СПОСОБ ИЗМЕНЕНИЯ УДЕРЖАНИЯ В ПЛАЗМЕ И ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/13 C07K16/00 C12N15/63 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы у животных, которым вводят молекулу, и к способам снижения иммунного ответа на антигенсвязывающую молекулу путем модификации Fc-области антигенсвязывающей молекулы, которая имеет антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающим молекулам, которые проявляют улучшенную фармакокинетику или сниженный иммунный ответ у животных, которым вводят эти молекулы. Более того, настоящее изобретение относится к способам получения антигенсвязывающих молекул и с фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента такую антигенсвязывающую молекулу.

Уровень техники

Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств, так как они обладают высокой стабильностью в плазме и обладают малым количеством побочных эффектов. В настоящее время ряд подобных фармацевтических средств IgG-типа являются коммерчески доступными и на сегодняшний день разрабатываются многие лекарственные средства на основе антител (непатентные документы 1 и 2). Между тем, описаны различные способы, применимые для второго поколения лекарственных средств на основе антител, включающие способы, которые усиливают эффекторную функцию, антигенсвязывающую способность, фармакокинетику и стабильность, и способы, которые снижают риск развития иммуногенности (непатентный документ 3). Как правило, требуемая доза лекарственного средства на основе антитела является очень высокой. Это, в свою очередь, привело к возникновению проблем, таких как высокая стоимость производства, а также к трудностям при получении подкожных составов. В теории, доза фармацевтического средства на основе антитела может быть снижена путем улучшения фармакокинетики антитела или повышения аффинности между антителами и антигенами.

В литературе описаны способы улучшения фармакокинетики антител с использованием искусственных замен аминокислот в константных областях (непатентные документы 4 и 5). Аналогично описано созревание аффинности в качестве способа улучшения антигенсвязывающей способности или активности нейтрализации антигена (непатентный документ б). Этот способ дает возможность увеличения антигенсвязывающей способности посредством внесения аминокислотной мутации в область CDR вариабельной области и т.п. Повышение антигенсвязывающей способности обеспечивает улучшение биологической активности in vitro или обеспечивает возможность снижения дозы и дополнительно обеспечивает повышенную эффективность in vivo (непатентный документ 7).

Способность одной молекулы антитела нейтрализовать антиген зависит от ее аффинности. Путем увеличения аффинности антиген можно нейтрализовать меньшим количеством антитела. Для увеличения аффинности антитела можно использовать различные способы (непатентный документ 6). Далее, если бы аффинность можно было сделать бесконечной посредством ковалентного связывания антитела с антигеном, одна молекула антитела могла бы нейтрализовать одну молекулу антигена (двухвалентное антитело могло бы нейтрализовать две молекулы антигена). Однако, стехиометрия нейтрализации одного антитела против одного антигена (одного двухвалентного антитела против двух антигенов) является лимитирующим фактором для предшествующих способов, и, таким образом, невозможно полностью нейтрализовать антиген количеством антитела, меньшим, чем количество антигена. Другими словами, эффект, усиливающий аффинность, имеет лимитирующее значение (непатентный документ 9). Для увеличения периода действия нейтрализующего эффекта нейтрализующего антитела в течение определенного периода антитело должно быть введено в дозе, более высокой, чем количество антигена, продуцируемое в организме в течение такого же периода. Таким образом, в случае улучшения только фармакокинетики антител или технологии созревания аффинности, как описано выше, существует ограничение в отношении снижения требуемой дозы антитела. Таким образом, для поддержания эффекта антител в отношении нейтрализации антигена в течение заданного периода времени с помощью антител в количестве, меньшем, чем количество антигена, одно антитело должно нейтрализовать множество антигенов.

Недавно было описано антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, в качестве нового способа для достижения описанной выше задачи (патентный документ 1). Антитела с рН-зависимым связыванием антигена, которые прочно связываются с антигеном при нейтральных условиях в плазме и диссоциируют от антигена при кислых условиях в энодосоме, могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Когда антитело с рН-зависимым связыванием антигена диссоциирует от антигена и рециркулирует в плазму посредством FcRn, оно может повторно связываться с другим антителом. Таким образом, антитело с рН-зависимым связыванием антигена может многократно связываться с несколькими антигенами.

Кроме того, время удержания антигена в плазме является очень коротким по сравнению со временем удержания антител, рециркулирующих в плазму путем связывания с FcRn. Если антитело с таким продолжительным временем удержания в плазме связывает антиген, время удержания в плазме комплекса антиген-антитело увеличивается до периода времени удержания антитела в плазме. Таким образом, вследствие связывания с антителом повышается время удержания антигена, и, таким образом, концентрация антигена в плазме увеличивается.

IgG-антитело имеет более длительное время удержания в плазме в результате связывания FcRn. Связывание между IgG и FcRn наблюдается только в кислых условиях (рН 6,0). Напротив, связывание практически не выявляется при нейтральных условиях (рН 7,4). IgG-антитело захватывается клетками неспецифически. Антитело возвращается на клеточную поверхность путем связывания с эндосомальным FcRn в кислых условиях эндосом, а затем диссоциирует от FcRn в нейтральных условиях плазмы. Когда связывание FcRn в кислых условиях утрачивается вследствие внесения мутаций в Fc-область IgG, отсутствие антитела, рециклирующего в плазму из эндосомы, значительно снижает время удержания антитела в плазме. Описанный способ повышения времени удержания в плазме IgG-антитела состоит в усилении связывания FcRn в кислых условиях. В Fc-область IgG-антитела вносят аминокислотные мутации, повышающие связывание FcRn в кислых условиях. Это увеличивает эффективность рециклирования в плазму из эндосомы, что приводит к увеличению времени удержания в плазме. Важным требованием для аминокислотной замены является отсутствие усиления связывания FcRn в нейтральных условиях. Если IgG-антитело связывается с FcRn в нейтральных условиях, антитело возвращается на клеточную поверхность путем связывания с FcRn в кислых условиях эндосом и не диссоциирует от FcRn в нейтральных условиях плазмы. В этом случае удержание в плазме, напротив, утрачивается, поскольку IgG-антитело не рециклирует в плазму. Например, было описано, что IgG1-антитело, модифицированное путем внесения аминокислотных замен так, чтобы полученное антитело было способно связываться с FcRn мыши в нейтральных условиях (рН 7,4), проявляет очень низкое удержание в плазме при введении мышам (непатентный документ 10). Более того, IgG1-антитело было модифицировано путем внесения аминокислотных замен так, чтобы полученное антитело проявляло увеличенное связывание FcRn человека в кислых условиях (рН 6,0) ив то же время стало способным связываться с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4) (непатентный документ 10, 11 и 12). Было описано, что полученное антитело не демонстрирует ни улучшения, ни изменения удержания в плазме при введении яванским макакам. Таким образом, технология инженерии антител для улучшения функций антител была сфокусирована только на увеличении времени удержания в плазме антитела путем усиления связывания с FcRn человека в кислых условиях без усиления его в нейтральных условиях (рН 7,4). На сегодняшний день не описано преимуществ повышения связывания с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4) путем внесения аминокислотных замен в Fc-область IgG-антитела. Даже если повысится аффинность антитела к антигену, элиминация антигена из плазмы не может быть усилена. Сообщалось, что описанные выше антитела с рН-зависимым связыванием антигена являются более эффективными в качестве способа усиления элиминации антигена из плазмы по сравнению с типичными антителами (патентный документ 1).

Таким образом, единичное антитело с рН-зависимым связыванием антигена связывается с множеством антигенов и способно облегчать элиминацию антигена из плазмы по сравнению с типичными антителами. Таким образом, антитела с рН-зависимым связыванием антигена обладают эффектами, не достигаемыми типичными антителами. Однако на сегодняшний день отсутствует описание способов инженерии антител для дальнейшего улучшения способности антител с рН-зависимым связыванием антигена многократно связываться с антигенами и обеспечивать усиление элиминации антигена из плазмы.

Между тем, иммуногенность фармацевтических препаратов на основе антител очень важна с точки зрения удержания в плазме, эффективности и безопасности, когда их вводят человеку.

Было описано, что если против вводимых фармацевтических препаратов на основе антител продуцируются антитела в организме человека, они вызывают нежелательные эффекты, такие как ускорение элиминации фармацевтических препаратов на основе антител из плазмы, снижение эффективности и индукции реакции гиперчувствительности, и влияние на безопасность (непатентный документ 13).

Прежде всего, при рассмотрении иммуногенности фармацевтических препаратов на основе антител необходимо понимать функции природных антител in vivo. Во-первых, большинство фармацевтических препаратов на основе антител представляют собой антитела, которые принадлежат классу IgG, и известно существование Fcγ-рецепторов (далее также обозначаемых как FcγR) в качестве Fc-рецепторов, которые функционируют, связываясь с Fc-областью IgG-антител. FcγR экспрессируются на клеточных мембранах дендритных клеток, NK-клеток, макрофагов, нейтрофилов, адипоцитов и прочих; и известно, что они передают активирующие или ингибирующие внутриклеточные сигналы иммунным клеткам при связывании Fc-области IgG. Для семейства белков FcγR человека известны изоформы FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и FcγRIIIb, и также описаны их аллотипы (непатентный документ 14). Для FcγRIIa человека описано два аллотипа: Arg (hFcγRIIa(R)) и His (hFcγRIIa(H)) в положении 131. Более того, два аллотипа было описано для FcγRIIIa человека: Val (hFcγRIIIa (V)) и Phe (hFcγRIIIa(F)) в положении 158. Между тем, для семейства белков FcγR мыши описаны FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV (непатентный документ 15).

FcγR человека включают активирующие рецепторы FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb, и ингибирующий рецептор FcγRIIb. Аналогично, FcγR мыши включают активирующие рецепторы FcγRI, FcγRIII и FcγRIV, и ингибирующий рецептор FcγRIIb.

Когда активирующий FcγR связывается с иммунным комплексом, он фосфорилирует иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы (ITAM), содержащиеся во внутриклеточном домене или общей γ-цепи FcR (партнер по взаимодействию), активирует передатчик сигнала SYK, и запускает воспалительный иммунный ответ путем инициации активации каскада передачи сигнала (непатентный документ 15).

Было продемонстрировано, что для связывания между Fc-областью и FcγR являются важными определенные аминокислотные остатки в шарнирной области и СН2-домене антитела, и цепь сахара, присоединенная к Asn в положении 297 СН2-домена в соответствии с системой нумерации EU (непатентные документы 15-17). Фокусируясь на антителах, в которые внесены мутации в участки, описанные выше, исследовали мутантов с различными свойствами связывания FcγR, и получили мутанты Fc-области, которые имеют более высокую аффинность к активирующим FcγR (патентные документы 2-5).

Между тем, FcγRIIb, который является ингибирующим FcγR, является единственным FcγR, экспрессируемым на В-клетках (непатентный документ 18). Описано, что взаимодействие Fc-области антитела с FcγRIIb подавляет первичный иммунный ответ В-клеток (непатентный документ 19). Более того, описано, что когда FcγRIIb на В-клетках и В-клеточный рецептор (BCR) связываются через иммунный комплекс, в крови подавляется активация В-клеток и подавляется продукция антитела В-клетками (непатентный документ 20). Для этой иммунодепрессивной передачи сигнала, опосредуемой BCR и FcγRIIb, необходим иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ITIM), содержащийся во внутриклеточном домене FcγRIIb (непатентные документы 21 и 22). Это иммунодепрессивное действие вызывается фосфорилированием ITIM. В результате фосфорилирования привлекается содержащая SH2 инозитолполифосфат-5-фосфатаза (SHIP), ингибируется передача других активирующих каскадов передачи сигнала FcγR и подавляется воспалительный иммунный ответ (непатентный документ 23).

Благодаря этому свойству FcγRIIb является перспективным в качестве средства для прямого снижения иммуногенности фармацевтических препаратов на основе антител. Эксендин-4 (Ех4) является чужеродным белком для мышей, однако даже когда слитую молекулу с IgG1 (Ex4/Fc) вводят мышам, антитела не продуцируются. Между тем, антитела против Ех4 продуцируются при введении молекулы (Ex4/Fc mut), которую получают путем модификации Ex4/Fc таким образом, чтобы он не связывался с FcγRIIb на В-клетках (непатентный документ 24). Этот результат указывает на то, что Ex4/Fc связывается с FcγRIIb на В-клетках и ингибирует продукцию антител мыши против Ех4 в В-клетках.

Более того, FcγRIIb также экспрессируется на дендритных клетках, макрофагах, активированных нейтрофилах, тучных клетках и базофилах. FcγRIIb ингибирует функции активирующего FcγR, такие как фагоцитоз и высвобождение воспалительных цитокинов в этих клетках, и подавляет воспалительные иммунные ответы (непатентный документ 25).

Важность иммуносупрессивных функций FcγRIIb устанавливали до настоящего времени путем исследований с использованием мышей с нокаутом FcγRIIb. Существуют сообщения, что у мышей с нокаутом FcγRIIb, гуморальный иммунитет регулируется не надлежащим образом (непатентный документ 26), увеличена подверженность индуцируемому коллагеном артриту (CIA) (непатентный документ 27), имеются волчаноподобные симптомы, и имеются симптомы, подобные синдрому Гудпасчера (непатентный документ 28).

Более того, было описано, что неадекватная регуляция FcγRIIb связана с аутоиммунными заболеваниями человека. Например, описана взаимосвязь между генетическим полиморфизмом в трансмембранной области и промоторной области FcγRIIb и частотой развития системной красной волчанки (SLE) (непатентные документы 29, 30, 31, 32 и 33), и описано снижение экспрессии FcγRIIb на поверхности В-клеток у пациентов с SLE (непатентный документ 34 и 35).

Исходя из моделей на мышах и собственно клинических данных, считается, что FcγRIIb играет роль контроля аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний, главным образом, через вовлечение В-клеток, и он является перспективной молекулой-мишенью для контроля аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний.

Известно, что IgG1, обычно используемый в качестве коммерчески доступного фармацевтического препарата на основе антитела, связывается не только с FcγRIIb, но и также он сильно связывается с активирующим FcγR (непатентный документ 36). Является возможной разработка фармацевтических препаратов на основе антител, имеющих лучшие иммунодепрессивные свойства по сравнению с иммунодепрессивными свойствами IgG1, с использованием Fc-области с усиленным связыванием FcγRIIb, или увеличенной селективностью связывания FcγRIIb по сравнению с активирующим FcγR. Например, было предположено, что применение антитела, имеющего вариабельную область, которая связывается с BCR, и Fc с усиленным связыванием FcγRIIb, может ингибировать активацию В-клеток (непатентный документ 37).

Однако FcγRIIb обладает 93% идентичностью последовательности во внеклеточной области с последовательностью внеклеточной области FcγRIIa, который является одним из активирующих FcγR, и они являются структурно очень сходными. Существуют аллотипы FcγRIIa, Н-тип и R-тип, в которых аминокислота в положении 131 представляет собой His (тип Н) или Arg (тип R), и каждый из них даже по-разному реагирует с антителами (непатентный документ 38). Таким образом, для получения Fc-области, которая специфично связывается с FcγRIIb, наиболее трудной проблемой может быть сообщение Fc-области антитела свойства селективно увеличенной активности связывания FcγRIIb, которое вовлекает снижение или не увеличение активности связывания с каждым аллотипом FcγRIIa при увеличении активности связывания с FcγRIIb.

Описан случай усиления специфичности связывания FcγRIIb путем внесения аминокислотных мутаций в Fc-область (непатентный документ 39). Согласно этому документу мутанты конструировали так, чтобы по сравнению с IgG1 они сохраняли их связывание с FcγRIIb в большей степени, чем с FcγRIIa, который имеет две полиморфные формы. Однако, было обнаружено, что по сравнению с природным IgG1, все мутанты, для которых в этом документе было описано, что они обладают увеличенной специфичностью к FcγRIIb, обладают сниженным связыванием FcγRIIb. Таким образом, считается трудным, чтобы мутанты индуцировали опосредуемую FcγRIIb иммуносупурессивную реакцию сильнее, чем IgG1.

Также имеется сообщение об усилении связывания FcγRIIb (непатентный документ 37). В этом документе связывание FcγRIIb увеличивали путем внесения мутаций, таких как S267E/L328F, G236D/S267E и S239D/S267E, в Fc-область антитела. Среди них антитело, в которое внесена мутация S267E/L328F, более прочно связывалось с FcγRIIb. Было показано, что этот мутант сохраняет связывание с FcγRIa и с FcγRIIa типа Н на уровнях, сравнимых с уровнями для природного IgG1. Даже если бы связывание FcγRIIb усиливалось относительно IgG1, ожидается, что только усиление связывания FcγRIIa, но не усиление связывания FcγRIIb, имеет эффект на клетки, такие как тромбоциты, которые экспрессируют FcγRIIa, но не FcγRIIb (непатентный документ 25). Например, было описано, что тромбоциты активируются посредством зависимого от FcγRIIa механизма при системном эритематозе и активация тромбоцитов коррелирует с тяжестью (непатентный документ 40). В соответствии с другим сообщением описанная выше мутация усиливала связывание с FcγRIIa типа R в несколько сотен раз, до той же степени, что и связывание FcγRIIb, и не повышало специфичность связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa типа R (патентный документ 17). Более того, в типах клеток, которые экспрессируют как FcγRIIa, так и FcγRIIb, таких как дендритные клетки и макрофаги, селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa необходима для передачи ингибиторных сигналов; однако такой селективности не могли достигнуть для типа R.

FcγRIIa типа Н и типа R встречаются практически с одинаковой частотой среди европиоидов и афро-американцев (непатентные документы 41 и 42). Таким образом, существуют определенные ограничения на применение антител с усиленным связыванием с FcγRIIa типа R для лечения аутоиммунных заболеваний. Даже если бы связывание FcγRIIb усиливалось по сравнению с активирующими FcγR, на тот факт, что связывание с любой из полиморфных форм FcγRIIa усиливается, нельзя не обратить внимания с точки зрения их применения в качестве лекарственного средства от аутоиммунных заболеваний.

Когда фармацевтические препараты на основе антител, нацеленные на FcγRIIb, получают для лечения аутоиммунных заболеваний, важно, чтобы активность опосредуемого Fc связывания с любой из полиморфных форм FcγRIIa не увеличивалась или предпочтительно снижалась, и чтобы активность связывания с FcγRIIb усиливалась по сравнению с природным IgG. Однако отсутствовали сообщения о мутантах, имеющих описанные выше свойства, и, таким образом, существует потребность в разработке таких мутантов.

Документы уровня техники настоящего изобретения представлены ниже.

Документы уровня техники

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] WO 2009/125825

[Патентный документ 2] WO 2000/042072

[Патентный документ 3] WO 2006/019447

[Патентный документ 4] WO 2004/0992 49

[Патентный документ 5] WO 2004/029207

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Janice М Reichert, Clark J Rosensweig, Laura В Faden & Matthew С Dewitz, Monoclonal Antibody successes in the clinic., Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078

[Непатентный документ 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibosies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396

[Непатентный документ 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29

[Непатентный документ 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs МГ, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356

[Непатентный документ 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640

[Непатентный документ 6] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general способ for greatly improving the affinity antibody by using combinatorial libraries., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102 (24), 8466-8471

[Непатентный документ 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665

[Непатентный документ 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S., Catalytic antibodies and their applications., Curr Opin Biotechnol. (2005) 16 (6), 631-636

[Непатентный документ 9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J., Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukine-8., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 1004-1013

[Непатентный документ 10] Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, Wu H, Kiener PA, Langermann S., Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences., J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180

[Непатентный документ 11] Yeung YA, Leabman MK, Marvin JS, Qiu J, Adams CW, Lien S, Starovasnik MA, Lowman HB., Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates., J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671

[Непатентный документ 12] Datta-Mannan A, Witcher DR, Tang Y, Watkins J, Wroblewski VJ., Monoclonal antibody clearance.

Impact of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor., J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717

[Непатентный документ 13] Niebecker R, Kloft C., Safety of therapeutic monoclonal antibodies., Curr. Drug Saf. (2010) 5 (4), 275-286

[Непатентный документ 14] Jefferis R, Lund J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models., Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65

[Непатентный документ 15] Nimmerjahn F, Ravetch JV., Fcgamma receptors as regulators of immune responses., Nat. Rev. Immunol. (2008) 8 (1), 34-47

[Непатентный документ 16] M. Clark, Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms., Chemical Immunology (1997), 65, 88-110

[Непатентный документ 17] Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104

[Непатентный документ 18] Amigorena S, Bonnerot C, Choquet D, Fridman WH, Teillaud JL., Fc gamma RII expression in resting and activated В lymphocytes., Eur. J. Immunol. (1989) 19, 1379-1385

[Непатентный документ 19] Nicholas R, Sinclair SC, Regulation of the immune response. I. Reduction in ability of specific antibody to inhibit long-lasting IgG immunological priming after removal of the Fc fragment., J. Exp. Med. (1969) 129, 1183-1201

[Непатентный документ 20] Heyman В., Feedback regulation by IgG antibodies., Immunol. Lett. (2003) 88, 157-161

[Непатентный документ 21] S Amigorena, С Bonnerot, Drake, JR, D Choquet, W Hunziker, JG Guillet, P Webster, С Sautes, I Mellman, and WH Fridman, Cytoplasmic domain heterogeneity and functions of IgG Fc receptors in В lymphocytes., Science (1992) 256, 1808-1812

[Непатентный документ 22] Muta, Т., Kurosaki, Т., Misulovin, Z., Sanchez, M., Nussenzweig, M.C., and Ravetch, J.V., A 13-amino-acid motif in the cytoplasmic domain of FcγRIIB modulates B-cell receptor signaling., Nature (1994) 368, 70-73

[Непатентный документ 23] Ravetch JV, Lanier LL., Immune inhibitory receptors., Science (2000) 290, 84-89

[Непатентный документ 24] Liang Y, Qiu H, Glinka Y, Lazarus AH, Ni H, Prud'homme GJ, Wang Q., Immunity against a therapeutic xenoprotein/Fc construct delivered by gene transfer is reduced through binding to the inhibitory receptor FcγRIIb., J. Gene Med. (2011) doi: 10.1002/jgm.1598

[Непатентный документ 25] Smith KG, Clatworthy MR., FcgammaRIIB in autoimmunity and infection: evolutionary and therapeutic implications., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10, 328-343

[Непатентный документ 26] Wernersson S, Karlsson MC, J, Mattsson R, Verbeek JS, Heyman В., IgG-mediated enhancement of antibody responses is low in Fc receptor gamma chain-deficient mice and increased in Fc gamma RII-deficient mice., J. Immunol. (1999) 163, 618-622

[Непатентный документ 27] Joachim L. Schultze, Sabine Michalak, Joel Lowne, Adam Wong, Maria H. Gilleece, John G. Gribben, and Lee M. Nadler, Human Non-Germinal Center В Cell Interleukin (IL)-12 Production Is Primarily Regulated by T Cell Signals CD40 Ligand, Interferon γ, and IL-10: Role of В Cells in the Maintenance of T Cell Responses., J. Exp. Med. (1999) 189, 187-194

[Непатентный документ 28] Nakamura, A., Yuasa, Т., Ujike, A., Ono, M., Nukiwa, Т., Ravetch, J.V., Takai, Т., Fey receptor IIB-deficient mice develop Goodpasture's syndrome upon immunization with type IV collagen: A novel murine model for autoimmune glomerular basement membrane disease., J. Exp. Med. (2000) 191, 899-906

[Непатентный документ 29] Blank MC, Stefanescu RN, Masuda E, Marti F, King PD, Redecha PB, Wurzburger RJ, Peterson MG, Tanaka S, Pricop L., Decreased transcription of the human FCGR2B gene mediated by the -343 G/C promoter polymorphism and association with systemic lupus erythematosus., Hum. Genet. (2005) 117, 220-227

[Непатентный документ 30] Olferiev M, Masuda E, Tanaka S, Blank MC, Pricop L., The Role of Activating Protein 1 in the Transcriptional Regulation of the Human FCGR2B Promoter Mediated by the -343 G ->C Polymorphism Associated with Systemic Lupus Erythematosus., J. Biol. Chem. (2007) 282, 1738-1746

[Непатентный документ 31] Lv J, Yang Y, Zhou X, Yu L, Li R, Hou P, Zhang H., FCGR3B copy number variation is not associated with lupus nephritis in a Chinese population., Arthritis Rheum. (2006) 54, 3908-3917

[Непатентный документ 32] Floto RA, Clatworthy MR, Heilbronn KR, Rosner DR, MacAry PA, Rankin A, Lehner PJ, Ouwehand WH, Allen JM, Watkins NA, Smith KG., Loss of function of a lupus-associated FcgammaRIIb polymorphism through exclusion from lipid rafts., Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058

[Непатентный документ 33] Li DH, Tung JW, Tarner IH, Snow AL, Yukinari T, Ngernmaneepothong R, Martinez OM, Parnes JR., CD72 Down-Modulates BCR-Induced Signal Transduction and Diminishes Survival in Primary Mature В Lymphocytes., J. Immunol. (2006) 176, 5321-5328

[Непатентный документ 34] Mackay M, Stanevsky A, Wang T, Aranow C, Li M, Koenig S, Ravetch JV, Diamond В., Selective dysregulation of the FcgammallB receptor on memory В cells in SLE., J. Exp. Med. (2006) 203, 2157-2164

[Непатентный документ 35] Su K, Yang H, Li X, Li X, Gibson AW, Cafardi JM, Zhou T, Edberg JC, Kimberly RP., Expression profile of FcgammaRIIb on leukocytes and its dysregulation in systemic lupus erythematosus., J. Immunol. (2007) 178, 3272-3280

[Непатентный документ 36] Bruhns P, Iannascoli B, England P, Mancardi DA, Fernandez N, Jorieux S, M., Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses., Blood (2009) 113, 3716-

[Непатентный документ 37] Chu SY, Vostiar I, Karki S, Moore GL, Lazar GA, Pong E, Joyce PF, Szymkowski DE, Desjarlais JR., Inhibition of В cell receptor-mediated activation of primary human В cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies., Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933

[Непатентный документ 38] Warmerdam PA, van de Winkel JG, Gosselin EJ, Capel PJ., Molecular basis for a polymorphism of human Fc gamma receptor II (CD32)., J. Exp. Med. (1990) 172, 19-25

[Непатентный документ 39] Armour, KL, van de Winkel, JG, Williamson, LM, Clark, MR., Differential binding to human FcgammaRIIa and FcgammaRIIb receptors by human IgG wildtype and mutant antibodies., Mol. Immunol. (2003) 40, 585-593

[Непатентный документ 40] Science Translational Medicine (2010) Vol. 2, Issue 47, p. 47ra63

[Непатентный документ 41] Salmon JE, Millard S, Schachter LA, Arnett FC, Glnzler EM, Gourley MF, Ramsey-Goldman R, Peterson MG, Kimberly RP., Fc gamma RIIA alleles are heritable risk factors for lupus nephritis in African Americans., J. Clin. Invest. (1996) 97, 1348-1354

[Непатентный документ 42] Manger K, Repp R, Spriewald BM, Rascu A, Geiger A, Wassmuth R, Westerdaal NA, Wentz B, Manger B, Kalden JR, van de Winkel JG., Fcgamma receptor IIa polymorphism in Caucasian patients with systemic lupus erythematosus: association with clinical symptoms., Arthritis Rheum. (1998) 41, 1181-1189

[Непатентный документ 43] Qiao SW, Kobayashi K, Johansen FE, Sollid LM, Andersen JT, Milford E, Roopenian DC, Lencer WI, Blumberg RS., Dependence of antibody-mediated presentation of antigen on FcRn., Proc. Natl. Acad. Sci. (2008) 105 (27) 9337-9342

[Непатентный документ 44] Mi W, Wanjie S, Lo ST, Gan Z, Pickl-Herk B, Ober RJ, Ward ES., Targeting the neonatal fc receptor for antigen delivery using engineered fc fragments., J. Immunol. (2008) 181 (11), 7550-7561.

Сущность изобретения

[Проблемы, решаемые изобретением]

В дополнение к вовлечению активирующего FcγR, описанного выше, так называемый механизм представления антигенов очень важен в качестве фактора индукции иммунного ответа на введенные фармацевтические препараты на основе антител. Представление антигена относится к иммунологическому механизму, в котором после внутриклеточной интернализации и деградации чужеродных антигенов, таких как бактерии, и эндогенных антигенов антигенпредставляющие клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, представляют части антигенов на клеточной поверхности. Представленные антигены распознаются Т-клетками и другими клетками и активируют как клеточный, так и гуморальный иммунитет.

Каскад представления антигенов дендритными клетками вовлекает интернализацию антигена в качестве иммунного комплекса (комплекс, образованный между поливалентным антителом и антигеном) в клетки, деградацию в лизосоме и представление полученных пептидов, происходящих из антигена, молекулами МНС класса II. FcRn играет важную роль в этом каскаде; и было описано, что при использовании дендритных клеток с дефицитом FcRn или иммунных комплексов, которые неспособны связываться с FcRn, представление антигена и конечная активация Т-клеток не происходят (непатентный документ 43).

Когда животным вводят антигенный белок в качестве чужеродного вещества, у них часто продуцируются антитела противвведенного антигенного белка. Например, когда мышам вводят растворимый рецептор IL-6 человека в качестве чужеродного белка, у них продуцируются антитела мыши против растворимого рецептора IL-6 человека. С другой стороны, даже когда мышам вводят антитело IgG1 человека в качестве чужеродного белка, у них почти не продуцируются антитела мыши против IgG1 человека. Это отличие указывает на то, что скорость элиминации введенного чужеродного белка из плазмы может иметь влияние.

Как описано в справочном примере 4, IgG1-антитело человека способно связывать FcRn мыши в кислых условиях, и, таким образом, подобно антителам мыши, IgG1-антитело человека рециклирует через FcRn мыши, когда его включают в эндосомы. По этой причине, когда IgG1-антитело человека вводят нормальным мышам, элиминация антитела из плазмы происходит очень медленно. Между тем, растворимый рецептор IL-6 человека не рециклирует через FcRn мыши и, таким образом, быстро элиминируется после введения. С другой стороны, как описано в справочном примере 4, продукцию антител мыши против растворимого антитела против IL-6R человека наблюдают у нормальных мышей, которым вводили растворимый рецептор IL-6 человека, в то время как продукция антител мыши против IgG1-антитела человека не встречается у нормальных мышей, которым вводили IgG1-антитело человека. Иными словами, растворимый рецептор IL-6 человека, который элиминируется быстро, является более иммуногенным у мышей, чем IgG1-антитело человека, которое элиминируется медленно.

