Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 807 352

(13)

(51)

МПК

C12Q1/68(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2022133328, 2022-12-19

(24)

Дата начала отсчета патента

2022-12-19

(22)

дата подачи заявки

2022-12-19

(45)

опубликовано

2023-11-14

(72)

авторы

Болдырев Степан ВячеславовичСамад СамияБаик Алина СвятославовнаКотелевцев Иван СергеевичГенцбиттель Лоран Андре СильванБен Сесиль

(73)

патентообладатели

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Научно-Исследовательский Институт Радиологии И Агроэкологии Национального Исследовательского Центра Институт"

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

PECCHIA, SUSANNA et alMolecular Detection of the Seed-Borne Pathogen Colletotrichum Lupini Targeting the Hyper-Variable IGS Region of the Ribosomal ClusterCampbell N R et alGenotyping-in-Thousands by sequencing (GT-seq): A cost effective SNP genotyping method based

НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ГРИБОВ ВИДОВОГО КОМПЛЕКСА COLLETOTRICHUM ACUTATUM Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68

Описание патента на изобретение RU2807352C1

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, фитопатологии, в частности относится к контролю распространения возбудителя антракноза Colletotrichum lupini. В частности, относится к селекции люпина белого и люпина желтого на устойчивость к антракнозу, где используется для контроля инфекционного фона.

Уровень техники

Антракноз люпина, вызываемый по всему миру несовершенными грибами вида Colletotrichum lupini, обладающими высокой агрессивностью и вирулентностью по отношению растению-хозяину и приводящий к потерям до 90% урожая в отдельные годы, остается неразрешенной проблемой (Thomas G., et al., Application of fungicides to reduce yield loss in anthracnose-infected lupins. Crop Prot. 2008; 27, 1071–1077). Это препятствует включению в севооборот и увеличению посевных площадей люпина белого и люпина желтого. На сегодняшний момент проводится активный мониторинг распространения возбудителя антракноза по районам возделывания люпина, с целью определения регионов видообразования Colletotrichum lupini и определения карантинных зон, из-за наличия в них наиболее вредоносных изолятов гриба. Одной из основных задач для селекционеров, занимающихся люпином, остается поиск источников устойчивости к антракнозу, а также определение локусов в геноме, связанных с устойчивостью к данному заболеванию (Alkemade J.A., et al., Genetic diversity of Colletotrichum lupini and its virulence on white and Andean lupin. Sci Rep 11, 13547 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-92953-y). Однако, чтобы ставить контролируемые эксперименты по картированию локусов устойчивости и контролировать инфекционный фон в селекционных питомниках, необходимо обладать инструментом для точного определения генотипов грибов вида C. lupini.

Род Colletotrichum (тип Ascomycota, подтип Sordariomycetes, порядок Glomerellales) содержит по меньшей мере 150 видов, разделенных на десять основных клад. Одним из крупнейших из них является видовой комплекс Colletotrichum acutatum, в который входит вид Colletotrichum lupini, включает грибковые патогены, поражающие большое разнообразие растений в естественных и управляемых экосистемах. Видовой комплекс имеет очень широкий спектр хозяев, и штаммы были связаны с болезнями более чем 90 родов растений и по меньшей мере трех видов насекомых (Lardner, R., et al., Morphological and Molecular Analysis of Colletotrichum Acutatum Sensu Lato. Mycological Research 103, no. 3 (March 1999): 275–85. https://doi.org/10.1017/S0953756298007023). Согласно опубликованным данным, для генотипирования изолятов антракноза используют тест-системы, основанные на классической ПЦР, ПЦР в реальном времени с гибридизационными пробами (TaqMan), секвенирование по Сэнгеру (Kamber, Tim, et al., A QPCR Assay for the Fast Detection and Quantification of Colletotrichum Lupini. Plants 10, no. 8 (July 28, 2021): 1548. https://doi.org/10.3390/plants10081548). Классические ПЦР системы основаны на отсутствии/наличии фрагмента ДНК заведомо известного размера, определяемого с использованием агарозного или акриламидного гель-электрофореза после проведения реакции. При наличии фрагмента требуемого размера диагностируется принадлежность изучаемого образца к виду Colletotrichum lupini. Также для генотипирования и решения филогенетичских задач были созданы системы, основанные на определении количества повторов в микросателлитных последовательностях (Pecchia, Susanna, et al., Molecular Detection of the Seed-Borne Pathogen Colletotrichum Lupini Targeting the Hyper-Variable IGS Region of the Ribosomal Cluster. Plants 8, no. 7 (July 14, 2019): 222. https://doi.org/10.3390/plants8070222). Для выявления абсолютного и относительного уровня инфицирования растения-хозяина патогеном используются ПЦР-системы в реальном времени, основанные на гибридизации пробы (TaqMan) с флюорофором и гасителем к комплементарной матрице. Для решения филогенетических задач наиболее точным способом генотипирования, однако имеющим свои ограничения, остается метод секвенирования по Сенгеру нескольких локусов (ITS, GAPDH, TUB2, CHS-1, ACT, HIS3, HMG, APN/MAT1) как совместно, так и отдельно и обладающих высоким полиморфизмом среди видового комплекса Colletotrichum acutatum (Dubrulle, Guillaume, et al., Phylogenetic Diversity and Effect of Temperature on Pathogenicity of Colletotrichum Lupini. Plant Disease 104, no. 3 (March 2020): 938–50. https://doi.org/10.1094/PDIS-02-19-0273-RE). Однако в случае необходимости генотипирования большого количества образцов затраты на секвенирование методом Сенгера всех перечисленных локусов будут существенными. Так же данный метод возможно использовать только на моноспоровых культурах или линиях грибов, из-за этого время, требующееся для проведения анализа, значительно увеличивается.

