Заливочная среда для получения с помощью вибратома переживающих срезов нормальных и опухолевых тканей центральной нервной системы для анализа методами оптической и атомно-силовой микроскопии Российский патент 2023 года по МПК C08B37/12 C07K14/78 G01N1/36 

Изобретение относится к области клеточной биологии, биотехнологии, медицины, в частности, к методам исследования живой ткани центральной нервной системы и может быть использовано как в научных исследованиях, так и в медицине, для создания систем диагностики и типирования опухолей центральной нервной системы.

В научных исследованиях и медицинской практике существует большое количество способов подготовки здоровых и опухолевых тканей центральной нервной системы для изучения методами оптической и атомно-силовой микроскопии. Самым распространенным методом пробоподготовки биоматериала является приготовление простого гистологического препарата и его окрашивание гематоксилин-эозином для определения злокачественности ткани, более продвинутым является использование иммунотипирования с помощью антител, что позволяет определять наличие молекулярных маркеров в опухолевой ткани. Однако вышеперечисленные методы сводятся к анализу получаемых изображений с помощью простого оптического, иногда флуоресцентного, микроскопа в ручном режиме, что налагает соответствующее ограничения, а результат сильно зависит от опыта исследователя. С другой стороны, в настоящее время в биологии появился и успел себя зарекомендовать другой метод исследования клеток и тканей - атомно-силовая микроскопия. Такой подход позволяет исследовать как морфологию тканей и клеток, так и их вязкоупругие свойства, которые как оказалось, с одной стороны играют важную роль в развитие нормальных тканей и канцерогенезе, а с другой могут выступать независимыми маркерами для онкодиагностики [Huml, M.; Silye, R.; Zauner, G.; Hutterer, S.; Schilcher, K. Brain tumor classification using AFM in combination with data mining techniques. Biomed Res. Int. 2013, 2013, 176519]. С помощью метода атомно-силовой микроскопии можно получить количественную информацию, что делает его статистически релевантным методом анализа и исключает человеческий фактор.

Фиксированные гистологические препараты могут быть исследованы с помощью атомно-силового микроскопа, однако следует понимать, что вязкоупругие свойства живой и фиксированной ткани различны. Для полной и точной оценки морфологических и механических свойств опухолевой и здоровой ткани центральной нервной системы следуют изучать методом атомно-силовой микроскопии живую ткань. Однако метод накладывает технические ограничения на исследуемые образцы, в частности поверхность ткани должна быть ровной, перепады высот могу составлять не более 15 мкм. Послеоперационный и биопсионный материал характеризуется высокой гетерогенность и неровной структурой поверхности и без предварительной пробоподготовки не подходит для высокопроизводительного сканирования на АСМ [Ciasca, G.; Sassun, T.E.; Minelli, E.; Antonelli, M.; Papi, M.; Santoro, A.; Giangaspero, F.; Delfini, R.; De Spirito, M. Nanomechanical signature of brain tumours. Nanoscale 2016, 8, 19629-19643; Lekka, M.; Gil, D.; Pogoda, K.; Duli ´nska-Litewka, J.; Jach, R.; Gostek, J.; Klymenko, O.; Prauzner-Bechcicki, S.; Stachura, Z.; Wiltowska-Zuber, J.; et al. Cancer cell detection in tissue sections using AFM. Arch. Biochem. Biophys. 2012, 518, 151-156].

Вибратом позволяет получать переживающие срезы тканей центральной нервной системы. Однако для улучшения итогового качества срезов следует использовать специальную среду для заливки биоматериала, так как качество срезов сильно зависит от наличия и состава среды [Sallee, C.J.; Russell, D.F. Embedding of neural tissue in agarose or glyoxyl agarose for vibratome sectioning. Biotech. Histochem.1993, 68, 360-368].

Известна заливочная среда, состоящая из акриламида, метиленбисакриламида, тригидрокситриметилметана, лимонной кислоты, цитрата натрия и тростникового сахара (CN1072779A, МПК C12N11/02, G01N1/28, G01N33/544, опубл. 02.06.1993). Несмотря на то, что заливочный раствор обеспечивает быстрое получение качественных срезов, он не позволяет сохранить ткань живой. Кроме того, мономеры до полной полимеризации пропитывают ткань, изменяя её вязкоупругие свойства, что искажает результаты исследований с помощью атомно-силовой микроскопии.