Часть каскада элиминации этих чужеродных белков (растворимый рецептор IL-6 человека и IgG1-антитело человека) из плазмы предположительно происходит путем захвата антигенпредставляющими клетками. Чужеродные белки, включенные в антигенпредставляющие клетки, ассоциируют с молекулами МНС класса II после внутриклеточного процессинга и транспортируются на клеточную мембрану. Затем представление антигена антигенспецифическим Т-клеткам (например, Т-клетки, которые специфично отвечают на растворимый рецептор IL-6 человека или IgG1-антитело человека) индуцирует активацию антигенспецифических Т-клеток. В этом контексте, предположительно, для чужеродного белка, который медленно элиминируется из плазмы, процессинг в антигенпредставляющих клетках затруднен, и в результате маловероятно, что произойдет представление антигена антигенпредставляющим Т-клеткам.

Известно, что связывание с FcRn в нейтральных условиях неблагоприятно влияет на удержание антитела в плазме. После связывания IgG-антитела с FcRn в нейтральных условиях, даже если оно возвращается на клеточную поверхность в кислых условиях эндосом в результате связывания с FcRn, IgG-антитело не может рециклировать в плазму без диссоциации от FcRn в нейтральных условиях в плазме; и это неблагоприятным образом влияет на удержание в плазме. Например, в соответствии с сообщением (непатентный документ 10), когда антитело, которое становится способным связываться с FcRn мыши в нейтральных условиях (рН 7,4) в результате аминокислотных замен, внесенных в IgG1, вводили мышам, удержание антитела в плазме ухудшалось. Между тем, было описано, что, когда антитело, для которого подтверждено, что оно связывается с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4), вводили яванским макакам, удержание антитела в плазме не пролонгировалось, а скорее оставалось неизмененным (непатентные документы 10-12). Когда время удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме снижается вследствие усиления ее связывания с FcRn в нейтральных условиях (рН 7,4), иммуногенность может стать более высокой вследствие ускоренной элиминации антигенсвязывающей молекулы.

Более того, было описано, что FcRn эспрессируется в антигенпредставляющих клетках и вовлечен в представление антигена. В соответствии с сообщением, опубликованным в отношении оценки иммуногенности белка, полученного путем слияния основного белка миелина (МБР), хотя он и не является антигенсвязывающей молекулой, с Fc-областью IgG1 мыши (далее сокращенно обозначаемого как MBP-Fc), Т-клетки, которые отвечают специфичным к MBP-Fc образом, активируются и пролиферируют, когда их культивируют в присутствии MBP-Fc. В этом аспекте известно, что активация Т-клеток интенсифицируется in vitro при добавлении к Fc-области MBP-Fc модификации, которая усиливает связывание FcRn, для увеличения включения в антигенпредставляющие клетки через FcRn, экспрессируемый на антигенпредставляющих клетках. Было описано, что, независимо от ускоренной элиминации из плазмы в результате внесения модификации, которая усиливает связывание с FcRn, активация Т-клеток in vivo скорее ухудшалась (непатентный документ 44). Таким образом, иммуногенность не обязательно усиливается, когда элиминацию ускоряют путем усиления связывания с FcRn.

Как описано выше, недостаточно проведено исследований для понимания того, как усиление связывания FcRn с антигенсвязывающей молекулой, которая имеет FcRn-связывающий домен в нейтральных условиях (рН 7,4) влияет на удержание в плазме и иммуногенность антигенсвязывающей молекулы. Таким образом, отсутствует описанный способ повышения удержания в плазме и иммуногенности антигенсвязывающих молекул, имеющих активность связывания FcRn в нейтральных условиях (рН 7,4).

Было обнаружено, что элиминацию антигена из плазмы можно ускорить с использованием антигенсвязывающей молекулы, которая содержит антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая имеет активность связывания с FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Однако не было проведено достаточно исследований для понимания того, как усиление активности связывания FcRn Fc-областью в диапазоне нейтральных значений рН влияет на удержание антигенсвязывающих молекул в плазме и иммуногенность. В ходе испытаний авторы настоящего изобретения обнаружили проблему, состоящую в том, что в результате усиления активности Fc-области в отношении связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, время удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме снижается (фармакокинетика ухудшается) и иммуногенность антигенсвязывающей молекулы повышается (иммунный ответ на антигенсвязывающую молекулу усиливается).

Настоящее изобретение было осуществлено ввиду описанных выше обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление способов улучшения фармакокинетики у животных, которым вводят антигенсвязывающую молекулу, путем модификации Fc-области антигенсвязывающей молекулы, которая содержит антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способов снижения иммунного ответа на антигенсвязывающую молекулу путем модификации Fc-области антигенсвязывающей молекулы, которая содержит антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которого варьирует, в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Другой задачей настоящего изобретения является предоставление антигенсвязывающих молекул, которые проявляют улучшенную фармакокинетику или сниженный иммунный ответ in vivo при введении животным. Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способов получения таких антигенсвязывающих молекул, а также фармацевтических композиций, содержащих антигенсвязывающие молекулы в качестве активного ингредиента.

[Средства для решения проблем]

Авторы настоящего изобретения провели целенаправленные исследования для достижения описанных выше задач. В результате авторы настоящего изобретения выявили, что антигенсвязывающая молекула, которая содержит антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которого варьирует, в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, образовывала гетерокомплекс, состоящий из четырех молекул: антигенсвязывающая молекула/две молекулы FcRn/активирующий Fcγ-рецептор (фиг. 48). Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что образование тетрамера неблагоприятно влияло на фармакокинетику и иммунный ответ. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что фармакокинетика антигенсвязывающей молекулы улучшалась путем модификации Fc-области такой антигенсвязывающей молекулы в Fc-область, которая в диапазоне нейтральных значений рН не образует гетеротетрамерный комплекс, содержащий две молекулы FcRn и активирующий Fcγ-рецептор. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что иммунный ответ у животных, которым вводят антигенсвязывающую молекулу, может быть изменен путем модификации Fc-области такой антигенсвязывающей молекулы в Fc-область, которая в диапазоне нейтральных значений рН не образует тетрамерный комплекс, содержащий две молекулы FcRn и активирующий Fcγ-рецептор. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что иммунный ответ на антигенсвязывающую молекулу снижался путем модификации в Fc-область, которая в диапазоне нейтральных значений рН не образует гетеротетрамерный комплекс, содержащий две молекулы FcRn и активирующий Fcγ-рецептор. Более того, авторы настоящего изобретения открыли антигенсвязывающие молекулы и способы их получения, и, кроме того, они открыли, что при введении фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента такую антигенсвязывающую молекулу или антигенсвязывающую молекулу, получаемую способом получения по настоящему изобретению, имели улучшенные свойства, такие как улучшенная фармакокинетика и сниженный иммунный ответ при введении в живой организм, по сравнению с общепринятыми антигенсвязывающими молекулами; и, тем самым, осуществили настоящее изобретение.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующему.

[1] Способ согласно любому из (а) или (b) ниже, где способ включает модификацию Fc-области антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность варьирует в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая имеет активность связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, в Fc-область, которая не образует гетерокомплекс, содержащий две молекулы FcRn и одну молекулу активирующего Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН:

(a) способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы; и

(b) способ снижения иммуногенности антигенсвязывающей молекулы.

[2] Способ согласно [1], где модификация в Fc-область, которая не образует указанный гетерокомплекс, включает модификацию Fc-области в Fc-область, активность связывания которой с активирующим Fcγ-рецептором является более низкой, чем активность связывания Fc-области нативного IgG человека с активирующим Fcγ-рецептором.

[3] Способ согласно [1] или [2], где активирующий Fcγ-рецептор представляет собой FcγRIa человека, FcYRIIa(R) человека, FcγRIIa(H) человека, FcγRIIIa(V) человека или FcγRIIIa(F) человека.

[4] Способ согласно любому из [1]-[3], который включает замену аминокислоты указанной Fc-области в одном или нескольких из положений аминокислот 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 и 32 9, как указано согласно нумерации EU.

[5] Способ согласно [4], который включает замену аминокислоты указанной Fc-области, как указано согласно нумерации EU, в любом одном или нескольких из:

аминокислота в положении 234 на любую из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr и Trp;

аминокислота в положении 235 на любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Arg;

аминокислота в положении 236 на любую из Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro и Tyr;

аминокислота в положении 237 на любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr и Arg;

аминокислота в положении 238 на любую из Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp и Arg;

аминокислота в положении 239 на любую из Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr и Arg;

аминокислота в положении 265 на любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 266 на любую из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 267 на любую из Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 269 на любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 270 на любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 271 на любую из Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 295 на любую из Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 296 на любую из Arg, Gly, Lys и Pro;

аминокислота в положении 297 на Ala;

аминокислота в положении 298 на любую из Arg, Gly, Lys, Pro, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 300 на любую из Arg, Lys и Pro;

аминокислота в положении 324 на Lys или Pro;

аминокислота в положении 325 на любую из Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 327 на любую из Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 328 на любую из Arg, Asn, Gly, His, Lys и Pro;

аминокислота в положении 329 на любую из Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val и Arg;

аминокислота в положении 330 на Pro или Ser;

аминокислота в положении 331 на любую из Arg, Gly и Lys; или

аминокислота в положении 332 на любую из Arg, Lys и Pro.

[6] Способ согласно [1], где модификация в Fc-область, которая не образует указанный гетерокомплекс, включает модификацию Fc-области в Fc-область, которая имеет более высокую активность связывания с ингибирующим Fcγ-рецептором, чем с активирующим Fcγ-рецептором.

[7] Способ согласно [6], где ингибирующий Fcγ-рецептор представляет собой FcγRIIb человека.

[8] Способ согласно [6] или [7], где активирующий Fcγ-рецептор представляет собой FcγRIa человека, FcγRIIa(R) человека, FcγRIIa(H) человека, FcγRIIIa(V) человека или FcγRIIIa(F) человека.

[9] Способ согласно любому из [6]-[8], который включает замену аминокислоты в положении 238 или 328, указанном согласно нумерации EU.

[10] Способ согласно [9], который включает замену аминокислоты в положении 238 на Asp или аминокислоты в положении 328 на Glu, как указано согласно нумерации EU.

[11] Способ согласно [9] или [10], который включает замену любой одной или нескольких аминокислот из:

аминокислота в положении 233 на Asp;

аминокислота в положении 234 на Trp или Tyr;

аминокислота в положении 237 на любую из Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 239 на Asp;

аминокислота в положении 267 на любую из Ala, Gln и Val;

аминокислота в положении 268 на любую из Asn, Asp и Glu;

аминокислота в положении 271 на Gly;

аминокислота в положении 326 на любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser и Thr;

аминокислота в положении 330 на любую из Arg, Lys и Met;

аминокислота в положении 323 на любую из Ile, Leu и Met; и

аминокислота в положении 296 на Asp; где аминокислоты указаны согласно нумерации EU.

[12] Способ согласно любому из [1]-[11], где Fc-область содержит одну или несколько аминокислот, которые отличаются от аминокислот нативной Fc-области в положениях аминокислот 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 указанной Fc-области, как указано согласно нумерации EU.

[13] Способ согласно [12], где аминокислоты указанной Fc-области, указанные согласно нумерации EU, представляют собой комбинацию одной или нескольких из:

Met в положении аминокислоты 237;

Ile в положении аминокислоты 248;

любой из Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 250;

любой из Phe, Trp и Tyr в положении аминокислоты 252;

Thr в положении аминокислоты 254;

Glu в положении аминокислоты 255;

любой из Asp, Asn, Glu и Gln в положении аминокислоты 256;

любой из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 257;

His в положении аминокислоты 258;

Ala в положении аминокислоты 265;

Ala или Glu в положении аминокислоты 286;

His в положении аминокислоты 289;

Ala в положении аминокислоты 297;

Gly в положении аминокислоты 298;

Ala в положении аминокислоты 303;

Ala в положении аминокислоты 305;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 307;

любой из Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln и Thr в положении аминокислоты 308;

любой из Ala, Asp, Glu, Pro и Arg в положении аминокислоты 309;

любой из Ala, His и Ile в положении аминокислоты 311;

Ala или His в положении аминокислоты 312;

Lys или Arg в положении аминокислоты 314;

любой из Ala, Asp и His в положении аминокислоты 315;

Ala в положении аминокислоты 317;

Val в положении аминокислоты 332;

Leu в положении аминокислоты 334;

His в положении аминокислоты 360;

Ala в положении аминокислоты 376;

Ala в положении аминокислоты 380;

Ala в положении аминокислоты 382;

Ala в положении аминокислоты 384;

Asp или His в положении аминокислоты 385;

Pro в положении аминокислоты 386;

Glu в положении аминокислоты 387;

Ala или Ser в положении аминокислоты 389;

Ala в положении аминокислоты 424;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 428;

Lys в положении аминокислоты 433;

любой из Ala, Phe, His, Ser, Trp и Tyr в положении аминокислоты 434; и

любой из His, Ile, Leu, Phe, Thr и Val в положении аминокислоты 436.

[14] Способ согласно любому из [1]-[13], где указанный антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов кальция.

[15] Способ согласно [14], где указанный антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует таким образом, что антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов кальция является более низкой, чем антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов кальция.

[16] Способ согласно любому из [1]-[13], где указанный антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от рН.

[17] Способ согласно [16], где указанный антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует таким образом, что антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем антигенсвязывающая активность в диапазоне нейтральных значений рН.

[18] Способ согласно любому из [1]-[17], где антигенсвязывающий домен представляет собой вариабельную область антитела.

[19] Способ согласно любому из [1]-[18], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело.

[20] Способ согласно [1], где модификация в Fc-область, которая не образует указанный гетерокомплекс, включает модификацию в Fc-область, в которой один из двух полипептидов, составляющих Fc-область, обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, а другой не обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН.

[21] Способ согласно [20], который включает замену аминокислоты в любом одном или нескольких из положений 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436, как указано согласно нумерации EU, в аминокислотной последовательности одного из двух полипептидов, составляющих указанную Fc-область.

[22] Способ согласно [21], который включает замену аминокислоты указанной Fc-области в любом или нескольких из:

аминокислота в положении 237 на Met;

аминокислота в положении 248 на Ile;

аминокислота в положении 250 на Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 252 на Phe, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 254 на Thr;

аминокислота в положении 255 на Glu;

аминокислота в положении 256 на Asp, Asn, Glu или Gln;

аминокислота в положении 257 на Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val;

аминокислота в положении 258 на His; аминокислота в положении 265 на Ala;

аминокислота в положении 286 на Ala или Glu;

аминокислота в положении 289 на His;

аминокислота в положении 297 на Ala;

аминокислота в положении 298 на Gly;

аминокислота в положении 303 на Ala;

аминокислота в положении 305 на Ala;

аминокислота в положении 307 на Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 308 на Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr;

аминокислота в положении 309 на Ala, Asp, Glu, Pro или Arg;

аминокислота в положении 311 на Ala, His или Ile;

аминокислота в положении 312 на Ala или His;

аминокислота в положении 314 на Lys или Arg;

аминокислота в положении 315 на Ala, Asp или His;

аминокислота в положении 317 на Ala;

аминокислота в положении 332 на Val;

аминокислота в положении 334 на Leu;

аминокислота в положении 360 на His;

аминокислота в положении 376 на Ala;

аминокислота в положении 380 на Ala;

аминокислота в положении 382 на Ala;

аминокислота в положении 384 на Ala;

аминокислота в положении 385 на Asp или His;

аминокислота в положении 386 на Pro;

аминокислота в положении 387 на Glu;

аминокислота в положении 389 на Ala или Ser;

аминокислота в положении 424 на Ala;

аминокислота в положении 428 на Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 433 на Lys;

аминокислота в положении 434 на Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr; и

аминокислота в положении 436 на His, Ile, Leu, Phe, Thr или Val; где аминокислоты указаны согласно нумерации EU.

[23] Способ согласно любому из [20]-[22], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации кальция.

[24] Способ согласно [23], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует таким образом, что антигенсвязывающая активность при низкой концентрации кальция является более низкой, чем антигенсвязывающая активность при высокой концентрации кальция.

[25] Способ согласно любому из [20]-[22], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от рН.

[26] Способ согласно [25], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует таким образом, что антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем антигенсвязывающая активность в диапазоне нейтральных значений рН.

[27] Способ согласно любому из [20]-[26], где антигенсвязывающий домен представляет собой вариабельную область антитела.

[28] Способ согласно любому из [20]-[27], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело.

[29] Антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, где Fc-область содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из:

Ala в положении аминокислоты 234;

Ala, Lys или Arg в положении аминокислоты 235;

Arg в положении аминокислоты 236;

Arg в положении аминокислоты 238;

Lys в положении аминокислоты 239;

Phe в положении аминокислоты 270;

Ala в положении аминокислоты 297;

Gly в положении аминокислоты 298;

Gly в положении аминокислоты 325;

Arg в положении аминокислоты 328; и

Lys или Arg в положении аминокислоты 329; где аминокислоты указаны согласно нумерации EU.

[30] Антигенсвязывающая молекула согласно [29], которая содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из:

Lys или Arg в положении аминокислоты 237;

Lys в положении аминокислоты 238;

Arg в положении аминокислоты 239; и

Lys или Arg в положении аминокислоты 329; где аминокислоты указаны согласно нумерации EU.

[31] Антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов, и Fc-область, в которой один из двух полипептидов, составляющих Fc-область, обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, а другой не обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН.

[32] Антигенсвязывающая молекула согласно любому из [29]-[31], где Fc-область содержит одну или несколько аминокислот, которые отличаются от аминокислот нативной Fc-области, в любом из положений аминокислот 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436, указанных согласно нумерации EU в аминокислотной последовательности одного из двух полипептидов, составляющих Fc-область.

[33] Антигенсвязывающая молекула согласно [32], которая содержит комбинацию одной или нескольких аминокислот указанной Fc-области из:

Met в положении аминокислоты 237;

Ile в положении аминокислоты 248;

Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr в положении аминокислоты 250;

Phe, Trp или Tyr в положении аминокислоты 252;

Thr в положении аминокислоты 254;

Glu в положении аминокислоты 255;

Asp, Asn, Glu или Gln в положении аминокислоты 256;

Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val в положении аминокислоты 257;

His в положении аминокислоты 258;

Ala в положении аминокислоты 265;

Ala или Glu в положении аминокислоты 286;

His в положении аминокислоты 289;

Ala в положении аминокислоты 297;

Ala в положении аминокислоты 303;

Ala в положении аминокислоты 305;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr в положении аминокислоты 307;

Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr в положении аминокислоты 308;

Ala, Asp, Glu, Pro или Arg в положении аминокислоты 309;

Ala, His или Ile в положении аминокислоты 311;

Ala или His в положении аминокислоты 312;

Lys или Arg в положении аминокислоты 314;

Ala, Asp или His в положении аминокислоты 315;

Ala в положении аминокислоты 317;

Val в положении аминокислоты 332;

Leu в положении аминокислоты 334;

His в положении аминокислоты 360;

Ala в положении аминокислоты 376;

Ala в положении аминокислоты 380;

Ala в положении аминокислоты 382;

Ala в положении аминокислоты 384;

Asp или His в положении аминокислоты 385;

Pro в положении аминокислоты 386;

Glu в положении аминокислоты 387;

Ala или Ser в положении аминокислоты 389;

Ala в положении аминокислоты 424;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в положении аминокислоты 428;

Lys в положении аминокислоты 433;

Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr в положении аминокислоты 434; и

His, Ile, Leu, Phe, Thr или Val в положении аминокислоты 436; где аминокислоты указаны согласно нумерации EU.

[34] Антигенсвязывающая молекула согласно любому из [29]-[33], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от концентрации ионов кальция.

[35] Антигенсвязывающая молекула согласно [34], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует таким образом, что антигенсвязывающая активность при низкой концентрации кальция является более низкой, чем антигенсвязывающая активность при высокой концентрации кальция.

[36] Антигенсвязывающая молекула согласно любому из [29]-[33], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от рН.

[37] Антигенсвязывающая молекула согласно [36], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует таким образом, что антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем антигенсвязывающая активность в диапазоне нейтральных значений рН.

[38] Антигенсвязывающая молекула согласно любому из [29]-[37], где антигенсвязывающий домен представляет собой вариабельную область антитела.

[39] Антигенсвязывающая молекула согласно любому из [29]-[38], где антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело.

[40] Полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу согласно любому из [29]-[39].

[41] Вектор, который функционально связан с полинуклеотидом согласно [40].

[42] Клетка, в которую введен вектор согласно [41].

[43] Способ получения антигенсвязывающей молекулы согласно любому из [29]-[39], который включает стадию сбора антигенсвязывающей молекулы из культуры клеток согласно [42].

[44] Фармацевтическая композиция, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенсвязывающую молекулу согласно любому из [29]-[39] или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом получения согласно [43].

Более того, настоящее изобретение относится к наборам для применения в способах по настоящему изобретению, которые содержат антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом получения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к средствам для улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы и средствам для снижения иммуногенности антигенсвязывающей молекулы, которые содержат в качестве активного ингредиента антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом получения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам лечения иммунных/воспалительных заболеваний, которые включают стадию введения индивидууму антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению или антигенсвязывающей молекулы, полученной способом получения по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению или антигенсвязывающих молекул, полученных способом получения по настоящему изобретению для получения средств для улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул и средств для снижения иммуногенности антигенсвязывающих молекул. Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающим молекулам по настоящему изобретению или антигенсвязывающим молекулам, полученным способом получения по настоящему изобретению, для применения в способах по настоящему изобретению.

[Эффекты изобретения]

Настоящее изобретение относится к способам улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул и способам снижения иммуногенности антигенсвязывающих молекул. Настоящее изобретение обеспечивает терапию антителами без возникновения неблагоприятных эффектов in vivo по сравнению с обычными антителами.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена диаграмма, на которой показаны эффекты на растворимый антиген существующего нейтрализующего антитела и антитела, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом и проявляет усиленное связывание FcRn в нейтральных условиях.

На фиг. 2 представлен график, на котором показана концентрация в плазме с течением времени после внутривенного или подкожного введения Fv4-IgG1 или Fv4-IgG1-F1 нормальным мышам.

На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIa человека.

На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIIa (R) человека.

На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIIa (H) человека.

На фиг. 6 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIIb человека.

На фиг. 7 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIIIa (F) человека.

На фиг. 8 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRI мыши.

На фиг. 9 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIIb мыши.

На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIII мыши.

На фиг. 11 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn человека состоянии Fv4-IgG1-F157 связывается с FcγRIV мыши.

На фиг. 12 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn мыши состоянии Fv4-IgG1-F20 связывается с FcγRI мыши, FcγRIIb мыши, FcγRIII мыши и FcγRIV мыши.

На фиг. 13 представлен график, демонстрирующий, что в связанном с FcRn мыши состоянии mPM1-mIgG1-mF3 связывается с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши.

На фиг. 14 представлен график на котором показана концентрация в плазме с течением времени Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F140, Fv4-IgG1-F157 и Fv4-IgG1-F424 у трансгенных мышей с FcRn человека.

На фиг. 15 представлен график, на котором показана концентрация в плазме с течением времени Fv4-IgG1 и Fv4-IgG1-F760 у трансгенных мышей с FcRn человека.

На фиг. 16 представлен график, на котором показана концентрация в плазме с течением времени Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 и Fv4-IgG1-F1009 у трансгенных мышей с FcRn человека.

На фиг. 17 представлен график, на котором показана концентрация в плазме с течением времени mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39 и mPM1-mIgG1-mF40 у нормальных мышей.

На фиг. 18 представлена диаграмма, на которой показан результат оценки иммуногенности с использованием Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F140.

На фиг. 19 представлена диаграмма, на которой показан результат оценки иммуногенности с использованием hA33-IgG1-F21 и hA33-IgG1-F140.

На фиг. 20 представлена диаграмма, на которой показан результат оценки иммуногенности с использованием hA33-IgG1-F698 и hA33-IgG1-F699.

На фиг. 21 представлена диаграмма, на которой показан результат оценки иммуногенности с использованием hA33-IgG1-F698 и hA33-IgG1-F763.

На фиг. 22 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против Fv4-IgG1-F11, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 23 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против Fv4-IgG1-F821, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 24 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против Fv4-IgG1-F890, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека. В представляет собой увеличение А.

На фиг. 25 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против Fv4-IgG1-F939, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 26 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против Fv4-IgG1-F947, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 27 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против Fv4-IgG1-F1009, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 28 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против mPM1-IgG1-mF14, через 14, 21 и 28 суток после введения нормальным мышам.

На фиг. 29 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против mPM1-IgG1-mF39, через 14, 21 и 28 суток после введения нормальным мышам.

На фиг. 30 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против mPM1-IgG1-mF38, через 14, 21 и 28 суток после введения нормальным мышам.

На фиг. 31 представлен график, на котором показаны титры антитела мыши, продуцированного против mPM1-IgG1-mF40, через 14, 21 и 28 суток после введения нормальным мышам.

На фиг. 32 представлен график, на котором показаны концентрации антитела в плазме для Fv4-IgG1-F947 и Fv4-IgG1-FA6a/FB4a через 15 минут, семь часов, одни, двое, трое, четверо и семь суток после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 33 представлена диаграмма, на которой показано изменение связывания каждого из мутантов В3 с FcγRIIb и FcγRIa.

На фиг. 34 представлена диаграмма, на которой показано изменение связывания каждого из мутантов В3 с FcγRIIb и FcγRIIa (Н).

На фиг. 35 представлена диаграмма, на которой показано изменение связывания каждого из мутантов В3 с FcγRIIb и FcγRIIa (R).

На фиг. 36 представлена диаграмма, на которой показано изменение связывания каждого из мутантов В3 с FcγRIIb и FcγRIIIa.

На фиг. 37 представлен график, на котором показана кинетика в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у нормальных мышей и титр антитела мыши против растворимого рецептора IL-6 человека в плазме мыши.

На фиг. 38 представлен график, на котором показана кинетика в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у нормальных мышей, которым вводили антитело мыши против CD4, и титр антитела мыши против растворимого рецептора IL-6 человека в плазме мыши.

На фиг. 39 представлен график, на котором показана кинетика в плазме антитела против рецептора IL-6 у нормальных мышей.

На фиг. 40 представлен график, на котором показана концентрация растворимого рецептора IL-6 человека с течением времени после совместного введения растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против рецептора IL-6 трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг. 41 представлена диаграмма, на которой показана структура CDR3 Fab-фрагмента тяжелой цепи антитела 6RL#9, определенная с помощью рентгеновской кристаллографии.

На фиг. 42 представлен график, на котором показана концентрация антитела в плазме с течением времени для H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1 у нормальных мышей.

На фиг. 43 представлен график, на котором показана концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека с течением времени у нормальных мышей, которым вводили H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 или FH4-IgG1.

На фиг. 44 представлен график, на котором показаны концентрации антитела в плазме с течением времени для H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W и FH4-N434W у нормальных мышей.

На фиг. 45 представлен график, на котором показана концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека с течением времени у нормальных мышей, которым вводили H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W или FH4-N434W.

На фиг. 46 представлена ионообменная хроматограмма для антитела, содержащего последовательность Vk5-2 человека, и антитела, содержащего последовательность hVk5-2_L65, которая имеет модифицированную последовательность гликозилирования из последовательности Vk5-2 человека. Сплошная линия соответствует хроматограмме для антитела, содержащего последовательность Vk5-2 человека (тяжелая цепь: CIM_H, SEQ ID NO: 108; и легкая цепь: hVk5-2, SEQ ID NO: 4). Пунктирная линия соответствует хроматограмме для антитела, содержащего последовательность hVk5-2_L65 (тяжелая цепь: CIM_H (SEQ ID NO: 108); и легкая цепь: hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 107)).

На фиг. 47 представлена диаграмма, на которой показано выравнивание последовательностей константной области IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые пронумерованы согласно системе нумерации EU.

На фиг. 48 представлена схематическая диаграмма, на которой показано образование тетрамерного комплекса, состоящего из одной молекулы Fc-области, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, двух молекул FcRn и одной молекулы FcγR.

На фиг. 49 представлена схематическая диаграмма, на которой показано взаимодействие двух молекул FcRn и одной молекулы FcγR с Fc-областью, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН и более низкой активностью связывания с активирующим FcγR, чем нативная Fc-область.

На фиг. 50 представлена схематическая диаграмма, на которой показано взаимодействие двух молекул FcRn и одной молекулы FcγR с Fc-областью, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН и селективной активностью связывания с ингибирующим FcγR.

На фиг. 51 представлена схематическая диаграмма, на которой показано взаимодействие двух молекул FcRn и одной молекулы FcγR с Fc-областью, в которой только один из двух полипептидов FcRn-связывающего домена обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, а другой не обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН.

На фиг. 52 представлен график, на котором показана взаимосвязь намеченного распределения аминокислот (обозначенное как модель) и распределения аминокислот (обозначенное как библиотека), для информации о последовательности в отношении 290 клонов, выделенных из Е. coli, в которые была введена генная библиотека антител, которые связываются с антигенами Са-зависимым образом. На горизонтальной оси указаны положения аминокислот в системе нумерации Kabat. На вертикальной оси указано % распределение аминокислот.

На фиг. 53 представлен график, на котором показана взаимосвязь намеченного распределения аминокислот (обозначенное как модель) и распределения аминокислот (обозначенное как библиотека) для информации о последовательности в отношении 132 клонов, выделенных из Е. coli, в которые была введена генная библиотека антител, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом. На горизонтальной оси указаны положения аминокислот в системе нумерации Kabat. На вертикальной оси указано % распределение аминокислот.

На фиг. 54 представлен график, на котором показана концентрация в плазме с течением времени Fv4-IgG1-F947 и Fv4-IgG1-F1326 у трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1-F947 или Fv4-IgG1-F1326.

На фиг. 55 представлен график, на котором на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для каждого варианта PD, а на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта PD. Значение величины связывания каждого варианта PD с каждым FcγR делили на значение величины связывания IL6R-F652, которое представляет собой контрольное антитело до внесения изменения (измененная Fc путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp) в каждый FcγR; а затем полученную величину умножали на 100 и использовали в качестве относительной величины активности связывания для каждого варианта PD с каждым FcγR. На графике F652 на фигуре показана величина для IL6R-F652.