Сущность изобретения

Одним из способов решения вышеозначенной проблемы является разработка набора олигонуклеотидных праймеров, специфически комплементарных консервативным участкам геномов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, подходящих для идентификации сельскохозяйственно значимых видов рода Colletotrichum, в том числе возбудителя антракноза люпина белого и люпина желтого Colletotrichum lupini, продукты амплификации которых обладают размером не более 400 п. н., и их возможно использовать для последующего секвенирования нового поколения.

Задача определения видовой принадлежности грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum решается путем создания набора специфичных праймеров, представляющими собой набор из олигонуклеотидных последовательностей длинной от 20 до 30 дезокирибонуклеотидов, к консервативным участкам локусов, обладающих видоспецифичными полиморфизмами и подходящими для секвенирования нового поколения (GTseq, AmpSeq, CleanPlex и др.).

Описанный в данном изобретении набор олигонуклеотидов разработан на основании анализа нуклеотидного разнообразия вариабельных участков моноспоровых линий грибов, в том числе патогенных, видового комплекса Colletotrichum acutatum.

Указанная задача решается путем создания набора праймеров для определения видовой принадлежности изолятов и/или штаммов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, включающего следующие стадии:

1. Выделяют общую ДНК из образца или образцов, предположительно содержащих мицелий гриба.

2. К патентуемым праймерам (SEQ _ID_NO:1, SEQ _ID_NO:2, SEQ _ID_NO:3, SEQ _ID_NO:4, SEQ _ID_NO:5, SEQ _ID_NO:6, SEQ _ID_NO:7, SEQ _ID_NO:8, SEQ _ID_NO:9, SEQ _ID_NO:10, SEQ _ID_NO:11, SEQ _ID_NO:12, SEQ _ID_NO:13, SEQ _ID_NO:14, SEQ _ID_NO:15, SEQ _ID_NO:16, SEQ _ID_NO:17, SEQ _ID_NO:18, SEQ _ID_NO:19, SEQ _ID_NO:20) со стороны 5’- конца добавляется служебная последовательность, необходимая для присоединения технических последовательностей (последовательностей-адаптеров) (Yang, S., Fresnedo-Ramírez, J., Wang, M. et al. A next-generation marker genotyping platform (AmpSeq) in heterozygous crops: a case study for marker-assisted selection in grapevine. Hortic Res 3, 16002 (2016). https://doi.org/10.1038/hortres.2016.2; Campbell, N.R., Harmon, S.A. and Narum, S.R. (2015), Genotyping-in-Thousands by sequencing (GT-seq): A cost effective SNP genotyping method based on custom amplicon sequencing. Mol Ecol Resour, 15: 855-867. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12357), зависящих от типа приготовляемой ДНК-библиотеки для секвенирования нового поколения и для последующего демультиплексирования и анализа образцов.

3. Методом мультиплексной ПЦР с использованием набора праймеров создается ДНК-библиотека ампликонов для всех исследуемых образцов.

4. Методом секвенирования нового поколения определяется последовательность нуклеотидов для каждого ампликона с двух сторон с длинной прочтений с каждой стороны не менее 150 нуклеотидов одновременно для всех образцов.

5. Биоинформатическими методами выравнивания последовательностей и филогенетического сравнения c генетическими базами данных, содержащими последовательности по локусам ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 для грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, определяется качественный видовой и внутривидовой состав в анализируемых образцах.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что для каждого из образцов последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 или каждого из локусов в отдельности можно определить с помощью секвенирования по Сэнгеру, но без необходимости добавления к 5’-концам праймеров технических последовательностей.

Таким образом, в рамках настоящего изобретения разработан набор олигонуклеотидных последовательностей, праймеров, для идентификации сельскохозяйственно значимых изолятов гриба Colletotrichum lupini, являющегося возбудителем антракноза люпина белого и люпина желтого, методом секвенирования ДНК путем амплификации и последующего определения нуклеотидных последовательностей фрагментов внутреннего транскрибируемого региона и 5.8S рРНК между генами малой (18S), большой субъединицы (23S) рибосомальной РНК (ITS1, ITS2), гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), гена бета-тубулина (TUB2), межгенной последовательности Apn2-Mat1-2-1 (APN/MAT1). Указанный набор содержит 20 олигонуклеотидов, обладающих праймерной активностью, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков перечисленных локусов (ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1) грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum.