Известна другая заливочная среда на основе желатина для получения срезов биоматериала для анализа методами микроскопии, которая не пропитывает ткань и не оказывает на нее термического воздействия, что позволяет сохранить ткань живой. Хотя в документе содержится информация о том, что такая среда позволяет предотвратить смятие ткани, качество поверхности получаемых срезов недостаточно для исследования методом атомно-силовой микроскопии, поскольку среда не обеспечивает должных вязкоупругих свойств для нервной ткани (US20170160174A1, МПК C08K5/09, C08L89/06, G01N1/30, опубл. 08.06.2017).

Другой средой для заливки, позволяющей сохранить ткань живой является прежелатинизированный крахмал, описанный в документе (CN102393321A, МПК G01N 1/28, опубл. 28.03.2012). Тем не менее вязкоупругие свойства такой заливочной среды так же не могут обеспечить качество получаемого среза, пригодное для исследования на атомно-силовом микроскопе.

Наиболее близким техническим решением по количеству существенных признаков является заливочная среда для получения переживающих срезов ткани центральной нервной системы схожей толщины с помощью вибротома, приготовленная на основе фосфатно-буферного раствора, содержащего 2% агарозы [Tsitlakidis, A.; Tsingotjidou, A.S.; Kritis, A.; Cheva, A.; Selviaridis, P.; Aifantis, E.C.; Foroglou, N. Atomic Force Microscope Nanoindentation Analysis of Diffuse Astrocytic Tumor Elasticity: Relation with Tumor Histopathology. Cancers 2021, 13, 4539].

В данном исследовании авторам удалось исследовать ткань на атомно-силовом микроскопии без получения подробных морфологических и механических карт поверхности, поскольку её качество позволило проводить измерения в отдельных точках с помощью зонда с большим радиусом острия (25 мкм), которое не могло обеспечить высокого разрешения. Другим существенным недостатком заливочной среды, заявленной в изобретении-прототипе, являются несбалансированные вязкоупругие свойства агарозного матрикса, которые не позволяют получить срезы центральной нервной системы, качество которых, удовлетворяет требованиям атомно-силовой и оптической микроскопии, так как на поверхности среза формируются значительные неоднородности и компрессионные деформации, искажающие морфологию ткани.

Технической проблемой, поставленной перед данным изобретением, является создание заливочной среды для получения переживающих срезов нормальных и опухолевых тканей центральной нервной системы с минимальной неоднородностью поверхности и деформацией образца, качество которых позволяет проводить высокопроизводительное картирование с помощью атомно-силовой и оптической микроскопии.

Поставленная техническая проблема решается тем, что в известной заливочной среде для получения переживающих срезов тканей центральной нервной системы, включающей полисахаридный компонент агарового происхождения в физиологическом растворе, согласно заявляемому изобретению, в качестве полисахаридного компонента используют агарозу или агар и вводят дополнительно коллаген до конечного содержания компонентов в следующем диапазоне, вес.%:

Агар или агароза 1,5 - 2,0 Коллаген 0,05 - 0,15

Использование агара в качестве полисахаридного компонента обеспечивает снижение стоимости заливочной среды без потери качества. Применение очищенной из агара агарозы также обеспечивает надлежащее качество, но увеличивает стоимость заливочной среды. Снижение концентрации агарозы или агара ниже 1,5% приводит к разрушению заливочной среды в процессе получения среза и как результат к невозможности анализа методами микроскопии. Повышение концентрации агарозы или агара выше 2,0% приводит к компрессионной деформации образца ткани и к ухудшению качества срезов до уровня, не позволяющего проводить анализ методами микроскопии.

Дополнительное введение в состав заливочной среды коллагена позволяет значительно улучшить её упругость, что снижает неоднородность поверхности срезов и улучшает качество картирования с помощью микроскопа. Содержания коллагена ниже отметки в 0,05% недостаточно для обеспечения упругости среды и соответственно качество срезов ухудшается. Содержание коллагена выше отметки в 0,15% приводит к избыточному увеличению упругости, что провоцирует деформацию ткани и увеличивает неоднородности на поверхности среза.

