thr Asp Pro Gly Phe Val
50 55 60
Lys Trp Thr Phe Glu Ile Leu Asp Glu Thr Asn Glu Asn Lys Gln Asn
65 70 75 80
Glu Trp Ile Thr Glu Lys Ala Glu Ala Thr Asn Thr Gly Lys Tyr Thr
85 90 95
Cys Thr Asn Lys His Gly Leu Ser Asn Ser Ile Tyr Val Phe Val Arg
100 105 110
Asp Pro Ala Lys Leu Phe Leu Val Asp Arg Ser Leu Tyr Gly Lys Glu
115 120 125
Asp Asn Asp Thr Leu Val Arg Cys Pro Leu Thr Asp Pro Glu Val Thr
130 135 140
Asn Tyr Ser Leu Lys Gly Cys Gln Gly Lys Pro Leu Pro Lys Asp Leu
145 150 155 160
Arg Phe Ile Pro Asp Pro Lys Ala Gly Ile Met Ile Lys Ser Val Lys
165 170 175
Arg Ala Tyr His Arg Leu Cys Leu His Cys Ser Val Asp Gln Glu Gly
180 185 190
Lys Ser Val Leu Ser Glu Lys Phe Ile Leu Lys Val Arg Pro Ala Phe
195 200 205
Lys Ala Val Pro Val Val Ser Val Ser Lys Ala Ser Tyr Leu Leu Arg
210 215 220
Glu Gly Glu Glu Phe Thr Val Thr Cys Thr Ile Lys Asp Val Ser Ser
225 230 235 240
Ser Val Tyr Ser Thr Trp Lys Arg Glu Asn Ser Gln Thr Lys Leu Gln
245 250 255
Glu Lys Tyr Asn Ser Trp His His Gly Asp Phe Asn Tyr Glu Arg Gln
260 265 270
Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Ala Arg Val Asn Asp Ser Gly Val Phe
275 280 285
Met Cys Tyr Ala Asn Asn Thr Phe Gly Ser Ala Asn Val Thr Thr Thr
290 295 300
Leu Glu Val Val Asp Lys Gly Phe Ile Asn Ile Phe Pro Met Ile Asn
305 310 315 320
Thr Thr Val Phe Val Asn Asp Gly Glu Asn Val Asp Leu Ile Val Glu
325 330 335
Tyr Glu Ala Phe Pro Lys Pro Glu His Gln Gln Trp Ile Tyr Met Asn
340 345 350
Arg Thr Phe Thr Asp Lys Trp Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Asn Glu
355 360 365
Ser Asn Ile Arg Tyr Val Ser Glu Leu His Leu Thr Arg Leu Lys Gly
370 375 380
Thr Glu Gly Gly Thr Tyr Thr Phe Leu Val Ser Asn Ser Asp Val Asn
385 390 395 400
Ala Ala Ile Ala Phe Asn Val Tyr Val Asn Thr Lys Pro Glu Ile Leu
405 410 415
Thr Tyr Asp Arg Leu Val Asn Gly Met Leu Gln Cys Val Ala Ala Gly
420 425 430
Phe Pro Glu Pro Thr Ile Asp Trp Tyr Phe Cys Pro Gly Thr Glu Gln
435 440 445
Arg Cys Ser Ala Ser Val Leu Pro Val Asp Val Gln Thr Leu Asn Ser
450 455 460
Ser Gly Pro Pro Phe Gly Lys Leu Val Val Gln Ser Ser Ile Asp Ser
465 470 475 480
Ser Ala Phe Lys His Asn Gly Thr Val Glu Cys Lys Ala Tyr Asn Asp
485 490 495
Val Gly Lys Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Phe Ala Phe Lys Gly Asn Asn
500 505 510
Lys Glu Gln Ile His Pro His Thr Leu Phe Thr Pro Leu Leu Ile Gly
515 520 525
Phe Val Ile Val Ala Gly Met Met Cys Ile Ile Val Met Ile Leu Thr
530 535 540
Tyr Lys Tyr Leu Gln Lys Pro Met Tyr Glu Val Gln Trp Lys Val Val
545 550 555 560
Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu
565 570 575
Pro Tyr Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe Gly
580 585 590
Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala
595 600 605
Tyr Gly Leu Ile Lys Ser Asp Ala Ala Met Thr Val Ala Val Lys Met
610 615 620
Leu Lys Pro Ser Ala His Leu Thr Glu Arg Glu Ala Leu Met Ser Glu
625 630 635 640
Leu Lys Val Leu Ser Tyr Leu Gly Asn His Met Asn Ile Val Asn Leu
645 650 655
Leu Gly Ala Cys Thr Ile Gly Gly Pro Thr Leu Val Ile Thr Glu Tyr
660 665 670
Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Phe Leu Arg Arg Lys Arg Asp Ser
675 680 685
Phe Ile Cys Ser Lys Gln Glu Asp His Ala Glu Ala Ala Leu Tyr Lys
690 695 700
Asn Leu Leu His Ser Lys Glu Ser Ser Cys Ser Asp Ser Thr Asn Glu
705 710 715 720
Tyr Met Asp Met Lys Pro Gly Val Ser Tyr Val Val Pro Thr Lys Ala
725 730 735
Asp Lys Arg Arg Ser Val Arg Ile Gly Ser Tyr Ile Glu Arg Asp Val
740 745 750
Thr Pro Ala Ile Met Glu Asp Asp Glu Leu Ala Leu Asp Leu Glu Asp
755 760 765
Leu Leu Ser Phe Ser Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Ala Phe Leu Ala
770 775 780
Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu
785 790 795 800
Thr His Gly Arg Ile Thr Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp
805 810 815
Ile Lys Asn Asp Ser Asn Tyr Val Val Lys Gly Asn Ala Arg Leu Pro
820 825 830
Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Cys Val Tyr Thr Phe
835 840 845
Glu Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Phe Leu Trp Glu Leu Phe Ser
850 855 860
Leu Gly Ser Ser Pro Tyr Pro Gly Met Pro Val Asp Ser Lys Phe Tyr
865 870 875 880
Lys Met Ile Lys Glu Gly Phe Arg Met Leu Ser Pro Glu His Ala Pro
885 890 895
Ala Glu Met Tyr Asp Ile Met Lys Thr Cys Trp Asp Ala Asp Pro Leu
900 905 910
Lys Arg Pro Thr Phe Lys Gln Ile Val Gln Leu Ile Glu Lys Gln Ile
915 920 925
Ser Glu Ser Thr Asn His Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Asn Cys Ser Pro
930 935 940
Asn Arg Gln Lys Pro Val Val Asp His Ser Val Arg Ile Asn Ser Val
945 950 955 960
Gly Ser Thr Ala Ser Ser Ser Gln Pro Leu Leu Val His Asp Asp Val
965 970 975
<210> 103
<211> 1390
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 103
Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys
20 25 30
Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala
35 40 45
Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu
50 55 60
Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys
65 70 75 80
Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe
85 90 95
Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp
100 105 110
Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His
130 135 140
Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys
145 150 155 160
Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val
165 170 175
Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe
180 185 190
Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp
195 200 205
His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp
210 215 220
Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu
225 230 235 240
Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn
245 250 255
Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln
260 265 270
Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu
275 280 285
His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg
290 295 300
Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala
305 310 315 320
Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser
325 330 335
Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp
340 345 350
Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys
355 360 365
Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg
370 375 380
Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg
385 390 395 400
Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr
405 410 415
Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly
420 425 430
Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly
435 440 445
Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln
450 455 460
Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu
465 470 475 480
Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu
485 490 495
Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys
500 505 510
Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln
515 520 525
Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys
530 535 540
Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile
545 550 555 560
Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu
565 570 575
Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg
580 585 590
Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu
595 600 605
Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys
610 615 620
Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile
625 630 635 640
Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp
645 650 655
Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly
660 665 670
Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg
675 680 685
His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn
690 695 700
Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe
705 710 715 720
Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe
725 730 735
Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser
740 745 750
Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn
755 760 765
Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg
770 775 780
Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys
785 790 795 800
Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys
805 810 815
Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp
820 825 830
Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val
835 840 845
Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp
850 855 860
Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys
865 870 875 880
Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val
885 890 895
Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys
900 905 910
Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp
915 920 925
Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala
930 935 940
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln
945 950 955 960
Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His
965 970 975
Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr
980 985 990
Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro
995 1000 1005
Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln
1010 1015 1020
Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly
1025 1030 1035
Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile
1040 1045 1050
Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His
1055 1060 1065
Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val
1070 1075 1080
Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu
1085 1090 1095
Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn
1100 1105 1110
Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly
1115 1120 1125
Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu
1130 1135 1140
Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu Pro
1145 1150 1155
Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr
1160 1165 1170
His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val
1175 1180 1185
Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg
1190 1195 1200
Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val
1205 1210 1215
Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu
1220 1225 1230
Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys
1235 1240 1245
Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys
1250 1255 1260
Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr
1265 1270 1275
Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr
1280 1285 1290
Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys
1295 1300 1305
Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys
1310 1315 1320
Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser
1325 1330 1335
Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn
1340 1345 1350
Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu
1355 1360 1365
Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro
1370 1375 1380
Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser
1385 1390
<210> 104
<211> 14507
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 104
Met Leu Lys Pro Ser Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ser Pro Thr Arg Ser
1 5 10 15
Leu Met Thr Gly Ser Arg Ser Thr Lys Ala Thr Pro Glu Met Asp Ser
20 25 30
Gly Leu Thr Gly Ala Thr Leu Ser Pro Lys Thr Ser Thr Gly Ala Ile
35 40 45
Val Val Thr Glu His Thr Leu Pro Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Leu
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr Gln Ser Leu Gly
65 70 75 80
Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg Gly Met Thr His
85 90 95
Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr
100 105 110
Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser Gly Leu Ser Ser
115 120 125
Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala
130 135 140
Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly Pro Val Thr Glu
145 150 155 160
Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu Gly Asp Ser Thr
165 170 175
Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys Ile Thr Ser Pro
180 185 190
Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu Asn Ala Pro Val
195 200 205
Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser His Thr Pro Gly
210 215 220
Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Leu
225 230 235 240
Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr Ser Leu Glu Leu
245 250 255
Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Gly Ser
260 265 270
Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile Phe Ser Gly Gln
290 295 300
Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu Ala Arg Ala Ser
305 310 315 320
Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala
325 330 335
Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Thr
340 345 350
Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile Leu Thr Phe His
355 360 365
Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His Ile Ala Lys Thr
370 375 380
Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu Gly Gly Thr Ser
385 390 395 400
Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr Leu Val Ser Glu
405 410 415
Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu Thr Glu Gly Thr
420 425 430
Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala Pro Gly Glu Glu
435 440 445
Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly Phe Thr Thr Leu
450 455 460
Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser Ser His Pro Thr
465 470 475 480
Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ser Ser Ser
485 490 495
Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala Thr Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr Ala Gln Gln Phe
515 520 525
Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser Pro Ser Met Lys
530 535 540
Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala Pro Ile Thr Thr
545 550 555 560
Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu Lys Thr Ser Ser
565 570 575
Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp Thr Leu Ile Gly
580 585 590
Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala Val Pro Thr Gly
595 600 605
Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser Gln Gly Thr Thr
610 615 620
His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ala Asp Leu
625 630 635 640
Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser Pro Ala Val Ser
645 650 655
Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr Lys Pro Ser Tyr
660 665 670
Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ser Ser
675 680 685
Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Leu Asn Thr Arg
690 695 700
His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly His Thr Lys Ile
705 710 715 720
Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Glu Asp Lys
725 730 735
Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala Thr Ser Ser Ile
740 745 750
Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys Pro Ser Ser Ala
755 760 765
Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr Ser Pro Glu Arg
770 775 780
Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser Pro Ser Gly Glu
785 790 795 800
Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ala Glu Thr Thr
805 810 815
Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ser Glu Ser Ser
820 825 830
Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser Gly Val Lys Thr
835 840 845
Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe Thr Ser Gly Glu
850 855 860
Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln Pro Glu Thr Ser
865 870 875 880
Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Val Pro Thr Pro
885 890 895
Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser Ala Gln Phe Ser
900 905 910
Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Ser Val
915 920 925
Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser His Leu Thr Gly
930 935 940
Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe Asn Asp Ser Ala
945 950 955 960
Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro Arg Phe Lys Thr
965 970 975
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Thr Ser Leu
980 985 990
Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro Ala Thr Ser Ser
995 1000 1005
Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr Ile Leu Thr
1010 1015 1020
Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala Ser Thr
1025 1030 1035
Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu Asp
1040 1045 1050
Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser
1055 1060 1065
Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser
1070 1075 1080
Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg
1085 1090 1095
Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu
1100 1105 1110
Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro
1130 1135 1140
Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro
1145 1150 1155
Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr
1160 1165 1170
Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser
1175 1180 1185
Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro
1190 1195 1200
Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val
1205 1210 1215
Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu
1220 1225 1230
Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr
1235 1240 1245
Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser
1250 1255 1260
Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr
1265 1270 1275
Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser
1280 1285 1290
Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr
1295 1300 1305
Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr
1310 1315 1320
Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val
1325 1330 1335
Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His
1340 1345 1350
Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro
1355 1360 1365
Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala
1370 1375 1380
Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr
1385 1390 1395
Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala
1400 1405 1410
Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly
1415 1420 1425
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu
1430 1435 1440
Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala
1445 1450 1455
Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp
1460 1465 1470
Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile
1475 1480 1485
Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu
1490 1495 1500
Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp
1505 1510 1515
Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr
1520 1525 1530
Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile
1535 1540 1545
Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser
1550 1555 1560
Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro
1565 1570 1575
Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu
1580 1585 1590
Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys
1595 1600 1605
Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr
1610 1615 1620
Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser
1625 1630 1635
Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly
1640 1645 1650
Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg
1655 1660 1665
Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu
1670 1675 1680
Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly
1685 1690 1695
Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr
1700 1705 1710
Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn
1715 1720 1725
Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser
1730 1735 1740
Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro
1745 1750 1755
Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val
1760 1765 1770
Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr
1775 1780 1785
Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr
1790 1795 1800
Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu
1805 1810 1815
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu
1820 1825 1830
Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1835 1840 1845
His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg
1850 1855 1860
Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly
1865 1870 1875
Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His
1880 1885 1890
Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1895 1900 1905
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1910 1915 1920
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
1925 1930 1935
Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1940 1945 1950
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
1955 1960 1965
Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
1970 1975 1980
Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
1985 1990 1995
Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
2000 2005 2010
Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
2015 2020 2025
Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser
2030 2035 2040
Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
2045 2050 2055
Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu
2060 2065 2070
Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr
2075 2080 2085
Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln
2090 2095 2100
Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala
2105 2110 2115
Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
2120 2125 2130
Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
2135 2140 2145
Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
2150 2155 2160
Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys
2165 2170 2175
Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser
2180 2185 2190
Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly
2195 2200 2205
Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser
2210 2215 2220
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp
2225 2230 2235
Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser
2240 2245 2250
Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu
2255 2260 2265
Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu
2270 2275 2280
Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser
2285 2290 2295
Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu
2300 2305 2310
Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro
2315 2320 2325
Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu
2330 2335 2340
Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg
2345 2350 2355
Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu
2360 2365 2370
Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr
2375 2380 2385
Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser
2390 2395 2400
Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser
2405 2410 2415
Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn
2420 2425 2430
Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser
2435 2440 2445
Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser
2450 2455 2460
Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met
2465 2470 2475
Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn
2480 2485 2490
Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
2495 2500 2505
Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser
2510 2515 2520
Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro
2525 2530 2535
Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly
2540 2545 2550
Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser
2555 2560 2565
Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser
2570 2575 2580
Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val
2585 2590 2595
Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val
2600 2605 2610
Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys
2615 2620 2625
Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu
2630 2635 2640
Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr
2645 2650 2655
Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile
2660 2665 2670
Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met
2675 2680 2685
Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser
2690 2695 2700
Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr
2705 2710 2715
Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val
2720 2725 2730
Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu
2735 2740 2745
Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
2750 2755 2760
Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala
2765 2770 2775
Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln
2780 2785 2790
Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
2795 2800 2805
Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro
2810 2815 2820
Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr
2825 2830 2835
Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr
2840 2845 2850
Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser
2855 2860 2865
Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp
2870 2875 2880
Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro
2885 2890 2895
Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser
2900 2905 2910
Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser
2915 2920 2925
Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr
2930 2935 2940
Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe
2945 2950 2955
Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His
2960 2965 2970
Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala
2975 2980 2985
Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala
2990 2995 3000
Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser
3005 3010 3015
Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser
3020 3025 3030
Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser
3035 3040 3045
Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg
3050 3055 3060
Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu
3065 3070 3075
Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu
3080 3085 3090
Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala
3095 3100 3105
Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser
3110 3115 3120
Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys
3125 3130 3135
Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys
3140 3145 3150
Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile
3155 3160 3165
Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala
3170 3175 3180
Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly
3185 3190 3195
Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu
3200 3205 3210
Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro
3215 3220 3225
Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu
3230 3235 3240
Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser
3245 3250 3255
Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro
3260 3265 3270
Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser
3275 3280 3285
Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly
3290 3295 3300
Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser
3305 3310 3315
Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro
3320 3325 3330
Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His
3335 3340 3345
Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser
3350 3355 3360
Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser
3365 3370 3375
Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp
3380 3385 3390
Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile
3395 3400 3405
Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr
3410 3415 3420
Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile
3425 3430 3435
Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr
3440 3445 3450
Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp
3455 3460 3465
Gln Gly Ile Thr Ser Leu Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser
3470 3475 3480
Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu
3485 3490 3495
Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala
3500 3505 3510
Gly His Leu Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ala Glu Val Ser Ile Leu
3515 3520 3525
Asp Val Thr Thr Ala Pro Thr Pro Gly Ile Ser Thr Thr Ile Thr
3530 3535 3540
Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu
3545 3550 3555
Val Gly Met Ser Thr Met Asp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Arg Arg
3560 3565 3570
Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala
3575 3580 3585
Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val
3590 3595 3600
Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ile Ser Thr Met His Thr Thr Ser Phe
3605 3610 3615
Leu Ala Ser Ser Thr Glu Leu Asp Ser Met Ser Thr Pro His Gly
3620 3625 3630
Arg Ile Thr Val Ile Gly Thr Ser Leu Val Thr Pro Ser Ser Asp