Настоящее изобретение позволяет расширить набор средств для амплификации и прицельного секвенирования, в том числе с применением методов секвенирования нового поколения фрагментов локусов (ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1) различных изолятов вида Colletotrichum lupini, возбудителя антракноза люпина белого и люпина желтого, а также близких ему видов комплекса Colletotrichum acutatum (C.tamarilloi, C.costaricensis, C.melonis, C.cuscutae, C.paranaense, C.nymphaeae, C.simmondsii, C.acutatum).

Также изобретение позволяет повысить точность и скорость установления видовой принадлежности моноспоровых и мультиспоровых изолятов видов комплекса Colletotrichum acutatum, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации сельскохозяйственно значимых изолятов антракноза, фитосанитарного контроля распространения патогенных штаммов, контроля инфекционного фона на селекционных и семеноводческих участках люпина белого и люпина желтого.

Краткое описание рисунков

Фигура 1. Филогенетическое дерево, с исследуемыми образцами и образцами сравнения из видового комплекса Colletotrichum acutatum, построенное на основании нуклеотидных последовательностей локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1

Фигура 2. Схема расположения набора прямых и обратных праймеров на локусах а) ITS б) GAPDH в) TUB2 г) APN/MAT1

Подробное раскрытие изобретения

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Изолятом гриба называется первое односпоровое (моноспоровое) или чистое выделение грибов из любого источника, субстрата. Линия - внешне однородная популяция, выравненность которой поддерживается отбором. Термин «линия» применяют к группе особей, отличающихся от остальных характерным признаком или группой признаков и сохраняющих это отличие в течение ряда поколений. Обычно большинство особей линии гомозиготно по генам, определяющим характерные для нее признаки, но не исключено наличие гетерозигот по другим признакам. Штамм - чистая культура бактерий, грибов и иных микроорганизмов, выделенная из определенного источника и идентифицированная по тестам современной классификации. В рамках описания данного изобретения, термины изолят, линия и штамм являются взаимозаменяемыми, поскольку раскрываемый в данном изобретении способ определения вида на основе подобранного набора праймеров применим как к различным изолятам, так и к линиям и штаммам грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum.

Номера нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO) в тексте описания соответствуют таковым в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, являющемуся частью настоящего описания изобретения. В случае наличия разночтений в структуре последовательностей между текстом описания и соответствующей последовательностью в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, приоритетными являются данные, представленные в тексте описания.

Данное изобретение описывает набор праймеров для установления видовой принадлежности изолятов грибов рода видового комплекса Colletotrichum acutatum.

Описанный в данном изобретении набор праймеров создан на основании анализа естественной вариабельности в популяции штаммов грибов рода видового комплекса Colletotrichum acutatum, выделенных с различных растений-хозяев в различных регионах Мира. Позиции под праймеры были выбраны в консервативных участках локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, представленных в (Фигура 2), и являются специфичными. Решение, предлагаемое в данном изобретении, состоит в создании набора праймеров, при помощи которых в процессе ПЦР образуются ампликоны длиной не более 400 нуклеотидов, пригодные для секвенирования нового поколения с длиной прочтения не менее 150 пар нуклеотидов при прочтении в обе стороны. Такой набор праймеров позволяет в относительно короткие сроки создавать ДНК-библиотеку из десятков образцов изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum и секвенировать ее методом нового поколения.

Олигонуклеотидные последовательности были разработаны in silico на основании консервативной референсной последовательности, указанной в Таблице 2, полученной при выравнивании последовательностей локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 программой UGENE V44.0 алгоритмом MUSCLE V5, взятых из базы нуклеотидных последовательностей GenBank, для 50 штаммов грибов рода Colletotrichum, перечисленных в Таблице 1. Также олигонуклеотидные последовательности отбирали с учетом гуанин-цитозинового состава – от 40 до 60 %. Температуры плавления подбираемых праймеров находились в пределах от 55°C до 60°C. Для определения последовательностей ампликонов используют метод AmpSeq или подобный ему, включающем два раунда ПЦР. В первом раунде происходит амплификация вариабельного участка и добавление линкерных последовательностей, а во втором к линкерным последовательностям добавляют уникальные для каждого образца баркоды. Полученный пул ампликонов секвенируется по протоколу Illumina. Анализ результатов секвенирования проводится стандартными биоинформатическими методами. После чего последовательности от каждого образца выравниваются, собираются в одну и подвергаются филогенетическому анализу совместно с последовательностями 50 штаммов различных видов видового комплекса Colletotrichum acutatum (C. lupini, C. tamarilloi, C. costaricensis, C. melonis, C. cuscutae, C. paranaense, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. acutatum) или аналогичным набором последовательностей. На основании проведенного выравнивания были рассчитаны апостериорные вероятности по алгоритму MrBayes с применением цепей Маркова и построено филогенетическое дерево в программном обеспечении UGENE V44.0. В полученной филограмме определяется в какую кладу, то есть к каким видами, попадет исследуемый образец, и на этом основании определяется его вид.