На фиг. 56 показан график, на котором на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для вариантов, полученных путем внесения каждого изменения в GpH7-B3, который не имеет изменения P238D, и на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для вариантов, полученных путем внесения каждого изменения в IL6R-F652, имеющего изменение P238D. Значение величины связывания FcγRIIb каждого варианта делили на значение величины связывания FcγRIIb предварительно измененного антитела; а затем полученную величину умножали на 100 и использовали в качестве величины относительной активности связывания. В этом случае, область А содержит изменения, которые проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb в обоих случаях, когда изменение вносят в GpH7-B3, который не имеет P238D, и когда изменение вносят в IL6R-F652, который имеет P238D. Область В содержит изменения, которые проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb при введении в GpH7-B3, который не имеет P238D, но не проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb при введении в IL6R-F652, который имеет P238D.

На фиг. 57 показана кристаллическая структура комплекса внеклеточной области Fc (P238D)/FcγRIIb.

На фиг. 58 представлено изображение с наложением кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, в отношении внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена A Fc путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основании расстояний между парами атомов Са.

На фиг. 59 показано сравнение детальной структуры в области P238D после наложения кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, в отношении только СН2-домена A Fc или только СН2-домена В Fc путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основании расстояний между парами атомов Сα.

На фиг. 60 показано, что водородная связь может находиться между основной цепью Gly в положении 237 (указанном согласно нумерации EU) в СН2-домене A Fc, и Tyr в положении 160 в FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 61 показано, что между Asp в положении 270 (указанном согласно нумерации EU) в СН2-домене В Fc, и Arg в положении 131 FcγRIIb может быть выявлено электростатическое взаимодействие в кристаллической структуре комплекса внеклеточной области Fc(P238D)/FcγRIIb.

На фиг. 62 представлен график, на котором на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для каждого варианта 2В, и на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта 2В. Значение величины связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR делили на значение величины связывания контрольного антитела перед изменением (измененная Fc с заменой Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp) для каждого FcγR; а затем полученную величину умножали на 100, и использовали в качестве величины относительной активности связывания каждого варианта 2В в отношении каждого FcγR.

На фиг. 63 показан Glu в положении 233 (указанном согласно нумерации EU) в цепи A Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 64 показан Ala в положении 330 (указанном согласно нумерации EU) в цепи A Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 65 показаны структуры Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU) цепи В Fc после наложения кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα, в отношении В-цепи Fc.

Способ осуществления изобретения

Определения и подробное описание ниже предоставлены для того, чтобы помочь понять настоящее изобретение, проиллюстрированное в настоящем описании.

Аминокислоты

В рамках настоящего изобретения аминокислоты описаны с помощью однобуквенного или трехбуквенного кодов или обоих из них, например, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I или Val/V.

Антигены

В рамках настоящего изобретения "антигены" конкретно не ограничены по их структуре, при условии, что они содержат эпитопы, с которыми связываются антигенсвязывающие домены.

Другие антигены включают, например, представленные ниже молекулы: 17-IA, 4-1ВВ, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозиновый рецептор A1, A33, ACE, ACE-2, активны, активны А, активны AB, активны В, активин С, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/ТАСЕ, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический пептид, интегрин av/b3, Ax1, b2M, В7-1, В7-2, В7-Н, В-лимфоцитарный стимулирующий фактор (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Вах, ВСА-1, ВСАМ, Bcl, ВСМА, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 остеогенин, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, костный нейротрофический фактор, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактор комплемента 3 (С3), С3а, С4, С5, С5а, С10, СА125, CAD-8, кальцитонин, сАМР, карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированный со злокачественной опухолью, катепсин А, катепсин В, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин Е, катепсин Н, катепсин L, катепсин О, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок р67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (В7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсин Botulinum, токсин Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератиновый ассоциированный с опухолью антиген, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, регулирующий фактор комплемента (фактор, ускоряющий распад), дез-(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, ДНКМ-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептор эндотелина, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, фактор активации фибробластов (FAP), Fas, FcRI, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа1 GFR-альфа2, GFR-альфа3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp 130, gp72, GRO, рилизинг-фактор гормона роста, гаптен (NP-cap или NIP-cap), НВ-EGF, НСС, гликопротеин оболочки gB HCMV, гликопротеин оболочки gH HCMV, UL HCMV, гемопоэтический фактор роста (HGF), НерВ gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген (HMW-MAA), gp120 HIV, петля V3 gp 120 IIIB HIV, HLA, HLA-DR, HM1,24, HMFG РЕМ, HRG, Hrk, сердечный миозин человека, цитомегаловирус человека (HCMV), гормон роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа-2, интегрин альфа-3, интегрин альфа-4, интегрин альфа4/бета1, интегрин альфа4/бета7, интегрин альфа5 (альфа V), интегрин альфа5/бета1, интегрин альфа5/бета3, интегрин альфа6, интегрин бета1, интегрин бета2, интерферон-гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин LI, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, KC, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bpl, LBP, LDGF, LECT2, lefty, антиген Lewis-Y, ассоциированный с Lewis-Y антиген, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, белок поверхности легких, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина-бета, Мас-1, MAdCAM, MAG, МАР2, MARC, МСАМ, МСАМ, MCK-2, МСР, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, МНС (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, ММАС1, ММР, ММР-1, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13, ММР-14, ММР-15, ММР-2, ММР-24, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, MPIF, Мро, MSK, MSP, муцин (Muc1), MUC18, мюллерово ингибиторное вещество, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, адгерин N-C, NCA90, NCAM, NCAM, неприлизин, нейротрофин-3, -4 или -6, нейротурин, фактор роста нервов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGGI, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP), P1GF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок С, PS, PSA, PSCA, простат-специфический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, А-цепь релаксина, В-цепь релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (ассоциированный с опухолью гликопротеин-72), TARC, ТСА-3, Т-клеточный рецептор (например, Т-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, TECK, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза семенников, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, панспецифический TGF-бета, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевой фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа-бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD 120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD 120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (0X40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (лиганд ODF TRANCE/RANK, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд Apo-3 TWEAK, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд IVEM LIGHT I, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганд AITR лиганда GITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a коннектин, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд gp34 OX40, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD154 CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганд Apo-1 Fas-лиганда, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD70 CD27), TNFSF8 (лиганд CD153 CD30), TNFSF9 (лиганд CD137 лиганда 4-1ВВ), TP-1, t-PA, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, ассоциированный с опухолью CA125, ассоциированный с опухолью антиген, экспрессирующий ассоциированные с Lewis-Y углеводы, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерин, VE-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный анотиген, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный LDL, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин А, хромогранин В, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, С3, С3а, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, фактор В, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевой фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор IXa, фактор X, фактор Ха, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор Xlla, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA и SIP; и рецепторы для гормонов и факторов роста.

"Эпитоп" означает антигенную детерминанту в антигене и относится к антигенному центру, с которым связывается антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, описанной в настоящем описании. Таким образом, например, эпитоп может быть определен в соответствии с его структурой. Альтернативно эпитоп может быть определен в соответствии с антигенсвязывающей активностью антигенсвязывающей молекулы, которая распознает эпитоп. Когда антиген представляет собой пептид или полипептид, эпитоп может быть указан с помощью аминокислотных остатков, образующих эпитоп. Альтернативно, когда эпитоп представляет собой цепь сахара, эпитоп может быть указан с помощью его определенной структуры цепи сахаров.

Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, который содержит эпитоп, в котором распознается его первичная аминокислотная последовательность. Такой линейный эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере три и наиболее часто по меньшей мере пять, например, приблизительно 8-10 или 6-20 аминокислот в его конкретной последовательности.

В противоположность линейному эпитопу, "конформационный эпитоп" представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность, содержащая эпитоп, не является единственной детерминантой распознаваемого эпитопа (например, первичная аминокислотная последовательность конформационного эпитопа не обязательно распознается определяющим эпитоп антителом). Конформационные эпитопы могут содержать большее количество аминокислот по сравнению с линейными эпитопами. Антитело, распознающее конформационный эпитоп, распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда молекула белка сворачивается и формирует трехмерную структуру, аминокислоты и/или основные цепи полипептида, которые образуют конформационный эпитоп, располагаются рядом друг с другом, и эпитоп становится распознаваемым для антитела. Способы определения конформаций эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию, двумерный ядерный магнитный резонанс, сайт-специфическое спиновое мечение и электронный парамагнитный резонанс, но они не ограничиваются ими. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).

Активность связывания

Примеры способа оценки связывания эпитопа исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, описаны ниже. В соответствии с примерами ниже, также можно соответствующим образом проводить способы оценки связывания эпитопа исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен, с антигеном, отличным от IL-6R.

Например, то, что исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, распознает линейный эпитоп в молекуле IL-6R, можно подтвердить, например, как описано ниже. Для указанной выше цели синтезируют линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. Пептид можно синтезировать химически или его можно получать способами генетической инженерии с использованием области, кодирующей аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену в кДНК IL-6R. Затем исследуемую антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен для IL-6R, оценивают в отношении ее активности связывания с линейным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен. Например, иммобилизованный линейный пептид можно использовать в качестве антигена в ELISA для оценки активности связывания антигенсвязывающей молекулы с пептидом. Альтернативно активность связывания с линейным пептидом можно оценивать, исходя из уровня, на котором линейный пептид ингибирует связывание антигенсвязывающей молекулы с клетками, экспрессирующими IL-6R. Эти исследования могут продемонстрировать активность связывания антигенсвязывающей молекулы с линейным пептидом.

Наличие распознавания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, конформационного эпитопа можно оценивать следующим образом. Для указанной выше цели получают экспрессирующие IL-6R клетки. Наличие распознавания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен IL-6R, конформационного эпитопа, можно определять, когда она прочно связывается с экспрессирующими IL-6R клетками при контакте, но по существу не связывается с иммобилизованным линейным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. В рамках настоящего изобретения "по существу не связывает" означает, что активность связывания составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее, и особенно предпочтительно 15% или менее по сравнению с активностью связывания с клетками, экспрессрующими IL-6R человека.

Способы оценки активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с экспрессирующими IL-6R клетками, включают, например, способы, описанные в Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). В частности, оценку можно проводить на основе принципа ELISA или активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с использованием в качестве антигена экспрессирующих IL-6R клеток.

В формате ELISA активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с экспрессирующими IL-6R клетками можно оценивать количественно путем сравнения уровней сигнала, генерируемого ферментативной реакцией. В частности, исследуемый полипептидный комплекс добавляют в планшет для ELISA, на котором иммобилизованы эксперессирующие IL-6R клетки. Затем антигенсвязывающую молекулу, связанную с клетками, выявляют с использованием меченного ферментом антитела, которое распознает исследуемую антигенсвязывающую молекулу. Альтернативно, когда используют FACS, приготавливают серии разведений исследуемой антигенсвязывающей молекулы и можно определять титр связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками для сравнения активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующими IL-6R клетками.

Связывание исследуемой антигенсвязывающей молекулы с антигеном, экспрессируемым на поверхности клеток, суспендированных в буфере или сходных с ним, можно выявлять с использованием проточного цитометра. Известные проточные цитометры включают, например, следующие устройства:

FACSCanto™ II

FACSAria™

FACSArray™

FACSVantage™ SE

FACSCalibur™ (все являются торговыми названиями BD Biosciences)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все являются торговыми названиями Beckman Coulter).

Предпочтительные способы оценки активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с антигеном, включают, например, следующий способ. Сначала экспрессирующие IL-6R клетки подвергают реакции с исследуемой антигенсвязывающей молекулой, а затем их окрашивают меченным FITC вторичным антителом, которое распознает антигенсвязывающую молекулу. Исследуемую антигенсвязывающую молекулу надлежащим образом разбавляют подходящим буфером с получением молекулы с желаемой концентрацией. Например, молекулу можно использовать в концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Затем определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток с использованием FACSCalibur (BD). Интенсивность флуоресценции, полученную с помощью анализа с использованием программного обеспечения CELL QUEST (BD), т.е. среднее геометрическое значение, отражает количество антитела, связанного с клетками. Следовательно, активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, которую отражает количество связанной исследуемой антигенсвязывающей молекулы, можно определять путем определения геометрического среднего значения.

То, обладает ли исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, общим эпитопом с другой антигенсвязывающей молекулой, можно оценивать на основе конкуренции между двумя молекулами за один и тот же эпитоп. Конкуренцию между антигенсвязывающими молекулами можно выявлять с помощью анализа перекрестного блокирования и т.п. Например, предпочтительным анализом перекрестного блокирования является конкурентный анализ ELISA.

В частности, в анализе перекрестного блокирования белок IL-6R, иммобилизованный на лунках микропланшета для титрования, предварительно инкубируют в присутствии или в отсутствие являющейся кандидатом конкурентной антигенсвязывающей молекулы, а затем к ним добавляют антигенсвязывающую молекулу. Количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с белком IL-6R в лунках, непрямо коррелирует со связывающей способностью являющейся кандидатом конкурентной антигенсвязывающей молекулы, которая конкурирует за связывание с тем же эпитопом. Следовательно, чем более высокой является аффинность конкурентной антигенсвязывающей молекулы к тому же эпитопу, тем более низкой является активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы с покрытыми белком IL-6R лунками.

Количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с лунками через IL-6R, можно без труда определить путем предварительного мечения антигенсвязывающей молекулы. Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу определяют с использованием конъюгата авидин/пероксидаза и соответствующего субстрата. В частности, анализ перекрестного блокирования, в котором используются ферментные метки, такие как пероксидаза, называют "конкурентным анализом ELISA".

Антигенсвязывающую молекулу также можно метить другими агентами для мечения, которые обеспечивают выявление или измерение. В частности, известны радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т.п.

Когда являющаяся кандидатом конкурентная антигенсвязывающая молекула может блокировать связывание исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 20-50%, и более предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с активностью связывания в контрольном эксперименте, проведенном в отсутствие конкурентной антигенсвязывающей молекулы, то определяют, что исследуемая антигенсвязывающая молекула по существу связывается с тем же эпитопом, с которым связывается конкурентная антигенсвязывающая молекула, или конкурирует за связывание с тем же эпитопом.

Когда структура эпитопа, с которым связывается исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, уже идентифицирована, тогда то, имеют ли исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы общий эпитоп, можно оценивать путем сравнения активности связывания двух антигенсвязывающих молекул с пептидом, полученным путем внесения аминокислотных мутаций в пептид, формирующий эпитоп.

Для измерения указанной выше активности связывания, например, активность связывания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул в отношении линейного пептида, в который внесена мутация, сравнивают в описанном выше формате ELISA. Помимо способов ELISA, активность связывания с мутантным пептидом, связанным с колонкой, можно определять путем пропускания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул через колонку, а затем количественного определения антигенсвязывающей молекулы, элюированной в элюирующем растворе. Способы адсорбции мутантного пептида на колонку, например, в форме слитого пептида с GST, известны.

Альтернативно, когда идентифицированный эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, тогда то, обладают ли исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы общим эпитопом, можно оценивать следующим способом. Сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки и клетки, экспрессирующие IL-6R с мутацией, внесенной в эпитоп. Исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы добавляют в суспензию клеток, полученную суспендированием этих клеток в соответствующем буфере, таком как PBS. Затем клеточные суспензии надлежащим образом промывают буфером, и к ним добавляют меченное FITC антитело, которое распознает исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы. Интенсивность флуоресценции и количество клеток, окрашенных меченым антителом, определяют с использованием FACSCalibur (BD). Исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы надлежащим образом разбавляют с использованием подходящего буфера и используют в желаемых концентрациях. Например, их можно использовать в концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Интенсивность флуоресценции, определенная с помощью анализа с использованием программного обеспечения CELL QUEST (BD), т.е. геометрическое среднее значение, отражает количество меченного антитела, связавшегося с клетками. Следовательно, активность связывания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул, которую отражает количество связавшегося меченого антитела, можно определять путем измерения геометрического среднего значения.

В описанном выше способе то, что антигенсвязывающая молекула "по существу не связывается с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R," можно оценивать, например, следующим способом. Сначала исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы, связанные с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R, окрашивают меченым антителом. Затем определяют интенсивность флуоресценции клеток. Когда используют FACSCalibur для выявления флуоресценции проточной цитометрией, определенную интенсивность флуоресцении можно анализировать с использованием программного обеспечения CELL QUEST. Из геометрических средних значений в присутствии и в отсутствие полипептидного комплекса можно вычислять сравнительное значение (ΔGeo-Mean) по следующей формуле для определения соотношения увеличения интенсивности флуоресценции в результате связывания антигенсвязывающей молекулой.

ΔGeo-Mean = Geo-Mean (в присутствии полипептидного комплекса) / Geo-Mean (в отсутствие полипептидного комплекса)

Геометрическое среднее сравнительное значение (значение ΔGeo-Mean для мутантной молекулы IL-6R), определенное с помощью описанного выше анализа, которое отражает количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R, сравнивают со сравнительным значением ΔGeo-Mean, которое отражает количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с экспрессирующими IL-6R клетками. В этом случае, особенно предпочтительно, чтобы концентрации исследуемой антигенсвязывающей молекулы, используемой для определения сравнительных значений ΔGeo-Mean для экспрессирующих IL-6R клеток и клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, были скорректированы так, чтобы они были равными или по существу равными. В качестве контрольной антигенсвязывающей молекулы используют антигенсвязывающую молекулу, для которой подтверждено, что она распознает эпитоп в IL-6R.

Если сравнительное значение ΔGeo-Mean исследуемой антигенсвязывающей молекулы для клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, меньше чем сравнительное значение ΔGeo-Mean исследуемой антигенсвязывающей молекулы для экспрессирующих IL-6R клеток по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 30%, и особенно предпочтительно на 15%, тогда исследуемая антигенсвязывающая молекула "по существу не связывается с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R". Формула для определения значения Geo-Mean (геометрического среднего значения) описана в руководстве пользователя программного обеспечения CELL QUEST (BD biosciences). Если сравнение показывает, что сравнительные величины по существу эквивалентны, то может быть определено, что эпитоп для исследуемой и контрольной антигенсвязывающих молекул является одним и тем же.

Антигенсвязывающий домен

В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающий домен" может представлять собой любую структуру при условии, что она связывается с представляющим интерес антигеном. Такие домены предпочтительно включают, например:

вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей антител;

модуль приблизительно из 35 аминокислот, называемый А-доменом, который содержится в мембранном белке клеток авимере in vivo (WO 2004/044011, WO 2005/040229);

аднектин, содержащий домен 10Fn3, который связывается с белковой частью фибронектина - гликопротеина, экспрессирующегося на клеточной мембране (WO 2002/032925);

аффитело, которое состоит из трехспирального пучка из 58-аминокислот на основе каркаса связывающего IgG домена белка А (WO 1995/001937);

Смоделированные белки анкиринового повтора (DARPin), которые представляют собой область, экспонированную на молекулярной поверхности анкириновых повторов (AR), имеющих структуру, в которой субъединица, состоящая из поворота, содержащего 33 аминокислотных остатка, две антипараллельных спирали и петли многократно сложены в стопку (WO 2002/020565);

антикалины и т.п., которые представляют собой домены, состоящие из четырех петель, которые поддерживают одну сторону структуры бочки, состоящей из восьми расположенных по кругу антипараллельных нитей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокалина, таких как ассоциированный с желатином липокалин нейтрофилов (NGAL) (WO 2003/029462); и

вогнутая область, образованная структурой параллельных слоев внутри структуры в форме подковы, образованной уложенными в стопку повторами модуля лейцин-богатого повтора (LRR) вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и используется в системе приобретенного иммунитета у бесчелюстных позвоночных, таких как минога и миксина (WO 2008/016854). Предпочтительные антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению включают, например, антигенсвязывающие домены, имеющие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей антител. Предпочтительные примеры антигенсвязывающих доменов включают "одноцепочечный Fv (scFv)", "одноцепочечное антитело", "Fv", "одноцепочечный Fv 2 (scFv2)", "Fab" и "F(ab')2".

Антигенсвязывающие домены антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению могут связываться с идентичным эпитопом. Такой эпитоп может присутствовать, например, в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Альтернативно эпитоп может присутствовать в белке, содержащем аминокислоты в положениях 20-365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Альтернативно, каждый из антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению может связываться с отличающимся эпитопом. В рамках настоящего изобретения, отличающийся эпитоп может присутствовать, например, в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Альтернативно, эпитоп может присутствовать в белке, содержащем аминокислоты в положениях 20-365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Специфичность

"Специфичный" означает, что одна из молекул, которая специфически связывается, не проявляет никакого существенного связывания с молекулами, отличными от одной или нескольких молекул-партнеров по связыванию. Более того, "специфичный" также используют, когда антигенсвязывающий домен является специфичным к конкретному эпитопу среди множества эпитопов в антигене. Когда эпитоп, связываемый антигенсвязывающим доменом, содержится в нескольких различных антигенах, антигенсвязывающие молекулы, содержащие антигенсвязывающий домен, могут связываться с различными антигенами, которые имеют этот эпитоп.

Антитело

В рамках настоящего изобретения "антитело" относится к природному иммуноглобулину или иммуноглобулину, полученному частичным или полным синтезом. Антитела можно выделять из природных источников, таких как природная плазма и сыворотка, или из культуральных супернатантов продуцирующих антитела гибридом. Альтернативно антитела можно частично или полностью синтезировать с использованием способов, таких как генетическая рекомбинация. Предпочтительные антитела включают, например, антитела изотипа иммуноглобулинов или принадлежащего ему подкласса. Известные иммуноглобулины человека включают антитела следующих девяти классов (изотипов): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM. Из этих изотипов антитела по настоящему изобретению включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Способы получения антитела с желаемой активностью связывания известны специалистам в данной области. Ниже приведен пример, в котором описан способ получения антитела, которое связывается с IL-6R (антитело против IL-6R). Антитела, которые связываются с антигеном, отличным от IL-6R, также можно получать в соответствии с примером, описанным ниже.

Антитела против IL-6R можно получать в качестве поликлональных или моноклональных антител с использованием известных способов. Продуцируемые антитела против IL-6R предпочтительно представляют собой моноклональные антитела, происходящие из млекопитающих. Такие происходящие из млекопитающих моноклональные антитела включают антитела, продуцируемые гибридомами или клетками-хозяевами, трансформированными экспрессирующим вектором, несущим ген антитела, способами генетической инженерии. Моноклональные антитела по настоящему изобретению включают "гуманизированные антитела" или "химерные антитела".

Продуцирующие моноклональные антитела гибридомы можно получать с использованием известных способов, например, как описано ниже. В частности, млекопитающих иммунизируют общепринятыми способами иммунизации с использованием белка IL-6R в качестве сенсибилизирующего антигена. Полученные иммунные клетки подвергают слиянию с известными родительскими клетками общепринятыми способами слияния клеток. Затем гибридомы, продуцирующие антитело против IL-6R, можно отбирать путем скрининга продуцирующих моноклональное антитело клеток с использованием общепринятых способов скрининга.

В частности, моноклональные антитела получают так, как описано ниже. Сначала можно экспрессировать ген IL-6R, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, для получения белка IL-6R, представленного в SEQ ID NO: 1, который будет использован в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела. Для этого последовательность гена, кодирующего IL-6R, встраивают в известный экспрессирующий вектор, и подходящие клетки-хозяева трансформируют этим вектором. Желаемый белок IL-6R человека очищают из клеток-хозяев или их культуральных супернатантов известными способами. Для получения растворимого IL-6R из культуральных супернатантов, например, белок, состоящий из аминокислот в положениях 1-357 в полипептидной последовательности IL-6R SEQ ID NO: 1, такой как описан в Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), экспрессируют в качестве растворимого IL-6R вместо белка IL-6R SEQ ID NO: 1. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать очищенный природный белок IL-6R.

Очищенный белок IL-6R можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для иммунизации млекопитающих. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать неполный пептид IL-6R. В этом случае, неполный пептид можно получать путем химического синтеза на основе аминокислотной последовательности IL-6R человека, или путем встраивания неполного гена IL-6R в экспрессирующий вектор для экспрессии. Альтернативно неполный пептид можно получать путем деградации белка IL-6R протеазой. Длина и область неполного пептида IL-6R не ограничены конкретными вариантами осуществления. Предпочтительная область может быть произвольным образом выбрана из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-357 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Количество аминокислот, образующих пептид, подлежащий применению в качестве сенсибилизирующего антигена, предпочтительно составляет по меньшей мере пять или более, шесть или более, или семь или более. Более конкретно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать пептид из 8-50 остатков, более предпочтительно, из 10-30 остатков.

Альтернативно, для сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок, полученный путем слияния желаемого неполного полипептида или пептида белка IL-6R с отличающимся полипептидом. Например, предпочтительно в качестве сенсибилизирующих антигенов используют Fc-фрагменты антител и пептидные метки. Векторы для экспрессии таких слитых белков можно конструировать путем слияния в рамке считывания генов, кодирующих два или более желаемых полипептидных фрагментов, и встраивания слитого гена в экспрессирующий вектор, как описано выше. Способы получения слитых белков описаны в Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Способы получения IL-6R для применения в качестве сенсибилизирующего антигена и способы иммунизации с использованием IL-6R конкретно описаны в WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693 и т.п.

Отсутствуют конкретное ограничение на млекопитающих, подлежащих иммунизации сенсибилизирующим антигеном. Однако предпочтительно выбирать млекопитающих, учитывая их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительно используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомячки, кроликов и обезьян.

Указанных выше животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном известными способами. Как правило, выполняемые способы иммунизации включают, например, внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующего антигена млекопитающим. В частности, сенсибилизирующий антиген соответствующим образом разбавляют PBS (фосфатно-солевой буфер), физиологическим солевым раствором или сходными с ними. Если желательно, общепринятый адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда, смешивают с антигеном и смесь эмульгируют. Затем сенсибилизирующий антиген вводят млекопитающем несколько раз с интервалами 4-21 суток. При иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно использовать подходящие носители. В частности, когда в качестве сенсибилизирующего антигена используют низкомолекулярный неполный пептид, иногда желательно связывать сенсибилизирующий антигенный пептид с белком-носителем, таким как альбумин или гемоцианин лимфы улитки, для иммунизации.

Альтернативно гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, можно получать с использованием способов иммунизации ДНК, как описано ниже. Иммунизация ДНК представляет собой способ иммунизации, который обеспечивает стимуляцию иммунной системы путем экспрессии сенсибилизирующего антигена у животного, имунизированного в результате введения векторной ДНК, сконструированной для обеспечения экспрессии гена, кодирующего антигенный белок, у животного. По сравнению с общепринятыми способами иммунизации, в которых белковый антиген вводят животным, подлежащим иммунизации, иммунизация ДНК является лучшей в том, что:

- может быть обеспечена стимуляция иммунной системы при сохранении структуры мембранного белка, такого как IL-6R; и

- отсутствует необходимость в очистке антигена для иммунизации.

Для получения моноклонального антитела по настоящему изобретению с использованием иммунизации ДНК, сначала ДНК, экспрессирующую белок IL-6R, вводят животному, подлежащему иммунизации. ДНК, кодирующую IL-6R, можно синтезировать известными способами, такими как ПЦР. Полученную ДНК встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор, а затем его вводят животному, подлежащему иммунизации. Предпочтительно используемые экспрессирующие векторы включают, например, коммерчески доступные экспрессирующие векторы, такие как pcDNA3.1. Векторы можно вводить в организм с использованием общепринятых способов. Например, иммунизацию ДНК проводят с использованием генной пушки для введения покрытых экспрессирующим вектором частиц золота в клетки организма животного, подлежащего иммунизации. Антитела, которые распознают IL-6R. также можно получать способами, описанными в WO 2003/104453.

После иммунизации млекопитающего, как описано выше, подтверждают увеличение титра связывающего IL-6R антитела в сыворотке. Затем иммунные клетки собирают от млекопитающего, а затем подвергают слиянию клеток. В частности, предпочтительно в качестве иммунных клеток используют спленоциты.

В качестве клетки, подлежащей слиянию с упомянутыми выше иммунными клетками, используют клетки миеломы млекопитающих. Клетки миеломы предпочтительно содержат подходящий селективный маркер для скрининга. Селективный маркер придает клеткам характеристики для их выживания (или гибели) в конкретных условиях культивирования. В качестве селективных маркеров известны дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (далее сокращенно обозначаемый как дефицит HGPRT) и дефицит тимидинкиназы (далее сокращенно обозначаемый как дефицит TK). Клетки с дефицитом HGPRT или TK обладают чувствительностью к гипоксантину-аминоптерину-тимидину (далее сокращенно обозначаемой чувствительностью HAT). Чувствительные к HAT клетки не могут синтезировать ДНК в селективной среде HAT, и, таким образом, погибают. Однако, когда клетки слиты с нормальными клетками, они могут продолжать синтезировать ДНК с использованием пути спасения нормальных клеток, и, таким образом, они могут расти в селективной среде HAT.

Селекцию клеток с дефицитом HGPRT и TK можно проводить в среде, содержащей 6-тиогуанин, 8-азагуанин (далее сокращенно обозначаемый как 8AG) или 5'-бромдезоксиуридин, соответственно. Нормальные клетки погибают, поскольку они включают аналоги пиримидина в их ДНК. Между тем, клетки, которые являются дефицитными по этим ферментам, могут выживать в селективной среде, поскольку они не могут включать эти аналоги пиримидина. Кроме того, селективный маркер, называемый устойчивостью к G418, обеспечиваемый геном устойчивости к неомицину, обеспечивает устойчивость к 2-дезоксистрептаминовым антибиотикам (аналоги гентамицина). Известны различные типы миеломных клеток, которые пригодны для слияния клеток.

Например, предпочтительно можно использовать миеломные клетки, включающие следующие клетки:

Р3(P3x63Ag8, 653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);

P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology и Immunology (1978)81, 1-7);

NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);

MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);

SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);

FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);

S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);

R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), и т.д.

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы по существу проводят с использованием известных способов, например, способа Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

Более конкретно, слияние клеток можно проводить, например, в общепринятой культуральной среде в присутствии агента, обеспечивающего слияние клеток. Агенты, обеспечивающие слияние клеток, включают, например, полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (HVJ). Если необходимо, также можно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид, для повышения эффективности слияния.

Соотношение иммунных клеток и клеток миеломы можно определять самостоятельно, предпочтительно, например, оно составляет одну клетку миеломы на каждые от одного до десяти иммуноцитов. Культуральные среды, используемые для слияния клеток, включают, например, среды, которые пригодны для выращивания клеточных линий, такие как среда RPMI1640 и среда MEM, и другие общепринятые культуральные среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, предпочтительно в культуральную среду можно добавлять сывороточные добавки, такие как эмбриональная телячья сыворотка (FCS).