3635 3640 3645
Ala Ser Ala Val Lys Thr Glu Thr Ser Thr Ser Glu Arg Thr Leu
3650 3655 3660
Ser Pro Ser Asp Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ile Ser Thr Phe Ser
3665 3670 3675
Arg Val Gln Arg Met Ser Ile Ser Val Pro Asp Ile Leu Ser Thr
3680 3685 3690
Ser Trp Thr Pro Ser Ser Thr Glu Ala Glu Asp Val Pro Val Ser
3695 3700 3705
Met Val Ser Thr Asp His Ala Ser Thr Lys Thr Asp Pro Asn Thr
3710 3715 3720
Pro Leu Ser Thr Phe Leu Phe Asp Ser Leu Ser Thr Leu Asp Trp
3725 3730 3735
Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Ser Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala
3740 3745 3750
Pro Gln Gly Ala Thr Thr Pro Gln Glu Leu Thr Leu Glu Thr Met
3755 3760 3765
Ile Ser Pro Ala Thr Ser Gln Leu Pro Phe Ser Ile Gly His Ile
3770 3775 3780
Thr Ser Ala Val Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Ser Gly Val
3785 3790 3795
Thr Phe Ser Arg Pro Asp Pro Thr Ser Lys Lys Ala Glu Gln Thr
3800 3805 3810
Ser Thr Gln Leu Pro Thr Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln Val
3815 3820 3825
Pro Arg Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Val Ile Pro His Thr Ala
3830 3835 3840
Lys Thr Pro Asp Ala Thr Phe Gln Arg Gln Gly Gln Thr Ala Leu
3845 3850 3855
Thr Thr Glu Ala Arg Ala Thr Ser Asp Ser Trp Asn Glu Lys Glu
3860 3865 3870
Lys Ser Thr Pro Ser Ala Pro Trp Ile Thr Glu Met Met Asn Ser
3875 3880 3885
Val Ser Glu Asp Thr Ile Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Ser Val
3890 3895 3900
Leu Arg Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu Glu Ser Gly Thr
3905 3910 3915
Thr Ser Ser Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Tyr Glu Arg Ile Ala
3920 3925 3930
Pro Ser Glu Ser Thr Thr Asp Lys Glu Ala Ile His Pro Ser Thr
3935 3940 3945
Asn Thr Val Glu Thr Thr Gly Trp Val Thr Ser Ser Glu His Ala
3950 3955 3960
Ser His Ser Thr Ile Pro Ala His Ser Ala Ser Ser Lys Leu Thr
3965 3970 3975
Ser Pro Val Val Thr Thr Ser Thr Arg Glu Gln Ala Ile Val Ser
3980 3985 3990
Met Ser Thr Thr Thr Trp Pro Glu Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu
3995 4000 4005
Pro Asn Ser Phe Leu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Val Ser Pro Tyr
4010 4015 4020
Met Asp Thr Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser Ile Ile Ser Ser Pro
4025 4030 4035
Gly Ser Thr Ala Ile Thr Lys Gly Pro Arg Thr Glu Ile Thr Ser
4040 4045 4050
Ser Lys Arg Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Gln Ser Met Arg Ser
4055 4060 4065
Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Asn Phe Pro
4070 4075 4080
Ala Met Thr Glu Ser Gly Gly Met Ile Leu Ala Met Gln Thr Ser
4085 4090 4095
Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Leu Asp Thr Ser
4100 4105 4110
Ala Thr Ala Ser Trp Thr Gly Thr Pro Leu Ala Thr Thr Gln Arg
4115 4120 4125
Phe Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe Ser Lys Gly Pro Glu
4130 4135 4140
Asp Thr Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser
4145 4150 4155
Ser Ser Ser Leu Val Pro Ile His Ala Thr Thr Ser Pro Ser Asn
4160 4165 4170
Ile Leu Leu Thr Ser Gln Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro
4175 4180 4185
Val Thr Ser Val Phe Leu Ser Glu Thr Ser Gly Leu Gly Lys Thr
4190 4195 4200
Thr Asp Met Ser Arg Ile Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ser Leu Pro
4205 4210 4215
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Glu
4220 4225 4230
Ala Ser Arg Asp Thr Lys Ala Ile His His Ser Ala Asp Thr Ala
4235 4240 4245
Val Thr Asn Met Glu Ala Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Pro Ile Pro
4250 4255 4260
Gly His Thr Lys Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Leu Val Thr Ser
4265 4270 4275
His Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser
4280 4285 4290
Ser Glu Thr Thr Glu Ile Glu Thr Val Ser Ser Val Asn Gln Gly
4295 4300 4305
Leu Gln Glu Arg Ser Thr Ser Gln Val Ala Ser Ser Ala Thr Glu
4310 4315 4320
Thr Ser Thr Val Ile Thr His Val Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr
4325 4330 4335
His Val Thr Lys Thr Gln Ala Thr Phe Ser Ser Gly Thr Ser Ile
4340 4345 4350
Ser Ser Pro His Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe Thr Asp
4355 4360 4365
Val Ser Thr Asn Pro Ser Thr Ser Leu Ile Met Thr Glu Ser Ser
4370 4375 4380
Gly Val Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ala Thr
4385 4390 4395
Gln Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Met Pro Tyr Leu Thr
4400 4405 4410
Glu Thr Pro Leu Ala Val Thr Pro Asp Phe Met Gln Ser Glu Lys
4415 4420 4425
Thr Thr Leu Ile Ser Lys Gly Pro Lys Asp Val Ser Trp Thr Ser
4430 4435 4440
Pro Pro Ser Val Ala Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Pro
4445 4450 4455
Phe Leu Val Thr Thr Ile Pro Pro Ala Thr Ser Thr Leu Gln Gly
4460 4465 4470
Gln His Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Thr Ser Val Leu Thr Ser
4475 4480 4485
Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Asn Thr Ser Met Glu Pro
4490 4495 4500
Val Thr Asn Ser Pro Gln Asn Leu Asn Asn Pro Ser Asn Glu Ile
4505 4510 4515
Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Thr Asp Ile Glu Thr Ile His Pro
4520 4525 4530
Ser Ile Asn Lys Ala Val Thr Asn Met Gly Thr Ala Ser Ser Ala
4535 4540 4545
His Val Leu His Ser Thr Leu Pro Val Ser Ser Glu Pro Ser Thr
4550 4555 4560
Ala Thr Ser Pro Met Val Pro Ala Ser Ser Met Gly Asp Ala Leu
4565 4570 4575
Ala Ser Ile Ser Ile Pro Gly Ser Glu Thr Thr Asp Ile Glu Gly
4580 4585 4590
Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Arg Lys Glu Asn Ser Thr
4595 4600 4605
Leu Gln Glu Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser Asn Ile Ile Leu Ser
4610 4615 4620
Asn Val Ser Val Gly Ala Ile Thr Glu Ala Thr Lys Met Glu Val
4625 4630 4635
Pro Ser Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ser Thr
4640 4645 4650
Lys Phe Pro Asp Ile Phe Ser Val Ala Ser Ser Arg Leu Ser Asn
4655 4660 4665
Ser Pro Pro Met Thr Ile Ser Thr His Met Thr Thr Thr Gln Thr
4670 4675 4680
Gly Ser Ser Gly Ala Thr Ser Lys Ile Pro Leu Ala Leu Asp Thr
4685 4690 4695
Ser Thr Leu Glu Thr Ser Ala Gly Thr Pro Ser Val Val Thr Glu
4700 4705 4710
Gly Phe Ala His Ser Lys Ile Thr Thr Ala Met Asn Asn Asp Val
4715 4720 4725
Lys Asp Val Ser Gln Thr Asn Pro Pro Phe Gln Asp Glu Ala Ser
4730 4735 4740
Ser Pro Ser Ser Gln Ala Pro Val Leu Val Thr Thr Leu Pro Ser
4745 4750 4755
Ser Val Ala Phe Thr Pro Gln Trp His Ser Thr Ser Ser Pro Val
4760 4765 4770
Ser Met Ser Ser Val Leu Thr Ser Ser Leu Val Lys Thr Ala Gly
4775 4780 4785
Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gln Ser
4790 4795 4800
Met Ser Asn Thr Leu Asp Asp Ile Ser Val Thr Ser Ala Ala Thr
4805 4810 4815
Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Pro Ser Ile Asn Thr Val Val Thr
4820 4825 4830
Asn Val Gly Thr Thr Gly Ser Ala Phe Glu Ser His Ser Thr Val
4835 4840 4845
Ser Ala Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Asn Val Thr
4850 4855 4860
Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ser Ile Pro Lys
4865 4870 4875
Ser Ser Lys Thr Thr Arg Thr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Ser Leu
4880 4885 4890
Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Glu Ile Thr Ser
4895 4900 4905
Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val Pro Tyr Lys Glu Leu Thr Gly Ala
4910 4915 4920
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Asp Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr
4925 4930 4935
Ser Phe Pro Gly Pro Asp Gln Ser Thr Val Ser Leu Asp Ile Ser
4940 4945 4950
Thr Glu Thr Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu
4955 4960 4965
Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro His Gly Ala
4970 4975 4980
Thr Ser Gln Asp Thr Phe Thr Met Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro
4985 4990 4995
Gln Ala Gly Ile His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln Leu
5000 5005 5010
Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Gln Asp Val Ser Trp
5015 5020 5025
Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe
5030 5035 5040
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr
5045 5050 5055
Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ser Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr
5060 5065 5070
Ser Gly Leu Val Lys Ile Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Leu Glu
5075 5080 5085
Pro Val Thr Ser Ser Leu Pro Asn Phe Ser Ser Thr Ser Asp Lys
5090 5095 5100
Ile Leu Ala Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asp Thr Lys Glu Ile Phe
5105 5110 5115
Pro Ser Ile Asn Thr Glu Glu Thr Asn Val Lys Ala Asn Asn Ser
5120 5125 5130
Gly His Glu Ser His Ser Pro Ala Leu Ala Asp Ser Glu Thr Pro
5135 5140 5145
Lys Ala Thr Thr Gln Met Val Ile Thr Thr Thr Val Gly Asp Pro
5150 5155 5160
Ala Pro Ser Thr Ser Met Pro Val His Gly Ser Ser Glu Thr Thr
5165 5170 5175
Asn Ile Lys Arg Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Thr Pro Arg Leu Arg
5180 5185 5190
Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ser Ser Phe Pro Thr Asp Thr Ser
5195 5200 5205
Phe Leu Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser
5210 5215 5220
Ser Thr Gly Val Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Thr Pro Asp His
5225 5230 5235
Asp Lys Ser Thr Val Pro Pro Asp Thr Phe Thr Gly Glu Ile Pro
5240 5245 5250
Arg Val Phe Thr Ser Ser Ile Lys Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr
5255 5260 5265
Ile Thr Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Ser Ala Ser His Ser Thr
5270 5275 5280
Leu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Thr Leu Ser Gln Gly Gly Thr His
5285 5290 5295
Ser Thr Val Thr Gln Gly Phe Pro Tyr Ser Glu Val Thr Thr Leu
5300 5305 5310
Met Gly Met Gly Pro Gly Asn Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro
5315 5320 5325
Val Glu Glu Thr Ser Ser Val Ser Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala
5330 5335 5340
Met Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Gln Ser Ile
5345 5350 5355
Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ala Leu Pro Thr Ser Val Leu
5360 5365 5370
Val Thr Thr Thr Asp Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Ser Val
5375 5380 5385
Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Ile Thr His Glu Arg Pro
5390 5395 5400
Ala Thr Tyr Lys Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Ala Met His His
5405 5410 5415
Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Gly Ser Gly
5420 5425 5430
His Lys Ser Gln Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Ser Lys
5435 5440 5445
Ala Thr Pro Leu Met Ser Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asp Thr Ser
5450 5455 5460
Val Ser Thr Ser Thr Pro Asn Ile Ser Gln Thr Asn Gln Ile Gln
5465 5470 5475
Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser
5480 5485 5490
Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe
5495 5500 5505
Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu
5510 5515 5520
Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr
5525 5530 5535
Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr
5540 5545 5550
Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln
5555 5560 5565
Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp
5570 5575 5580
Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser
5585 5590 5595
Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr
5600 5605 5610
Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr
5615 5620 5625
Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser
5630 5635 5640
Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu
5645 5650 5655
Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn
5660 5665 5670
Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro
5675 5680 5685
Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp
5690 5695 5700
Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr
5705 5710 5715
Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln
5720 5725 5730
Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro
5735 5740 5745
Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser
5750 5755 5760
Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser
5765 5770 5775
Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile
5780 5785 5790
Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr
5795 5800 5805
Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser
5810 5815 5820
Arg Thr Thr Ile Ser Gly Pro Asp His Ser Lys Met Ser Pro Tyr
5825 5830 5835
Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val
5840 5845 5850
Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile
5855 5860 5865
Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr
5870 5875 5880
Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro
5885 5890 5895
His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val
5900 5905 5910
Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser
5915 5920 5925
Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr
5930 5935 5940
Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr
5945 5950 5955
Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp
5960 5965 5970
Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser
5975 5980 5985
Phe Ser Gly Glu Ile Leu Thr Ser Glu Ala Ser Thr Asn Thr Glu
5990 5995 6000
Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr
6005 6010 6015
Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser
6020 6025 6030
Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met
6035 6040 6045
Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr
6050 6055 6060
Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu
6065 6070 6075
Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser
6080 6085 6090
Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val
6095 6100 6105
Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala
6110 6115 6120
Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser
6125 6130 6135
Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys
6140 6145 6150
Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly
6155 6160 6165
Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ser Ala Gly Thr
6170 6175 6180
Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser
6185 6190 6195
Val Met Asn Asn Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Thr Ser Pro Phe
6200 6205 6210
Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu
6215 6220 6225
Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His
6230 6235 6240
Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr
6245 6250 6255
Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr
6260 6265 6270
Arg Ser Pro Gln Asn Leu Arg Asn Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ala
6275 6280 6285
Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val
6290 6295 6300
Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr
6305 6310 6315
Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val
6320 6325 6330
Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro
6335 6340 6345
Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser
6350 6355 6360
Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly
6365 6370 6375
Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala
6380 6385 6390
Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg
6395 6400 6405
Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr
6410 6415 6420
Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr
6425 6430 6435
Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg
6440 6445 6450
Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr
6455 6460 6465
Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln
6470 6475 6480
Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser
6485 6490 6495
Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
6500 6505 6510
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr
6515 6520 6525
Thr Leu Pro Glu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Val His Leu Thr Ser
6530 6535 6540
Leu Pro Thr Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Ala Ser
6545 6550 6555
Val Ala Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gly Ser Thr Ser His Lys Ile
6560 6565 6570
Pro Thr Thr Ser Glu Asp Ile Lys Asp Thr Glu Lys Met Tyr Pro
6575 6580 6585
Ser Thr Asn Ile Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Thr Ser Glu
6590 6595 6600
Lys Glu Ser Tyr Ser Ser Val Pro Ala Tyr Ser Glu Pro Pro Lys
6605 6610 6615
Val Thr Ser Pro Met Val Thr Ser Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ile
6620 6625 6630
Val Ser Thr Ser Met Pro Gly Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu
6635 6640 6645
Met Glu Ser Thr Phe Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ser
6650 6655 6660
Thr Ser Gln Asp Pro Ile Val Ser Thr Glu Lys Ser Ala Val Leu
6665 6670 6675
His Lys Leu Thr Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ser Arg Thr Glu Val
6680 6685 6690
Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Asp His Ser Thr
6695 6700 6705
Glu Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Pro Ser Leu Pro Ile
6710 6715 6720
Ser Leu Gly Ile Thr Glu Ser Ser Asn Met Thr Ile Ile Thr Arg
6725 6730 6735
Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu
6740 6745 6750
Asp Thr Pro Thr Thr Ser Ser Arg Ala Gly Thr His Ser Met Ala
6755 6760 6765
Thr Gln Glu Phe Pro His Ser Glu Met Thr Thr Val Met Asn Lys
6770 6775 6780
Asp Pro Glu Ile Leu Ser Trp Thr Ile Pro Pro Ser Ile Glu Lys
6785 6790 6795
Thr Ser Phe Ser Ser Ser Leu Met Pro Ser Pro Ala Met Thr Ser
6800 6805 6810
Pro Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Ile His Thr Thr Pro
6815 6820 6825
Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser Leu Val Met Thr Thr
6830 6835 6840
Asp Thr Leu Gly Thr Ser Pro Glu Pro Thr Thr Ser Ser Pro Pro
6845 6850 6855
Asn Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Ile Leu Thr Thr Asp Glu Asp
6860 6865 6870
Thr Thr Ala Ile Glu Ala Met His Pro Ser Thr Ser Thr Ala Ala
6875 6880 6885
Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser
6890 6895 6900
Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp
6905 6910 6915
Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser
6920 6925 6930
Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser
6935 6940 6945
Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
6950 6955 6960
Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly
6965 6970 6975
Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg
6980 6985 6990
Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
6995 7000 7005
Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr
7010 7015 7020
Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly
7025 7030 7035
Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys
7040 7045 7050
Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
7055 7060 7065
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser
7070 7075 7080
Trp Gln Ser Ser Pro Ser Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Pro Ser
7085 7090 7095
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser
7100 7105 7110
Thr Leu Pro Val Thr Ile Ser Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser
7115 7120 7125
Leu Leu Thr Ser Ser Pro Val Thr Thr Thr Asp Met Leu His Thr
7130 7135 7140
Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr
7145 7150 7155
Ser Asp Glu Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asp Thr Thr Asn Thr Glu
7160 7165 7170
Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ile
7175 7180 7185
Pro Ser Ser Gly His Glu Ser Pro Ser Ser Ala Leu Ala Asp Ser
7190 7195 7200
Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro Met Phe Ile Thr Ser Thr Gln
7205 7210 7215
Glu Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Pro His Phe Leu Glu Thr
7220 7225 7230
Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
7235 7240 7245
Arg Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Ser Ser Ala Ile Glu Thr
7250 7255 7260
Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7265 7270 7275
Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Gly
7280 7285 7290
Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys
7295 7300 7305
Ile Ile Lys Phe Pro Thr Ser Pro Ile Leu Ala Glu Ser Ser Glu
7310 7315 7320
Met Thr Ile Lys Thr Gln Thr Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser Glu
7325 7330 7335
Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile
7340 7345 7350
Thr His Ser Thr Met Thr Gln Arg Leu Pro His Ser Glu Ile Thr
7355 7360 7365
Thr Leu Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Val Pro Arg Pro Ser Ser
7370 7375 7380
Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Gln Leu Ser Leu
7385 7390 7395
Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala
7400 7405 7410
Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro
7415 7420 7425
Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro
7430 7435 7440
Glu Thr Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile
7445 7450 7455
Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
7460 7465 7470
Phe Ser Asn Thr Ala Val Thr Lys Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly
7475 7480 7485
His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Pro Asp Ser Glu Thr Thr Lys
7490 7495 7500
Ala Thr Ser Ala Met Gly Thr Ile Ser Ile Met Gly Asp Thr Ser
7505 7510 7515
Val Ser Thr Leu Thr Pro Ala Leu Ser Asn Thr Arg Lys Ile Gln
7520 7525 7530
Ser Glu Pro Ala Ser Ser Leu Thr Thr Arg Leu Arg Glu Thr Ser
7535 7540 7545
Thr Ser Glu Glu Thr Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Thr Val Leu
7550 7555 7560
Ser Lys Val Ser Thr Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu
7565 7570 7575
Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Ser Met Ser Gly Pro Glu Gln Ser
7580 7585 7590
Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser
7595 7600 7605
Ala Ser Ser Val Leu Thr Glu Ser Ala Lys Met Thr Ile Thr Thr
7610 7615 7620
Gln Thr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Leu Glu Ser Thr Leu Asn Leu
7625 7630 7635
Asn Thr Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val
7640 7645 7650
Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg
7655 7660 7665
Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu
7670 7675 7680
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser
7685 7690 7695
Pro His Pro Val Ser Thr Thr Phe Leu Ala His Ile Pro Pro Ser
7700 7705 7710
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr
7715 7720 7725
Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser
7730 7735 7740
Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys
7745 7750 7755
Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Gly
7760 7765 7770
Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser
7775 7780 7785
Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met
7790 7795 7800
Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr
7805 7810 7815
Arg Arg Ile Gln Thr Glu Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu
7820 7825 7830
Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met
7835 7840 7845
Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7850 7855 7860
Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr
7865 7870 7875
Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr
7880 7885 7890
Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His
7895 7900 7905
Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp
7910 7915 7920
Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser
7925 7930 7935
Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly
7940 7945 7950
Pro Glu Asp Val Ser Trp Met Ser Pro Pro Leu Leu Glu Lys Thr
7955 7960 7965
Arg Pro Ser Phe Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala Thr Thr Ser Pro
7970 7975 7980
Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro
7985 7990 7995
Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ala Lys Thr Thr
8000 8005 8010
Asp Met Leu His Lys Ser Ser Glu Pro Val Thr Asn Ser Pro Ala
8015 8020 8025
Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val
8030 8035 8040
Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val
8045 8050 8055
Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe
8060 8065 8070
Val Leu Ala Asp Ser Gln Thr Ser Lys Val Thr Ser Pro Met Val
8075 8080 8085
Ile Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro
8090 8095 8100
Gly Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Thr Glu Pro Thr Ser Ser
8105 8110 8115
Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser
8120 8125 8130
Leu Ala Thr Glu Met Ser Thr Val Leu Ser Gly Val Pro Thr Gly
8135 8140 8145
Ala Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg
8150 8155 8160
Thr Ser Ile Ser Gly Phe Ala Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr
8165 8170 8175
Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Thr Ser Ser Ile Met Thr
8180 8185 8190
Glu Ser Ala Glu Met Met Ile Lys Thr Gln Thr Asp Pro Pro Gly
8195 8200 8205
Ser Thr Pro Glu Ser Thr His Thr Val Asp Ile Ser Thr Thr Pro
8210 8215 8220
Asn Trp Val Glu Thr His Ser Thr Val Thr Gln Arg Phe Ser His
8225 8230 8235
Ser Glu Met Thr Thr Leu Val Ser Arg Ser Pro Gly Asp Met Leu
8240 8245 8250
Trp Pro Ser Gln Ser Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser
8255 8260 8265
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser
8270 8275 8280
Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser
8285 8290 8295
Leu Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp Arg Met Gly Ile
8300 8305 8310
Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Ser Thr
8315 8320 8325
Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr Val Asp Thr Glu
8330 8335 8340
Asp Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr Asn Val Arg Thr
8345 8350 8355
Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val Leu Ser Asp Ser
8360 8365 8370
Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr Thr Tyr Thr Met
8375 8380 8385
Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp Phe Phe Glu Thr
8390 8395 8400
Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu
8405 8410 8415
Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser Ala Thr Glu Gly
8420 8425 8430
Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Thr Glu Val
8435 8440 8445
Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr Ser Met Ser Gly
8450 8455 8460
Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Ala Ile
8465 8470 8475
Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ser
8480 8485 8490
Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Glu Gly
8495 8500 8505
Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr
8510 8515 8520
His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr
8525 8530 8535
Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Pro Ser Leu Pro
8540 8545 8550
Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser Ser Pro
8555 8560 8565
Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile
8570 8575 8580
Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro
8585 8590 8595
Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr
8600 8605 8610
Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala
8615 8620 8625
Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile His Pro Ser Ser
8630 8635 8640
Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile Tyr Lys His Leu
8645 8650 8655
Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr Thr Lys Pro Thr
8660 8665 8670
Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn Thr Ser Val Ser
8675 8680 8685
Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met Thr Gln Pro Thr
8690 8695 8700
Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu
8705 8710 8715
Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Met Pro
8720 8725 8730
Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu Ala Leu Ser Leu
8735 8740 8745
Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Ile Ser Pro
8750 8755 8760
Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr
8765 8770 8775
Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro Lys Thr Gly His
8780 8785 8790
Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ser
8795 8800 8805
Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala Thr His Arg Ser
8810 8815 8820
Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp
8825 8830 8835
Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Pro Pro
8840 8845 8850
Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu
8855 8860 8865
Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser Pro Leu Arg Val
8870 8875 8880
Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr Thr Asp Met Leu
8885 8890 8895
Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro Pro Ser Met Asn
8900 8905 8910
Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys Ala Thr Met Glu
8915 8920 8925
Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala Val Thr Gln Met