Структура 20 олигонуклеотидных последовательностей (10 пар праймеров в сочетаниях SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:10):

SEQ ID NO:1

CGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGG

SEQ ID NO:2

GCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCT

SEQ ID NO:3

ATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCT

SEQ ID NO:4

TAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCT

SEQ ID NO:5

TTCGTCTGCTGCCTTAGGCCGA

SEQ ID NO:6

GACCTGCCTATGTGGATCATCAGCTAT

SEQ ID NO:7

GAAATGTATAGACTACGACGCTTGA

SEQ ID NO:8

ATAATGGAATCATAATGTTCATGTCTCATT

SEQ ID NO:9

CGAAAGGATAGAGCAATTCGCGT

SEQ ID NO:10

AACCGGAGGAGCACTTCAGCCT

SEQ ID NO:11

TTCATTGAGACCAAGTACGCTGT

SEQ ID NO:12

GAGCGTACTTGAGCATGTAGGCCT

SEQ ID NO:13

GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA

SEQ ID NO:14

TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGA

SEQ ID NO:15

GACGTCGTGTAAATAGAGTTTGGTTTCCT

SEQ ID NO:16

TTTACGGCAAGAGTCCCTCCG

SEQ ID NO:17

GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCT

SEQ ID NO:18

GGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATG

SEQ ID NO:19

TAGACGCTCATGCGCTCGAGCTG

SEQ ID NO:20

GGAACGTACTTGTTGCCGGAGGCCT

Также каждому праймеру было присвоено название:

SEQ ID NO:1 - LCG_Sk_F1; SEQ ID NO:2 - LCG_Sk_F10; SEQ ID NO:3 - LCG_Sk_F11; SEQ ID NO:4 - LCG_Sk_F12; SEQ ID NO:5 - LCG_Sk_R10; SEQ ID NO:6 - LCG_Sk_R3; SEQ ID NO:7 - LCG_Sk_R4; SEQ ID NO:8 - LCG_Sk_R5; SEQ ID NO:9 - LCG_Sk_R6; SEQ ID NO:10 - LCG_Sk_R7; SEQ ID NO:11 - LCG_Sk_F5; SEQ ID NO:12 - LCG_Sk_R2; SEQ ID NO:13 - LCG_Sk_F2; SEQ ID NO:14 - LCG_Sk_F9; SEQ ID NO:15 - LCG_Sk_R1; SEQ ID NO:16 - LCG_Sk_R8; SEQ ID NO:17 - LCG_Sk_F6; SEQ ID NO:18 - LCG_Sk_F7; SEQ ID NO:19 - LCG_Sk_R11; SEQ ID NO:20 - LCG_Sk_R9.

Таблица 1. Набор видов видового комплекса Colletotrichum acutatum, использовавшийся для поиска консервативных участков ДНК в локусах ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1. Название линии, GenBank Видовое название Вид растения-хозяина Номер доступа GenBank Локус ITS Локус GAPDH Локус TUB2 Локус APN/MAT1 CBS 109216 C. lupini L. mutabilis MT741840 MW342515 MW342537 MW342559 CBS 109221 C. lupini L. albus MW342494 MW342516 MW342538 MW342560 CBS 109225 C. Lupini L. albus MW342495 MW342517 MW342539 MW342561 CBS 109226 C. lupini L. albus MW342496 MW342518 MW342540 MW342562 CBS 122122 C. simmondsii Carica papaya MW342497 MW342519 MW342541 MW342563 CBS 129814 C. tamarilloi Solanum betaceum MW342498 MW342520 MW342542 MW342564 CBS 129955 C. tamarilloi Solanum betaceum MW342499 MW342521 MW342543 MW342565 CBS 130239 C. nymphaeae Fragaria x ananassa MW342500 MW342522 MW342544 MW342566 CBS 134730 C. melonis Malus domestica MW342501 MW342523 MW342545 MW342567 CBS 211.78 C. costaricensis Coffea sp. MW342502 MW342524 MW342546 MW342568 CBS 369.73 C. acutatum L. angustifolius MW342503 MW342525 MW342547 MW342569 CBS 370.73 C. acutatum Pinus Aridata MW342504 MW342526 MW342548 MW342570 CBS 509.97 C. lupini L. albus MW342505 MW342527 MW342549 MW342571 IMI 304,802 C. cuscutae Cuscuta sp. MW342506 MW342528 MW342550 MW342572 IMI 360928 C. nymphaeae Fragaria x ananassa MW342507 MW342529 MW342551 MW342573 IMI 375715 C. lupini L. albus MW342508 MW342530 MW342552 MW342574 IMI 384185 C. paranaense Caryocar brasiliense MW342509 MW342531 MW342553 MW342575 JA01 Colletotrichum lupini Lupinus albus MW342510 MW342532 MW342554 MW342576 JA02 C. lupini L. albus MW342511 MW342533 MW342555 MW342577 JA03 C. lupini L. albus MW342512 MW342534 MW342556 MW342578 JA04 C. lupini L. albus MW342513 MW342535 MW342557 MW342579 JA05 C. lupini L. albus MW342514 MW342536 MW342558 MW342580 JA06 C. lupini L. albus JQ948156 JQ948486 JQ949807 MW342581 JA07 C. lupini L. angustifolius JQ948169 JQ948499 JQ949820 MK478328 JA08 C. lupini L. luteus JQ948155 JQ948485 JQ949806 MK478329 JA09 C. lupini L. albus JQ948158 JQ948488 MK478189 MK478316 JA10 C. lupini L. albus JQ948159 JQ948489 JQ949810 MK478355 JA11 C. lupini L. albus JQ948161 JQ948491 JQ949812 MK478341 JA12 C. lupini L. albus MK463722 KM252117 MK478186 MK478308 JA13 C. lupini L. mutabilis MH865693 JQ948508 JQ949829 MK478310 JA14 C. lupini L. hartwegii MK463723 KM252194 KM251944 MK478313 JA15 C. lupini L. albus MK463726 MK463750 MK478190 MK478317 JA16 C. lupini L. angustifolius MK463727 MK463751 MK478191 MK478318 JA17 C. lupini L. albus MK463728 MK463752 MK478192 MK478319 JA18 C. lupini L. mutabilis JQ948172 JQ948502 JQ949823 MK478320 JA19 C. lupini L. mutabilis MK463729 MK463753 MK478193 MK478321 JA20 C. lupini L. mutabilis MK463730 KM252203 KM251951 MK478322 JA21 C. lupini L. mutabilis MK463733 MK463756 MK478196 MK478345 JA22 C. lupini L. mutabilis MK463738 MK463761 MK478201 MK478350 RB020 C. lupini L. albus JQ948184 JQ948514 JQ949835 MW342584 RB042 C. lupini Cinnamonium zeylanicum JQ948189 JQ948519 JQ949840 MK478307 RB116 C. lupini L. polyphyllus JQ948181 JQ948511 JQ949832 MK478333 RB122 C. lupini L. luteus KC204997 KC205031 KC205065 MK478357 RB123 C. lupini L. albus JQ948195 JQ948525 JQ949846 MK478340 RB124 C. lupini L. albus JQ948191 JQ948521 JQ949842 MK478342 RB125 C. lupini L. albus JQ948250 JQ948580 JQ949901 MW342583 RB127 C. lupini Olea europaea JQ948243 JQ948573 JQ949894 MK478326 RB147 C. lupini Lupinus sp. JQ948276 JQ948606 JQ949927 MK478332 RB221 C. lupini Lupinus sp. JQ948350 JQ948681 JQ950001 MW342582 RB226 C. lupini Lupinus sp. JQ948351 JQ948682 JQ950002 MK478335