Изобретение характеризуется следующими фигурами.

На Фиг. 1 представлен процесс получения среза головного мозга крысы (a-d) , где: а - образец мозга внутри затвердевшей заливочной среды; b - схематическое изображение компонентов вибратома: (1 - образец мозга, 2 - конус заливочной среды, 3 - лезвие вибратома, 4 - направление движения лезвия вибратома, 5 - прокладка/спейсер); (c) Процесс получения среза головного мозга крысы в заливочной среде с недостаточной жесткостью (<2,5 мН/м) и эластичностью (<27 кПа); (d) Процесс получения среза головного мозга крысы в заливочной среде с подходящей жесткостью (2,6 мН/м) и эластичностью (27 кПа); (д) Процесс получения среза головного мозга крысы в заливочной среде с избыточной жесткостью (>3,5 мН/м) и эластичностью (>30 кПа); (f, g) контроль качества среза с помощью АСМ с зондом ScanAsyst Fluid High Resolution (канал датчика высоты): (f) поверхность среза агаровой заливочной среды (2,0% агара) без коллагена (канал датчика высоты); (g) поверхность среза коллагеново-агаровой заливочной среды (2,0% агара; 0,05 % коллагена).

На Фиг. 2 представлена сравнительная характеристика механики и жизнеспособности срезов тканей, полученных в различных типах заливочных сред с фрагментом ткани, не подвергавшейся заливке в среду и вибратомии, где: (а) Фрагмент ткани, не подвергшийся вибратомии. (b) Срез ткани, полученный в заливочной среде, состоящей из 1,5% агара, 0,15 % коллагена. (c) полученный в заливочной среде, состоящей из 2,0% агара, 0,05 % коллагена. (d) Срез ткани, полученный в заливочной среде, состоящей 2,0% агара, 0,10 % коллагена. (e) Срез ткани, полученный в заливочной среде, состоящей из 2,0% агара, 0,15 % коллагена.

На Фиг. 3 изображена поверхность среза мозга крысы, изученная с помощью лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) (a) Изображение, полученное с помощью ЛСМ, показывающее соотношение живых (зеленое свечение) и мертвых клеток (красное свечение). (h, i) Две области показывают 3D-реконструкцию меньших участков карты, выбранных для последующих исследований АСМ. Морфология поверхности выбранного среза, полученная с использованием зондов, модифицированных лазером (b) и с помощью микрочастиц (c). Врезки на обоих изображениях представляют трехмерные реконструкции этих областей. (d, e). Карты упругости, полученные с использованием зондов, модифицированных лазером (f, g). Карты эластичности и жесткости, полученные с использованием зондов, модифицированных микрочастицами.

На Фиг. 4 изображена поверхность среза опухоли головного мозга человека, изученная с помощью лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ), где: (a) Изображение, полученное с помощью ЛСМ, показывающее соотношение живых (зеленое свечение) и мертвых клеток (красное свечение). (h, i) Две области показывают 3D-реконструкцию меньших участков карты, выбранных для последующих исследований АСМ. Морфология поверхности выбранного среза, полученная с использованием зондов, модифицированных лазером (b) и с помощью микрочастиц (c). Врезки на обоих изображениях представляют трехмерные реконструкции этих областей. (d, e). Карты упругости, полученные с использованием зондов, модифицированных лазером (f, g). Карты эластичности и жесткости, полученные с использованием зондов, модифицированных микрочастицами.

На Фиг. 5 представлен комбинированный иммуногистохимический и морфологический анализ срезов головного мозга крысы, проведенный с помощью ЛСМ и АСМ, где: (а) Иммуногистохимия поверхности среза, снятая с помощью ЛСМ (синий сигнал - ядро клетки, маркированное DAPI; зеленый сигнал - белок цитоскелета GFAP - маркер астроглии); (b) объединенные каналы ЛСМ и АСМ; (c) морфологическая карта поверхности среза, полученная с помощью АСМ (датчик высоты).