Для слияния клеток заданные количества указанных выше иммунных клеток и миеломных клеток смешивают в описанной выше культуральной среде. Затем добавляют раствор PEG (например, средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый до приблизительно 37°С, в концентрации, как правило, от 30% до 60% (масс./об.). Затем эту смесь осторожно перемешивают для получения желаемых слитых клеток (гибридом). Затем к клеткам постепенно добавляют подходящую культуральную среду, упомянутую выше, и смесь многократно центрифугируют для удаления супернатанта. Таким образом, можно удалить агенты слияния клеток и т.п., которые являются неблагоприятными для роста гибридомы.

Селекцию полученных таким образом гибридом можно проводить путем культивирования с использованием общепринятой селективной среды, например, среды HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, отличные от желаемых гибридом (неслитые клетки) можно уничтожать путем продолжения культивирования в описанной выше среде HAT в течение достаточного периода времени. Как правило, период составляет от нескольких суток до нескольких недель. Затем, гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, подвергают скринингу и клонируют по отдельности общепринятыми способами лимитирующих разведений.

Селекцию полученных таким образом гибридом можно проводить с использованием селективной среды на основе селективного маркера, которым обладает миелома, используемая для слияния клеток. Например, селекцию клеток с дефицитом HGPRT или TK можно проводить путем культивирования с использованием среды HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В частности, когда для слияния клеток используют чувствительные к HAT миеломные клетки, клетки, успешно слитые с нормальными клетками, могут селективно пролиферировать в среде HAT. Клетки, отличные от желаемых гибридом (неслитые клетки), можно уничтожать путем продолжения культивирования в описанной выше среде HAT в течение достаточного периода времени. В частности, селекцию желаемых гибридом можно проводить путем культивирования, как правило, в течение от нескольких суток до нескольких недель. Затем гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, подвергают скринингу и по отдельности клонируют общепринятыми способами лимитирующих разведений.

Желаемые антитела можно предпочтительно отбирать и по отдельности клонировать способами скрининга на основе известной реакции антиген/антитело. Например, связывающее IL-6R моноклональное антитело может связываться с IL-6R, экспрессированным на поверхности клетки. Такое моноклональное антитело можно подвергать скринингу с помощью активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS). FACS представляет собой систему, которая оценивает связывание антитела с клеточной поверхностью путем анализа клеток, контактирующих с флуоресцентным антителом, с использованием лазерного луча и измерения флуоресценции, испускаемой индивидуальными клетками.

Для скрининга гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела по настоящему изобретению, с помощью FACS, сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки. Клетки, предпочтительно используемые для скрининга, представляют собой клетки млекопитающих, в которых IL-6R экспрессируется неестественным образом. В качестве контроля можно проводить селективное выявление активности антитела, которое связывается с IL-6R клеточной поверхности, с использованием в качестве клеток-хозяев нетрансформированных клеток млекопитающих. В частности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против IL-6R, можно выделять путем селекции гибридом, которые продуцируют антитело, которое связывается с клетками, в которых экспрессируется IL-6R неестественным образом, но не с клетками-хозяевами.

Альтернативно активность связывания антитела с иммобилизованными экспрессирующими IL-6R клетками можно оценивать на основе принципа ELISA. Например, экспрессирующие IL-6R клетки иммобилизуют на лунках планшета для ELISA. Культуральные супернатанты гибридом контактируют с иммобилизованными клетками в лунках и выявляют антитела, которые связываются с иммобилизованными клетками. Когда моноклональные антитела происходят из мыши, антитела, связанные с клетками, можно выявлять с использованием антитела против иммуноглобулина мыши. Селекцию гибридом, продуцирующих желаемое антитело, обладающее антигенсвязывающей способностью, проводят с помощью описанного выше скрининга, и их можно клонировать способом лимитирующих разведений и т.п.

Продуцирующие моноклональное антитело гибридомы, полученные таким образом, можно пассировать в общепринятой культуральной среде и хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

Описанные выше гибридомы культивируют общепринятым способом, и желаемые моноклональные антитела можно получать из культуральных супернатантов. Альтернативно гибридомы вводят совместимым млекопитающим и выращивают в них, и моноклональные антитела получают из асцитной жидкости. Первый из этих способов пригоден для получения антител с высокой чистотой.

Предпочтительно также можно использовать антитела, кодируемые генами антител, которые клонированы из антителопродуцирующих клеток, таких как описанные выше гибридомы. Клонированный ген антитела встраивают в подходящий вектор, и его вводят в клетку-хозяина для экспрессии антитела, кодируемого геном. Способы выделения генов антител, встраивания генов в векторы и трансформации клеток-хозяев, уже разработаны, например, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Способы продуцирования рекомбинантных антител также известны, как описано ниже.

Например, кДНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела против IL-6R, получают из клеток гибридомы, экспрессирующих антитело против IL-6R. Для этой цели сначала из гибридом экстрагируют тотальную РНК. Способы, используемые для экстракции мРНК из клеток, включают, например:

- способ ультрацентрифугирования с гуанидином (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), и

- способ AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159)

Экстрагированные мРНК можно очищать с использованием набора для очистки мРНК mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience) и т.п. Альтернативно также коммерчески доступны наборы для экстракции тотальной мРНК непосредственно из клеток, такие как набор для очистки мРНК QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience). мРНК можно получать из гибридом с использованием таких наборов. кДНК, кодирующие V-область антитела, можно синтезировать из полученных мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Co.) и т.п. Более того, для синтеза и амплификации кДНК можно соответствующим образом использовать набор для амплификации кДНК SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) и способ 5'-RACE на основе ПЦР (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932). В таком способе синтеза кДНК на оба конца кДНК можно вносить подходящие участки для ферментов рестрикции, описанные ниже.

Представляющий интерес фрагмент кДНК очищают из полученного продукта ПЦР, а затем его лигируют в векторную ДНК. Таким образом, конструируют рекомбинантный вектор и вводят в Е. coli и т.п. После селекции колоний из образующих колонии Е. coli можно получать желаемый рекомбинантный вектор. Затем исследуют, имеет ли рекомбинантный вектор представляющую интерес нуклеотидную последовательность кДНК, известным способом, таким как способ с терминацией цепи дидезоксинуклеотидами.

Способ 5'-RACE, в котором используются праймеры для амплификации гена вариабельной области, удобно использовать для выделения гена, кодирующего вариабельную область. Сначала конструируют библиотеку кДНК 5'-RACE с помощью синтеза кДНК с использованием РНК, экстрагированных из клеток гибридом в качестве матрицы. Для синтеза библиотеки кДНК 5'-RACE соответствующим образом используют коммерчески доступный набор, такой как набор для амплификации кДНК SMART RACE.

Ген антитела амплифицируют способом ПЦР с использованием полученной библиотеки кДНК 5'-RACE в качестве матрицы. Праймеры для амплификации гена антитела мыши можно конструировать на основе известных последовательностей генов антител. Нуклеотидные последовательности праймеров варьируют, в зависимости от подкласса иммуноглобулинов. Таким образом, предпочтительно, чтобы подкласс был определен заранее с использованием коммерчески доступного набора, такого как набор для изотипирования моноклональных антител мыши Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).

В частности, например, праймеры, которые обеспечивают амплификацию генов, кодирующих тяжелые цепи γ1, γ2а, γ2b и γ3 и легкие цепи κ и λ, используют для выделения генов, кодирующих IgG мыши. Как правило, для амплификации гена вариабельной области gG используют праймер, который гибридизуется с областью константной области вблизи вариабельной области, в качестве 3'-праймера. Между тем, в качестве 5'-праймера используют праймер, прилагаемый к набору для конструирования библиотеки кДНК 5'-RACE.

Продукты ПЦР, амплифицированные таким образом, используют для переформировывания иммуноглобулинов, состоящих из комбинации тяжелых и легких цепей. Селекцию желаемого антитела можно проводить с использованием активности связывания IL-6R переформированного иммуноглобулина в качестве индикатора. Например, когда задачей является выделение антитела против IL-6R, более предпочтительно, чтобы связывание антитела с IL-6R было специфическим. Скрининг связывающего IL-6R антитела можно проводить, например, с помощью следующих стадий:

(1) контактирование экспрессирующей IL-6R клетки с антителом, содержащим V-область, кодируемую кДНК, выделенной из гибридомы;

(2) выявление связывания антитела с эксперессирующей IL-6R клеткой; и

(3) селекция антитела, которое связывается с экспрессирующей IL-6R клеткой.

Способы выявления связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками известны. В частности, связывание антитела с экспрессирующими IL-6R клетками можно выявлять с помощью описанных выше способов, таких как FACS. Для оценки активности связывания антитела соответствующим образом используют иммобилизованные образцы экспрессирующих IL-6R клеток.

Предпочтительные способы скрининга антител, в которых в качестве индикатора используется активность связывания, также включают способы пэннинга с использованием фаговых векторов. Способы скрининга с использованием фаговых векторов являются преимущественными, когда гены антител выделяют из библиотек подклассов тяжелых цепей и легких цепей из популяции клеток, экспрессирующей поликлональное антитело. Гены, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей, можно связывать соответствующей линкерной последовательностью с получением одноцепочечного Fv (scFv). Фаги, представляющие scFv на их поверхности, можно получать встраиванием гена, кодирующего scFv, в фаговый вектор. Фаги контактируют с представляющим интерес антигеном. Затем ДНК, кодирующую scFv, обладающие представляющей интерес активностью связывания, можно выделять путем сбора фагов, связанных с антигеном. Этот процесс можно повторять при необходимости для увеличения содержания scFv, обладающих представляющий интерес активностью связывания.

После выделения кДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела против IL-6R, кДНК расщепляют ферментами рестрикции, которые распознают участки рестрикции, встроенные на обоих концах кДНК. Предпочтительные ферменты рестрикции распознают и расщепляют нуклеотидную последовательность, которая встречается в нуклеотидной последовательности гена антитела с низкой частотой. Более того, предпочтительно в представляющий интерес вектор вводят участок рестрикции для фермента, который образует липкий конец, для встраивания одной копии расщепленного фрагмента в правильной ориентации. Кодирующую кДНК V-область антитела против IL-6R расщепляют, как описано выше, и ее встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор для конструирования экспрессирующего вектора для антитела. В этом случае, если ген, кодирующий константную область антитела (С-область) и ген, кодирующий описанную выше V-область, слить в рамке считывания, то получится химерное антитело. В рамках настоящего изобретения "химерное антитело" означает, что происхождение константной области отличается от вариабельной области. Таким образом, в дополнение к гетерохимерным антителам мыши/человека, химерные антитела по настоящему изобретению включают аллохимерные антитела человека/человека. Экспрессирующий вектор для химерного антитела можно конструировать путем встраивания гена V-области в экспрессирующий вектор, который уже имеет константную область. В частности, например, последовательность, распознаваемая первым ферментом рестрикции, который расщепляет выше гена V-области, можно соответствующим образом помещать на 5'-конец экспрессирующего вектора, содержащего ДНК, кодирующую желаемую константную область (С-область) антитела. Экспрессирующий вектор для химерного антитела конструируют путем слияния в рамке считывания двух генов, расщепленных одной и той же комбинацией ферментов рестрикции.

Для получения моноклонального антитела против IL-6R, гены антител встраивают в экспрессирующий вектор так, чтобы гены экспрессировались под контролем регулирующей экспрессию области. Регулирующая экспрессию область для экспрессии антитела включает, например, энхансеры и промоторы. Более того, на N-конец можно присоединять подходящую сигнальную последовательность, так чтобы экспрессируемое антитело секретировалось наружу клеток. В примерах, описанных ниже, в качестве сигнальной последовательности используют пептид, имеющий аминокислотную последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3). Между тем, можно присоединять другие подходящие сигнальные последовательности. Экспрессированный полипептид расщепляется на С-конце описанной выше последовательности, и полученный полипептид секретируется из клеток в качестве зрелого полипептида. Затем подходящие клетки-хозяева трансформируют экспрессирующим вектором и получают рекомбинантные клетки, экспрессирущие ДНК, кодирующую антитело IL-6R.

ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) и легкую цепь (L-цепь) антитела по отдельности встраивают в различные экспрессирующие векторы для экспрессии гена антитела. Молекулу антитела, имеющую Н- и L-цепи, можно экспрессировать путем котрансфекции одной и той же клетки-хозяина векторами, в которые соответственно встроены гены Н-цепи и L-цепи. Альтернативно клетки-хозяева можно трансформировать одним экспрессирующим вектором, в который встроены ДНК, кодирующие Н- и L-цепи (см. WO 1994/011523).

Существуют различные известные комбинации клетка-хозяин/экспрессирующий вектор для получения антител путем введения выделенных генов антител в соответствующих хозяев. Все из этих экспрессирующих систем пригодны для выделения антигенсвязывающих доменов по настоящему изобретению. Подходящие эукариотические клетки, используемые в качестве клеток-хозяев, включают клетки животных, клетки растений и клетки грибов. В частности, клетки животных включают, например, следующие клетки.

(1) клетки млекопитающих: СНО, COS, клетки миеломы, клетки почки китайского хомячка (BHK), HeLa, Vero клетки почки эмбриона человека (HEK) 293 и т.п.;

(2) клетки земноводных: ооциты Xenopus и т.п.; и

(3) клетки насекомых: sf9, sf21, Tn5 и т.п.

Кроме того, в качестве клетки растений известна экспрессирующая система для генов антител с использованием клеток, происходящих из рода Nicotiana, таких как Nicotiana tabacum. Для трансформации клеток растений можно соответствующим образом использовать культивированные клетки каллуса.

Более того, в качестве клеток грибов можно использовать следующие клетки:

- дрожжи: род Saccharomyces, как например, Saccharomyces serevisiae, и род Pichia, как например, Pichia pastoris; и

- нитчатые грибы: род Aspergillus, как например, Aspergillus niger.

Более того, также известны экспрессирующие системы для генов антител, в которых используются прокариотические клетки. Например, при использовании бактериальных клеток, в рамках настоящего изобретения можно подходящим образом использовать клетки Е. coli, клетки Bacillus subtilis и т.п. Экспрессирующие векторы, несущие представляющие интерес гены антитела, вводят в клетки путем трансфекции. Трансфицированные клетки культивируют in vitro, и из культуры трансформированных клеток можно получать желаемое антитело.

В дополнение к описанным выше клеткам-хозяевам, также для получения рекомбинантного антитела можно использовать трансгенных животных. Следовательно, антитело можно получать из животного, которому введен ген, кодирующий представляющее интерес антитело. Например, ген антитела можно конструировать в качестве слитого гена путем встраивания в рамке считывания в ген, который кодирует белок, специфически продуцируемый в молоке. В качестве белка, секретируемого в молоке, можно использовать, например, β-казеин козы и т.п. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в который встроен ген антитела, инъецируют в эмбрион козы, а затем этот эмбрион имплантируют самке козы. Желаемые антитела можно получать в качестве белка, слитого с белком молока, из молока, продуцируемого трансгенной козой, родившейся от козы, являющейся реципиентом эмбриона (или ее потомства). Кроме того, для увеличения объема молока, содержащего желаемое антитело, продуцируемого трансгенной козой, трансгенной козе при необходимости можно вводить гормоны, Ebert, K. М. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

Когда полипептидный комплекс, описанный в настоящем описании, вводят человеку, антигенсвязывающий домен, происходящий из генетически рекомбинантного антитела, которое является искусственно модифицированным для снижения гетерологической антигенности против человека и т.п., можно соответствующим образом использовать в качестве антигенсвязывающего домена комплекса. Такие генетически рекомбинантные антитела включают, например, гуманизированные антитела. Эти модифицированные антитела получают соответствующим образом известными способами.

Вариабельная область антитела, используемая для получения антигенсвязывающего домена полипептидного комплекса, описанного в настоящем описании, как правило, образована тремя определяющими комплементарность областями (CDR) которые разделены четырьмя каркасными областями (FR). CDR представляет собой область, которая по существу определяет специфичность связывания антитела. Аминокислотные последовательности CDR являются в высокой степени разнообразными. С другой стороны, образующие FR аминокислотные последовательности часто обладают высокой идентичностью, даже среди антител с отличающейся специфичностью связывания. Таким образом, как правило, специфичность связывания определенного антитела можно вносить в другое антитело путем пересадки CDR.

Гуманизированное антитело также называют переформированным антителом человека. В частности, известны гуманизированные антитела, полученные пересадкой CDR антитела не являющегося человеком животного, такого как антитело мыши, в антитело человека и т.п. Также известны стандартные способы генной инженерии для получения гуманизированных антител. В частности, например, в качестве способа пересадки CDR антитела мыши в FR человека известна перекрывающаяся ПЦР с удлинением. В перекрывающейся ПЦР с удлинением нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR антитела мыши, подлежащую пересадке, добавляют к праймерам для синтеза FR антитела человека. Праймеры получают для каждой из четырех FR. Является общепризнанным, что при пересадке CDR мыши в FR человека, выбор FR человека, который имеет высокую идентичность FR мши, является преимущественным для сохранения функции CDR. Таким образом, как правило, предпочтительно использовать FR человека, содержащую аминокислотную последовательность, которая обладает высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью FR, соседней с CDR мыши, подлежащей пересадке.

Нуклеотидные последовательности, подлежащие лигированию, конструируют так, чтобы они были соединены друг с другом в рамке считывания. FR человека синтезируют по отдельности с использованием соответствующих праймеров. В результате получают продукты, в которых ДНК, кодирующая CDR мыши, связана с индивидуальными ДНК, кодирующими FR. Нуклеотидные последовательности, кодирующие CDR мыши, каждого продукта конструируют так, чтобы они перекрывались друг с другом. Затем проводят синтез комплементарной цепи для гибридизации перекрывающихся CDR-областей продуктов, синтезированных с использованием гена антитела человека в качестве матрицы. С помощью этой реакции FR человека лигируют через последовательности CDR мыши.

Полноразмерный ген V-области, в котором в конечном итоге лигированы три CDR и четыре FR, амплифицируют с использованием праймеров, которые гибридизуются с его 5'- или 3'-концом, в которые добавлены подходящие последовательности, распознаваемые ферментом рестрикции. Экспрессирующий вектор для гуманизированного антитела можно получать путем встраивания ДНК, полученной, как описано выше, и ДНК, которая кодирует С-область антитела человека, в экспрессирующий вектор, так чтобы они лигировались в рамке считывания. После трансфекции рекомбинантным вектором хозяина для получения рекомбинантных клеток, рекомбинантные клетки культивируют и ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, экспрессируют с получением гуманизированного антитела в клеточной культуре (см., публикацию патента Европы № ЕР 239400 и международную публикацию патента № WO 1996/002576).

Путем качественного или количественного определения и оценки антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела, полученного, как описано выше, можно пригодным образом отобрать FR антитела человека, которые позволяют CDR образовывать подходящий антигенсвязывающий центр при лигировании через CDR. Аминокислотные остатки в FR можно заменять при необходимости, так чтобы CDR переформированного анитетела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр. Например, мутации аминокислотной последовательности можно вносить в FR с использованием способа ПЦР, который используется для пересадки CDR мыши в FR человека. Более конкретно, в праймеры, которые гибридизуются с FR, можно вносить частичные мутации нуклеотидной последовательности. Мутации нуклеотидной последовательности вносятся в FR, синтезированные с использованием таких праймеров. Мутантные последовательности FR, имеющие желаемые характеристики, можно отбирать путем измерения и оценки активности мутанта антитела с замененной аминокислотой в отношении связывания с антигеном с помощью упомянутого выше способа (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).

Альтернативно желаемые антитела человека можно получать путем иммунизации трансгенных животных, имеющих полный набор генов антител человека (см. WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) путем иммунизации ДНК.

Более того, также известны способы получения антител человека путем пэннинга с использованием библиотек антител человека. Например, V-область антитела человека экспрессируют в качестве одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага способом фагового дисплея. Можно отбирать фаги, экспрессирующие scFv, которые связываются с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующую V-область антитела человека, которая связывается с антигеном, можно определять путем анализа генов выбранных фагов. Определяют последовательность ДНК scFv, которая связывается с антигеном. Получают Экспрессирующий вектор путем слияния последовательности V-области в рамке считывания с последовательностью С-области желаемого антитела человека, и встраивания ее в соответствующий экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вводят в клетки, пригодные для экспрессии, такие как клетки, описанные выше. Антитело человека можно получать путем экспрессии гена, кодирующего антитело человека, в клетках. Эти способы уже известны (см. WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

В дополнение к способам, описанным выше, для выделения генов антител можно соответствующим образом использовать способы клонирования В-клеток (идентификация каждой кодирующей антитело последовательности, ее клонирование и выделение; использование при конструировании экспрессирующего вектора для получения каждого антитела (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности); и т.п.), как описано, например Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) или в WO 2008/081008.

Система нумерации EU и система нумерации Kabat

В соответствии со способами, используемыми в рамках настоящего изобретения, положения аминокислот, приписываемые CDR и FR антитела, указаны в соответствии с нумерацией по Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991)). В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, аминокислоты вариабельной области указаны в соответствии с нумерацией по системе Kabat, в то время как аминокислоты константной области указаны в соответствии с системой нумерации EU на основе положений аминокислот по Kabat.

Условия концентрации ионов

Условия концентрации ионов металлов

В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация ионов относится к концентрации ионов металлов. "Ионы металлов" относятся к ионам элементов группы I, за исключением водорода, таких как щелочные металлы и элементы группы меди, ионам элементов группы II, таких как щелочноземельные металлы и элементы группы цинка, ионам элементов группы III, за исключением бора, ионам элементов группы IV, за исключением углерода и кремния, ионам элементов группы VIII, таких как элементы группы железа и элементы группы платины, ионам элементов, принадлежащих подгруппе А групп V, VI и VII, и элементов металлов, таких как сурьма, висмут и полоний. Атомы металлов обладают свойством высвобождения валентных электронов так, что они становятся катионами. Это называют тенденцией к ионизации. Металлы с высокой тенденцией к ионизации считаются химически активными.

В рамках настоящего изобретения предпочтительные ионы металлов включают, например, ион кальция. Ион кальция вовлечен в модулирование множества биологических явлений, включая сокращение мышц, таких как скелетные, гладкие и сердечная мышцы; активацию движения, фагоцитоза и т.п. лейкоцитов; активацию изменения формы, секреции и т.п. тромбоцитов; активацию лимфоцитов; активацию тучных клеток, включая секрецию гистамина; клеточные ответы, опосредуемые рецептором катехоламина а или рецептором ацетилхолина; экзоцитоз; высвобождение веществ-передатчиков из окончаний нейронов; и поток аксоплазмы в нейронах. Известные внутриклеточные рецепторы ионов кальция включают тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкую цепь миозина, которые имеют несколько участков связывания ионов кальция и, как полагают, имеют общее происхождение с точки зрения молекулярной эволюции. Также существует множество известных кальций-связывающих мотивов. Такие хорошо известные мотивы включают, например, домены кадгерина, EF-hand кальмодулина, С2-домен протеинкиназы С, Gla-домен белка фактора свертывания крови IX, лектины С-типа рецептора ациарогликопротеинов и манноза-связывающего рецептора, А-домены рецепторов LDL, аннексии, домен тромбоспондина 3 типа и EGF-подобные домены.

В рамках настоящего изобретения, когда ион металла представляет собой ион кальция, условия концентрации ионов кальция включают низкие концентрации ионов кальция и высокие концентрации ионов кальция. "Активность связывания варьирует, в зависимости от концентраций ионов кальция" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует вследствие различий между условиями низкой и высокой концентрации ионов кальция. Например, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция. Альтернативно антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть более высокой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция.

В рамках настоящего изобретения высокая концентрация ионов кальция, в частности, не ограничена конкретной величиной; однако концентрация предпочтительно может быть выбрана из величин в пределах от 100 мкМ до 10 мМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 200 мкМ до 5 мМ. В альтернативном варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 400 мкМ до 3 мМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 200 мкМ до 2 мМ. Более того, концентрация может быть выбрана из величин в переделах от 400 мкМ до 1 мМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ, которая является близкой к концентрации ионов кальция в плазме (крови) in vivo.

В рамках настоящего изобретения низкая концентрация ионов кальция, в частности, не ограничена конкретной величиной; однако концентрация предпочтительно может быть выбрана из величин в пределах от 0,1 мкМ до 30 мкМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 0,2 мкМ до 20 мкМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 0,5 мкМ до 10 мкМ. В альтернативном варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ. Более того, концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 2 мкМ до 4 мкМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ, которая является близкой к концентрации ионизированного кальция в ранних эндосомах in vivo.

В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 0,1 мкМ до 30 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 100 мкМ до 10 мМ. Предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 0,5 мкМ до 10 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 200 мкМ до 5 мМ. Особенно предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность при концентрации ионов кальция в ранней эндосоме in vivo является более слабой, чем при концентрации ионов кальция в плазме in vivo; и, в частности, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ.

То, изменяется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов металлов, можно определять, например, с использованием известных способов измерения, таких как способы, описанные в разделе "Активность связывания" выше. Например, для подтверждения того, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы становится более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция, сравнивают антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы при низкой и высокой концентрациях ионов кальция.

В рамках настоящего изобретения выражение "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" также может быть выражено как "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция". В настоящем описании "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" иногда представлено как "антигенсвязывающая способность является более слабой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция". Также "антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов кальция снижена так, чтобы она была ниже, чем антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов кальция" может быть представлено как "антигенсвязывающую способность при низкой концентрации ионов кальция ослабили по сравнению с антигенсвязывающей способностью при высокой концентрации ионов кальция".

При определении антигенсвязывающей активности, условия, отличные от концентрации ионов кальция, могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области, и они конкретно не ограничены. Например, активность можно определять при 37°С в буфере HEPES. Например, для определения можно использовать Biacore (GE Healthcare) и т.п. Когда антиген представляет собой растворимый антиген, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы можно оценивать путем пропускания антигена в качестве анализируемого соединения над чипом, на котором иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Когда антиген представляет собой антиген мембраны, активность связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном мембраны можно оценивать путем пропускания антигенсвязывающей молекулы в качестве анализируемого соединения над чипом, на котором иммобилизован антиген.

При условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению является более слабой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, соотношение антигенсвязывающей активности между низкими и высокими концентрациями ионов кальция конкретно не ограничено. Однако соотношение KD (константа диссоциации) антигенсвязывающей молекулы в отношении антигенов при низкой концентрации ионов кальция и KD при высокой концентрации ионов кальция, т.е. величина KD (3 мкМ Са)/KD (2 мМ Са), предпочтительно составляет 2 или более, более предпочтительно 10 или более, и еще более предпочтительно 40 или более. Верхний предел величины KD (3 мкМ Са)/KD (2 мМ Са) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии, что молекулу можно получить способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, для отображения антигенсвязывающ ей активности можно использовать KD (константа диссоциации). Между тем, когда антиген представляет собой антиген мембраны, для отображения активности можно использовать кажущуюся KD (кажущаяся константа диссоциации). KD (константа диссоциации) и кажущуюся KD (кажущаяся константа диссоциации) можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или проточного цитометра.

Альтернативно, например, также в качестве показателя для отображения соотношения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при низкой и высокой концентрациях кальция предпочтительно можно использовать константу скорости диссоциации (kd). Когда константу скорости диссоциации (kd) используют вместо константы диссоциации (KD) в качестве показателя для отображения соотношение активностей связывания, соотношение констант скорости диссоциации (kd) при низкой и высокой концентрациях кальция, т.е. величина kd (низкая концентрация кальция)/kd (высокой концентрация кальция), предпочтительно равна 2 или более, более предпочтительно 5 или более, еще более предпочтительно 10 или более, и еще более предпочтительно 30 или более. Верхний предел величины Kd (низкая концентрация кальция)/kd (высокая концентрация кальция) конкретно не ограничен, и он может представлять собой любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии что можно получить молекулу способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать kd (константа скорости диссоциации). Между тем, когда антиген представляет собой антиген мембраны, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать кажущуюся kd (кажущуюся константу скорости диссоциации). kd (константа скорости диссоциации) и кажущуюся kd (кажущаяся константа скорости диссоциации) можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare) или проточного цитометра. В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы определяют при различных концентрациях ионов кальция, предпочтительно использовать одни и те же условия, за исключением концентраций кальция.

Например, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которого является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего стадии:

(a) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации кальция;

(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации кальция; и

(c) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которого является более низкой при низкой концентрации кальция, чем при высокой концентрации кальция.

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, или их библиотеки, включающего стадии:

(a) контактирование антигена с антигенсвязывающим доменом или антителом или их библиотекой при высокой концентрации кальция;

(b) инкубация при низкой концентрации кальция антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (а); и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, диссоциировавших на стадии (b).

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител или их библиотеки, включающего стадии:

(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител при низкой концентрации кальция;

(b) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые не связались с антигеном на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, выбранным на стадии (с), связываться с антигеном при высокой концентрации кальция; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (с).

Кроме того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:

(a) контактирование при высокой концентрации кальция библиотеки антигенсвязывающих доменов или антител с колонкой, на которой иммобилизован антиген;

(b) элюирование антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с колонкой на стадии (а), из колонки при низкой концентрации кальция; и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных на стадии (b).

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:

(a) позволение библиотеке антигенсвязывающих доменов или антител при низкой концентрации кальция пройти через колонку, на которой иммобилизован антиген;

(b) сбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые элюировались без связывания с колонкой на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, собранным на стадии (b), связаться с антигеном при высокой концентрации кальция; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (с).

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:

(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител при высокой концентрации кальция;

(b) получение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (а);

(c) инкубация при низкой концентрации кальция антигенсвязывающего домена или антитела, полученных на стадии (b); и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых на стадии (с) является более слабой, чем критерий для выбора на стадии (b).

Описанные выше стадии можно повторять два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам или антителам, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые получают способами скрининга, которые дополнительно включают стадию повторения два или более раз стадий (а)-(с) или (a)-(d) в описанных выше способах скрининга. Количество циклов стадий (а)-(с) или (a)-(d) конкретно не ограничено, однако обычно составляет 10 или менее.

В способах скрининга по настоящему изобретению антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации кальция конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 0,1 мкМ до 30 мкМ, но предпочтительно она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 0,5 мкМ до 10 мкМ. Более предпочтительно, она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция в ранней эндосоме in vivo, в частности, от 1 мкМ до 5 мкМ. Между тем, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации кальция конкретно не ограничена, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ, но предпочтительно она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 200 мкМ до 5 мМ. Более предпочтительно, она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция в плазме in vivo, в частности, от 0,5 мМ до 2,5 мМ.

Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Условия, отличные от концентрации ионизированного кальция, могут быть определены специалистами в данной области. Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно оценивать в качестве константы диссоциации (KD), кажущейся константы диссоциации (кажущаяся KD), константы скорости диссоциации (kd), кажущейся константы диссоциации (кажущаяся kd) и т.п. Их можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или FACS.

В рамках настоящего изобретения стадия выбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых является более высокой при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, является тождественной стадии выбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрация кальция, чем при высокой концентрации кальция.

При условии, что антигенсвязывающая активность является более высокой при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, различие в антигенсвязывающей активности между высокой и низкой концентрациями концентрация конкретно не ограничено; однако антигенсвязывающая активность при высокой концентрации кальция предпочтительно в два раза или более, более предпочтительно в 10 раз или более, и еще более предпочтительно в 40 раз или более превышает низкую концентрацию кальция.

Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу способами скрининга, описанными выше, могут представлять собой любые антигенсвязывающие домены и антитела. Например, можно проводить скрининг описанных выше антигенсвязывающих доменов или антител. Например, можно проводить скрининг антигенсвязывающих доменов или антител, имеющих природные последовательности или последовательности с замещенными аминокислотами.

Библиотеки

В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, которая в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены которых имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул, в зависимости от концентрации ионов. Концентрации ионов предпочтительно включают, например, концентрацию ионов металлов и концентрацию ионов водорода.

В рамках настоящего изобретения "библиотека" относится к множеству антигенсвязывающих молекул или множеству слитых полипептидов, содержащих антигенсвязывающие молекулы, или нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, кодирующих их последовательности. Последовательности множества антигенсвязывающих молекул или множества слитых полипептидов, содержащих антигенсвязывающие молекулы, в библиотеке не идентичны, а отличаются друг от друга.

В рамках настоящего изобретения выражение "последовательности отличаются друг от друга" в выражении "множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга," означает, что последовательности антигенсвязывающих молекул в библиотеке отличаются друг от друга. В частности, в библиотеке количество последовательностей, отличающихся друг от друга, отражает количество независимых клонов с различными последовательностями, и также может называться "размером библиотеки". Размер библиотеки для обычной библиотеки фагового дисплея находится в диапазоне от 10⁶ до 10¹². Размер библиотеки может быть увеличен вплоть до 10¹⁴ с использованием известных способов, таких как рибосомный дисплей. Однако истинное количество фаговых частиц, используемых в селекции способом пэннинга фаговой библиотеки, как правило, в 10-10000 раз превышает размер библиотеки. Эту избыточную множественность также называют "количеством эквивалентов библиотеки", и она означает, что существует от 10 до 10000 индивидуальных клонов, которые обладают одной и той же аминокислотной последовательностью. Таким образом, в рамках настоящего изобретения выражение "последовательности отличаются друг от друга" означает, что последовательности независимых антигенсвязывающих молекул в библиотеке, исключая эквиваленты библиотеки, отличаются друг от друга. Более конкретно, указанное выше означает, что существует от 10⁶ до 10¹⁴ антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, предпочтительно от 10⁷ до 10¹² молекул, более предпочтительно от 10⁸ до 10¹¹ молекул, и особенно предпочтительно от 10⁸ до 10¹⁰ молекул, последовательности которых отличаются друг от друга.

В рамках настоящего изобретения выражение "множество" в выражении "библиотека в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул" в случае, например, антигенсвязывающих молекул, слитых полипептидов, полинуклеотидных молекул, векторов или вирусов по настоящему изобретению, главным образом, относится к группе из двух или более типов вещества. Например, когда два или более вещества отличаются друг от друга конкретной характеристикой, это означает, что существует два или более типов вещества. Такие примеры могут включать, например, мутантные аминокислоты, наблюдаемые в конкретных аминокислотных положениях аминокислотной последовательности. Например, когда существует две или более антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых являются по существу одинаковыми или предпочтительно одинаковыми, за исключением нестрогих остатков или за исключением конкретных мутантных аминокислот в гипервариабельных положениях, экспонированных на поверхности, существует множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. В другом примере, когда существует две или более полинуклеотидных молекулы, последовательности которых являются по существу одинаковыми или предпочтительно одинаковыми, за исключением нуклеотидов, кодирующих нестрогие остатки, или нуклеотидов, кодирующих мутантные аминокислоты гипервариабельных положений, экспонированных на поверхности, существует множество полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения выражение "в основном состоит из" в выражении "библиотека в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул" отражает количество антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых варьирует, в зависимости от концентрации ионов, среди независимых клонов с отличающимися последовательностями в библиотеке. Особенно предпочтительно, чтобы в библиотеке существовало по меньшей мере 10⁴ антигенсвязывающих молекул, имеющих такую активность связывания. Более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10⁵ антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Еще более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10⁶ антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Особенно предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10⁷ антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Еще более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10⁸ антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Альтернативно это также предпочтительно может быть выражено как соотношение количества антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых варьирует, в зависимости от концентрации ионов, и количества независимых клонов, имеющих различные последовательности, в библиотеке. В частности, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в которой антигенсвязывающие молекулы, имеющие такую активность связывания, составляют от 0,1% до 80%, предпочтительно от 0,5% до 60%, более предпочтительно от 1% до 40%, еще более предпочтительно от 2% до 20%, и особенно предпочтительно от 4% до 10% независимых клонов с отличающимися последовательностями в библиотеке. В случае слитых полипептидов, полинуклеотидных молекул или векторов, могут быть возможными сходные выражения, в которых используются количества молекул или отношение к общему количеству молекул. В случае вирусов, также могут быть возможными сходные выражения, в которых используется количество вирионов или отношение к общему количеству вирионов.

Аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих доменов в зависимости от концентрации ионов кальция

Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым путем. Например, когда ион металла представляет собой ион кальция, можно использовать ранее существующие антитела, ранее существующие библиотеки (фаговая библиотека, и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из гибридом, полученных путем иммунизации животных или из В-клеток иммунизированных животных, антитела или библиотеки, полученные внесением аминокислот, способных хелатировать кальций (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), или неприродных аминокислотных мутаций в описанные выше антитела или библиотеки (хелатирующие кальций аминокислоты (такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), библиотеки с увеличенным содержанием неприродных аминокислот, библиотеки полученные путем внесения хелатирующих кальций аминокислот (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в конкретные положения, и т.п.

Примеры аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция, как описано выше, могут представлять собой любые типы аминокислот, при условии что аминокислоты формируют кальций-связывающий мотив. Кальций-связывающие мотивы хорошо известны специалистам в данной области и подробно описаны (например, Springer et al. (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki и Kretsinger (Белок Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief et al. (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux et al. (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch и Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer et al. (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg et al. (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). В частности, любые известные кальций-связывающие мотивы, включая лектины С-типа, такие как ASGPR, CD23, MBR и DC-SIGN, могут быть включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Предпочтительные примеры таких предпочтительных кальций-связывающих мотивов также включают, в дополнение к кальций-связывающим мотивам, описанным выше, например, кальций-связывающий мотив в антигенсвязывающем домене SEQ ID NO: 4.

Более того, в качестве аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция, например, предпочтительно можно использовать аминокислоты, имеющие активность хелатирования металлов. Примеры таких хелатирующих металлы аминокислот включают, например, серии (Ser(S)), треонин (Thr(T)), аспарагин (Asn(N)), глутамин (Gln(Q)), аспарагиновую кислоту (Asp(D)) и глутаминовую кислоту (Glu(E)).

Положения в антигенсвязывающих доменах, в которых содержатся описанные выше аминокислоты, конкретно не ограничены конкретными положениями, и они могут представлять собой любые положения в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, которые образуют антигенсвязывающий домен, при условии, что они изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В частности, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены тяжелых цепей которых содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены тяжелой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены тяжелых цепей которых содержат упомянутые выше аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

Между тем, в одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены легкой цепи которых содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR1-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR1-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты в положениях 30, 31 и/или 32, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR2-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к библиотекам, в основном состоящим из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR2-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в положении 50, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. В альтернативном варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в положении 92, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

Более того, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и в которых две или три CDR, выбранных из описанных выше CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. Более того, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и легкие цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в любом одном или нескольких из положений 30, 31, 32, 50 и/или 92, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

В особенно предпочтительном варианте осуществления каркасные последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы предпочтительно содержат каркасные последовательности человека эмбрионального типа. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда каркасные последовательности представляют собой полностью человеческие последовательности, ожидается, что при введении такой антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению человеку (например, для лечения заболеваний), она индуцирует небольшой иммуногенный ответ или не индуцирует иммуногенного ответа. В указанном выше контексте выражение "содержащий последовательность эмбрионального типа" в рамках настоящего изобретения означает, что часть каркасных последовательностей по настоящему изобретению идентична части любых каркасных последовательностей человека эмбрионального типа. Например, когда последовательность FR2 тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению представляет собой комбинацию последовательностей FR2 тяжелой цепи различных каркасных последовательностей человека эмбрионального типа, такая молекула также представляет собой антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, "содержащую последовательность эмбрионального типа".

Предпочтительные примеры каркасных областей включают, например, последовательности полностью человеческих каркасных областей человека, известные в настоящее время, которые включены в web-сайт V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) или другие. Эти последовательности каркасных областей можно соответствующим образом использовать в качестве последовательности эмбрионального типа, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению. Последовательности эмбрионального типа могут быть подразделены на категории в соответствии с их сходством (Tomlinson et al. (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams и Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Соответствующие последовательности эмбрионального типа могут быть выбраны из Vκ, которые подразделяются на семь подгрупп; Vλ, которые подразделяются на десять подгрупп; и VH, которые подразделяются на семь подгрупп.

Полностью человеческие последовательности VH предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например, последовательности VH:

подгруппы VH1 (например, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 и VH1-69);

подгруппы VH2 (например, VH2-5, VH2-26 и VH2-70);

подгруппы VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 и VH3-74);

подгруппы VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 и VH4-61);

подгруппы VH5 (VH5-51);

подгруппы VH6 (VH6-1); и

подгруппы VH7 (VH7-4 и VH7-81).

Они также описаны в известных документах (Matsuda et al. (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) и т.п., и, таким образом, специалисты в данной области могут соответствующим образом моделировать антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, исходя из информации об этих последовательностях. Также предпочтительно использовать другие полностью человеческие каркасные области или каркасные субобласти.

Полностью человеческие последовательности Vk предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:

А20, А30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 и O18, выделенные в подгруппу Vk1;

A1, А2, A3, А5, А7, А17, А18, А19, А23, O1 и O11, выделенные в подгруппу Vk2;

A11, А27, L2, L6, L10, L16, L20 и L25, выделенные в подгруппу Vk3;

В3, выделенная в подгруппу Vk4;

В2 (также обозначаемая как Vk5-2), выделенная в подгруппу Vk5; и

А10, А14 и А26, выделенные в подгруппу Vk6.

(Kawasaki et al. (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable and Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173-181)).

Полностью человеческие последовательности VL предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:

V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 и V1-22, выделенные в подгруппу VL1;

V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 и V2-19, выделенные в подгруппу VL1;

V3-2, V3-3 и V3-4, выделенные в подгруппу VL3;

V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 и V4-6, выделенные в подгруппу VL4; и

V5-1, V5-2, V5-4 и V5-6, выделенные в подгруппу VL5 (Kawasaki et al. (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).

Обычно эти каркасные последовательности отличаются друг от друга одним или несколькими аминокислотными остатками. Эти каркасные последовательности можно использовать в комбинации с "по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов" по настоящему изобретению. Другие примеры полностью человеческих каркасных областей, используемых в комбинации с "по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов" по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, например, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и РОМ (например, Kabat et al. (1991), выше, Wu et al. (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

Без связи с конкретной теорией полагают, что одна из причин для того, чтобы ожидать, что использование последовательностей эмбрионального типа предотвратит неблагоприятные иммунные ответы у большинства индивидуумов, состоит в следующем. В результате процесса созревания аффинности в ходе нормальных иммунных ответов, часто в вариабельных областях иммуноглобулинов происходят соматические мутации. Такие мутации чаще всего происходят в области CDR, последовательности которых являются гипервариабельными, но также затрагивают остатки каркасных областей. Такие мутации каркасной области не существуют в генах эмбрионального типа, и они также с меньшей вероятностью будут иммуногенными у пациентов. С другой стороны, в нормальной человеческой популяции присутствует большинство каркасных последовательностей, экспрессируемых с генов эмбрионального типа. В результате иммунной толерантности, ожидается, что эти каркасные области эмбрионального типа будут иметь низкую иммуногенность у пациентов или не иметь иммуногенности у пациентов. Для максимизации возможности иммунной толерантности можно выбирать гены, кодирующие вариабельную область, из группы часто встречающихся функциональных генов эмбрионального типа.

Для получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, в которых описанные выше каркасные последовательности содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР с удлинением.

Например, библиотеку, которая содержит множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, где вариабельную область легкой цепи выбирают в качестве каркасной последовательности, первоначально содержащей по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. В качестве неограничивающего примера, когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, такие предпочтительные библиотеки включают, например, библиотеки, сконструированные путем комбинирования последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 4 (Vk5-2) и вариабельной области тяжелой цепи, полученной в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области.

Альтернативно последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную в качестве каркасной области, первоначально содержащей по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы, как упоминалось выше, можно конструировать так, чтобы она содержала различные аминокислотные остатки, отличные от упомянутых выше аминокислотных остатков. В настоящем описании такие остатки называют нестрогими остатками. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Например, когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, подлежащих внесению в последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 4 (Vk5-2), включают аминокислотные остатки, приведенные в таблицах 1 или 2.

В настоящем описании нестрогие остатки относятся к варьированию аминокислотных остатков, имеющемуся в гипервариабельных положениях, в которых присутствует несколько различных аминокислот, в вариабельных областях легкой цепи и тяжелой цепи, когда сравнивают аминокислотные последовательности известных и/или нативных антител или антигенсвязывающих доменов. Гипервариабельные положения, как правило, расположены в областях CDR. В одном варианте осуществления для определения гипервариабельных положений в известных и/или нативных антителах пригодны данные, предоставленные Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 и 1991). Более того, в базах данных в Интернете (http://vbase.mrc-cpe.cam.ас.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) предоставлены собранные последовательности многих легких цепей и тяжелых цепей человека и их положения. Информация о последовательностях и положениях пригодна для определения гипервариабельных положений в рамках настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением, когда определенное положение аминокислоты имеет предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 20 возможных вариантов аминокислотных остатков, предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 19, предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 18, предпочтительно от 5 до 17, предпочтительно от 6 до 16, предпочтительно от 7 до 15, предпочтительно от 8 до 14, предпочтительно от 9 до 13, и предпочтительно от 10 до 12 возможных вариантов аминокислотных остатков, это положение является гипервариабельным. В некоторых вариантах осуществления определенное положение аминокислоты может иметь предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 4, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 8, предпочтительно приблизительно 10 и предпочтительно приблизительно 12 вариантов аминокислотных остатков.

Альтернативно библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов, как упоминалось выше. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают, например, библиотеки, в которых вариабельные области тяжелой цепи, полученные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, комбинируют с последовательностями вариабельной области легкой цепи, в которых конкретный остаток(и) в последовательности эмбрионального типа, такой как SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) или SEQ ID NO: 8 (Vk4) заменен по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки в CDR1 легкой цепи. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки в CDR2 легкой цепи. Кроме того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи.

Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR1 легкой цепи, включают остатки в положениях 30, 31 и/или 32 в CDR1 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации EU. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR2 легкой цепи, включают аминокислотный остаток в положении 50 в CDR2 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR3 легкой цепи, включают аминокислотный остаток в положении 92 в CDR3 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Эти аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или в комбинации, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив и/или при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует, в зависимости от концентрации ионов кальция. Между тем, поскольку известны тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкая цепь миозина, которые обладают несколькими участками связывания ионов кальция и, как полагают, имеют общее происхождение с точки зрения молекулярной эволюции, можно конструировать CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи так, чтобы они имели их связывающие мотивы. Например, можно использовать домены кадгерина, EF-hand кальмодулина, С2-домен протеинкиназы С, Gla-домен белка фактора свертывания крови IX, лектины С-типа рецептора ациарогликопротеинов и манноза-связывающего рецептора, А-домены рецепторов LDL, аннексии, домена тромбоспондина 3 типа, и EGF-подобные домены соответствующим образом для описанных выше целей.

Когда вариабельные области тяжелой цепи, полученные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, и вариабельные области легкой цепи, в которые внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, комбинируют, как описано выше, последовательности вариабельных областей легкой цепи можно конструировать так, чтобы они содержали нестрогие остатки аналогично тому, как описано выше. Количество и положение таких нестрогих остатков конкретно не ограничивается конкретными вариантами осуществления, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области легкой цепи, включают аминокислотные остатки, приведенные в таблицах 1 и 2.

Предпочтительные вариабельные области тяжелой цепи, подлежащие комбинированию, включают, например, рандомизированные библиотеки вариабельной области. Для получения рандомизированной библиотеки вариабельной области известные способы комбинируют соответствующим образом. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области предпочтительно можно использовать иммунную библиотеку, сконструированную на основе генов антител, происходящих из лимфоцитов животных, иммунизированных конкретным антигеном, пациентов с инфекциями, индивидуумов с повышенным титром антител в крови в результате вакцинации, пациентов со злокачественной опухолью или пациентов с аутоиммунным заболеванием.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также предпочтительно можно использовать синтетическую библиотеку, полученную путем замены последовательностей CDR V-генов в геномной ДНК или функциональных реконструированных V-генов набором синтетических олигонуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие наборы кодонов соответствующей длины. В этом случае, поскольку в последовательности CDR3 тяжелой цепи наблюдают разнообразие, также можно заменять только последовательность CDR3. Критерием возникновения разнообразия аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является то, что разнообразие возникает у аминокислотных остатков в экспонированных на поверхности положениях антигенсвязывающей молекулы. Экспонированное на поверхности положение относится к положению, которое считается способным экспонироваться на поверхности и/или контактировать с антигеном, исходя из структуры, группы структур и/или смоделированной структуры антигенсвязывающей молекулы. Как правило, такие положения представляют собой CDR. Предпочтительно, экспонированные на поверхности положения определяют с использованием координат из трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с использованием компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Экспонированные на поверхности положения можно определять с использованием алгоритмов, известных в данной области (например, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение экспонированных на поверхности положений можно проводить с использованием программного обеспечения, пригодного для моделирования белка, и информации о трехмерной структуре, полученной для антитела. Программное обеспечение, которое можно использовать для этих целей, предпочтительно включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Главным образом или предпочтительно, когда алгоритм требует введения пользователем параметра размера, "размер" образца, который используют в вычислении, устанавливают как радиус, равный приблизительно 1,4 Ангстрем или менее. Более того, способы определения экспонированных на поверхности областей и участков с использованием программного обеспечения для персональных компьютеров описаны Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также особенно предпочтительно можно использовать наивную библиотеку, которая сконструирована из генов антител, происходящих из лимфоцитов здоровых индивидуумов, и набор генов которой состоит из наивных последовательностей, которые представляют собой последовательности антител без предпочтений (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). В настоящем описании, аминокислотная последовательность, содержащая наивную последовательность, относится к аминокислотной последовательности, полученной из такой наивной библиотеки.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, полученных путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области, где вариабельная область тяжелой цепи, выбрана в качестве каркасной последовательности, которая первоначально содержит "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов". Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают библиотеки, сконструированные путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1). Альтернативно такую библиотеку можно конструировать путем выбора соответствующих вариабельных областей легкой цепи из вариабельных областей легкой цепи, которые имеют последовательности эмбрионального типа, вместо вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области. Такие предпочтительные библиотеки включают, например, библиотеки, в которых последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 10 (6КС4-1#85-IgG1) комбинируют с вариабельными областями легкой цепи, имеющими последовательность эмбрионального типа.

Альтернативно последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную в качестве каркасной последовательности, которая первоначально содержит "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы", как упоминалось выше, можно конструировать так, чтобы она содержала нестрогие остатки. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1), включают все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях 95, 96 и/или 100а. Альтернативно неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1), включают все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях аминокислоты 95 и/или 101.

Альтернативно библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельных областей легкой цепи, имеющих последовательности эмбрионального типа, с вариабельными областями тяжелой цепи, в которые внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, ответственный за зависимое от концентрации ионов изменение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы". Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают библиотеки, в которых вариабельные области легкой цепи, сконструированные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательности эмбрионального типа, комбинируют с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, в которой конкретный остаток(остатки) заменен по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки CDR1 тяжелой цепи. Следующие неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки CDR2 тяжелой цепи. Кроме того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков CDR3 тяжелой цепи включают аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101 в CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, эти аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или в комбинации, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив и/или антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует в зависимости от концентрации ионов кальция.

Когда вариабельные области легкой цепи, сконструированные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательность эмбрионального типа, комбинируют с вариабельной областью тяжелой цепи, в которую внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, как упоминалось выше, последовательность вариабельной области тяжелой цепи также можно конструировать так, чтобы она содержала нестрогие остатки, аналогично тому, как описано выше. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует, в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Более того, рандомизированные библиотеки вариабельной области можно предпочтительно использовать в качестве аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, отличных от аминокислотных остатков, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы. Когда в качестве вариабельных областей легкой цепи используют последовательности эмбрионального типа, неограничивающие примеры таких последовательностей включают последовательности SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) и SEQ ID NO: 8 (Vk4).

Предпочтительно можно использовать любую из описанных выше аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов кальция, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив. В частности, такие аминокислоты включают электронодонорные аминокислоты. Предпочтительные примеры таких электронодонорных аминокислот включают серии, треонин, аспарагин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

Условия концентраций ионов водорода

В одном варианте осуществления настоящего изобретения условия концентраций ионов относятся к условиям концентраций ионов водорода или условиям рН. В рамках настоящего изобретения концентрация протона, т.е. ядра атома водорода, используется в качестве синонима водородного показателя (рН). Когда активность ионов водорода в водном растворе отображают как аН+, рН определяется как -log10aH+. Когда ионная сила водного раствора является низкой (например, ниже 10^-3), аН+ практически равна ионной силе водорода. Например, ионное произведение воды при 25°С и 1 атмосфере составляет Kw=aH+aOH=10^-14, и, таким образом, в чистой воде аН+=аОН=10^-7. В этом случае, рН=7 является нейтральным; водный раствор, рН которого ниже 7, является кислым, или рН которого больше 7, является щелочным.

В рамках настоящего изобретения, когда условия рН используют в качестве условий концентрации ионов, условия рН включают высокие концентрации ионов водорода или низкие значения рН, т.е. диапазон кислых значений рН, и низкие концентрации ионов водорода или высокие значения рН, т.е. диапазон нейтральных значений рН. "Активность связывания варьирует в зависимости от условий рН" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует вследствие различий в условиях высокой концентрации ионов водорода или низких значений рН (диапазон кислых значений рН) и низкой концентрации ионов водорода или высоких значений рН (диапазон нейтральных значений рН). Это включает, например, случай, когда антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой в диапазоне нейтральных значений рН, чем в диапазоне кислых значений рН, и случай, когда антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой в диапазоне кислых значений рН, чем в диапазоне нейтральных значений рН.

В настоящем описании диапазон нейтральных значений рН не ограничивается конкретной величиной и предпочтительно выбран из диапазона от рН 6,7 до рН 10,0. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН 6,7 до рН 9,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН 7,0 до рН 9,0. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН 7,0 до рН 8,0. Особенно предпочтительное значение рН включает рН 7,4, которое является близким к рН плазмы (крови) in vivo.

В настоящем описании диапазон кислых значений рН не ограничивается конкретной величиной и предпочтительно выбран из диапазона от рН 4,0 до рН 6,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН 4,5 до рН 6,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН 5,0 до рН 6,5. В другом варианте осуществления рН может быть выбрано из диапазона от рН 5,5 до рН 6,5. Особенно предпочтительное значение рН включает рН 5,8, что является близким к рН в ранней эндосоме in vivo.

В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН (диапазон кислых значений рН) является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН (диапазон нейтральных значений рН)" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН 4,0 до рН 6,5, является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН 6,7 до рН 10,0; предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН 4,5 до рН 6,5, является более слабой, чем при рН, выбранном из диапазона от рН 6,7 до рН 9,5; более предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН 5,0 до рН 6,5, является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН 7,0 до рН 9,0; еще более предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН 5,5 до рН 6,5 является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН 7,0 до рН 8,0; особенно предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность при значении рН в ранней эндосоме in vivo является более слабой, чем антигенсвязывающая активность при значении рН в плазме in vivo; и, конкретно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при рН 5, 8 является более слабой, чем антигенсвязывающая активность при рН 7,4.

Определение того, изменяется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий рН можно проводить, например, с использованием известных способов измерения, таких как способы, описанные в разделе "Активность связывания" выше. В частности, активность связывания измеряют в различных условиях рН с использованием способов измерения, описанных выше. Например, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы сравнивают в условиях диапазона кислых значений рН и диапазона нейтральных значений рН, чтобы подтвердить, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы изменяется так, что она является более высокой в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем в условиях диапазона кислых значений рН.

Более того, в рамках настоящего изобретения выражение "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" также может быть выражено как "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН". В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" может быть описана как "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более слабой, чем антигенсвязывающая способность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН". Альтернативно "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, снижена так, чтобы она была более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" может быть описана как "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, снижена так, чтобы она была слабее, чем антигенсвязывающая способность при низкой концентрации ионов водорода или высоких значениях рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН".

Условия, отличные от концентрации ионов водорода или рН для измерения и антигенсвязывающей активности, могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области и они конкретно не ограничены. Измерение можно проводить, например, при 37°С с использованием буфера HEPES. Измерение можно проводить, например, с использованием Biacore (GE Healthcare). Когда антиген представляет собой растворимый антиген, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы можно определять путем оценки активности связывания с растворимым антигеном путем нанесения антигена в качестве анализируемого соединения на чип, на который иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Когда антиген представляет собой антиген мембраны, активность связывания с антигеном мембраны можно оценивать путем нанесения антигенсвязывающей молекулы в качестве анализируемого соединения на чип, на который иммобилизован антиген.

При условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более слабой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, соотношение антигенсвязывающей активности между антигенсвязывающей активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН конкретно не ограничено, и величина KD (pH5,8)/KD (рН7,4), которая представляет собой соотношение константы диссоциации (KD) для антигена при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и KD при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (pH5,8)/KD (рН7,4) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (pH5,8)/KD (рН7,4) составляет 4 0 или более. Верхний предел величины KD (pH5,8)/KD (рН7,4) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 4 00, 1000 или 10000, при условии что молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, константу диссоциации (KD) можно использовать в качестве величины антигенсвязывающей активности. Между тем, когда антиген представляет собой мембранный антиген, можно использовать кажущуюся константу диссоциации (KD). Константу диссоциации (KD) и кажущуюся константу диссоциации (KD) можно измерять способами, известными специалистам в данной области, и можно использовать Biacore (GE healthcare), график Скэтчарда, проточный цитометр и т.п.

Альтернативно, например, константу скорости диссоциации (kd) можно соответствующим образом использовать в качестве показателя, указывающего на соотношение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению между активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН. Когда kd (константа скорости диссоциации) используют в качестве показателя, указывающего на соотношение активностей связывания вместо KD (константа диссоциации), величина kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН), которая представляет собой соотношение kd (константа скорости диссоциации) в отношении антигена при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений, рН и kd (константа скорости диссоциации) при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно составляет 2 или более, более предпочтительно 5 или более, еще более предпочтительно 10 или более и еще более предпочтительно 3 0 или более. Верхний предел величины kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) конкретно не ограничен, и он может представлять собой любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии, что молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, в качестве величины антигенсвязывающей активности можно использовать константу скорости диссоциации (kd), и когда антиген представляет собой антиген мембраны, можно использовать кажущуюся константу скорости диссоциации (kd). Константу скорости диссоциации (kd) и кажущуюся константу скорости диссоциации (kd) можно определять способами, известными специалистам в данной области, и можно использовать Biacore (GE healthcare), проточный цитометр и т.п. В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы измеряют при различных концентрациях ионов водорода, т.е. рН, условия, отличные от концентрации ионов водорода, т.е. рН, предпочтительно являются одинаковыми.

Например, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются одним из вариантов осуществления, предусматриваемых настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего следующие стадии (а)-(с):

(a) получение значения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела в диапазоне кислых значений рН;

(b) получение значения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела в диапазоне нейтральных значений рН; и

(с) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН.

Альтернативно антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются одним из вариантов осуществления, предусматриваемых настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител или их библиотеки, включающего следующие стадии (а)-(с):

(a) контактирование антигенсвязывающего домена, или антитела, или их библиотеки, в диапазоне нейтральных значений рН с антигеном;

(b) помещение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (а), в диапазон кислых значений рН; и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, диссоциировавших на стадии (b).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов, или антител, или их библиотеки, включающего следующие стадии (a)-(d):

(a) контактирование в диапазоне кислых значений рН антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител;

(b) отбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые не связываются с антигеном на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, отобранным на стадии (b), связываться с антигеном в диапазоне нейтральных значений рН; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (с).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (а)-(с):

(a) контактирование в диапазоне нейтральных значений рН библиотеки антигенсвязывающих доменов или антител с колонкой, на которой иммобилизован антиген;

(b) элюирование в диапазоне кислых значений рН из колонки антигенсвязывающего домена или антитела, связавшегося с колонкой на стадии (а); и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных на стадии (b).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (a)-(d):

(a) позволение в диапазоне кислых значений рН библиотеке антигенсвязывающих доменов или антител проходить через колонку, на которую иммобилизован антиген;

(b) сбор антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных без связывания с колонкой на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, собранным на стадии (b), связываться с антигеном в диапазоне нейтральных значений рН; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (с).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (a)-(d):

(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител в диапазоне нейтральных значений рН;

(b) получение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (а);

(c) помещение антигенсвязывающего домена или антитела, полученных на стадии (b), в диапазон кислых значений рН; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых на стадии (с) является более слабой, чем у стандарта, выбранного на стадии (b).