Таблица 2. Консервативные последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, полученные после выравнивания 50 изолятов видового комплекса Colletotrichum acutatum. Прочерками в последовательностях обозначены не консервативные участки. Название локуса Длина фрагмента, п. н. Последовательность нуклеотидов, 5’-3’ ITS
(SEQ ID NO:21) 496 TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAAC-TACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCC-TCCCCTCCCGGCGCCG--CCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATG-GAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCA-ACGTGGGCCCTT-AAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACG-CTCGCAC-GGGAT-CGGAGGGACTCTTGCCGTAAA-CCCCC--A-TT-TTTACAG GAPDH
(SEQ ID NO:22) 259 TTCATTGAGACCAAGTACGCTGT-AGTA-CA-CC-ACTTTACCCCTCCATC-TG-TATC-CGTCT-CCAC-ATAACACCAGCTTCGTCG-TA-C--C-GG-AAAAGAGT--G--CTAGC---CTC-AC-T-TTT--CCCC--GGTTTCGA-TGGGCT-GTTGTA--GA--CGACGTGA-ACAA-C-TGC-GAAACA-CC-AGAC--AA-TTGCTGAC-AGACA-AT----CAC-AGGCCTACATGCTCAAGTACGCTCC TUB2
(SEQ ID NO:23) 431 GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCC--CGA-GCGGCGAT---GA-ATTTGACACGATCTCG-ACT-A--TT-G--ACAGGCA-AACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTC-C--GTCCTC-AG-G-GGC--CC-C-TGGACC-A--AGCTAATCA---CA-AGGTACAACGGCACTTCCGAGCT-CAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTA-TTCAACGAAGTTTGTTA-CCTAGT-CCCCAGTGTGCAGGCAA-CCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCC-CGCGCCGT-CTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTT-GGCCA-CTTTTCCGCCCCGACAAC APN/MAT1
(SEQ ID NO:24) 1183 GCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTA-AC-------------CCAAC------------CAC-C----CA-ACA-ACG-CC--A-CCCCTT-TT---CTC-TTTATGCG-CCACCGAGGCC----G-CC-ACCCTC-TCTC--TC--T-CCCCGACATAT-CCGA-CTTTC--G-------------------C--C-TT-ATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTC--TT-T-CAT-TGCGC-CGTCCT-TGGGGAAATC-GGAGAAAAGGAAAA-G-GACGGAGTGGAG-TGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAA-AA-AGCCA---TCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTC--AAGG-GCGA--T--AG-C--GCG--A-TCG--G-A--G--TGT-A-GAG-TG----C-T-AC--T-GAAAA-AGA-A--T-GGTA-TTTAG--GTGCAGAA-AAGA-GAT--A---AATGAGACATGAACATTATGATTCCATTAT-GTT---G-AA-TCT-TCAA-CA-T-TATATCG-T-TTGTG-T-GCTCATC-T---ATCATGGCAG---TAGACATCC-A--CTT-GGCA-C-A--ACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCT--T-G-AGT-GC-CACT-TTTGC-TGAAC-CCATCAAGAG-G-CGC-ACCG-C-CC-C-C-AT-AT-CGTCC---AT--------------------------------------------------------C-C-AA----AGCCT-TC-T-G-CT--A--GG-CC-TAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCT---GCTGA-----------------------CACGGCATGTCT-CTTAGT--T-GCCC-A-C-TC--GTG-TGGTGTT-TTT-GACTT-CT-GGCGC-A-CTGGGA-A-GGCT-TGA-GG-AG--GAGG-A-A-TCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGT-CTCCTTCGC-GCAACTT-TA-TCGC--A--TT-TTGCAC-GT-AT-G-GAC-T-GCA-GGTAG-AAC---TG-AGCGACG-TGTGATGG--CG-TTCTTG-TCC-A-GATCCTT---CTCCATCT--A-AAC-G-G-TG---G-GA---T-AGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Применение набора праймеров для определения вида изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum методом секвенирования нового поколения