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 3,34% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный раствор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ HEPES-NaOH, pH 7.4, 1,0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агара нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация в заливочной среде составляет: 2,0% агара и 0,1% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен на Фиг 1а.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0,2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм. Пример схемы фиксации конуса с образцом в поддоне вибратома представлен на Фиг 1b. Пример фотографии в момент удачного получения среза представлен на Фиг 1d. Как видно из представленной фигуры визуально срез обладает ровной, однородной поверхностью.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. Типичный вид морфологической карты представлен на Фиг. 3b и Фиг. 3c, типичный вид наномеханической карты представлен на Фиг. 3d, Фиг. 3e, Фиг 3f, Фиг 3g. Типичный вид морфологической карты поверхности среза заливочной среды представлен на Фиг 1g. Как видно из представленных фигур заливочная среда данного состава позволяет получить срез, который возможно картировать в высоком разрешении и качестве за счет ровной и однородной поверхности.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотиоционата и техасского красного. Изображения представлены на Фиг 3а, Фиг 3h, Фиг 3i. Как видно из представленных фигур заливочная среда данного состава позволяет получить срез, который возможно картировать с помощью лазерного сканирующего микроскопа, так как срез не подвергается деформации и его морфология не искажается.

Выживаемость клеток и механические свойства ткани сравнивают с таковыми у биоматериала, не подвергнутого вибратомии. Данные показатели представлены на Фиг. 2d. Как видно на представленной фигуре, заливочная среда данного состава сохраняет выживаемость клеток на высоком уровне в сравнении с контролем, не подвергнутым вибратомии (Фиг. 2а)

В качестве заливочной среды сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, используют 2% раствор агарозы на физиологическом солевом растворе. Готовят раствор 2% агара на физиологическом солевом растворе 150 мМ NaCl без добавления коллагена. Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 5 мл термостатированного раствора агарозы. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0,2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды на помещают чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. На морфологической карте поверхности среза заливочной среды видны регулярные диагональные полосы, являющееся результатом компрессионного сдавливания заливочной среды и ткани в момент получения среза, ввиду недостаточной упругости агарового геля без добавления коллагена. Для срезов ткани невозможно картирование с помощью атомно-силового микроскопа, ввиду крайне неровной поверхности.

Пример 2

В другом случае используют 2,5% агарозный раствор на солевом растворе 200мМ NaCl. Для делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 2,5% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ HEPES-NaOH, pH 7.4, 1,0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агарозы, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация в заливочной среде составляет: 1,5% агара и 0,15% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0,2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. Данный состав заливочной среды позволяет получить срезы, которые возможно картировать в высоком разрешении и качестве за счет ровной и однородной поверхности.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и техасского красного. Заливочная среда данного состава позволяет получить срез, который возможно картировать с помощью лазерного сканирующего микроскопа, так как срез не подвергается деформации и его морфология не искажается. Выживаемость клеток и механические свойства ткани сравнивают с таковыми у биоматериала, не подвергнутого вибратомии. Примеры показателей представлены на Фиг. 2b. Данный состав заливочной среды обеспечивает высокую выживаемость клеток в ткане.

В качестве заливочной среды сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, используют 2% раствор агара на физиологическом солевом растворе. Готовят раствор 2,5% агара на физиологическом солевом растворе 150 мМ NaCl без добавления коллагена. Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 5 мл термостатированного раствора агара. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0,2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды на помещают чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. На морфологической карте поверхности среза заливочной среды видны регулярные диагональные полосы (Фиг 1f), являющееся результатом компрессионного сдавливания заливочной среды и ткани в момент получения среза, ввиду недостаточной упругости агарового геля без добавления коллагена. Для срезов ткани невозможно картирование с помощью атомно-силового микроскопа, ввиду крайне неровной поверхности.

Пример 3

В другом случае используют 7,5 мг/мл коллагеновый раствор, а в физиологическом солевом буферном растворе заменяют 120 мМ HEPES-NaOH на 120 мМ TRIS-HCl.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 3,34% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агара нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация в заливочной среде составляет: 2,0% агара и 0,15% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. Данный состав заливочной среды позволяет получить срезы, которые возможно картировать в высоком разрешении и качестве за счет ровной и однородной поверхности.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и техасского красного. Заливочная среда данного состава позволяет получить срез, который возможно картировать с помощью лазерного сканирующего микроскопа, так как срез не подвергается деформации и его морфология не искажается. Выживаемость клеток и механические свойства ткани сравнивают с таковыми у биоматериала, не подвергнутого вибратомии. Примеры показателей представлены на Фиг. 2e. Данный состав заливочной среды обеспечивает высокую выживаемость клеток в ткане.