Описанные выше стадии можно повторять два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам и антителам, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, которые получают способом скрининга, который дополнительно включает стадии повторения стадий (а)-(с) или (a)-(d) в описанных выше способах скрининга. Количество повторений стадий (а)-(с) или (a)-(d) конкретно не ограничено; однако обычно количество составляет 10 или менее.

В способах скрининга по настоящему изобретению антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, конкретно не ограничена, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую активность при рН от 4,0 до 6,5, и включает антигенсвязывающую активность при рН от 4,5 до 6,6 в качестве предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН от 5,0 до 6,5, и антигенсвязывающую активность при рН от 5,5 до 6,5 в качестве других предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН в ранней эндосоме in vivo в качестве более предпочтительного значения рН, и, в частности, антигенсвязывающую активность при рН 5,8. Между тем, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой антигенсвязывающую активность при рН от 6,7 до 10, и включает антигенсвязывающую активность при рН от 6,7 до 9,5 в качестве предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН от 7,0 до 9,5 и антиген связывающую активность при рН от 7,0 до 8,0 в качестве других предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН плазмы in vivo в качестве более предпочтительных значений рН, и, в частности, антигенсвязывающую активность при рН 7,4.

Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить условия, отличные от концентрации ионизированного кальция. Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно оценивать, основываясь на константе диссоциации (KD), кажущейся константе диссоциации (KD), константе скорости диссоциации (kd), кажущейся константе скорости диссоциации (kd) и т.п. Их можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или FACS.

В рамках настоящего изобретения стадия отбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является синонимичной стадии отбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН.

При условии, что антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, отличие между антигенсвязывающей активностью при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, и антигенсвязывающей активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, конкретно не ограничено; однако антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно в два или более раз, более предпочтительно в 10 или более раз, и еще более предпочтительно в 4 0 или более раз превышает антигенсвязывающую активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН.

Антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению, подвергаемые скринингу способами скрининга, описанными выше, могут представлять собой любой антигенсвязывающий домен или антитело, и можно проводить скрининг упомянутого выше антигенсвязывающего домена или антитела. Например, можно проводить скрининг антигенсвязывающего домена или антитела, имеющих нативную последовательность, и можно проводить скрининг антигенсвязывающего домена или антитела, в которых их аминокислотные последовательности были заменены.

Антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым способом. Например, можно использовать общепринятые антитела, общепринятые библиотеки (фаговая библиотека и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из В-клеток иммунизированных животных или из гибридом, полученных путем иммунизации животных, антитела или библиотеки (библиотеки с увеличенным содержанием аминокислот с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, библиотеки, в которые внесены аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислотные мутации в конкретных положениях и т.д.), полученные путем внесения аминокислот с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в описанные выше антитела или библиотеки.

Способы получения антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, из антигенсвязывающих доменов или антител, полученных из гибридом, полученных иммунизацией животных или из В-клеток иммунизированных животных, предпочтительно включают, например, антигенсвязывающую молекулу или антитело, в которых по меньшей мере одна из аминокислот антигенсвязывающего домена или антитела заменена аминокислотой с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или мутацией на неприродную аминокислоту, или антигенсвязывающий домен или антитело, в которые встроена аминокислота с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродная аминокислота, такая как описана в WO 2009/125825.

Участки внесения мутаций на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты конкретно не ограничены, и они могут представлять собой любое положение, при условии что антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН становится более слабой, чем в диапазоне нейтральных значений рН (величина KD (в диапазоне кислых значений рН)/KD (в диапазоне нейтральных значений рН) или kd (в диапазоне кислых значений рН) /kd (в диапазоне нейтральных значений рН) увеличивается) по сравнению с величиной до замены или вставки. Например, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, являются пригодными вариабельная область и CDR антитела. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить количество аминокислот, подлежащих замене, или количество аминокислот с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, подлежащих встраиванию. Можно осуществить замену на одну аминокислоту, имеющую рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одну неприродную аминокислоту; можно осуществить встраивание одной аминокислоты, имеющей рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одной неприродной аминокислоты; можно осуществить замену на две или более аминокислоты, имеющих рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или на две или более неприродных аминокислоты; и можно осуществить встраивание двух или более аминокислот, имеющих рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или двух или более неприродных аминокислот. Альтернативно другие аминокислоты можно параллельно удалять, добавлять, встраивать и/или заменять, помимо замены на аминокислоты, имеющие рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, или встраивания аминокислот, имеющих рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот. Замену на или встраивание аминокислот с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот можно проводить случайным образом способами, такими как сканирование гистидином, в которых аланин в способе сканирования аланином, известном специалистам в данной области, заменяют на гистидин. Антигенсвязывающие молекулы, проявляющие более высокую величину KD (в диапазоне кислых значений рН)/KD (в диапазоне нейтральных значений рН) или kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) по сравнению с величиной до внесения мутации можно выбирать из антигенсвязывающих доменов или антител, в которые внесены случайные инсерции или мутации с заменой на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты.

Предпочтительные примеры антигенсвязывающих молекул, содержащих мутацию на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, как описано выше, и антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, включают антигенсвязывающие молекулы, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне нейтральных значений рН после мутации на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты сравнима с антигенсвязывающей активностью до мутации на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты. В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая молекула после мутации на аминокислоты, имеющие рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты имеет антигенсвязывающую активность, сравнимую с антигенсвязывающей активностью до мутации на аминокислоты, имеющие рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты" означает, что, при принятии антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы до мутации на аминокислоты, имеющие рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты как 100%, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы после мутации на аминокислоты, имеющие рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты составляет по меньшей мере 10% или более, предпочтительно 50% или более, более предпочтительно 80% или более, и еще более предпочтительно 90% или более. Антигенсвязывающая активность после мутации на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты при рН 7,4 может быть более высокой, чем до мутации на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты при рН 7,4. Если антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы снижается вследствие встраивания или замены на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, антигенсвязывающую активность можно сделать сравнимой с антигенсвязывающей активностью до встраивания или замены на аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, путем внесения замены, делеции, вставки и/или инсерции одной или нескольких аминокислот антигенсвязывающей молекулы. Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы, активность связывания которых скорректирована так, чтобы она была сравнимой, путем замены, делеции, вставки и/или инсерции одной или нескольких аминокислот после замены на или вставки аминокислоты с рКа боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродной аминокислоты.

Между тем, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой вещество, содержащее константную область антитела, предпочтительные варианты осуществления антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, включают способы, в которых константные области антитела, содержащиеся в антигенсвязывающих молекулах, модифицированы. Конкретные примеры модифицированных константных областей антител предпочтительно включают константные области SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14.

Аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена в зависимости от условий концентрации ионов водорода

Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым способом. Например, когда условия концентрации ионов представляют собой условия концентрации ионов водорода или условия рН, можно использовать общепринятые антитела, общепринятые библиотеки (фаговая библиотека и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из В-клеток иммунизированных животных или из гибридом, полученных иммунизацией животных, антитела или библиотеки (библиотеки с увеличенным содержанием аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, библиотеки, в которые внесены мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты в конкретных положениях и т.д.), полученные путем внесения мутаций на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты в описанные выше антитела или библиотеки.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, также можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода".

Такие аминокислотные остатки включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR1 легкой цепи. Аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR2 легкой цепи. Аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR3 легкой цепи.

Описанные выше аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR1 легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 24, 27, 28, 31, 32 и/или 34 согласно нумерации Kabat в CDR1 вариабельной области легкой цепи. Между тем, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR2 легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 50, 51, 52, 53, 54, 55 и/или 5 6 согласно нумерации Kabat в CDR2 вариабельной области легкой цепи. Более того, аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 89, 90, 91, 92, 93, 94 и/или 95А согласно нумерации Kabat, в CDR3 вариабельной области легкой цепи. Более того, аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или они могут содержаться в комбинации из двух или более аминокислот, при условии, что они позволяют изменять антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода.

Даже когда вариабельную область тяжелой цепи, полученную в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, комбинируют с описанной выше вариабельной областью легкой цепи, в которую внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода", ее можно конструировать так, чтобы нестрогие остатки содержались в последовательности вариабельной области легкой цепи аналогично тому, как описано выше. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено конкретным вариантом осуществления, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению изменяется в зависимости от условий концентрации ионов водорода. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Например, нестрогие остатки, подлежащие внесению в последовательности вариабельных областей легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, приведенные в таблице 3 и 4. Между тем, аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи, отличные от нестрогих остатков, и аминокислотные остатки, которые изменяют антигенсвязывающую активность

антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода, соответственно включают, но не ограничиваются ими, последовательности эмбрионального типа, такие как Vk1 (SEQ ID NO: 5), Vk2 (SEQ ID NO: 6), Vk3 (SEQ ID NO: 7) и Vk4 (SEQ ID NO: 8).

(положение указано согласно нумерации Kabat)

(положение указано согласно нумерации Kabat)

Любой аминокислотный остаток можно соответствующим образом использовать в качестве описанных выше аминокислотных остатков, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода. В частности, такие аминокислотные остатки включают аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0. Такие электроноотдающие аминокислоты предпочтительно включают, например, встречающиеся в природе аминокислоты, такие как гистидин и глутаминовая кислота, а также неприродные аминокислоты, такие как аналоги гистидина (US 2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3.5-Br2-Tyr (pKa 7,21) и 3.5-12-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Особенно предпочтительные аминокислотные остатки включают, например, аминокислоты с pKa боковой цепи 6,0-7,0. Такие электроноотдающие аминокислотные остатки предпочтительно включают, например, гистидин.

Для модификации аминокислот антигенсвязывающих доменов можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР с удлинением. Более того, различные известные способы также можно использовать в качестве способа модификации аминокислот для замены аминокислот на аминокислоты, отличные от природных аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно соответствующим образом использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, в которых амбер-супрессорная тРНК, которая комплементарна кодону UAG (амбер-кодон), который является стоп-кодоном, связана с неприродной аминокислотой.

Предпочтительная вариабельная область тяжелой цепи, которую используют в комбинации, включает, например, рандомизированные библиотеки вариабельной области. Известные способы соответствующим образом комбинируют в качестве способа получения рандомизированной библиотеки вариабельной области. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области можно использовать иммунную библиотеку, сконструированную на основе генов антител, происходящих из животных, иммунизированных конкретными антигенами, пациентов с инфекцией или индивидуумов с повышенным титром антител в крови в результате вакцинации, пациентов со злокачественной опухолью или лимфоцитов от пациентов с иммунными заболеваниями.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, аналогично тому, как описано выше, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также пригодным образом можно использовать синтетическую библиотеку, полученную путем замены последовательностей CDR V-генов в геномной ДНК или функциональных реконструированных V-генов набором синтетических олигонуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие наборы кодонов соответствующей длины. В этом случае, поскольку в последовательности CDR3 тяжелой цепи наблюдают разнообразие, также можно заменять только последовательность CDR3. Основанием для получения вариантов аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является получение вариантов аминокислотных остатков экспонированных на поверхности положений антигенсвязывающей молекулы. Экспонированное на поверхности положение относится к положению, которое считается способным экспонироваться на поверхности и/или контактировать с антигеном, исходя из структуры, группы структур и/или смоделированной структуры антигенсвязывающей молекулы, и, как правило, такие положения представляют собой CDR. Предпочтительно, экспонированные на поверхности положения определяют с использованием координат из трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с использованием компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Экспонированные на поверхности положения можно определять с использованием алгоритмов, известных в данной области (например, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение экспонированных на поверхности положений можно проводить на основе информации о трехмерной структуре с использованием программного обеспечения, пригодного для моделирования белка. Программное обеспечение, которое можно использовать для этих целей, предпочтительно включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Когда алгоритм требует введения пользователем параметра размера, "размер" образца, который используют в вычислении, устанавливают как радиус, приблизительно равный 1,4 Ангстрем или менее. Более того, способы определения экспонированных на поверхности областей и участков с использованием программного обеспечения для PC описаны Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также особенно пригодным является использование наивной библиотеки, которая сконструирована из генов антител, происходящих из лимфоцитов здоровых индивидуумов, и набор генов которой состоит из наивных последовательностей, которые представляют собой последовательности антител без предпочтений (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).

FcRn

В отличие от Fcγ-рецептора, принадлежащего семейству иммуноглобулинов, FcRn, в частности, FcRn человека, структурно сходен с полипептидами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, проявляя 22%-29% идентичность последовательности с молекулами МНС класса I (Ghetie el al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn экспрессируется в качестве гетеродимера, состоящего из растворимой β- или легкой цепи (β2-микроглобулин) в комплексе с трансмембранной α- или тяжелой цепью. Подобно МНС, α-цепь FcRn содержит три внеклеточных домена (α1, α2 и α3) и ее короткий цитоплазматический домен заякоривает белок на клеточной поверхности, α1- и α2-домены взаимодействуют с FcRn-связывающим доменом Fc-области антитела (Raghavan et al., Immunity (1994) 1:303-315).

FcRn экспрессируется в материнской плаценте и желточном мешке млекопитающих, и он вовлечен в перенос IgG от матери к плоду. Кроме того, в тонком кишечнике новорожденных грызунов, где FcRn экспрессируется, FcRn вовлечен в перенос материнских IgG через эпителий щеточной каемки из проглоченного молозива или молока. FcRn экспрессируется во множестве других тканей и системах эндотелиальных клеток различных видов. FcRn также экспрессируется у взрослого человека в эндотелии, кровеносных сосудах мышц и синусоидных капиллярах печени. Полагают, что FcRn участвует в поддержании концентрации IgG в плазме путем опосредования рециклирования IgG в сыворотку при связывании с IgG. Как правило, связывание FcRn с молекулами IgG строго зависит от рН. Оптимальное связывание наблюдают при кислом диапазоне рН ниже 7,0.

FcRn человека, предшественником которого является полипептид, имеющий сигнальную последовательность SEQ ID NO: 15 (полипептид с сигнальной последовательностью представлен в SEQ ID NO: 16), образует комплекс с β2-микроглобулином человека in vivo. Как показано в справочных примерах, описанных ниже, растворимый FcRn человека в комплексе с β2-микроглобулином получают с использованием общепринятых способов рекомбинантной экспрессии. FcRn-области по настоящему изобретению можно оценивать в отношении их активности связывания с таким растворимым FcRn человека в комплексе с β2-микроглобулином. В рамках настоящего изобретения, если нет иных указаний, FcRn человека относится к форме, способной связываться с FcRn-связывающим доменом по настоящему изобретению. Примеры включают комплекс между FcRn человека и β2-микроглобулином человека.

Fc-область

Fc-область содержит аминокислотную последовательность, происходящую из константной области тяжелой цепи антитела. Fc-область представляет собой часть константной области тяжелой цепи антитела, начинающуюся с N-конца шарнирной области, которая соответствует участку расщепления папаином у аминокислоты вблизи положения 216 согласно системе нумерации EU, и содержит шарнирную область, СН2- и СН3-домены.

Активность связывания Fc-области по настоящему изобретению с FcRn, в частности FcRn человека, можно измерять способами, известными специалистам в данной области, как описано в разделе "Активность связывания" выше. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить условия, отличные от рН. Антигенсвязывающую активность и активность связывания FcRn человека антигенсвязывающей молекулы можно оценивать, основываясь на константе диссоциации (KD), кажущейся константе диссоциации (KD), константе скорости диссоциации (kd), кажущейся константе скорости диссоциации (kd) и т.п. Их можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Например, можно использовать Biacore (GE healthcare), график Скэтчарда или проточный цитометр.

Когда измеряют активность связывания FcRn человека Fc-области по настоящему изобретению, условия, отличные от рН, конкретно не ограничены, и их могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области. Измерения можно проводить, например, при 37°С с использованием буфера MES, как описано в WO 2009125825. Альтернативно активность связывания FcRn человека Fc-области по настоящему изобретению можно измерять способами, известными специалистам в данной области, и ее можно измерять с использованием, например, Biacore (GE Healthcare) и т.п. Активность Fc-области в отношении связывания по настоящему изобретению с FcRn человека можно оценивать путем нанесения в качестве анализируемого соединения FcRn человека, Fc-области или антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, содержащей Fc-область, на чип, на который иммобилизована Fc-область, антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, содержащая Fc-область, или FcRn человека.

Диапазон нейтральных значений рН в качестве условий, где Fc-область, содержащаяся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, имеет активность связывания FcRn, как правило, означает от рН 6,7 до рН 10,0. Предпочтительно, диапазон нейтральных значений рН представляет собой диапазон, указанный с помощью произвольных величин рН от рН 7,0 до рН 8,0, и предпочтительно он выбран из рН 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 и 8,0, и особенно предпочтительно рН 7,4, что близко к значению рН плазмы (крови) in vivo. Когда аффинность связывания между FcRn-связывающим доменом человека и FcRn человека при рН 7,4 является слишком низкой, чтобы ее оценить, вместо рН 7,4 можно использовать рН 7,0. В рамках изобретения диапазон кислых значений рН в качестве условий, где Fc-область, содержащаяся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, имеет активность связывания FcRn, как правило, означает от рН 4,0 до рН 6,5. Предпочтительно, диапазон кислых значений рН означает от рН 5,5 до рН 6,5, особенно предпочтительно от рН 5,8 до рН 6,0, что близко к рН в ранней эндосоме in vivo. что касается температуры, используемой в качестве условий измерения, аффинность связывания между доменом, связывающим FcRn человека, и FcRn человека можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Предпочтительно, аффинность связывания между доменом, связывающим FcRn человека, и FcRn человека можно определять при от 15°С до 40°С. Более предпочтительно, аффинность связывания между доменом, связывающим FcRn человека, и FcRn человека, можно определять аналогичным образом при произвольной температуре от 20°С до 35°С, такой как любая температура из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35°С. В одном варианте осуществления настоящего изобретения температура включает, но не ограничивается ими, например, 25°С.

Согласно Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671, активность связывания природного IgG1 человека с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН (рН 6,0) составляет KD 1,7 мкМ, в то время как эта активность практически не поддается выявлению в диапазоне нейтральных значений рН. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления можно проводить скрининг антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, обладающих активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и в диапазоне нейтральных значений рН, включая антигенсвязывающие молекулы, у которых активность связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН составляет 20 мкМ (KD) или сильнее, и активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН сравнима или сильнее чем активность связывания FcRn человека у нативного IgG человека. В более предпочтительном варианте осуществления можно проводить скрининг антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, включая антигенсвязывающие молекулы, у которых активность связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН составляет 20 мкМ (KD) или сильнее, и активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН составляет 40 мкМ (KD) или сильнее. В следующем более предпочтительном варианте осуществления можно проводить скрининг антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, включая антигенсвязывающие молекулы, у которых активность связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН составляет 0,5 мкМ (KD) или сильнее и активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН составляет 15 мкМ (KD) или сильнее. Описанные выше величины KD определяют способом, описанным в Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (путем иммобилизации антигенсвязывающей молекулы на чип и нанесения FcRn человека в качестве анализируемого образца).

В рамках настоящего изобретения предпочтительные Fc-области обладают активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и в диапазоне нейтральных значений рН. Когда Fc-область первоначально имеет активность связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и в диапазоне нейтральных значений рН, ее можно использовать как есть. Когда Fc-область имеет только слабую или не имеет активности связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и/или в диапазоне нейтральных значений рН, Fc-области, имеющие желаемую активность связывания FcRn человека, можно получать путем модификации аминокислот антигенсвязывающей молекулы. Fc-области, имеющие желаемую активность связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и/или в диапазоне нейтральных значений рН также можно соответствующим образом получать путем модификации аминокислот Fc-области человека. Альтернативно Fc-области, имеющие желаемую активность связывания FcRn человека, можно получать путем модификации аминокислот Fc-области, которая первоначально обладает активность связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и/или в диапазоне нейтральных значений рН. Аминокислотные модификации Fc-области человека, которые приводят к такой желаемой активности связывания, можно выявлять путем сравнения активности связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и/или в диапазоне нейтральных значений рН до и после модификации аминокислот. Специалисты в данной области могут соответствующим образом модифицировать аминокислоты с использованием известных способов.

В рамках настоящего изобретения "модификация аминокислот" или "аминокислотная модификация" Fc-области включает модификацию до аминокислотной последовательности, которая отличается от исходной Fc-области. Исходная Fc-область может представлять собой любую Fc-область, при условии, что варианты, полученные путем модификации исходной Fc-области, могут связываться с FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН.

Более того, также в качестве измененной Fc-области по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать Fc-область, модифицированную из исходной Fc-области, которая уже модифицирована. "Исходная Fc-область" может относиться к самому полипептиду, композиции, содержащей исходную Fc-область или полинуклеотидной последовательности, кодирующей исходную Fc-область. Исходные Fc-области могут содержать Fc-область известного IgG-антитела, полученную путем рекомбинации, кратко описанной в разделе "Антитела". Источник исходных Fc-областей не ограничен, и их можно получать из человека или любых не являющихся человеком организмов. Такие организмы предпочтительно включают мышей, крыс, морских свинок, хомячков, песчанок, кошек, кроликов, собак, коз, овец, животных семейства бычьи, лошадей, верблюдов и организмов, выбранных из не являющихся человеком приматов. В другом варианте осуществления исходные Fc-области также можно получать из яванских макаков, мартышек, макаков-резус, шимпанзе или людей. Исходные Fc-области можно предпочтительно получать из IgG1 человека; однако они не ограничиваются каким-либо конкретным классом IgG. Это означает, что в качестве исходной Fc-области можно соответствующим образом использовать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, и в рамках настоящего изобретения это также означает, что предпочтительно в качестве исходной Fc-области можно использовать Fc-область произвольного класса или подкласса IgG, происходящую из любых организмов, описанных выше. Примеры встречающихся в природе вариантов или модифицированных форм IgG описаны в опубликованных документах (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635 и WO 2006/105338); однако они не ограничиваются этими примерами.

Примеры изменений включают изменения с одной или несколькими мутациями, например, мутациями путем замены другими аминокислотными остатками аминокислот исходных Fc-областей, путем встраивания одного или нескольких аминокислотных остатков в исходные Fc-области, или путем делеции одной или нескольких аминокислот из исходных Fc-областей. Предпочтительно, аминокислотные последовательности измененных Fc-областей включают по меньшей мере часть аминокислотной последовательности ненативной Fc-области. Такие варианты обязательно обладают идентичностью или сходством последовательности с их исходной Fc-областью, меньшим чем 100%. В предпочтительном варианте осуществления варианты обладают идентичностью или сходством аминокислотной последовательности приблизительно от 75% до менее чем 100%, более предпочтительно приблизительно от 80% до менее чем 100%, еще более предпочтительно приблизительно от 85% до менее чем 100%, еще более предпочтительно, приблизительно от 90% до менее чем 100%, и еще более предпочтительно приблизительно от 95% до менее чем 100% с аминокислотной последовательностью их исходной Fc-области. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна аминокислота отличается между модифицированной Fc-областью по настоящему изобретению и ее исходной Fc-областью. Аминокислотное отличие между модифицированной Fc-областью по настоящему изобретению и ее исходной Fc-областью также может быть предпочтительно указано на основе аминокислотных отличий в описанных выше конкретных положениях аминокислот в соответствии с системой нумерации EU.

Fc-области, имеющие активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, которые содержатся в антигенсвязывающих молекулах по настоящему изобретению, можно получать любым способом. В частности, Fc-области, обладающие активностью связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, можно получать путем модификации аминокислот иммуноглобулина человека IgG-типа в качестве исходной Fc-области. Fc-области иммуноглобулинов IgG-типа, пригодные для модификации, включают, например, Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и их модифицированные формы). Аминокислоты любых положений можно модифицировать в другие аминокислоты, при условии, что Fc-области имеют активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН или может увеличиваться активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений. Когда антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области человека, предпочтительно, чтобы полученная Fc-область содержала модификацию, которая приводит к эффекту усиления связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Аминокислоты, которые позволяют такую модификацию, включают, например, аминокислоты в положениях 221-225, 227, 228, 230, 232, 233-241, 243-252, 254-260, 262-272, 274, 276, 278-289, 291-312, 315-320, 324, 325, 327-339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375-378, 380, 382, 385-387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426-438, 440 и 442 согласно нумерации EU. Более конкретно, такие модификации аминокислот включают модификации, приведенные в таблице 5. Модификация этих аминокислот усиливает связывание Fc-области иммуноглобулина IgG-типа с FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН.

Из описанных выше модификаций, для применения в рамках настоящего изобретения соответствующим образом выбирают модификации, которые усиливают связывание FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН. Особенно предпочтительные аминокислоты модифицированных Fc-областей включают, например, аминокислоты в положениях 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 в соответствии с системой нумерации EU. Активность связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН Fc-области, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле, можно увеличивать путем замены по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из описанных выше аминокислот, на другую аминокислоту.

Особенно предпочтительные модификации включают, например:

Met вместо аминокислоты в положении 237;

Ile вместо аминокислоты в положении 248;

Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 250;

Phe, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 252;

Thr вместо аминокислоты в положении 254;

Glu вместо аминокислоты в положении 255;

Asp, Asn, Glu или Gln вместо аминокислоты в положении 256;

Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val вместо аминокислоты в положении 257;

His вместо аминокислоты в положении 258:

Ala вместо аминокислоты в положении 265;

Ala или Glu вместо аминокислоты в положении 286;

His вместо аминокислоты в положении 289;

Ala вместо аминокислоты в положении 297;

Ala вместо аминокислоты в положении 303;

Ala вместо аминокислоты в положении 305;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 307;

Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr вместо аминокислоты в положении 308;

Ala, Asp, Glu, Pro или Arg вместо аминокислоты в положении 309;

Ala, His или Ile вместо аминокислоты в положении 311;

Ala или His вместо аминокислоты в положении 312;

Lys или Arg вместо аминокислоты в положении 314;

Ala, Asp или His вместо аминокислоты в положении 315;

Ala вместо аминокислоты в положении 317;

Val вместо аминокислоты в положении 332;

Leu вместо аминокислоты в положении 334;

His вместо аминокислоты в положении 360;

Ala вместо аминокислоты в положении 376;

Ala вместо аминокислоты в положении 380;

Ala вместо аминокислоты в положении 382;

Ala вместо аминокислоты в положении 384;

Asp или His вместо аминокислоты в положении 385;

Pro вместо аминокислоты в положении 386;

Glu вместо аминокислоты в положении 387;

Ala или Ser вместо аминокислоты в положении 389;

Ala вместо аминокислоты в положении 424;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 428;

Lys вместо аминокислоты в положении 433;

Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 434; и

His, Ile, Leu, Phe, Thr или Val вместо аминокислоты в положении 436 Fc-области согласно нумерации EU. Между тем, количество аминокислот, подлежащих модификации, конкретно не ограничено, и можно модифицировать аминокислоту только в одном участке и можно модифицировать аминокислоты в двух или более участках. Комбинации модификаций аминокислот в двух или более участках включают, например, комбинации, описанные в таблице 6.

Антигенсвязывающая молекула

В рамках настоящего изобретения, термин "антигенсвязывающая молекула" используют в наиболее широком значении для обозначения молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и Fc-область. В частности, антигенсвязывающие молекулы включают различные типы молекул, при условии, что они проявляют антигенсвязывающую активность. Молекулы, в которых антигенсвязывающий домен связан с Fc-областью, включают, например, антитела. Антитела могут включать единичные моноклональные антитела (включая антитела-агонисты и антитела-антагонисты), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и т.п. Альтернативно при использовании в качестве фрагментов антител, они предпочтительно включают антигенсвязывающие домены и антигенсвязывающие фрагменты (например, Fab, F(ab')2, scFv и Fv). Каркасные молекулы, где трехмерные структуры, такие как уже известная стабильная белковая структура α/β-бочонок, используются в качестве каркаса (основы) и только некоторые части структур преобразуют в библиотеки для конструирования антигенсвязывающих доменов, также включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере некоторые части Fc-области, которые опосредуют связывание с FcRn и Fcγ-рецептором. В неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающая молекула включает, например, антитела и слитые белки Fc. Слитый белок относится к химерному полипептиду, содержащему полипептид, имеющий первую аминокислотную последовательность, который связан с полипептидом, имеющим вторую аминокислотную последовательность, которые не связаны в природе. Например, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере части Fc-области (например, часть Fc-области, ответственная за связывание с FcRn, или часть Fc-области, ответственная за связывание с Fcγ-рецептором) и не являющийся иммуноглобулином полипептид, содержащий, например, аминокислотную последовательность лиганд-связывающего домена рецептора или рецептор-связывающего домена лиганда. Аминокислотные последовательности могут находиться в отдельных белках, которые переносят вместе в слитый белок, или, как правило, они могут находиться в одном белке, но они включены в слитый полипептид в новом порядке. Слитые белки можно получать, например, посредством химического синтеза или способами генетической рекомбинации для экспрессии полинуклеотида, кодирующего области пептидов в желаемом порядке.

Соответствующие домены по настоящему изобретению могут быть связаны вместе через линкеры или прямо через связывание полипептида.

Линкеры включают произвольные пептидные линкеры, которые можно вносить способами генетической инженерии, синтетические линкеры и линкеры, описанные, например, в Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305. Однако пептидные линкеры являются предпочтительными в рамках настоящего изобретения. Длина пептидных линкеров конкретно не ограничена, и ее могут надлежащим образом выбирать специалисты в данной области в зависимости от назначения. Длина предпочтительно составляет пять аминокислот или более (без конкретных ограничений, верхний предел обычно составляет 30 аминокислоты или менее, предпочтительно 20 аминокислоты или менее), и особенно предпочтительно 15 аминокислот.

Например, такие пептидные линкеры предпочтительно включают:

Ser

Gly⋅Ser

Gly⋅Gly⋅Ser

Ser⋅Gly⋅Gly

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 17)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 18)

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 19)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 20)

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 21)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 22)

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 23)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 24)

(Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 19))n

(Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 20))n

где n представляет собой целое число, равное 1 или более.

Длину или последовательности пептидных линкеров могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области, в зависимости от назначения.

Обычно для сшивания пептидов используют синтетические линкеры (химические сшивающие агенты), и например:

N-гидроксисукцинимид (NHS),

дисукцинимидилсуберат (DSS),

бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS³),

дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP),

дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP),

этиленгликоль бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS),

этиленгликоль бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS),

дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST),

бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES),

и бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Эти сшивающие агенты являются коммерчески доступными.

Когда используют множество линкеров для связывания соответствующих доменов, все они могут быть одного типа или они могут быть различных типов.