Для демонстрации возможности использования набора праймеров при определении вида изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, были взяты 3 образца мицелия реизолированного с листьев, семян и створок бобов, с признаками антракноза, на картофельно-декстрозном агаре и морфологически подходящих под описание грибов рода Colletotrichum. С использованием набора праймеров были определены нуклеотидные последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 у трех образцов сои на платформе MiniSeq Illumina. Этапы определения вида описаны ниже.

1. На первом этапе были выделены препараты ДНК из воздушного мицелия трех образцов, реизолированных со створок бобов и семян на картофельно-декстрозном агаре, собранных в полях люпина белого.

2. На втором этапе была проведена подготовка образцов ДНК гриба к дальнейшей работе, которая включала несколько последовательных этапов:

a) Мультиплексная ПЦР с набором из 10 пар праймеров для каждого образца в отдельности. При прохождении реакции происходит многократное увеличение количества вариабельных участков локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1. Этапы и условия проведения реакции включали: первичную денатурацию один цикл 1 минуту; 35 циклов состоящих из денатурации 30 секунд при 95°C, отжига праймеров при 58°C 30 секунд, элонгация при 72°C 30 секунд; 1 цикл 5 минут элонгации при 72°C.

b) Проведение второй реакции ПЦР для добавления индексных последовательностей к ампликонам каждого образца в отдельности. В качестве праймеров используются известные, специально подобранные, последовательности, которые совпадают с последовательностями на 5'-концах ампликонов, получившихся в результате первой ПЦР-реакции. Целью данного этапа является добавление индивидуальных последовательностей (индексов) к каждому ампликону, так как в последующем, при одновременном секвенировании всех образцов, остается возможность отнесения полученных последовательностей ДНК к определенному образцу изолята гриба.

c) Очистка каждого из 3 пулов ампликонов от ненужных на последующих этапах солей, неиспользованных нуклеотидов и т.д., с применением силико-колонок (Qiagen) и их перерастворение в 0,1х TE буфере.

d) Для получения библиотеки выполнили равномерное (по концентрации) смешивание трех пулов ампликонов.

3. В последующем, библиотека подготавливалась и секвенировалась согласно протоколам производителя секвенатора, в данном случае - Illumina.

Результаты определения последовательностей, полученных с помощью набора праймеров для локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, трех образцов в соединенном виде приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Собранные последовательности ДНК экспериментальных трех образцов в порядке ITS (1-496), GAPDH (497-755), TUB2 (756-1186), APN/MAT1 (1187-2369). Номер
образца Последовательность нуклеотидов локусов ITS (1-496), GAPDH (497-755), TUB2 (756-1186), APN/MAT1 (1187-2369); 5’-3’ 1
(SEQ ID NO:25) TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC 2
(SEQ ID NO:26) TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC 3
(SEQ ID NO:27) TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC

В последующем последовательности образцов были выравнены с использованием алгоритма MUSCLE V5 совместно с 50 другими последовательностями из Таблицы 1, относящимися к видам C. lupini, C. tamarilloi, C. costaricensis, C. melonis, C. cuscutae, C. paranaense, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. acutatum. На основании проведенного выравнивания были рассчитаны апостериорные вероятности по алгоритму MrBayes с применением цепей Маркова и построено филогенетическое дерево в программном обеспечении UGENE V44.0.

Последовательности образцов №1, №2 и №3 попали в кладу, содержащую последовательности, принадлежащие к разным по происхождению моноспоровым линиям гриба Colletotrichum lupini (Фиг. 2). Это позволило нам определить вид грибов в искомых образцах как Colletotrichum lupini. Полученные последовательности исследуемых образцов не содержали внутри образца вариабельности и были одинаковыми между собой, из чего можно сделать вывод о том, что собранные изоляты одинаковы или очень близки по генотипу. Полученные результаты показывают возможность успешного применения представленного набора праймеров для определения видовой принадлежности изолятов в видовом комплексе Colletotrichum acutatum методом секвенирования нового поколения.