В заливочной среде сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, снижают концентрацию маточного раствора агара до 1,7%. Для этого делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 1,7% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация в заливочной среде составляет: 1,0% агара и 0,15% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. При попытке сделать срезы любой толщины заливочная среда разрушается и биоматериал из нее вываливается, что представлено на Фиг 1с.

Пример 4

В другом случае используют 1,5 мг/мл коллагеновый раствор, а в физиологическом солевом буферном растворе заменяют 120 мМ HEPES-NaOH на 120 мМ TRIS-HCl.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 1,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 3,3% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1,0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агарозы, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация в заливочной среде составляет: 2,0% агара и 0,05% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. Данный состав заливочной среды позволяет получить срезы, которые возможно картировать в высоком разрешении и качестве за счет ровной и однородной поверхности.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор 4% PFA, приготовленный на PBS и инкубируют в течение 20 минут, затем заменяют раствор PFA на 0.5% раствор PBS-Triton и инкубируют в течение 10 минут. Чашку Петри с образцом промывают и добавляют раствор первичных мышиных антител против Глиального фибриллярного кислого белка на 1 час. Чашку Петри с образцом промывают и добавляют раствор вторичных антител против мыши на 1 час. Чашку Петри с образцом промывают и добавляют раствор 4',6-диамидино-2-фенилиндол (ДАФИ) на 5 минут. Чашку Петри с образцом промывают троекратно.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и синим флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и ДАФИ.

Изображение морфологической карты, полученной с помощью атомно-силового микроскопа и изображение, полученное на лазерном сканирующем микроскопе, совмещают, как представлено на Фиг. 5. Выживаемость клеток и механические свойства ткани сравнивают с таковыми у биоматериала, не подвергнутого вибратомии. Примеры показателей представлены на Фиг. 2c. Данный состав заливочной среды позволяет получить срезы, качество которых удовлетворяет требованиям лазерной сканирующей и микроскопии, в том числе проведению иммуногистохимического исследования, за счет сохранения оригинальной морфологии ткани.

В заливочной среде сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, повышают концентрацию маточного раствора агара до 4,2%. Для этого делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 4,2% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация в заливочной среде составляет: 2,5% агара и 0,15% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0,2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. При попытке сделать срезы любой толщины ткань дезагрегирует на мелкие кусочки и разрушается, что представлено на Фиг 1e.

Пример 5

В ином варианте вместо фрагмента головного мозга крысы используют послеоперационный материал ткани опухоли головного мозга человека (глиобластома).

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 3,3% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ HEPES-NaOH, pH 7.4, 1,0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агара нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация составляет: 2,0% агара и 0.1% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент ткани опухоли головного мозга человека. Помещают форму со средой и фрагментом опухоли мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. Типичный вид морфологической карты представлен на Фиг. 4b и Фиг. 4c, типичный вид наномеханической карты представлен на Фиг. 4d, Фиг. 4e, Фиг 4f, Фиг 4g.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и техасского красного. Примеры изображений представлены на Фиг 4а, Фиг 4h, Фиг 4i.

Данный состав заливочной среды позволяет получать срезы высокого качества, подходящие для атомно-силовой и лазерной сканирующей микроскопии за счет сохранения морфологии, отсутствия деформации и ровной однородной поверхности.

В качестве заливочной среды сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, используют 2% раствор агарозы на физиологическом солевом растворе. Готовят раствор 2% агарозы на физиологическом солевом растворе 150 мМ NaCl без добавления коллагена. Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 5 мл термостатированного раствора агарозы. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент ткани опухоли головного мозга человека. Помещают форму со средой и фрагментом опухоли мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды на помещают чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. На морфологической картые поверхности среза заливочной среды видны регулярные диагональные полосы, являющееся результатом компрессионного сдавливания заливочной среды и ткани в момент получения среза, ввиду недостаточной упругости агарозного геля без добавления коллагена. Для срезов ткани невозможно картирование с помощью атомно-силового микроскопа, ввиду крайне неровной поверхности.