В дополнение к линкерам, проиллюстрированным выше, также можно соответствующим образом использовать линкеры с пептидными метками, такими как His-метка, НА-метка, myc-метка и FLAG-метка. Более того, также можно соответствующим образом использовать образование водородных связей, образование дисульфидных связей, образование ковалентных связей, ионное взаимодействие и свойства связывания друг с другом в результате их комбинации. Например, можно использовать аффинность между СН1 и CL антитела, и также можно использовать Fc-области, происходящие из описанных выше биспецифических антител для гетероассоциации Fc-областей. Более того, также можно соответствующим образом использовать дисульфидные связи, образующиеся между доменами.

Для связывания соответствующих доменов пептидной связью, полинуклеотиды, кодирующие домены, связывают вместе в рамке считывания. Известные способы связывания полинуклеотидов в рамке считывания включают способы, такие как лигирование фрагментов рестрикции, ПЦР со слиянием и перекрывающаяся ПЦР. Такие способы можно соответствующим образом использовать отдельно или в комбинации для конструирования антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. В рамках настоящего изобретения термины "связанный" и "слитый", или "связывание" и "слияние" используют взаимозаменяемо. Эти термины означают, что два или более элементов или компонентов, таких как полипептиды, слиты вместе с образованием единой структуры любыми способами, включая описанные выше способы химического связывания и способы генетической рекомбинации. Слияние в рамке считывания означает, когда два или более элементов или компонентов представляют собой полипептиды, связывание двух или более элементов рамок считывания с образованием непрерывной более длинной рамки считывания при сохранении правильных рамок считывания полипептидов. Когда две молекулы Fab используют в качестве антигенсвязывающего домена, в качестве предпочтительной антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно использовать антитело, которое представляет собой антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, где антигенсвязывающий домен связан в рамке считывания с Fc-областью через пептидную связь без линкера.

Fcγ-рецептор

Fcγ-рецептор (также описываемый как FcγR) относится к рецептору, способному связываться с Fc-областью моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, и включает всех представителей, принадлежащих семейству белков, по существу кодируемых геном Fcγ-рецептора. У человека семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотип Н131 и R131), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2), и FcγRIIc; и FcγRIII (CD16) включая изоформу FcγRIIIa (включая аллотип V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотип FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2); а также неидентифицированные FcγR человека, изоформы FcγR и их аллотипы. Однако Fcγ-рецептор не ограничивается этими примерами. Не ограничиваясь этим, FcγR включает FcγR человека, мыши, крысы, кролика и обезьяны. FcγR может происходить из любых организмов. FcγR мыши включает, но не ограничивается ими, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (FcγRIV, CD16-2), a также неидентифицированные FcγR мыши, изоформы FcγR и их аллотипы. Такие предпочтительные Fcγ-рецепторы включают, например, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16) и/или FcγRIIIb (CD16) человека. Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRI представлены в SEQ ID NO: 25 (NM_000566.3) и 26 (NP_000557.1), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIa (аллотип Н131) представлены в SEQ ID NO: 27 (ВС020823.1) и 28 (ААН20823.1) (аллотип R131 представляет собой последовательность, в которой аминокислота в положении 166 SEQ ID NO: 28 заменена на Arg), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγIIB представлены в SEQ ID NO: 29 (ВС146678.1) и 30 (AAI46679.1), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIa представлены в SEQ ID NO: 31 (ВС033678.1) и 32 (ААН33678.1), соответственно; и полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIb представлены в SEQ ID NO: 33 (ВС128562.1) и 34 (AAI28563.1), соответственно (номер доступа RefSeq представлен в каждом случае в скобках).

Например, как описано в справочном примере 27 и т.п., для FcγRIIIaV, когда используют аллотип V158, если нет иных указаний, используют аллотип F158; однако аллотип изоформы FcγRIIIa, описанный в настоящем описании, не следует интерпретировать как конкретно ограниченный.

То, обладает ли Fcγ-рецептор активностью связывания с Fc-областью моноклонального антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 можно оценивать с помощью скрининга ALPHA (анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции), способа BIACORE на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и другие (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), в дополнение к описанным выше форматам FACS и ELISA.

Между тем, "Fc-лиганд" или "эффекторный лиганд" относится к молекуле и предпочтительно полипептиду, которые связываются с Fc-областью антитела, образуя комплекс Fc/Fc-лиганд. Молекула может происходить из любых организмов. Связывание Fc-лиганда с Fc предпочтительно индуцирует одну или несколько эффекторных функций. Такие Fc-лиганды включают, но не ограничиваются ими, Fc-рецепторы, FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q и С3, маннан-связывающий лектин, рецептор маннозы, белок A Staphylococcus, белок G Staphylococcus и вирусные FcγR. Fc-лиганды также включают гомологи Fc-рецептора (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), которые являются семейством Fc-рецепторов, гомологичных FcγR. Fc-лиганды также включают неидентифицированные молекулы, которые связываются с Fc.

В FcγRI (CD64), включая FcγRIa, FcγRIb, и FcγRIc, и FcγRII (CD16), включающий изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2), α-цепь, которая связывается с Fc-частью IgG, ассоциирована с общей γ-цепью, имеющей ITAM, ответственный за передачу внутриклеточного активирующего сигнала. Между тем, цитоплазматический домен FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотипы H131 и R131) и FcγRIIc содержит ITAM. Эти рецепторы экспрессируются на многих клетках, таких как макрофаги, тучные клетки и антигенпредставляющие клетки. Активирующий сигнал, передаваемый при связывании этих рецепторов с Fc-частью IgG, приводит к усилению фагоцитарной активности макрофагов, продукции воспалительных цитокинов, дегрануляции тучных клеток и усилению функции антигенпредставляющих клеток. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать активирующий сигнал, как описано выше, также называют активирующими Fcγ-рецепторами.

Между тем, внутрицитоплазматический домен FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) содержит ITIM, ответственный за передачу ингибиторных сигналов. Связывание между FcγRIIb и В-клеточным рецептором (BCR) на В-клетках подавляет активирующий сигнал из BCR, что приводит к подавлению продукции антитела через BCR. Связывание FcγRIII и FcγRIIb на макрофагах подавляет фагоцитарную активность и продукцию воспалительных цитокинов. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать ингибирующий сигнал, как описано выше, также называют ингибирующим Fcγ-рецептором.

Скрининг ALPHA проводят с помощью технологии ALPHA на основе принципа, описанного ниже, где используется два типа гранул: донорные и акцепторные. Люминесцентный сигнал выявляется только когда молекулы, связанные с донорными гранулами, биологически взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными гранулами, и эти два типа гранул находятся вблизи друг друга. Возбуждаемый лазерным пучком фотосенсибилизатор в донорных гранулах преобразует кислород вокруг гранулы в возбужденный синглетный кислород. Когда синглетный кислород распространяется среди донорных гранул и достигает акцепторных гранул, расположенных близко, в акцепторных гранулах индуцируется хемилюминесцентная реакция. Это в конечном итоге приводит к испусканию света. Когда молекулы, связанные с донорными гранулами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными гранулами, сиглетный кислород, продуцируемый донорными гранулами, не достигает акцепторных гранул и хемилюминесцентная реакция не происходит.

Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область, иммобилизуют на донорных гранулах, и Fcγ-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST) иммобилизуют на акцепторных гранулах. В отсутствие антигенсвязывающей молекулы, содержащей конкурирующий полипептидный вариант Fc-области, Fcγ-рецептор взаимодействует с полипептидным комплексом, содержащим Fc-область дикого типа, что приводит к индукции сигнала в области 520-620 нм. Антигенсвязывающая молекула, имеющая немеченый вариант Fc-области, конкурирует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативную Fc-область, для взаимодействия с Fcγ-рецептором. Относительную аффинность связывания можно определять путем количественного определения снижения флуоресценции в результате конкуренции. Способы биотинилирования антигенсвязывающих молекул, таких как антитела, с использованием сульфо-NHS-биотина и т.п., известны. Соответствующие способы добавления GST-метки к Fcγ-рецептору включают способы, которые вовлекают слияние полипептидов, кодирующих Feγ и GST в рамке считывания, экспрессию слитого гена с использованием клеток, в которые введен вектор, с которым ген функционально связан, а затем очистку с использованием колонки с глутатионом. Индуцированный сигнал предпочтительно можно анализировать, например, путем аппроксимации его к односторонней модели конкуренции на основе нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения, такого как GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).

Одно из веществ при наблюдении их взаимодействия иммобилизуют в качестве лиганда на тонкую золотую пленку на сенсорном чипе. Когда свет падает на заднюю поверхность сенсорного чипа, так чтобы общее отражение происходило на поверхности контакта между тонкой золотой пленкой и стеклом, интенсивность отраженного света частично снижается в определенной области (сигнал SPR). Другое из веществ при выявлении взаимодействия инжектируют в качестве анализируемого соединения на поверхность сенсорного чипа. Когда анализируемое соединение связывается с лигандом, масса иммобилизованной молекулы лиганда возрастает. Изменение индекса рефракции вызывает сдвиг положения сигнала SPR (с другой стороны, диссоциация вызывает сдвиг сигнала обратно в исходное положение). В системе Biacore величину сдвига, упомянутая выше (т.е. изменение массы на поверхности сенсорного чипа) наносят на график по вертикальной оси, и, таким образом, изменение массы с течением времени показывают в качестве данных измерения (сенсограмма). Параметры кинетики (константа скорости ассоциации (ka) и константу скорости диссоциации (kd)), определяют из кривых сенсограммы, и аффинность (KD) определяют из соотношения этих двух констант. В способе BIACORE, предпочтительно используют анализ ингибирования. Примеры такого анализа ингибирования описаны в Proc. Natl. Acad. Sci USA (2006) 103 (11): 4005-4010.

Гетерокомплекс, содержащий четыре элемента из: двух молекул FcRn и одной молекулы активирующего Fcγ-рецептора

Кристаллографические исследования FcRn и IgG-антител продемонстрировали, что комплекс FcRn-IgG состоит из одной молекулы IgG на две молекулы FcRn, и полагают, что эти две молекулы связываются вблизи поверхности контакта СН2- и СН3-доменов, расположенных с обеих сторон от Fc-области IgG (Burmeister et al. (Nature (1994) 372, 336-343)). Между тем, как показано в примере 3 ниже, было продемонстрировано, что Fc-область антитела способна образовывать комплекс, содержащий четыре элемента из: двух молекул FcRn и одной молекулы активирующего Fcγ-рецептора (фиг. 48). Образование этого гетерокомплекса является феноменом, который был выявлен в результате анализа свойств антигенсвязывающих молекул, содержащих Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН.

Без связи с конкретным принципом, можно считать, что вводимые in vivo антигенсвязывающие молекулы вызывают эффекты, описанные ниже, на фармакокинетику in vivo (удержание в плазме) антигенсвязывающих молекул и иммунный ответ (иммуногенность) на введенные антигенсвязывающие молекулы в результате образования гетерокомплексов, содержащих четыре элемента из: Fc-области, содержащейся в антигенсвязывающих молекулах, двух молекул FcRn и одной молекулы активирующего Fcγ-рецептора. Как описано выше, в дополнение к различным типам активирующего Fcγ-рецептора, FcRn экспрессируется на иммунных клетках и образование антигенсвязывающими молекулами таких комплексов из четырех частей на иммунных клетках указывает на то, что аффинность в отношении иммунных клеток возрастает, и что цитоплазматические домены собираются вместе, что приводит к амплификации сигнала интернализации и ускорению включения в иммунные клетки. То же самое также применимо к антигенпредставляющим клеткам, и предполагается возможность того, что образование комплексов из четырех частей на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток обеспечивает легкое включение антигенсвязывающих молекул в антигенпредставляющие клетки. Как правило, антигенсвязывающие молекулы, включенные в антигенпредставляющие клетки, деградируются в лизосомах антигенпредставляющих клеток и представляются Т-клеткам. В результате, поскольку включение антигенсвязывающих молекул в антигенпредставляющие клетки обеспечивается образованием описанных выше комплексов из четырех частей на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток, удержание в плазме антигенсвязывающих молекул может ухудшаться. Аналогично может индуцироваться (усиливаться) иммунный ответ.

По этой причине понятно, что, когда антигенсвязывающую молекулу, имеющую нарушенную способность образовывать такие комплексы из четырех частей, вводят в организм, удержание в плазме антигенсвязывающих молекул может повышаться и может подавляться индукция иммунного ответа в организме. Предпочтительные варианты осуществления таких антигенсвязывающих молекул, которые ингибируют образование этих комплексов на иммунных клетках, включая антигенпредставляющие клетки, включают три варианта осуществления, описанных ниже.

(Вариант осуществления 1) Антигенсвязывающая молекула, содержащая Fc-область, имеющую активность связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, и активность связывания которой в отношении активирующего FcγR является более низкой, чем активность связывания нативной Fc-области в отношении активирующего FcγR.

Антигенсвязывающая молекула согласно варианту осуществления 1 образует комплекс из трех частей путем связывания с двумя молекулами FcRn; однако она не образует никакого комплекса, содержащего активирующий FcγR (фиг. 49). Fc-область, активность связывания которой с активирующим FcγR является более низкой, чем активность связывания нативной Fc-области с активирующим FcγR, можно получать путем модификации аминокислот нативной Fc-области, как описано выше. То, является ли активность связывания модифицированной Fc-области с активирующим FcγR более низкой, чем активность связывания с активирующим FcγR нативной Fc-области, можно соответствующим образом исследовать с использованием способов, описанных в разделе "Активность связывания" выше.

Примеры предпочтительных активирующих Fcγ-рецепторов включают FcγRI (CD64), который включает FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRIIa (включая аллотипы R131 и Н131); и FcγRIII (CD16), который включает изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы VI58 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2).

Для условий рН для измерения активности связывания Fc-области и Fcγ-рецептора, содержащихся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, можно соответствующим образом использовать условия в диапазоне кислых значений рН или в диапазоне нейтральных значений рН. Диапазон нейтральных значений рН в качестве условий для измерения активности связывания Fc-области и Fcγ-рецептора, содержащихся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, как правило, обозначают как от рН 6,7 до рН 10,0. Предпочтительно, он представляет собой диапазон, обозначаемый с помощью произвольных величин рН от рН 7,0 до рН 8,0; и предпочтительно, он выбран из рН 7,0, рН 7,1, рН 7,2, рН 7,3, рН 7,4, рН 7,5, рН 7,6, рН 7,7, рН 7,8, рН 7,9 и рН 8,0; и особенно предпочтительно он представляет собой рН 7,4, что является близким к рН плазмы (крови) in vivo. В рамках настоящего изобретения диапазон кислых значений рН, в качестве условий наличия активности связывания Fc-области и Fcγ-рецептора, которой обладает антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, как правило, обозначают как от рН 4,0 до рН 6,5. Предпочтительно, его обозначают как от рН 5,5 до рН 6,5, и особенно предпочтительно его обозначают как от рН 5,8 до рН 6,0, что близко к рН в ранней эндосоме in vivo. Что касается температуры, используемой в качестве условий измерения, аффинность связывания между Fc-областью и Fcγ-рецептором человека можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Предпочтительно, для определения аффинности связывания между Fc-областью человека и Fcγ-рецептором используют температуру от 15°С до 40°С. Более предпочтительно, аналогично для определения аффинности связывания между Fc-областью и Fcγ-рецептором используют температуру от 20°С до 35°С, такую как любая температура из 20°С, 21°С, 22°С, 23°С, 24°С, 25°С, 26°С, 27°С, 28°С, 29°С, 30°С, 31°С, 32°С, 33°С, 34°С или 35°С. В одном варианте осуществления настоящего изобретения неограничивающим примером является температура, составляющая 25°С.

В рамках настоящего изобретения, "активность связывания варианта Fc-области с активирующим Fcγ-рецептором является более низкой, чем активность связывания нативной Fc-области с активирующим Fcγ-рецептором" означает, что активность связывания варианта Fc-области с любым из Fcγ-рецепторов человека из FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb является более низкой, чем активность связывания нативной Fc-области с этими Fcγ-рецепторами человека. Например, это означает, что, исходя из описанного выше способа анализа, активность связывания антигенсвязывающей молекулы, содержащей вариант Fc-области, составляет 95% или менее, предпочтительно 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее, особенно предпочтительно 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, или 1% или менее по сравнению с активностью связывания антигенсвязывающей молекулы, содержащей нативную Fc-область, в качестве контроля. В качестве нативной Fc-области можно использовать исходную Fc-область, и также можно использовать Fc-области антител дикого типа различных изотипов.

Между тем, активность связывания нативной формы с активирующим FcγR предпочтительно представляет собой активность связывания с Fcγ-рецептором для IgG1 человека. Для снижения активности связывания с Fcγ-рецептором, помимо проведения описанных выше модификаций, изотип также можно заменять на IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека. Альтернативно, помимо проведения описанных выше модификаций, активность связывания с Fcγ-рецептором также можно снижать путем экспрессии антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область, имеющую активность связывания с Fcγ-рецептором, в хозяевах, которые не добавляют цепи Сахаров, таких как Escherichia coli.

В качестве антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область, которую используют в качестве контроля, можно соответствующим образом использовать антигенсвязывающие молекулы, имеющие Fc-область моноклонального IgG-антитела. Структуры таких Fc-областей представлены в SEQ ID NO: 1 (А добавлен на N-конце последовательности с номером доступа RefSeq № ААС82527.1), SEQ ID NO: 2 (А добавлен на N-конце последовательности с номером доступа RefSeq № ААВ59393.1), SEQ ID NO: 3 (номер доступа RefSeq № САА27268.1), и SEQ ID NO: 4 (A добавлен на N-конце последовательности с номером доступа RefSeq № ААВ59394.1). Кроме того, когда антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область конкретного изотипа антитела используют в качестве исследуемого вещества, эффект активности связывания антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область, в отношении Fcγ-рецептора, исследуют с использованием в качестве контроля антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область моноклонального IgG-антитела этого конкретного изотипа. Таким образом, соответствующим образом выбирают антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область, для которой было продемонстрировано, что ее активность связывания с Fcγ-рецептора является высокой.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные примеры Fc-областей, активность связывания которых с активирующим FcγR является более низкой, чем активность связывания нативной Fc-области с активирующим FcγR, включают Fc-области, в которых одна или несколько аминокислот в любом из положений 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 и 329, как указано согласно нумерации EU, модифицированы в аминокислоты, которые отличаются от аминокислот нативной Fc-области, среди аминокислот описанной выше Fc-области. Модификации в Fc-области не ограничиваются описанным выше примером, и они могут представлять собой, например, модификации, такие как дегликозилирование (N297A и N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A и IgG4-L236E, описанные в Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; модификации, такие как G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R и N325LL328R, описанные WO 2008/092117; вставки аминокислот в положениях 233, 234, 235 и 237 согласно нумерации EU; и модификации в положениях, описанных в WO 2000/042072.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения примеры подходящей Fc-области включают Fc-области, имеющие одну или несколько из следующих модификаций, как указано согласно нумерации EU, в упомянутой выше Fc-области:

аминокислота в положении 234 представляет собой любую из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr или Trp;

аминокислота в положении 235 представляет собой любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val или Arg;

аминокислота в положении 236 представляет собой любую из Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro или Tyr;

аминокислота в положении 237 представляет собой любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr или Arg;

аминокислота в положении 238 представляет собой любую из Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp или Arg;

аминокислота в положении 239 представляет собой любую из Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr или Arg;

аминокислота в положении 265 представляет собой любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

аминокислота в положении 266 представляет собой любую из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 267 представляет собой любую из Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 269 представляет собой любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туг или Val;

аминокислота в положении 270 представляет собой любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

аминокислота в положении 271 представляет собой любую из Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 295 представляет собой любую из Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 296 представляет собой любую из Arg, Gly, Lys или Pro;

аминокислота в положении 297 представляет собой любую из Ala;

аминокислота в положении 298 представляет собой любую из Arg, Gly, Lys, Pro, Trp или Tyr;

аминокислота в положении 300 представляет собой любую из Arg, Lys или Pro;

аминокислота в положении 324 представляет собой любую из Lys или Pro;

аминокислота в положении 325 представляет собой любую из Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr или Val;

аминокислота в положении 327 представляет собой любую из Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

аминокислота в положении 328 представляет собой любую из Arg, Asn, Gly, His, Lys или Pro;

аминокислота в положении 329 представляет собой любую из Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val или Arg;

аминокислота в положении 330 представляет собой любую из Pro или Ser;

аминокислота в положении 331 представляет собой любую из Arg, Gly или Lys; или

аминокислота в положении 332 представляет собой любую из Arg, Lys или Pro.

(Вариант осуществления 2) Антигенсвязывающая молекула, содержащая Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, и активность связывания которой с ингибирующим FcγR превышает активность связывания с активирующим Fcγ-рецептором

Посредством связывания двух молекул FcRn и одной молекулы ингибиторного FcγR, антигенсвязывающая молекула согласно варианту осуществления 2 может образовывать комплекс, содержащий эти четыре элемента. Однако поскольку одна антигенсвязывающая молекула может связывать только одну молекулу FcγR, антигенсвязывающая молекула в состоянии, связанном с ингибирующим FcγR, не может связываться с другими активирующими FcγR (фиг. 50). Более того, было описано, что антигенсвязывающие молекулы, которые включены в клетки в состоянии, связанном с ингибирующим FcγR, рециклируют на клеточную мембрану, и, таким образом, ускользают от внутриклеточной деградации (Immunity (2005) 23, 503-514). Таким образом, полагают, что антигенсвязывающие молекулы, обладающие селективной активностью связывания с ингибирующим FcγR, не способны образовывать гетерокомплексы, содержащие активирующие FcγR и две молекулы FcRn, которые вызывают иммунный ответ.

Примеры предпочтительных активирующих Fcγ-рецепторов включают FcγRI (CD64) который включает FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRIIa (включая аллотипы R131 и Н131); и FcγRIII (CD16), который включает изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2). Между тем, примеры предпочтительных ингибирующих Fcγ-рецепторов включают FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2).

В рамках настоящего изобретения "активность связывания с ингибирующим FcγR является более высокой, чем активность связывания с активирующим Fcγ-рецептором" означает, что активность связывания варианта Fc-области с FcγRIIb является более высокой, чем активность связывания с любым из Fcγ-рецепторов человека: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb. Например, это означает, что, исходя из описанного выше способа анализа, активность связывания с FcγRIIb антигенсвязывающей молекулы, содержащей вариант Fc-области, составляет 105% или более, предпочтительно 110% или более, 120% или более, 130% или более, 140% или более, в частности предпочтительно 150% или более, 160% или более, 170% или более, 180% или более, 190% или более, 200% или более, 250% или более, 300% или более, 350% или более, 400% или более, 450% или более, 500% или более, 750% или более, 10 раз или более, 20 раз или более, 30 раз или более, 40 раз или более, 50 раз или более по сравнению с активностью связывания с любым из Fcγ-рецепторов человека из FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb.

Наиболее предпочтительно, активность связывания с FcγRIIb является более высокой, чем каждая из активностей связывания с FcγRIa, FcγRIIa (включая аллотипы R131 и H131) и FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158). FcγRIa демонстрирует заметно высокую аффинность в отношении нативного IgG1; таким образом, полагают, что связывание будет насыщенным in vivo вследствие присутствия большого количества эндогенного IgG1. По этой причине ингибирование образования комплекса может быть возможным, даже если активность связывания с FcγRIIb является более высокой, чем активность связывания с FcγRIIa и FcγRIIIa, и более низкой, чем активность связывания с FcγRIa.

В качестве антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область, которую используют в качестве контроля, можно соответствующим образом использовать антигенсвязывающие молекулы, имеющие Fc-область моноклонального IgG-антитела. Структуры таких Fc-областей представлены в SEQ ID NO: 11 (А добавлен на N-конец номера доступа RefSeq № ААС82527.1), SEQ ID NO: 12 (А добавлен на N-конец номера доступа RefSeq № ААВ59393.1), SEQ ID NO: 13 (номер доступа RefSeq № CAA27268.1) и SEQ ID NO: 14 (А добавлен на N-конец номера доступа RefSeq № ААВ59394.1). Кроме того, когда антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область конкретного изотипа антитела используют в качестве исследуемого вещества, эффект активности связывания антигенсвязывающей молекулы, содержащей эту Fc-область, с Fey-рецептором исследуют с использованием в качестве контроля антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область моноклонального IgG-антитела этого конкретного изотипа. Таким образом, соответствующим образом выбирают антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область, для которой было продемонстрировано, что ее активность связывания с Fcγ-рецептором является высокой.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные примеры Fc-областей, обладающих способностью селективного связывания с ингибирующим FcγR, включают Fc-области, в которых среди аминокислот описанной выше Fc-области, аминокислота в положении 328 или 329, как указано согласно нумерации EU, модифицирована в аминокислоту, которая отличается от аминокислоты нативной Fc-области. Более того, в качестве Fc-областей, обладающих активностью селективного связывания с ингибирующим Fcγ-рецептором, можно соответствующим образом выбирать Fc-области или модификации, описанные в US 2009/0136485.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительным примером является Fc-область, имеющая одну или несколько из следующих модификаций, как указано согласно нумерации EU, в упомянутой выше Fc-области: аминокислота в положении 238 представляет собой Asp; или аминокислота в положении 328 представляет собой Glu.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения примеры подходящей Fc-области включают Fc-области, имеющие одну или несколько из следующих модификаций:

замена Pro в положении 238 согласно нумерации EU на Asp, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Trp, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Phe, аминокислота в положении 267 согласно нумерации EU представляет собой Val, аминокислота в положении 267 согласно нумерации EU представляет собой Gln, аминокислота в положении 268 согласно нумерации EU представляет собой Asn, аминокислота в положении 271 согласно нумерации EU представляет собой Gly, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Leu, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Gln, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Glu, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Met, аминокислота в положении 239 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 267 согласно нумерации EU представляет собой Ala, аминокислота в положении 234 согласно нумерации EU представляет собой Trp, аминокислота в положении 234 согласно нумерации EU представляет собой Tyr, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Ala, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Glu, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Leu, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Met, аминокислота в положении 237 согласно нумерации EU представляет собой Tyr, аминокислота в положении 330 согласно нумерации EU представляет собой Lys, аминокислота в положении 330 согласно нумерации EU представляет собой Arg, аминокислота в положении 233 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 268 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 268 согласно нумерации EU представляет собой Glu, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Ser, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Thr, аминокислота в положении 323 согласно нумерации EU представляет собой Не, аминокислота в положении 323 согласно нумерации EU представляет собой Leu, аминокислота в положении 323 согласно нумерации EU представляет собой Met, аминокислота в положении 296 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Ala, аминокислота в положении 326 согласно нумерации EU представляет собой Asn, и аминокислота в положении 330 согласно нумерации EU представляет собой Met.

(Вариант осуществления 3) Антигенсвязывающая молекула, содержащая Fc-область, в которой один из двух полипептидов, образующих Fc-область, обладает активность связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, и другой не обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН.

Посредством связывания с одной молекулой FcRn и одной молекулой FcγR, антигенсвязывающая молекула согласно варианту осуществления 3 может образовывать комплекс из трех частей; однако она не образует какой-либо гетерокомплекс, содержащий четыре элемента из двух молекул FcRn и одной молекулы FcγR (фиг. 51). В качестве Fc-области, в которой один из двух полипептидов, образующих Fc-область, обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, а другой не обладает какой-либо активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле согласно варианту осуществления 3 можно соответствующим образом использовать Fc-области, происходящие из биспецифических антител. Биспецифические антитела представляют собой два типа антител, обладающих специфичностью к различным антигенам. Биспецифические антитела IgG-типа могут секретироваться из гибридных гибридом (квадром), полученных путем слияния двух типов гибридом, продуцирующих IgG-антитела (Milstein et al. (Nature (1983) 305, 537-540).

Когда антигенсвязывающую молекулу согласно варианту осуществления 3, описанному выше, получают с использованием способов рекомбинации, таких как способы, описанные в представленном выше разделе "Антитело", можно использовать способ, в котором гены, кодирующие полипептиды, которые составляют два типа представляющих интерес Fc-областей, вводят в клетки для коэкспрессии их. Однако полученные Fc-области будут представлять собой смесь, в которой следующие компоненты будут существовать в молекулярном соотношении 2:1:1: Fc-области, в которых один из двух полипептидов, образующих Fc-область, обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, а другой полипептид не обладает какой-либо активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН; Fc-области, в которых оба из двух полипептидов, образующих Fc-область, обладают активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН; и Fc-области, в которых оба из двух полипептидов, образующих Fc-область, не обладают какой-либо активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН. Трудно очистить антигенсвязывающие молекулы, содержащие желаемую комбинацию Fc-областей, из трех типов IgG.

При получении антигенсвязывающих молекул согласно варианту осуществления 3 с использованием таких рекомбинантных способов, антигенсвязывающие молекулы, содержащие гетеромерную комбинацию Fc-областей, можно предпочтительно секретировать путем добавления соответствующих аминокислотных замен в СН3-домены, составляющие Fc-области.

В частности, этот способ проводят путем замены аминокислотой, имеющей более крупную боковую цепь (выступ (что означает "выпуклая часть")) аминокислоты в СН3-домене одной из тяжелых цепей, и замены аминокислотой, имеющей меньшую боковую цепь (углубление (что означает "полость")) аминокислоты в СН3-домене другой тяжелой цепи, так чтобы выступ размещался в полости. Это обеспечивает образование гетеромерной Н-цепи и одновременно ингибирует образование гомомерной Н-цепи (WO 1996027011; Ridgway et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).