Пример 2. Применение набора праймеров для определения вида изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum методом севенирования по Сэнгеру

Для демонстрации возможности использования набора праймеров для определения последовательности нуклеотидов моноспоровой культуры гриба видового комплекса Colletotrichum acutatum, был взят 1 образец мицелия реизолированного с семян с признаками антракноза, на картофельно-декстрозном агаре и морфологически подходящего под описание. С использованием набора праймеров для определения вида грибов были определены нуклеотидные последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 у образца методом секвенирования по Сэнгеру. Этапы определения последовательности описаны ниже:

1. На первом этапе был выделен препарат ДНК из воздушного мицелия моноспоровой культуры, реизолированной с зараженных антракнозом семян люпина белого.

2. На втором этапе была проведена подготовка образца ДНК гриба к дальнейшей работе, которая включала несколько последовательных этапов:

a) Провели ПЦР с каждой из 10 пар праймеров в отдельной пробирке с ДНК интересующего образца. При прохождении реакции происходит многократное увеличение количества вариабельных участков локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1. Этапы и условия проведения реакции включали первичную денатурацию один цикл 1 минуту; 35 циклов состоящих из денатурации 30 секунд при 95°C, отжига праймеров при 58°C 30 секунд, элонгация при 72°C 30 секунд; 1 цикл 5 минут элонгации при 72°C.

b) Очистили продукты всех ПЦР, проведенных в предыдущем шаге, от ненужных на последующих этапах солей, неиспользованных нуклеотидов и т.д., с применением силико-колонок (Qiagen), и их перерастворение в 0,1х TE буфере.

c) Провели вторую реакцию терминирующего секвенирования для всех продуктов ПЦР с соответствующими им праймерами.

3. Провели отдельный капиллярный электрофорез для всех продуктов реакций терминирующего секвенирования.

Собранная последовательность локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, для образца в объединенном виде приведена в Таблице 4.

Таблица 4. Последовательность ДНК моноспоровой культуры гриба рода Colletotrichum исследуемого образца 1. Номер
Образца Последовательность нуклеотидов локусов ITS (1-496), GAPDH (497-755), TUB2 (756-1186), APN/MAT1 (1187-2369); 5’-3’ 1
(SEQ ID NO:28) TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC

Последовательности образца №1 попали в кладу, содержащую последовательности принадлежащие к разным по происхождению моноспоровым линиям гриба Colletotrichum lupini. Это позволило нам определить вид грибов в искомых образцах как Colletotrichum lupini.

Полученные результаты показывают возможность успешного применения представленного набора праймеров для амплификации и последующего определения последовательности ДНК в локусах ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 моноспоровых культур видового комплекса Colletotrichum acutatum.

--->

This XML file does not appear to have any style information

associated with it. The document tree is shown below.

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Colletotrichum

acutatum.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.0.0"

productionDate="2022-12-16">

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский

институт радиологии и агроэкологии"</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Scientific Institution

"All-Russian Research Institute of Radiology and

Agroecology"</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор олигонуклеотидных праймеров

для генотипирования грибов видового комплекса Colletotrichum

acutatum</InventionTitle>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggtacttttatatggagcagtgattgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccgggcgtcaactgtggtaagtct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attgctctatcctttcgagtcttgctct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taagttagcagaagaagtctcttttgct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcgtctgctgccttaggccga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacctgcctatgtggatcatcagctat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaatgtatagactacgacgcttga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ataatggaatcataatgttcatgtctcatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaaaggatagagcaattcgcgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaccggaggagcacttcagcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcattgagaccaagtacgctgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagcgtacttgagcatgtaggcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaacgcagcgaaatgcgataagtaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacgtcgtgtaaatagagtttggtttcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttacggcaagagtccctccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtaaccagattggtgctgccttct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtctcgacagcaatggcgtgtatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagacgctcatgcgctcgagctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaacgtacttgttgccggaggcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>496</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..496</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacntacctaaccgttgcttcggcg

ggcaggggaagcctctcgcgggccntcccctcccggcgccgnnccccaccacggggacggggcgcccgcc

ggaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaac

aacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgngaattgcagaat

tcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagc

gtcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcanacgtgggcccttnaaggtagtgg

cggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgnctcgcacngggatncggagggactcttgccg

taaancccccnnanttntttacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>259</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..259</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcattgagaccaagtacgctgtnagtancanccnactttacccctccatcn

tgntatcncgtctnccacnataacaccagcttcgtcgntancnncnggnaaaagagtnngnnctagcnnn

ctcnacntntttnnccccnnggtttcgantgggctngttgtannganncgacgtganacaancntgcnga

aacanccnagacnnaanttgctgacnagacanatnnnncacnaggcctacatgctcaagtacgctcc</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>431</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..431</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtaaccagattggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccnncgangcg

gcgatnnnganatttgacacgatctcgnactnannttngnnacaggcanaacatctctggcgagcacggt

ctcgacagcaatggcgtgtatgtcncnngtcctcnagngnggcnnccncntggaccnannagctaatcan

nncanaggtacaacggcacttccgagctncagctcgagcgcatgagcgtctanttcaacgaagtttgtta

ncctagtnccccagtgtgcaggcaancctattgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggc

aacaagtacgttccncgcgccgtnctcgtcgacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtc

ccttnggccancttttccgccccgacaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1183</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1183</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccgggcgtcaactgtggtaagtctanacnnnnnnnnnnnnnccaacnnnnn

nnnnnnncacncnnnncanacanacgnccnnanccccttnttnnnctcntttatgcgnccaccgaggccn

nnngnccnaccctcntctcnntcnntnccccgacatatnccganctttcnngnnnnnnnnnnnnnnnnnn

ncnncnttnatagctgatgatccacataggcaggtcnnttntncatntgcgcncgtcctntggggaaatc

nggagaaaaggaaaangngacggagtggagntgcggtacttttatatggagcagtgattggaanaanagc

cannntcaagcgtcgtagtctatacatttcnnaaggngcganntnnagncnngcgnnantcgnngnanng

nntgtnangagntgnnnncntnacnntngaaaanagananntnggtantttagnngtgcagaanaagang

atnnannnaatgagacatgaacattatgattccattatngttnnngnaantctntcaancantntatatc

gntnttgtgntngctcatcntnnnatcatggcagnnntagacatccnanncttnggcancnannacgcga

attgctctatcctttcgagtcttgctctnntngnagtngcncactntttgcntgaacnccatcaagagng

ncgcnaccgncnccncncnatnatncgtccnnnatnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncncnaannnnagcctntcntngnctnnannggnccntaagttagcagaa

gaagtctcttttgctnnngctgannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncacggcatgtctncttagtnntng

cccnancntcnngtgntggtgttntttngacttnctnggcgcnanctgggananggctntganggnagnn

gaggnanantcggcctaaggcagcagacgaaggtnctccttcgcngcaacttntantcgcnnannttntt

gcacngtnatngngacntngcanggtagnaacnnntgnagcgacgntgtgatggnncgnttcttgntccn

angatccttnnnctccatctnnanaacngngntgnnngngannntnaggctgaagtgctcctccggttgc

gacgacgcttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>2313</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2313</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacgtacctaaccgttgcttcggcg

ggcaggggaagcctctcgcgggcctcccctcccggcgccggcccccaccacggggacggggcgcccgccg

gaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaaca

acggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt

cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagcg

tcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcacacgtgggcccttgaaggtagtggc

ggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgtctcgcactgggatccggagggactcttgccgt

aaaaccccccaattctttacagttcattgagaccaagtacgctgtgagtatcaccccactttacccctcc

atcatgatatcacgtctgccacgataacaccagcttcgtcggtacccacggcaaaagagtcagaactagc

accctcgacttttttgccccaaggtttcgattgggcttgttgtaatgacacgacgtgacacaatcatgcc

gaaacagccgagacaaaacttgctgacagacaatcatcacaggcctacatgctcaagtaggtaaccagat

tggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccaacgacgcggcgatttcgatatttgacacgatctcgaa

ctgaccttgatacaggcagaacatctctggcgagcacggtctcgacagcaatggcgtgtatgtcacttgt

cctccagtgcggcatcctcatggacccagcagctaatcacaccacaggtacaacggcacttccgagctcc

agctcgagcgcatgagcgtctatttcaacgaagtttgttatcctagtcccccagtgtgcaggcaatccta

ttgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggcaacaagtacgttcctcgcgccgtcctcgtc

gacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtccctttggccagcttttccgccccgacaacg

ccgggcgtcaactgtggtaagtctaaacccaaccacaccacacacacgccttacccccttcttactcgtt

tatgcgtccaccgaggcctctgtcctaccctcctctctctcgtcccccgacatatcccgatctttctgcc

cccgccccccctcgacccccattcatagctgatgatccacataggcaggtcgtttttcatctgcgcccgt

cctctggggaaatccggagaaaaggaaaaggggacggagtggaggtgcggtacttttatatggagcagtg

attggaaaaagagccagtctcaagcgtcgtagtctatacatttctaaggggcgatgtggagtcacgcgag

attcgacgaacagtgtgacgagctgtaaccgttactatcgaaaagagacagctaggtagtttagtcgtgc

agaagaagaagattaaggcaatgagacatgaacattatgattccattatcgttttagtaaatctatcaag

cattctatatcggtcttgtggtggctcatcttcgcatcatggcagagttagacatccgattcttcggcag

cgacgacgcgaattgctctatcctttcgagtcttgctctgcttgaagtagctcactctttgcttgaaccc

catcaagagcgtcgccaccgtctccgcccaatgatgcgtccggaattcgcccatcttgtgagtagagcag

gtaaaactccacgaagtggctttggagccttacacgaattcgagcctttcctggtctcgacaggccccta

agttagcagaagaagtctcttttgctccggctgagcatggtaagggtgagtgccgggcacggcatgtctg

cttagttctggcccaaacatcaagtgttggtgttttttcgactttctcggcgcgagctgggacatggctc

tgagggaagacgaggcatactcggcctaaggcagcagacgaaggtgctccttcgcggcaacttgtagtcg

cgaaaattcttgcacagtcattgagacctagcatggtaggaactaatgcagcgacgttgtgatggatcgc

ttcttgctcctacgatccttgatctccatctctagaacggggtggcagggacgattaggctgaagtgctc

ctccggttgcgacgacgcttc</INSDSeq_sequence>