Пример 6

В другом случае используют 2,5% агарозный раствор на солевом растворе 200мМ NaCl, а вместо фрагмента головного мозга крысы используют послеоперационный материал ткани опухоли головного мозга человека (глиобластома). Для делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 2,5% агарозы на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ HEPES-NaOH, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агарозы, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация составляет: агарозы 1,5%, коллагена 0,15%. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент ткани опухоли головного мозга человека. Помещают форму со средой и фрагментом опухоли мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и техасского красного.

Данный состав заливочной среды позволяет получать срезы высокого качества, подходящие для атомно-силовой и лазерной сканирующей микроскопии за счет сохранения морфологии, отсутствия деформации и ровной однородной поверхности.

В качестве заливочной среды сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, используют 2% раствор агара на физиологическом солевом растворе. Готовят раствор 2,5% агара на физиологическом солевом растворе 150 мМ NaCl без добавления коллагена. Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 5 мл термостатированного раствора агара. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент ткани опухоли головного мозга человека. Помещают форму со средой и фрагментом опухоли мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды на помещают чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды. На морфологической карте поверхности среза заливочной среды видны регулярные диагональные полосы, являющееся результатом компрессионного сдавливания заливочной среды и ткани в момент получения среза, ввиду недостаточной упругости агарового геля без добавления коллагена. Для срезов ткани невозможно картирование с помощью атомно-силового микроскопа, ввиду крайне неровной поверхности.

Пример 7

В другом случае используют 7,5 мг/мл коллагеновый раствор, а в физиологическом солевом буферном растворе заменяют 120 мМ HEPES-NaOH на 120 мМ TRIS-HCl, а вместо фрагмента головного мозга крысы используют послеоперационный материал ткани опухоли головного мозга человека (глиобластома). Для делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 3,34% агарозы на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агарозы, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом, конечная концентрация составляет: агарозы 2,0%, коллагена 0,15%. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент ткани опухоли головного мозга человека. Помещают форму со средой и фрагментом опухоли мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и техасского красного.

Данный состав заливочной среды позволяет получать срезы высокого качества, подходящие для атомно-силовой и лазерной сканирующей микроскопии за счет сохранения морфологии, отсутствия деформации и ровной однородной поверхности.

В заливочной среде сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, снижают концентрацию маточного раствора агара до 1%. Для этого делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 1,7% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. При попытке сделать срезы любой толщины заливочная среда разрушается и биоматериал из нее вываливается.

Пример 8

В другом случае используют 1,5 мг/мл коллагеновый раствор, а в физиологическом солевом буферном растворе заменяют 120 мМ HEPES-NaOH на 120 мМ TRIS-HCl, а вместо фрагмента головного мозга крысы используют послеоперационный материал ткани опухоли головного мозга человека (глиобластома). Для делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 1,5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 3,3% агарозы на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1,0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агарозы, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования, таким образом конечная концентрация составляет: 2,0% агарозы, 0,05% коллагена. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент ткани опухоли головного мозга человека. Помещают форму со средой и фрагментом опухоли мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0,2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. Делают несколько срезов ткани толщиной от 100 до 350 мкм.

Срез ткани и заливочной среды помещают на чашку Петри, закрепляя с помощью тонкой пленки цианоакрилатного клея. Добавляют 5 мл раствора ДНКазы в концентрации 1000 е.д./мл и инкубируют на комнатной температуре 5 минут.

Раствор ДНКазы заменяют на питательную среду DMEM, чашку Петри монтируют на атомно-силовой микроскоп и проводят комбинированное морфологическое и наномеханическое картирование участка среза мозга и участка среза заливочной среды.

Раствор DMEM в чашке Петри с образцом заменяют на раствор для исследования жизнеспособности клеток, содержащий FDA в концентрации 8мг/мл и PI в концентрации 50 мг/мл, в этом растворе ткань инкубируют 5 минут, после чего заменяют раствор на питательную среду DMEM.