8930 8935 8940
Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser Ser Tyr Pro Gly
8945 8950 8955
Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Val Thr Ser Ser
8960 8965 8970
Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ser Glu
8975 8980 8985
Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Thr
8990 8995 9000
Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His Ser Ala Thr Lys
9005 9010 9015
Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ala Thr Ile Glu
9020 9025 9030
Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg Gly Pro Ser Pro
9035 9040 9045
Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Thr
9050 9055 9060
Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr
9065 9070 9075
Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr
9080 9085 9090
Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser
9095 9100 9105
Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met
9110 9115 9120
Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val
9125 9130 9135
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met
9140 9145 9150
Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His
9155 9160 9165
Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val
9170 9175 9180
Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser
9185 9190 9195
Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile
9200 9205 9210
Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val
9215 9220 9225
Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala
9230 9235 9240
Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr
9245 9250 9255
Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser
9260 9265 9270
Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro
9275 9280 9285
Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr
9290 9295 9300
Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr
9305 9310 9315
Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile
9320 9325 9330
Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu
9335 9340 9345
Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr
9350 9355 9360
Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser
9365 9370 9375
Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro
9380 9385 9390
Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro Gln Ser Val Val
9395 9400 9405
Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser
9410 9415 9420
Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser
9425 9430 9435
Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser
9440 9445 9450
Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr
9455 9460 9465
Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu
9470 9475 9480
Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu
9485 9490 9495
Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His
9500 9505 9510
Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu Thr Thr Ser Ala
9515 9520 9525
Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe Ser Glu Pro Thr
9530 9535 9540
Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn
9545 9550 9555
Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly Ile Thr Arg Ile
9560 9565 9570
Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr
9575 9580 9585
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val
9590 9595 9600
Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu Val Ser Arg Thr
9605 9610 9615
Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln
9620 9625 9630
Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Arg Leu
9635 9640 9645
Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr
9650 9655 9660
Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Val Thr Leu Pro
9665 9670 9675
Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr His Ser Thr Met
9680 9685 9690
Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg
9695 9700 9705
Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg Phe Val Glu Thr
9710 9715 9720
Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser
9725 9730 9735
Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser Ser Pro Ser Ser
9740 9745 9750
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Lys Thr
9755 9760 9765
Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Thr Ser Ser Ser
9770 9775 9780
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro Ala Thr Ser Glu
9785 9790 9795
Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser Ser Asn Thr Ala
9800 9805 9810
Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser
9815 9820 9825
Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met
9830 9835 9840
Gly Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn
9845 9850 9855
Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe
9860 9865 9870
Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr Ser Glu Glu Thr
9875 9880 9885
Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Tyr Gly Val Pro Thr
9890 9895 9900
Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile Met Ser Ser Asn
9905 9910 9915
Arg Ile His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr Met Ser Pro Asp
9920 9925 9930
Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser Ser Ser Met Met
9935 9940 9945
Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro
9950 9955 9960
Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Thr Thr Ala
9965 9970 9975
Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His
9980 9985 9990
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser
9995 10000 10005
Trp Lys Ser Ser Leu Phe Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
10010 10015 10020
Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr
10025 10030 10035
Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu
10040 10045 10050
Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro
10055 10060 10065
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Ser Val Glu Ile
10070 10075 10080
Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
10085 10090 10095
Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Gly
10100 10105 10110
His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser Glu Pro Ser Lys
10115 10120 10125
Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser
10130 10135 10140
Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr Thr Gly Phe Glu
10145 10150 10155
Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Phe Arg Lys Thr Asn
10160 10165 10170
Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr Asn Thr Pro Ser
10175 10180 10185
Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser Lys Thr Asp Phe
10190 10195 10200
Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp Pro Pro Ala Ser
10205 10210 10215
Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr Pro Phe Asn Ala
10220 10225 10230
Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu
10235 10240 10245
Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr His His Leu Ser
10250 10255 10260
Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gly Thr Val
10265 10270 10275
Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe Ala Thr Thr Gly
10280 10285 10290
Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro Phe Ser Arg Thr
10295 10300 10305
Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr Ile Ala Glu Ser
10310 10315 10320
Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ser Thr Phe Thr
10325 10330 10335
Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His Glu Ile Thr Ser
10340 10345 10350
Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser Leu Gly Thr Glu
10355 10360 10365
Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val Ser Thr Leu Asp
10370 10375 10380
Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Asp
10385 10390 10395
Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr Val Thr Ser Ala
10400 10405 10410
Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr Arg Thr Asp Gly
10415 10420 10425
Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu Ala Ala His Arg
10430 10435 10440
Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr Ser Thr Ser Pro
10445 10450 10455
Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr Lys Arg Met Glu
10460 10465 10470
Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr
10475 10480 10485
Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr Thr Pro Thr Leu
10490 10495 10500
Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Thr
10505 10510 10515
Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Asp
10520 10525 10530
Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu
10535 10540 10545
Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg
10550 10555 10560
Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu
10565 10570 10575
Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro
10580 10585 10590
Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala Glu Thr Ile Pro
10595 10600 10605
Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp
10610 10615 10620
Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala Asp Val Ser Ser
10625 10630 10635
Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu Asp Ala Leu Thr
10640 10645 10650
Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro
10655 10660 10665
Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr Arg Thr Thr Trp
10670 10675 10680
Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile Pro Arg Thr Ile
10685 10690 10695
Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr Pro Ser Ile Ala
10700 10705 10710
Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile Pro Ile Met Thr
10715 10720 10725
Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser Gln Val Thr Ser
10730 10735 10740
Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser
10745 10750 10755
Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val Thr His Pro Glu
10760 10765 10770
Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr Ile Ser Pro Ala
10775 10780 10785
Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
10790 10795 10800
Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser Pro Gly Glu Pro
10805 10810 10815
Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Pro Ala Gln Thr Ser Pro
10820 10825 10830
Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp
10835 10840 10845
Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala Glu Ser Ser Ser
10850 10855 10860
Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val Pro Gly Val Val
10865 10870 10875
Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile Ser Thr Thr Ile
10880 10885 10890
Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser
10895 10900 10905
Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ile Pro Thr
10910 10915 10920
Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val
10925 10930 10935
Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr
10940 10945 10950
Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser
10955 10960 10965
His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr Val Leu Pro Glu
10970 10975 10980
Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val
10985 10990 10995
Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro
11000 11005 11010
Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser
11015 11020 11025
Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro Gly Val Val Thr
11030 11035 11040
Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser Thr Ser Ile Pro
11045 11050 11055
Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr Thr Pro Ser Met
11060 11065 11070
Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro
11075 11080 11085
Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr
11090 11095 11100
Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
11105 11110 11115
Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His
11120 11125 11130
Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val
11135 11140 11145
Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr
11150 11155 11160
Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Asp Glu Pro Glu
11165 11170 11175
Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala Lys Met Ile Ser
11180 11185 11190
Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val
11195 11200 11205
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser
11210 11215 11220
Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr Ile Asp Ser Trp
11225 11230 11235
Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu
11240 11245 11250
Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile Ser Leu Val Thr
11255 11260 11265
His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg
11270 11275 11280
Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser
11285 11290 11295
Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro
11300 11305 11310
Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg
11315 11320 11325
Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu
11330 11335 11340
Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser
11345 11350 11355
Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro
11360 11365 11370
Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr
11375 11380 11385
Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met
11390 11395 11400
Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr
11405 11410 11415
Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr
11420 11425 11430
Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro
11435 11440 11445
Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu
11450 11455 11460
Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu
11465 11470 11475
Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile
11480 11485 11490
His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys
11495 11500 11505
Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr
11510 11515 11520
Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile
11525 11530 11535
Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser
11540 11545 11550
Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro
11555 11560 11565
Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu
11570 11575 11580
Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg
11585 11590 11595
Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp
11600 11605 11610
Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro
11615 11620 11625
Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser
11630 11635 11640
Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr
11645 11650 11655
Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr
11660 11665 11670
Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro Asp Thr Met Ala
11675 11680 11685
Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr Pro Val Ser Arg
11690 11695 11700
Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val
11705 11710 11715
Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr
11720 11725 11730
Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr Ser Gln Ile Thr
11735 11740 11745
Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His
11750 11755 11760
Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Ser Thr His Pro
11765 11770 11775
Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser Thr Val Phe Pro
11780 11785 11790
Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Ala
11795 11800 11805
Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Phe
11810 11815 11820
Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Pro Thr
11825 11830 11835
Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro Leu Ser Thr His
11840 11845 11850
Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Ser Thr Leu Ser
11855 11860 11865
Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser
11870 11875 11880
Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro Ala
11885 11890 11895
Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr Asp Lys Pro Gln
11900 11905 11910
Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser
11915 11920 11925
Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met
11930 11935 11940
Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro Lys Thr Ser His
11945 11950 11955
Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val
11960 11965 11970
Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser Pro Thr Val Ala
11975 11980 11985
Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr
11990 11995 12000
Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val
12005 12010 12015
Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr
12020 12025 12030
Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro
12035 12040 12045
Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro
12050 12055 12060
Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu
12065 12070 12075
Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His
12080 12085 12090
Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly
12095 12100 12105
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
12110 12115 12120
Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser
12125 12130 12135
Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Glu
12140 12145 12150
Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
12155 12160 12165
Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg
12170 12175 12180
Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro
12185 12190 12195
Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser
12200 12205 12210
Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
12215 12220 12225
Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr
12230 12235 12240
Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met
12245 12250 12255
Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr
12260 12265 12270
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
12275 12280 12285
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
12290 12295 12300
His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu
12305 12310 12315
Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly
12320 12325 12330
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
12335 12340 12345
His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr
12350 12355 12360
Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro
12365 12370 12375
Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn
12380 12385 12390
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Gly His Pro
12395 12400 12405
Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu
12410 12415 12420
Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
12425 12430 12435
Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala
12440 12445 12450
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
12455 12460 12465
Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
12470 12475 12480
Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn
12485 12490 12495
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
12500 12505 12510
Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly
12515 12520 12525
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
12530 12535 12540
Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
12545 12550 12555
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
12560 12565 12570
Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser
12575 12580 12585
Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
12590 12595 12600
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
12605 12610 12615
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
12620 12625 12630
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro
12635 12640 12645
Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
12650 12655 12660
Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
12665 12670 12675
Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
12680 12685 12690
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
12695 12700 12705
Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
12710 12715 12720
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met
12725 12730 12735
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
12740 12745 12750
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
12755 12760 12765
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
12770 12775 12780
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile
12785 12790 12795
Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
12800 12805 12810
Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ser Thr Pro
12815 12820 12825
Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser
12830 12835 12840
Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr
12845 12850 12855
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His
12860 12865 12870
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
12875 12880 12885
Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu
12890 12895 12900
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly
12905 12910 12915
Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys Ser His Arg Leu Asp Pro
12920 12925 12930
Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
12935 12940 12945
Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp
12950 12955 12960
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
12965 12970 12975
Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
12980 12985 12990
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Val Pro
12995 13000 13005
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln
13010 13015 13020
Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr
13025 13030 13035
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Leu Phe Lys Asn
13040 13045 13050
Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ile Ser Leu
13055 13060 13065
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys
13070 13075 13080
Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln
13085 13090 13095
Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
13100 13105 13110
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe
13115 13120 13125
Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr Ser Thr Pro Trp Thr Ser
13130 13135 13140
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Pro Val Pro Ser
13145 13150 13155
Pro Thr Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
13160 13165 13170
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asn Met Gly His Pro Gly
13175 13180 13185
Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu
13190 13195 13200
Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly
13205 13210 13215
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr
13220 13225 13230
Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ile Pro
13235 13240 13245
Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr
13250 13255 13260
His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser
13265 13270 13275
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr
13280 13285 13290
Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln Pro Glu Thr Ser Glu Thr
13295 13300 13305
Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala Thr Gly Pro Val Leu Leu
13310 13315 13320
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu
13325 13330 13335
Asp Met Arg Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
13340 13345 13350
Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val
13355 13360 13365
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu
13370 13375 13380
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp Ala Val Cys Thr His Arg
13385 13390 13395
Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp
13400 13405 13410
Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr
13415 13420 13425
Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln
13430 13435 13440
Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro Asp Thr Ser Thr Met His
13445 13450 13455
Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Pro Met Thr
13460 13465 13470
Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile Thr
13475 13480 13485
Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg Lys
13490 13495 13500
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val
13505 13510 13515
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
13520 13525 13530
Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp
13535 13540 13545
Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp
13550 13555 13560
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile
13565 13570 13575
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
13580 13585 13590
Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro
13595 13600 13605
Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser
13610 13615 13620
Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr
13625 13630 13635
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Gln
13640 13645 13650
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
13655 13660 13665
Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu
13670 13675 13680
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly
13685 13690 13695
Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro
13700 13705 13710
Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
13715 13720 13725
Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ala Leu Asp
13730 13735 13740
Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
13745 13750 13755
Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro Thr Val Tyr Leu Gly Ala
13760 13765 13770
Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly Pro Ser Ala Ala Ser His
13775 13780 13785
Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg
13790 13795 13800
Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
13805 13810 13815
Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr
13820 13825 13830
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
13835 13840 13845
Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
13850 13855 13860
His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
13865 13870 13875
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
13880 13885 13890
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
13895 13900 13905
His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu
13910 13915 13920
Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met
13925 13930 13935
Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp
13940 13945 13950
Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser
13955 13960 13965
Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
13970 13975 13980
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr
13985 13990 13995
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe
14000 14005 14010
His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
14015 14020 14025
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu
14030 14035 14040
Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr
14045 14050 14055
Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His
14060 14065 14070
Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr
14075 14080 14085
Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu
14090 14095 14100
Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
14105 14110 14115
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro
14120 14125 14130
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr
14135 14140 14145
His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr
14150 14155 14160
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe
14165 14170 14175
Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro
14180 14185 14190
Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile
14195 14200 14205
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr
14210 14215 14220
Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr
14225 14230 14235
Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr
14240 14245 14250
Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe
14255 14260 14265
Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp
14270 14275 14280
Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln
14285 14290 14295
Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln
14300 14305 14310
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr
14315 14320 14325
Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr
14330 14335 14340
Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
14345 14350 14355
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys
14360 14365 14370
Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr Gly
14375 14380 14385
Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
14390 14395 14400
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly
14405 14410 14415
Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val
14420 14425 14430
Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
14435 14440 14445
Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu
14450 14455 14460
Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr
14465 14470 14475
Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys
14480 14485 14490
Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
14495 14500 14505
<210> 105
<211> 755
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 105
Met Ala Arg Lys Leu Ser Val Ile Leu Ile Leu Thr Phe Ala Leu Ser
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr
20 25 30
Thr Glu Lys Ile Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Asn Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln
65 70 75 80
Asn Ile Gly Ile Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His
85 90 95
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
100 105 110
Asp His Glu His His Ser Glu His Glu His His Ser Asp His Asp His
115 120 125
His Ser His His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
130 135 140
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser Gly Lys Asp Pro Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
165 170 175
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr
180 185 190
Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu Glu Thr Ile Glu Thr Pro
195 200 205
Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro
210 215 220
Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Thr
225 230 235 240
Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly Phe Met Tyr Ser Arg Asn
245 250 255
Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Thr
260 265 270
Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn
275 280 285
Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu
290 295 300
Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser
325 330 335
Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val
340 345 350
Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr
355 360 365
Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
370 375 380
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg
385 390 395 400
Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala
405 410 415
Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr
420 425 430
Phe Met Phe Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys
435 440 445
Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val
450 455 460
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
465 470 475 480
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala
485 490 495
Asp Ser Gln Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu
500 505 510
Glu Glu Glu Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr
515 520 525
Asn Glu Tyr Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe
530 535 540
His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp
545 550 555 560
Tyr His His Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His
565 570 575
Ser His Ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val
580 585 590
Ala Thr Leu Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe
595 600 605
Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser
610 615 620
Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu
625 630 635 640
Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln
645 650 655
Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met
660 665 670
Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp
675 680 685
Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp
690 695 700
Met Val Pro Glu Met Leu His Asn Asp Ala Ser Asp His Gly Cys Ser
705 710 715 720
Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
725 730 735
Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg
740 745 750
Ile Asn Phe
755
<210> 106
<211> 710
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 106
Met Gly Gly Lys Gln Arg Asp Glu Asp Asp Glu Ala Tyr Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Lys Tyr Asp Pro Ser Phe Arg Gly Pro Ile Lys Asn Arg Ser Cys
20 25 30
Thr Asp Val Ile Cys Cys Val Leu Phe Leu Leu Phe Ile Leu Gly Tyr
35 40 45
Ile Val Val Gly Ile Val Ala Trp Leu Tyr Gly Asp Pro Arg Gln Val
50 55 60
Leu Tyr Pro Arg Asn Ser Thr Gly Ala Tyr Cys Gly Met Gly Glu Asn
65 70 75 80
Lys Asp Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Asn Ile Phe Ser Cys Ile Leu
85 90 95
Ser Ser Asn Ile Ile Ser Val Ala Glu Asn Gly Leu Gln Cys Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Val Cys Val Ser Ser Cys Pro Glu Asp Pro Trp Thr Val Gly
115 120 125
Lys Asn Glu Phe Ser Gln Thr Val Gly Glu Val Phe Tyr Thr Lys Asn
130 135 140
Arg Asn Phe Cys Leu Pro Gly Val Pro Trp Asn Met Thr Val Ile Thr
145 150 155 160
Ser Leu Gln Gln Glu Leu Cys Pro Ser Phe Leu Leu Pro Ser Ala Pro
165 170 175
Ala Leu Gly Arg Cys Phe Pro Trp Thr Asn Val Thr Pro Pro Ala Leu
180 185 190
Pro Gly Ile Thr Asn Asp Thr Thr Ile Gln Gln Gly Ile Ser Gly Leu
195 200 205
Ile Asp Ser Leu Asn Ala Arg Asp Ile Ser Val Lys Ile Phe Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Gln Ser Trp Tyr Trp Ile Leu Val Ala Leu Gly Val Ala Leu
225 230 235 240
Val Leu Ser Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu Arg Leu Val Ala Gly Pro
245 250 255
Leu Val Leu Val Leu Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Leu Ala Tyr Gly
260 265 270
Ile Tyr Tyr Cys Trp Glu Glu Tyr Arg Val Leu Arg Asp Lys Gly Ala
275 280 285
Ser Ile Ser Gln Leu Gly Phe Thr Thr Asn Leu Ser Ala Tyr Gln Ser
290 295 300
Val Gln Glu Thr Trp Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu Ala Val Leu Glu
305 310 315 320
Ala Ile Leu Leu Leu Met Leu Ile Phe Leu Arg Gln Arg Ile Arg Ile
325 330 335
Ala Ile Ala Leu Leu Lys Glu Ala Ser Lys Ala Val Gly Gln Met Met
340 345 350
Ser Thr Met Phe Tyr Pro Leu Val Thr Phe Val Leu Leu Leu Ile Cys
355 360 365
Ile Ala Tyr Trp Ala Met Thr Ala Leu Tyr Leu Ala Thr Ser Gly Gln
370 375 380
Pro Gln Tyr Val Leu Trp Ala Ser Asn Ile Ser Ser Pro Gly Cys Glu
385 390 395 400
Lys Val Pro Ile Asn Thr Ser Cys Asn Pro Thr Ala His Leu Val Asn
405 410 415
Ser Ser Cys Pro Gly Leu Met Cys Val Phe Gln Gly Tyr Ser Ser Lys
420 425 430
Gly Leu Ile Gln Arg Ser Val Phe Asn Leu Gln Ile Tyr Gly Val Leu
435 440 445
Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp Val Leu Ala Leu Gly Gln Cys Val
450 455 460
Leu Ala Gly Ala Phe Ala Ser Phe Tyr Trp Ala Phe His Lys Pro Gln
465 470 475 480
Asp Ile Pro Thr Phe Pro Leu Ile Ser Ala Phe Ile Arg Thr Leu Arg
485 490 495
Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Ala Leu Ile Leu Thr Leu Val
500 505 510
Gln Ile Ala Arg Val Ile Leu Glu Tyr Ile Asp His Lys Leu Arg Gly
515 520 525
Val Gln Asn Pro Val Ala Arg Cys Ile Met Cys Cys Phe Lys Cys Cys
530 535 540
Leu Trp Cys Leu Glu Lys Phe Ile Lys Phe Leu Asn Arg Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Ile Met Ile Ala Ile Tyr Gly Lys Asn Phe Cys Val Ser Ala Lys Asn
565 570 575
Ala Phe Met Leu Leu Met Arg Asn Ile Val Arg Val Val Val Leu Asp
580 585 590
Lys Val Thr Asp Leu Leu Leu Phe Phe Gly Lys Leu Leu Val Val Gly
595 600 605
Gly Val Gly Val Leu Ser Phe Phe Phe Phe Ser Gly Arg Ile Pro Gly
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Phe Lys Ser Pro His Leu Asn Tyr Tyr Trp Leu Pro
625 630 635 640
Ile Met Thr Ser Ile Leu Gly Ala Tyr Val Ile Ala Ser Gly Phe Phe
645 650 655
Ser Val Phe Gly Met Cys Val Asp Thr Leu Phe Leu Cys Phe Leu Glu
660 665 670
Asp Leu Glu Arg Asn Asn Gly Ser Leu Asp Arg Pro Tyr Tyr Met Ser
675 680 685
Lys Ser Leu Leu Lys Ile Leu Gly Lys Lys Asn Glu Ala Pro Pro Asp
690 695 700
Asn Lys Lys Arg Lys Lys
705 710
<210> 107
<211> 339
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 107
Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met
1 5 10 15
Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln
35 40 45
Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr
50 55 60
Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile
65 70 75 80
Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His
85 90 95
Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu
100 105 110
Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu
115 120 125
Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly
130 135 140
Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr
145 150 155 160
Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala
165 170 175
Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu
180 185 190
Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp
195 200 205
Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile
210 215 220
Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser
225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys
245 250 255
Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe
260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro
275 280 285
Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe
290 295 300
Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile
305 310 315 320
Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys
325 330 335
Ser Gln Leu
<210> 108
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
primer"
<400> 108
actctcttcc gcatcgctgt 20
<210> 109
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
primer"
<400> 109
ccgacgggtt tccgatccaa 20
<210> 110
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
probe"
<400> 110
ctgttgggct cgcggttg 18
<210> 111
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
primer"
<400> 111
tggcatcaga ttgcaaagac 20
<210> 112
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
Праймер"
<400> 112
acgccgggtg atgtatctat 20
<210> 113
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический
зонд"
<400> 113
cgaaacgcac ccgtcagacg 20
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| АМАТОКСИНОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА С ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2826004C2 |
| ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ROR2 | 2018 |
|
RU2784586C2 |
| НАЦЕЛЕННЫЕ НА uPARAP КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2017 |
|
RU2740311C2 |
| АНТИТЕЛА И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА-ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD123, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2018 |
|
RU2789150C2 |
| САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА К HER2 И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА | 2016 |
|
RU2745565C2 |
| КОНЪЮГАТЫ АНТИ-HER2 БИПАРАТОПНЫХ АНТИТЕЛ-ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2806049C2 |
| АНТИТЕЛА И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ ДЛЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО КОНЪЮГИРОВАНИЯ | 2016 |
|
RU2757815C2 |
| СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ОЧИСТКИ И СОСТАВЛЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2019 |
|
RU2801229C2 |
| КОНЬЮГАТ АНТИТЕЛА К КЛАУДИНУ И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2826119C1 |
| КОНЪЮГАТЫ СВЯЗУЮЩЕГО И АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (ADC), ИМЕЮЩИЕ ФЕРМЕНТАТИВНО РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ ГРУППЫ | 2017 |
|
RU2761390C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая модулятор сплайсинга или его фармацеватически приемлемую соль, соединение для лечения неопластического нарушения, конъюгат антитела и лекарственного средства для лечения неопластического нарушения, фармацевтическую композицию для лечения неопластического нарушения, применение модулятора сплайсинга или его фармацевтически приемлемой соли, соединения или конъюгата антитела и лекарственного средства для лечения неопластического нарушения, применение модулятора сплайсинга или его фармацевтически приемлемой соли, соединения или конъюгата антитела и лекарственного средства для изготовления лекарственного средства для лечения неопластического нарушения и способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие. Изобретение расширяет арсенал средств модулирования сплайсинга. 7 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 14 табл., 4 пр.
1. Модулятор сплайсинга со следующей формулой:
(I)
или его фармацевтически приемлемая соль,
где Y выбран из O, S, NR6 и CR6R7;
каждый из R1, R2 и R3 независимо выбран из водорода, гидроксила, групп -O-(C1-C6алкил), групп -O-C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил) и C1-C6алкильных групп;
R4 выбран из C1-C6алкильных групп, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил) и -C(=O)-NR6R7;
R5 выбран из водорода, гидроксила, -CH2-OH, -CO2H, групп -C(=O)-O-(C1-C6алкил), -C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8, -O-C(=O)-NR6R7, -NR6-C(=O)-R8 и -NR6-C(=O)-NR6R7;
каждый из R6 и R7 независимо выбран из водорода, -R8, -C(=O)-R8 и -C(=O)-O-R8; и
R8 выбран из C1-C6алкильных групп, C3-C8карбоциклильных групп и C3-C8гетероциклильных групп,
где каждый из R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C6алкильных групп, групп -O-(C1-C6алкил), -CO2H, групп -C(=O)-(C1-C6алкил), групп -C(=O)-(C3-C8карбоциклил), групп -C(=O)-(C3-C8гетероциклил), -NR6R7, C3-C8карбоциклильных групп, C1-C6алкилгидроксигрупп, C1-C6алкилалкоксигрупп, бензильных групп и C3-C8гетероциклильных групп, каждая из которых может быть независимо замещена 0 или 1 группой, выбранной из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, C1-C3галогеналкильных групп, -NH-C(=O)(C1-C3алкил) и -NH-C(=O)-O-(C1-C3алкил).
2. Модулятор сплайсинга по п. 1, где модулятор сплайсинга имеет следующую формулу:
,
или его фармацевтически приемлемая соль,
где R9 выбран из C3-C8гетероциклильных групп; и
R10 выбран из H и C1-C6алкильных групп,
где каждый из R9 и R10 независимо замещен 0-3 группами, независимо выбранными из галогенов, гидроксила, C1-C3алкильных групп, C1-C3алкоксигрупп, -NH2, -NH-(C1-C3алкил) и -N-(C1-C3алкил)2.
3. Модулятор сплайсинга по п. 1, где модулятор сплайсинга представляет собой соединение формулы (Ib)
(Ib)
или его фармацевтически приемлемую соль,
где R11 выбран из 
, 
и 
, где * обозначает точку присоединения R11 к остальной части соединения; и
каждый из R12 и R13 независимо выбран из H и метила.
4. Модулятор сплайсинга по п. 1, где модулятор сплайсинга выбирают из
(H1), 
(H2), 
(H3), 
(H12)
и их фармацевтически приемлемых солей, необязательно, модулятор сплайсинга выбирают из Н1, Н3 или их фармацевтически приемлемой соли.