Чашку Петри с образцом монтируют на лазерный сканирующий микроскоп, где получают изображения в зеленом и красном флуоресцентных каналах, соответствующих возбуждения флуоресцеина изотеоционата и техасского красного. Данный состав заливочной среды позволяет получать срезы высокого качества, подходящие для атомно-силовой и лазерной сканирующей микроскопии за счет сохранения морфологии, отсутствия деформации и ровной однородной поверхности.

В заливочной среде сравнения, не позволяющей достигать заявленного технического результата, повышают концентрацию маточного раствора агара до 4.2%. Для этого делают следующее.

Первоначально для приготовления заливочной среды готовят маточный раствор 7.5 мг/мл коллагена на 30мМ уксусной кислоте, так же ведут приготовление раствора 4.2% агара на солевом растворе 200мМ NaCl, для нейтрализации кислой среды маточного раствора коллагена при последующем желировании готовят физиологический солевой буферный растовор со следующей концентрацией основных компонентов: 150 мМ NaCl, 120 мМ TRIS-HCl, pH 7.4, 1.0 мМ NaOH. Готовят форму для заливки фрагментов мозга, получая её путем отсечения донной конической части центрифужной пробирки типа Falcon объемом 50 мл.

Непосредственно перед заливкой биоматериала раствор агарозы нагревают в микроволновой печи, избегая кипения, доводя до жидкого состояния, затем термостатируют раствор на водяной бане на температуре 37°С в течение 10 минут. В предварительно приготовленную форму для заливки добавляют 3 мл термостатированного раствора агара, 1 мл коллагена, 1 мл физиологического солевого буферного раствора, перемешивают путем пипетирования. Немедленно с помощью пинцета помещают внутрь формы с не отвердевшей заливочной средой фрагмент мозга крысы. Помещают форму со средой и фрагментом мозга на ледяную баню на 5 минут.

По прошествии 5 минут извлекают затвердевшую заливочную среду с образцом из формы для заливки, приклеивают к предметному стеклу на цианоакрилатный клей, предметное стекло с конусом отвердевшей заливочной среды с материалом фиксируют в поддоне вибратома. Пример конуса из затвердевшей заливочной среды с биоматериалом внутри представлен.

Поддон с конусом монтируют на вибратом, устанавливают угол лезвия к плоскости предметного стекла в 13°, скорость движения лезвия 0.2 мм/с, частоту вибрации лезвия 50 Гц. При попытке сделать срезы любой толщины ткань дезагрегирует на мелкие кусочки и разрушается.

Заявленное изобретение обеспечивает получение срезов, качество которых позволяет проводить их картирование в высоком разрешении и качестве с помощью атомно-силовой микроскопии, так как их поверхность однородная, не содержит неровностей. Среда не пропитывает ткань и не искажает её механические свойства. Это обеспечено добавлением в состав среды коллагена, который обеспечивает должную упругость. Кроме того, среда позволяет сохранить морфологию ткани, не деформирует её, поэтому срезы возможно изучать с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Представленная заливочная среда сохраняет жизнеспособность ткани во время вибратомии, так что соотношение живых и мертвых клеток статистически неотличимо от ткани, которая вибратомии не подвергается.

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к заливочной среде для получения переживающих срезов тканей центральной нервной системы, включающей полисахаридный компонент агарового происхождения в физиологическом растворе, отличающейся тем, что в качестве полисахаридного компонента используют агарозу или агар и вводят дополнительно коллаген до конечной концентрации компонентов в следующем диапазоне, вес.%: агар или агароза 1,5-2,0; коллаген 0,05-0,15. Технический результат заключается в получении переживающих срезов нормальных и опухолевых тканей центральной нервной системы с минимальной неоднородностью поверхности и деформацией образца, качество которых позволяет проводить высокопроизводительное картирование с помощью атомно-силовой и оптической микроскопии. 5 ил., 8 пр.

Заливочная среда для получения переживающих срезов тканей центральной нервной системы, включающая полисахаридный компонент агарового происхождения в физиологическом растворе, отличающаяся тем, что в качестве полисахаридного компонента используют агарозу или агар и вводят дополнительно коллаген до конечной концентрации компонентов в следующем диапазоне, вес.%:

Агар или агароза 1,5 - 2,0 Коллаген 0,05 - 0,15