5. Соединение для лечения неопластического нарушения, содержащее линкер-модулятор сплайсинга формулы L-H, или его фармацевтически приемлемая соль, где L представляет собой линкер и где H представляет собой модулятор сплайсинга по п. 1.
6. Соединение по п. 5, где H ковалентно присоединен через любой атом к L, валентность атома, который ковалентно присоединен к L, не превышена; необязательно, где L представляет собой расщепляемый линкер.
7. Соединение по п. 5, выбранное из:
,
,
,
;
,
и их фармацевтически приемлемых солей.
8. Соединение по п. 5, выбираемое из:
;
;
;
и их фармацевтически приемлемых солей.
9. Соединение по п. 5, где линкер представляет собой расщепляемый линкер, содержащий по меньшей мере один расщепляемый фрагмент; и где линкер содержит:
(i) расщепляемый пептид; необязательно, где расщепляемый пептид содержит валин-цитруллин (Val-Cit) или валин-аланин (Val-Ala); или
(ii) расщепляемый глюкуронидный фрагмент; необязательно, где расщепляемый глюкуронидный фрагмент является расщепляемым посредством фермента; необязательно, где расщепляемый глюкуронидный фрагмент является расщепляемым под действием глюкуронидазы; необязательно, где расщепляемый глюкуронидный фрагмент является расщепляемым под действием β-глюкуронидазы.
10. Соединение по п. 9, где линкер содержит малеимидный (Mal) фрагмент, необязательно, где Mal фрагмент содержит малеимидокапроил (MC), необязательно, где линкер содержит MC-Val-Cit или MC-Val-Ala.
11. Соединение по п. 9, где линкер содержит по меньшей мере одно спейсерное звено, необязательно, где или
(i) спейсерное звено содержит полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент, необязательно, где PEG-фрагмент содержит -(PEG)m- и m представляет собой целое число от 1 до 10, необязательно, где m представляет собой 2; или
(ii) спейсерное звено содержит фрагмент, необязательно, где алкильный фрагмент содержит -(CH2)n- и n представляет собой целое число от 1 до 10, необязательно, где n представляет собой 2, 5 или 6;
необязательно, где спейсерное звено присоединяется к малеимидному (Mal) фрагменты (“Mal-спейсерное звено”).
12. Соединение по п. 9, где расщепляемый фрагмент непосредственно присоединен к модулятору сплайсинга соединения или где спейсерное звено присоединяет расщепляемый фрагмент к модулятору сплайсинга соединения, необязательно, где расщепление расщепляемого фрагмента обеспечивает высвобождение модулятора сплайсинга от линкера, необязательно, где спейсерное звено, присоединяющее расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга, является саморасщепляемым.
13. Соединение по п. 12, где спейсерное звено, присоединяющее расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга, содержит п-аминобензильный (pAB) или п-аминобензилоксикарбонильный (pABC) фрагменты, необязательно, где pAB и pABC фрагменты присоединяют расщепляемый фрагмент в линкере к модулятору сплайсинга, необязательно, где расщепляемый пептид содержит Val-Cit или Val-Ala; необязательно, где линкер содержит Val-Cit-pAB, Val-Ala-pAB, Val-Cit-pABC или Val-Ala-pABC; необязательно, где линкер содержит MC-Val-Cit-pAB, MC-Val-Ala-pAB, MC-Val-Cit-pABC или MC-Val-Ala-pABC.
14. Конъюгат антитела и лекарственного средства для лечения неопластического нарушения, где конъюгат антитела и лекарственного средства имеет формулу (I)
Ab-(L-H)p (I),
где Ab представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые целенаправленно воздействуют на неопластическую клетку;
L-H содержит соединение по любому из пп. 5-13; и
p представляет собой целое число от 1 до 15.
15. Конъюгат антитела и лекарственного средства по п. 14, где неопластическую клетку получают из:
(i) гематологического злокачественного новообразования; необязательно, где гематологическое злокачественное новообразование выбрано из B-клеточного злокачественного новообразования, лейкоза, лимфомы, миеломы, острого миелоидного лейкоза и множественной миеломы; или
(ii) солидной опухоли, необязательно, где солидная опухоль выбрана из рака молочной железы, рака желудка, рака предстательной железы, рака яичника, рака легкого, рака матки, карциномы слюнных протоков, меланомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака почки, колоректального рака и рака пищевода.
16. Конъюгат антитела и лекарственного средства по п. 14, где неопластическая клетка представляет собой:
(i) клетку, экспрессирующую HER2, необязательно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к HER2 или его антигенсвязывающий фрагмент; и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 1 (HCDR1), SEQ ID NO: 2 (HCDR2) и SEQ ID NO: 3 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 4 (LCDR1), SEQ ID NO: 5 (LCDR2) и SEQ ID NO: 6 (LCDR3); и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20, необязательно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека, и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig человека;
(ii) клетку, экспрессирующую CD138; необязательно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к CD138 или его антигенсвязывающий фрагмент; и/или
где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) и SEQ ID NO: 9 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) и SEQ ID NO: 12 (LCDR3); и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22, необязательно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG2a человека, и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig человека; или
(iii) клетку, экспрессирующую EPHA2; необязательно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к EPHA2 или его антигенсвязывающий фрагмент; и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO: 14 (HCDR2) и SEQ ID NO: 15 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 16 (LCDR1), SEQ ID NO: 17 (LCDR2) и SEQ ID NO: 18 (LCDR3); и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24, необязательно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека, и/или где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой каппа-цепи Ig человека.
17. Фармацевтическая композиция для лечения неопластического нарушения, содержащая: (i) модулятор сплайсинга по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемую соль; (ii) соединение по любому из пп. 5-13 или (iii) конъюгат антитела и лекарственного средства по любому из пп. 14-16 и фармацевтически приемлемый носитель.
18. Применение модулятора сплайсинга по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли, соединения по любому из пп. 5-13 или конъюгата антитела и лекарственного средства по любому из пп. 14-16 для лечения неопластического нарушения.
19. Применение модулятора сплайсинга по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли, соединения по любому из пп. 5-13 или конъюгата антитела и лекарственного средства по любому из пп. 14-16 для изготовления лекарственного средства для лечения неопластического нарушения.
20. Применение по п. 18, где неопластическое нарушение представляет собой:
(i) HER2-положительные рак молочной железы, рак яичника, рак желудка, рак легких, рак матки, остеосаркому или карциному слюнных протоков; необязательно, где HER2-экспрессирующий рак легких представляет собой аденокарциному легкого и/или HER2-экспрессирующий рак матки представляет собой серозную карциному эндометрия матки;
(ii) CD138-экспрессирующую множественную миелому; или
(iii) EPHA2-экспрессирующие рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак легких, меланому, рак толстой кишки или рак пищевода.
21. Применение по п. 19, где неопластическое нарушение представляет собой:
(i) HER2-положительные рак молочной железы, рак яичника, рак желудка, рак легких, рак матки, остеосаркому или карциному слюнных протоков; необязательно, где HER2-экспрессирующий рак легких представляет собой аденокарциному легкого и/или HER2-экспрессирующий рак матки представляет собой серозную карциному эндометрия матки;
(ii) CD138-экспрессирующую множественную миелому; или
(iii) EPHA2-экспрессирующие рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак легких, меланому, рак толстой кишки или рак пищевода.
22. Применение по п. 18, где модулятор сплайсинга, соединение или конъюгат антитела и лекарственного средства предназначены для применения в лечении неопластического нарушения в комбинации с ингибитором контрольных точек, который целенаправленно воздействует на CTLA4, PD1, PDL1, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3 и/или KIR.
23. Применение по п. 19, где модулятор сплайсинга, соединение или конъюгат антитела и лекарственного средства предназначены для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения неопластического нарушения в комбинации с ингибитором контрольных точек, который целенаправленно воздействует на CTLA4, PD1, PDL1, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3 и/или KIR.
24. Применение по п. 20, где модулятор сплайсинга, соединение или конъюгат антитела и лекарственного средства предназначены для применения в лечении неопластического нарушения в комбинации с ингибитором контрольных точек, который целенаправленно воздействует на CTLA4, PD1, PDL1, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3 и/или KIR.
25. Способ лечения субъекта, у которого имеется неопластическое нарушение или подозрение на его наличие, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества модулятора сплайсинга по любому из пп. 1-4, или его фармацевтически приемлемой соли, соединения по любому из пп. 5-13 или конъюгата антитела и лекарственного средства по любому из пп. 14-16.
26. Способ по п. 25, где неопластическое нарушение представляет собой:
(i) HER2-положительные рак молочной железы, рак яичника, рак желудка, рак легких, рак матки, остеосаркому или карциному слюнных протоков; необязательно, где HER2-экспрессирующий рак легких представляет собой аденокарциному легкого и/или HER2-экспрессирующий рак матки представляет собой серозную карциному эндометрия матки;
(ii) CD138-экспрессирующую множественную миелому; или
(iii) EPHA2-экспрессирующие рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак легких, меланому, рак толстой кишки или рак пищевода.
27. Способ по п. 25, дополнительно включающий введение субъекту ингибитора контрольных точек, который целенаправленно воздействует на CTLA4, PD1, PDL1, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3 и/или KIR.
| Lagisetti C | |||
| et al | |||
| Pre-mRNA splicing-modulatory pharmacophores: the total synthesis of herboxidiene, a pladienolide-herboxidiene hybrid analog and related derivatives //ACS chemical biology, 2014, 9(3), p | |||
| ПРИСПОСОБЛЕНИЕ В ЛЕСОПИЛЬНОЙ РАМЕ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОГО ИЗМЕНЕНИЯ ПОДАЧИ С ИЗМЕНЕНИЕМ ТОЛЩИНЫ БРЕВНА | 1923 |
|
SU643A1 |
| Puthenveetil S | |||
| et al | |||
| Natural product splicing inhibitors: a new class of antibody-drug conjugate (ADC) payloads //Bioconjugate | |||