Более того, также существуют известные способы получения биспецифического антитела с использованием способов контроля ассоциации полипептидов или ассоциации образованных полипептидом гетеромерных мультимеров для ассоциации между двумя полипептидами, которые образуют Fc-область. В частности, способы контроля ассоциации полипептидов можно использовать для получения биспецифического антитела (WO 2006/106905), в котором аминокислотные остатки, образующие поверхность контакта между двумя полипептидами, которые образуют Fc-область, изменяют для ингибирования ассоциации между Fc-областями, имеющими ту же последовательность, и для обеспечения образования полипептидных комплексов, образованных двумя Fc-областями с различными последовательностями. Такие способы можно использовать для получения антигенсвязывающей молекулы согласно варианту осуществления 3 по настоящему изобретению.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения два полипептида, составляющих Fc-область, происходящие из биспецифического антитела, описанного выше, можно соответствующим образом использовать в качестве Fc-области. Более конкретно, можно соответствующим образом использовать два полипептида, составляющих Fc-область, в которых, в аминокислотной последовательности одного из полипептидов, аминокислота в положении 349, как указано согласно нумерации EU, представляет собой Cys и аминокислота в положении 366 представляет собой Trp, и в аминокислотной последовательности других полипептидов аминокислота в положении 356, как указано согласно нумерации EU, представляет собой Cys, аминокислота в положении 366 представляет собой Ser, аминокислота в положении 368 представляет собой Ala и аминокислота в положении 407 представляет собой Val.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве Fc-области можно соответствующим образом использовать два полипептида, составляющих Fc-область, в которых, в аминокислотной последовательности одного из полипептидов, аминокислота в положении 409 согласно нумерации EU представляет собой Asp, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 399 согласно нумерации EU представляет собой Lys. В описанном выше варианте осуществления аминокислота в положении 409 может представлять собой Glu вместо Asp, и аминокислота в положении 399 может представлять собой Arg вместо Lys. Более того, в дополнение к аминокислоте Lys в положении 399, Asp можно соответствующим образом добавлять в качестве аминокислоты в положении 360 или Asp можно соответствующим образом добавлять в качестве аминокислоты в положении 392.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве Fc-области можно соответствующим образом использовать два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 370 согласно нумерации EU представляет собой Glu, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 357 согласно нумерации EU представляет собой Lys.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве Fc-области можно соответствующим образом использовать два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 439 согласно нумерации EU представляет собой Glu, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 356 согласно нумерации EU представляет собой Lys.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве Fc-области можно соответствующим образом использовать любой из вариантов осуществления, указанных ниже, в которых вышеуказанное скомбинировано:

два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 409 согласно нумерации EU представляет собой Asp и аминокислота в положении 370 представляет собой Glu, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 399 согласно нумерации EU представляет собой Lys и аминокислота в положении 357 представляет собой Lys (в этом варианте осуществления аминокислота в положении 370 согласно нумерации EU может представлять собой Asp вместо Glu, и аминокислоту Asp в положении 392 согласно нумерации EU можно использовать вместо аминокислоты Glu в положении 370 согласно нумерации EU);

два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 409 согласно нумерации EU представляет собой Asp и аминокислота в положении 439 представляет собой Glu, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 399 согласно нумерации EU представляет собой Lys и аминокислота в положении 356 представляет собой Lys (в этом варианте осуществления аминокислоту Asp в положении 360 согласно нумерации EU, аминокислоту Asp в положении 392 согласно нумерации EU или аминокислоту Asp в положении 439 согласно нумерации EU можно использовать вместо аминокислоты Glu в положении 439 согласно нумерации EU);

два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 370 согласно нумерации EU представляет собой Glu и аминокислота в положении 439 представляет собой Glu, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 357 согласно нумерации EU представляет собой Lys и аминокислота в положении 356 представляет собой Lys; и

два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 409 согласно нумерации EU представляет собой Asp, аминокислота в положении 370 представляет собой Glu, и аминокислота в положении 439 представляет собой Glu, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов, аминокислота в положении 399 согласно нумерации EU представляет собой Lys, аминокислота в положении 357 представляет собой Lys, и аминокислота в положении 356 представляет собой Lys (в этом варианте осуществления аминокислота в положении 370 согласно нумерации EU может быть не заменена на Glu, и, более того, когда аминокислота в положении 370 не заменена на Glu, аминокислота в положении 439 может представлять собой Asp вместо Glu, или аминокислоту Asp в положении 392 можно использовать вместо аминокислоты Glu в положении 439).

Кроме того, в другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения также можно соответствующим образом использовать два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов, аминокислота в положении 356 согласно нумерации EU представляет собой Lys, и в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 435 согласно нумерации EU представляет собой Arg и аминокислота в положении 439 представляет собой Glu.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения можно соответствующим образом использовать два полипептида, составляющих Fc-область, в которых в аминокислотной последовательности одного из полипептидов аминокислота в положении 356 согласно нумерации EU представляет собой Lys и аминокислота в положении 357 представляет собой Lys, в аминокислотной последовательности другого из полипептидов аминокислота в положении 370 согласно нумерации EU представляет собой Glu, аминокислота в положении 435 представляет собой Arg, и аминокислота в положении 439 представляет собой Glu.

Ожидается, что эти антигенсвязывающие молекулы согласно вариантам осуществления 1-3 будут способны снижать иммуногенность и повышать удержание в плазме по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, способными образовывать комплексы из четырех частей.

Снижение иммунного ответа (снижение иммуногенности)

То, можно ли модифицировать иммунный ответ против антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, можно оценивать путем измерения ответной реакции в организме, в который ввели фармацевтическую композицию, содержащую антигенсвязывающую молекулу в качестве активного ингредиента. Ответные реакции организма включают, главным образом, два иммунных ответа: клеточный иммунитет (индукция цитотоксических Т-клеток, которые распознают пептидные фрагменты антигенсвязывающих молекул, связанные с МНС класса I) и гуморальный иммунитет (индукция продукции антител, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами). Что касается белковых фармацевтических средств в частности, продукцию антител против вводимых антигенсвязывающих молекул называют иммуногенностью. Существует два типа способов оценки иммуногенности: способы оценки продукции антител in vivo и способы оценки реакции иммунных клеток in vitro.

Иммунный ответ (иммуногенность) in vivo можно оценивать путем измерения титра антител после введения в организм антигенсвязывающих молекул. Например, титры антител измеряют после введения антигенсвязывающих молекул А и В мышам. Когда титр антител для антигенсвязывающей молекулы А превышает титр антител для антигенсвязывающей молекулы В, или когда после введения нескольким мышам, при введении антигенсвязывающей молекулы А встречаемость повышенного титра антител у мышей является более высокой, тогда считается, что А обладает более высокой иммунногенностью, чем В. Титры антител можно измерять с использованием способов определения молекул, которые специфично связываются с введенными молекулами с использованием ELISA, ECL или SPR, которые известны специалистам в данной области (J. Pharm. Biomed. Anal. (2011) 55 (5), 878-888).

Способы оценки иммунного ответа организма на антигенсвязывающие молекулы (иммуногенности) in vitro включают способы, состоящие в реакции in vitro мононуклеарных клеток периферической крови человека, выделенных из доноров (или их фракционированных клеток) с антигенсвязывающими молекулами и измерении количества клеток или процента хелперных Т-клеток и т.п., которые реагируют или пролиферируют, или количества продуцированных цитокинов (Clin. Immunol. (2010) 137 (1), 5-14; Drug R D. (2008) 9 (6), 385-396). Например, при оценке антигенсвязывающих молекул А и В с помощью таких тестов иммуногенности in vitro, когда ответ в случае антигенсвязывающей молекулы А превышает ответ в случае антигенсвязывающей молекулы В, или когда оценивают несколько доноров и показатель положительности реакции в случае антигенсвязывающей молекулы А является более высоким, тогда считают, что А обладает более высокой иммуногенностью, чем В.

Без связи с конкретной теорией, поскольку антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН могут образовывать тетрамерные гетерокомплексы, содержащие две молекулы FcRn и одну молекулу FcγR, на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток, полагают, что иммунный ответ легко индуцируется вследствие усиленного включения в антигенпредставляющие клетки. Существуют участки фосфорилирования во внутриклеточных доменах FcγR и FcRn. Как правило, фосфорилирование внутриклеточных доменов рецепторов, экспрессируемых на клеточной поверхности, происходит при сборке рецепторов, и их фосфорилирование вызывает интернализацию рецепторов. Сборка внутриклеточных доменов FcγR не происходит, даже если нативный IgG1 образует димерный комплекс FcγR/IgG1 на антигенпредставляющих клетках. Однако в случае, когда молекула IgG, имеющая активность связывания с FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, образует комплекс, содержащий четыре элемента FcγR/две молекулы FcRn/IgG, происходит сборка трех внутриклеточных доменов FcγR и FcRn, и возможно, что в результате индуцируется интернализация гетерокомплекса, содержащего четыре элемента из FcγR/две молекулы FcRn/IgG. Полагают, что гетерокомплексы, содержащие четыре элемента из FcγR/две молекулы FcRn/IgG, образуются на антигенпредставляющих клетках, коэкспрессирующих FcγR и FcRn, и возможно, что количество молекул антител, включенных в антигенпредставляющие клетки, тем самым увеличивается, что приводит к снижению иммуногенности. Полагают, что путем ингибирования описанного выше образования комплекса на антигенпредставляющих клетках с использованием любого из способов согласно вариантам осуществления 1, 2 или 3, выявленным в рамках настоящего изобретения, включение в антигенпредставляющие клетки может быть снижено и, следовательно, иммуногенность может быть увеличена.

Улучшение фармакокинетики

Без связи с конкретным принципом, причины того, почему количество антигенов, которые может связывать одна антигенсвязывающая молекула, увеличивается и почему ускоряется снижение концентрации антигена в плазме после обеспечения включения в клетки организма при введении в организм, например, антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область, обладающую активностью связывания с FcRn человека в условиях диапазона нейтральных значений рН, и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, так чтобы антигенсвязывающая активность в условиях диапазона кислых значений рН была более низкой, чем антигенсвязывающая активность в диапазоне нейтральных значений рН, могут быть объяснены, например, следующим образом.

Например, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, которое связывается с мембранным антигеном, антитело, введенное в организм, связывается с антигеном, а затем захватывается путем интернализации в эндосомы в клетках вместе с антигеном, в то время как антитело продолжает быть связанным с антигеном. Затем антитело переносится в лизосомы, в то время как антитело продолжает быть связанным с антигеном, и антитело деградируется лизосомой вместе с антигеном. Опосредуемая интернализацией элиминация из плазмы называется антиген-зависимой элиминацией, и такая элиминация описана для многочисленных молекул антител (Drug Discov Today (2006) 11(1-2): 81-88). Когда одна молекула IgG-антитела связывается с антигенами двухвалентным образом, одна молекула антитела интернализуется, антитело продолжает быть связанным с двумя молекулами антигена, и деградируется в лизосоме. Таким образом, в случае обычных антител, одна молекула IgG-антитела не может связываться с тремя или более молекулами антигена. Например, одна молекула IgG-антитела, имеющая нейтрализующую активность, не может нейтрализовать три или более молекулы антигена.

Относительно пролонгированное удержание (медленная элиминация) IgG-молекул в плазме является следствием функции FcRn человека, который известен как рецептор спасения для IgG-молекул. При захвате в эндосомы путем пиноцитоза, IgG-молекулы связываются с FcRn человека, экспрессированным в эндосомах, в кислых условиях эндосом. В то время как IgG-молекулы, которые не связались с FcRn человека, переносятся в лизосомы, где они деградируются, IgG-молекулы, которые связаны с FcRn человека, переносится на клеточную поверхность и вновь возвращаются в плазму путем диссоциации от FcRn человека в нейтральных условиях в плазме.

Альтернативно, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, которое связывается с растворимым антигеном, антитело, введенное в организм, связывается с антигеном, а затем захватывается в клетки, в то время как антитело продолжает быть связанным с антигеном.

Большинство антител, включенных в клетки, связываются с FcRn в эндосомах и транслоцируются на клеточную поверхность. Антитела диссоциируют от FcRn человека в нейтральных условиях плазмы и высвобождаются во внешнюю среду клеток. Однако антитела, обладающие обычными антигенсвязывающими доменами, антигенсвязывающая активность которых не изменяется, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, высвобождаются во внешнюю среду клеток, оставаясь связанными с антигенами; таким образом, они неспособны вновь связываться с антигенами. Таким образом, аналогично антителам, которые связываются с антигенами мембраны, одна обычная молекула IgG-антитела, антигенсвязывающая активность которой не изменяется, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, неспособна связываться с тремя молекулами антигена или более.

Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосомах (антитела, которые связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антитела, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосомах (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция) могут диссоциировать от антигенов в эндосомах. Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, или антитела, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, способны вновь связываться с антигенами после того, как они диссоциировали от антигенов, и рециклируют в плазму с помощью FcRn. Таким образом, одна молекула антитела может многократно связываться с несколькими молекулами антигенов. Между тем, антигены, связавшиеся с антигенсвязывающими молекулами, диссоциируют от антител в эндосомах и деградируют в лизосомах без рециклироания в плазму. Путем введения таких антигенсвязывающих молекул в организмы ускоряется включение антигенов в клетки и концентрация антигена в плазме может снижаться.

Включение в клетки антигенов, с которыми связываются антигенсвязывающие молекулы, далее ускоряется путем сообщения способности связывать FcRn человека в условиях диапазона нейтральных значений рН (рН 7,4) антителам, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосомах (антитела, которые связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антителам, которые связываются с антигеном зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосомах (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция). Таким образом, путем введения таких антигенсвязывающих молекул в организмы ускоряется элиминация антигена и можно снижать концентрацию антигенов в плазме. Обычные антитела, которые лишены способности связываться с антигенами рН-зависимым образом или способности связываться с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, а также их комплексы антиген-антитело, включаются в клетки путем неспецифического эндоцитоза, транспортируются на клеточную поверхность после связывания с FcRn в кислых условиях в эндосомах, и рециклируют в плазму после диссоциации от FcRn в нейтральных условиях на клеточной поверхности. По этой причине, когда антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом в достаточной степени (которое связывается в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциирует в условиях диапазона кислых значений рН), или антитело, которое связывается с антигеном зависимым от концентрации ионов кальция образом в достаточной степени (которое связывается в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциирует в условиях низкой концентрации ионов кальция) связывается с антигеном в плазме и диссоциирует в эндосомах от антигена, с которым оно связано, скорость элиминации антигена будет эквивалентна скорости включения в клетки посредством неспецифического эндоцитоза антитела или его комплекса антиген-антитело. Когда зависимость от рН или зависимость от концентрации ионов кальция при связывании между антителами и антигенами является достаточной, антигены, которые не диссоциировали от антител в эндосомах, будут рециклировать в плазму вместе с антителами. Однако, когда зависимость от рН или зависимость от концентрации ионов кальция является достаточной, скорость включения в клетки посредством неспецифического эндоцитоза будет скорость-ограничивающей для скорости элиминации антигена. Между тем, поскольку FcRn транспортирует антитела из эндосом на клеточную поверхность, полагают, что часть FcRn также присутствует на клеточной поверхности.

Как правило, иммуноглобулин IgG-типа, который является вариантом осуществления антигенсвязывающей молекулы, практически не проявляет активности связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Авторы настоящего изобретения сделали заключение, что иммуноглобулин IgG-типа, обладающий активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, может связываться с FcRn на клеточной поверхности и будет включаться в клетки FcRn-зависимым образом путем связывания с FcRn на клеточной поверхности. Скорость опосредуемого FcRn включения в клетки является более высокой, чем скорость включения в клетки посредством неспецифического эндоцитоза. Таким образом, авторы настоящего изобретения сделали заключение, что скорость элиминации антигена антигенсвязывающими молекулами можно далее увеличить путем сообщения способности связывать FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. В частности, антигенсвязывающие молекулы, обладающие способностью связывать FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, могут направлять антигены в клетки более быстро, чем нативные иммуноглобулины IgG-типа, высвобождать антигены в эндосомах, рециклировать вновь на поверхность клетки или в плазму, вновь связываться там с антигенами и вновь включаться в клетки через FcRn. Скорость этого цикла можно увеличить путем увеличения способности связывать FcRn в диапазоне нейтральных значений рН; таким образом, скорость элиминации антигенов из плазмы увеличивается. Более того, скорость элиминации антигена из плазмы можно далее увеличивать путем снижения антигенсвязывающей активности в диапазоне кислых значений рН антигенсвязывающей молекулы по сравнению с антигенсвязывающей активностью в диапазоне нейтральных значений рН. Кроме того, полагают, что количество молекул антигена, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула, увеличится вследствие увеличения количества циклов, что приводит к ускорению этого цикла. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению содержат антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен, и FcRn-связывающий домен не влияет на связывание антигена. Более того, ввиду механизма, описанного выше, они не зависят от типа антигенов. Таким образом, путем снижения антигенсвязывающей активности (способности связываться) антигенсвязывающей молекулы в условиях диапазона кислых значений рН или концентрации ионов, такой как низкая концентрация ионов кальция по сравнению с антигенсвязывающей активностью (активностью связывания) в условиях диапазона нейтральных значений рН или концентраций ионов, таких как высокая концентрация ионов кальция, и/или путем увеличения активности связывания FcRn при рН плазмы, может ускоряться включение в клетки антигенов посредством антигенсвязывающих молекул и может ускоряться элиминация антигена.

В настоящем описании "включение антигена в клетки" посредством антигенсвязывающих молекул означает, что антигены включаются в клетки посредством эндоцитоза. Более того, в настоящем описании "ускорять включение в клетки" указывает на то, что скорость включения в клетки антигенсвязывающих молекул, которые связываются с антигенами в плазме, увеличивается, и/или количество включенных антигенов, которые рециклировали в плазму, снижается. В этом случае, скорость включения в клетки антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, или антигенсвязывающей молекулы, которая обладает этой активностью связывания FcRn человека и антигенсвязывающая активность которой в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, должна увеличиваться по сравнению с антигенсвязывающей молекулой, которая не обладает активностью связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, или с антигенсвязывающей молекулой, антигенсвязывающая активность которой в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН. В другом варианте осуществления скорость включения в клетки антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению предпочтительно увеличивается по сравнению со скоростью в случае нативного IgG человека, и особенно предпочтительно она увеличивается по сравнению со скоростью в случае нативного IgG человека. Таким образом, в рамках настоящего изобретения то, ускоряется ли включение посредством антигенсвязывающих молекул антигенов в клетки, можно определять, исходя из того, увеличивается ли скорость включения антигена в клетки. Скорость включения антигенов в клетки можно измерять, например, путем добавления антигенсвязывающих молекул и антигенов в культуральную среду, содержащую клетки, экспресирующие FcRn человека, и измерения снижения с течением времени концентрации антигенов в среде, или путем измерения с течением времени количества антигенов, включенных в клетки, экспрессирующие FcRn человека. С использованием способов ускорения включения в клетки антигенов, опосредуемого антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению, например, путем введения антигенсвязывающих молекул, может увеличиваться скорость элиминации антигена из плазмы. Таким образом, то, увеличивается ли включение посредством антигенсвязывающих молекул антигенов в клетках, также можно оценивать, например, путем измерения того, увеличивается ли скорость элиминации антигенов, присутствующих в плазме, или измерения того, снижается ли общая концентрация антигена в плазме после введения антигенсвязывающих молекул.

В настоящем описании, "нативный IgG человека" относится к немодифицированному IgG человека и он не ограничивается конкретным подклассом IgG. Это означает, что IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека можно использовать в качестве "нативного IgG человека", при условии, что они способны связываться с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН. Предпочтительно, "нативный IgG человека" может представлять собой IgG1 человека.

В настоящем описании "способность элиминировать антигены из плазмы" относится к способности элиминировать антигены, присутствующие в плазме, из плазмы после введения in vivo антигенсвязывающих молекул или секреции in vivo антигенсвязывающих молекул. Таким образом, в настоящем описании "способность антигенсвязывающих молекул элиминировать антигены из плазмы увеличивается" означает, что, когда вводят антигенсвязывающие молекулы, активность антигенсвязывающих молекул в отношении связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН увеличивается, или что, в дополнение к этому увеличению активности связывания FcRn человека, скорость элиминации антигена из плазмы увеличивается по сравнению со скоростью элиминации антигена из плазмы до снижения антигенсвязывающей активности в диапазоне кислых значений рН по сравнению с антигенсвязывающей активностью в диапазоне нейтральных значений рН. То, увеличивается ли способность антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены из плазмы, можно оценивать, например, путем введения растворимых антигенов и антигенсвязывающей молекулы in vivo и измерения концентрации в плазме растворимых антигенов после введения. Если концентрация растворимых антигенов в плазме снижается после введения растворимых антигенов и антигенсвязывающих молекул после увеличения активности антигенсвязывающих молекул в отношении связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, или, в дополнение к увеличению этой активности связывания FcRn человека, после снижения антигенсвязывающей активности в диапазоне кислых значений рН по сравнению с антигенсвязывающей активностью в диапазоне нейтральных значений рН, тогда способность антигенсвязывающих молекул элиминировать антигены в плазме считается увеличенной. Растворимый антиген может представлять собой антиген, который связывается с антигенсвязывающей молекулой, или антиген, который не связывается с антигенсвязывающей молекулой, и его концентрацию можно определять в качестве "концентрации в плазме антигена, связанного с антигенсвязывающими молекулами" или в качестве "концентрации в плазме антигена, который не связан с антигенсвязывающими молекулами", соответственно (последний является синонимом "концентрации свободного антигена в плазме"). "Общая концентрация антигена в плазме" означает сумму концентрации антигена, связанного или не связанного антигенсвязывающей молекулой, или "концентрацию свободного антигена в плазме", которая представляет собой концентрацию антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой. Таким образом, концентрацию растворимого антигена можно определять как "общую концентрацию антигена в плазме".

Различные способы измерения "общей концентрации антигена в плазме" или "свободной концентрации антигена в плазме" хорошо известны в данной области, как описано в настоящем описании далее.

В настоящем описании "усиление фармакокинетики", "улучшение фармакокинетики" и "превосходящая фармакокинетика" можно переформулировать как "усиление удержание в плазме (крови)", "улучшение удержания в плазме (крови)", "превосходящее удержание в плазме (крови)", и "пролонгированное удержание в плазме (крови)". Эти термины являются синонимами.

В настоящем описании "улучшение фармакокинетики" означает не только пролонгирование периода времени до элиминации из плазмы (например, пока антигенсвязывающая молекула не деградирует внутреклеточно и т.п. и может вернуться в плазму) после введения антигенсвязывающей молекулы человеку или не являющимся человеком животным, таким как мыши, крысы, обезьяны, кролики и собаки, но также пролонгирование удержания в плазме антигенсвязывающих молекул в форме, которая обеспечивает связывание антигена (например, в свободной от антигена форме антигенсвязывающей молекулы) в ходе периода введения до элиминации вследствие деградации. IgG человека, имеющий Fc-область дикого типа, может связываться с FcRn из не являющихся человеком животных. Например, мышь можно предпочтительно использовать для введения в целях подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы по изобретению, поскольку IgG человека, имеющий Fc дикого типа, может связываться с FcRn мыши прочнее, чем с FcRn человека (Int Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). В качестве другого примера, также для введения в целях подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы по изобретению, описанного далее, предпочтительно можно использовать мышь, у которой ее нативные гены FcRn разрушены и содержится трансген для гена FcRn человека (Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104). В частности, "улучшение фармакокинетики" также включает пролонгирование периода времени до элиминации вследствие деградации антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигенами (свободная от антигена форма антигенсвязывающей молекулы). Антигенсвязывающая молекула в плазме не может связываться с новым антигеном, если антигенсвязывающая молекула уже связана с антигеном. Таким образом, чем более длительным является период времени, когда антигенсвязывающая молекула не связана с антигеном, тем более длительным является период времени, когда она может связываться с новым антигеном (более высокая вероятность связывания с другим антигеном). Это обеспечивает уменьшение периода времени, когда антиген свободен от антигенсвязывающей молекулы in vivo, и продление периода времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой. Концентрация в плазме свободной от антигена формы антигенсвязывающей молекулы может увеличиваться и период времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, может продлеваться путем ускорения элиминации антигена из плазмы посредством введения антигенсвязывающей молекулы. В частности, в настоящем описании "улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы" включает улучшение фармакокинетического параметра свободной от антигена формы антигенсвязывающей молекулы (любое из продления времени полужизни в плазме, продления среднего времени удержания в плазме и снижения клиренса из плазмы), продление периода времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы, и ускорение опосредуемой антигенсвязывающей молекулой элиминации из плазмы. Улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы можно оценивать путем определения любого из параметров: время полужизни в плазме, среднее время удержания в плазме и клиренс из плазмы, для антигенсвязывающей молекулы или ее свободной от антигена формы ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Например, концентрацию в плазме антигенсвязывающей молекулы или ее свободной от антигена формы определяют после введения антигенсвязывающей молекулы мышам, крысам, обезьянам, кроликам, собакам или человеку. Затем, определяют каждый параметр. Когда время полужизни в плазме или среднее время удержания в плазме пролонгируются, можно считать, что фармакокинктика антигенсвязывающей молекулы в плазме повышается. Параметры можно определять способами, известными специалистам в данной области. Параметры можно оценивать соответствующим образом, например, с помощью некомпартментного анализа с использованием программного обеспечения для фармакокинетического анализа WinNonlin (Pharsight) в соответствии с инструкцией по применению. Концентрацию в плазме свободной от антигена антигенсвязывающей молекулы можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием способа анализа, описанного в Clin Pharmacol. 2008 Apr; 48(4): 406-417.

В рамках настоящего изобретения "улучшение фармакокинетики" также включает пролонгирование периода, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы. Оценку того, пролонгируется ли период, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой после введения антигенсвязывающей молекулы, можно проводить путем определения концентрации в плазме свободного антигена. Заключение о пролонгировании можно делать, исходя из определенной концентрации в плазме свободного антигена или периода времени, требуемого для увеличения соотношения концентрации свободного антигена и концентрации общего антигена.

Концентрацию свободного антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой, или соотношение концентрации свободного антигена и концентрации общего антигена можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, способом, используемым в Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103. Альтернативно, когда антиген проявляет конкретную функцию in vivo, оценку того, связан ли антиген с антигенсвязывающей молекулой, которая нейтрализует функцию антигена (антагонистическая молекула), можно проводить путем исследования того, нейтрализуется ли функция антигена. Оценку того, нейтрализуется ли функция антигена, можно проводить путем анализа маркера in vivo, который отражает функцию антигена. Оценку того, связан ли антиген с антигенсвязывающей молекулой, которая активирует функцию антигена (молекула-агонист), можно проводить путем анализа маркера in vivo, который отражает функцию антигена.

Определение концентрации в плазме свободного антигена и соотношения количества свободного антигена в плазме и количества общего антигена в плазме, анализ маркеров in vivo и сходные способы определения конкретно не ограничены; однако анализы предпочтительно проводят после того, как проходит определенный период времени после введения антигенсвязывающей молекулы. В рамках настоящего изобретения период после введения антигенсвязывающей молекулы конкретно не ограничен; специалисты в данной области могут определить соответствующий период, в зависимости от свойств и т.п. вводимой антигенсвязывающей молекулы. Такие периоды включают, например, одни сутки после введения антигенсвязывающей молекулы, трое суток после введения антигенсвязывающей молекулы, семь суток после введения антигенсвязывающей молекулы, 14 суток после введения антигенсвязывающей молекулы и 28 суток после введения антигенсвязывающей молекулы. В настоящем описании понятие "концентрация антигена в плазме" включает как "общую концентрацию антигена в плазме", которая представляет собой сумму концентрации антигена, связанного и не связанного антигенсвязывающей молекулой, так и "концентрацию свободного антигена в плазме", которая представляет собой концентрацию антигена, не связанного антигенсвязывающей молекулой.

Путем введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению общую концентрацию антигена в плазме можно снижать в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или даже больше по сравнению с введением эталонной антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область IgG дикого типа в качестве эталонной антигенсвязывающей молекулы или по сравнению с тем, когда молекулу с антигенсвязывающим доменом по настоящему изобретению не вводят.

Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно вычислять, как показано ниже;

величина А: Молярная концентрация антигена в каждый момент времени

величина В: Молярная концентрация антигенсвязывающей молекулы в каждый момент времени

величина С: Молярная концентрация антигена на молярную концентрацию антигенсвязывающей молекулы (молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула) в каждый момент времени

С=А/В.

Меньшая величина С указывает на более высокую эффективность элиминации антигена на антигенсвязывающую молекулу, в то время как более высокая величина С указывает на более низкую эффективность элиминации антигена на антигенсвязывающую молекулу.

Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно вычислять, как описано выше.

Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно снижать путем введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению в 2 раз, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или даже выше по сравнению с введением эталонной антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область IgG человека дикого типа в качестве связывающего FcRn человека домена.

В настоящем описании IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека дикого типа предпочтительно используют в качестве IgG человека дикого типа, чтобы сравнивать с антигенсвязывающими молекулами в отношении их активности связывания FcRn человека или активности связывания in vivo. Предпочтительно, можно соответствующим образом использовать эталонную антигенсвязывающую молекулу, содержащую тот же антигенсвязывающий домен, что и представляющая интерес антигенсвязывающая молекула, и Fc-область IgG человека дикого типа в качестве FcRn-связывающего домена человека. Более предпочтительно, неизмененный IgG1 человека используют в качестве эталонного IgG человека дикого типа, чтобы сравнивать с антигенсвязывающими молекулами в отношении их активности связывания FcRn человека или активности in vivo.

Снижение общей концентрации в плазме или молярного соотношения антиген/антитело можно оценивать, как описано в примерах 4, 5 и 12. Более конкретно, с использованием трансгенной линии мышей с FcRn человека 32 или 276 (Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104), их можно оценивать либо с помощью модели совместной инъекции антиген-антитело, либо стационарной инфузионной модели, когда антигенсвязывающая молекула не реагирует перекрестно с антигеном-аналогом мыши. Когда антигенсвязывающая молекула перекрестно реагирует с аналогом мыши, их можно оценивать путем простой инъекции антигенсвязывающей молекулы мышам линии трансгенных мышей с FcRn человека 32 или 276 (Jackson Laboratories). В модели совместной инъекции мыши вводят смесь антигенсвязывающей молекулы и антигена. В стационарной инфузионной модели, мыши имплантируют инфузионный насос, содержащий раствор антигена, для достижения постоянной концентрации антигена в плазме, а затем мыши инъецируют антигенсвязывающую молекулу. Исследуемую антигенсвязывающую молекулу вводят в той же дозировке. Общую концентрацию антигена в плазме, концентрацию свободного антигена в плазме и концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме измеряют в соответствующий момент времени с использованием способа, известного специалистам в данной области.

Концентрацию общего или свободного антигена в плазме и молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно измерять через 2, 4, 7, 14, 28, 56 или 84 суток после введения для оценки долговременного эффекта настоящего изобретения. Иными словами, долговременную концентрацию антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 2, 4, 7, 14, 28, 56 или 84 суток после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойства антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению. То, достигается ли с помощью антигенсвязывающей молекулы, описанной в рамках настоящего изобретения, снижение концентрации антигена в плазме или молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула, можно определять путем оценки снижения в любой один или несколько из моментов времени, описанных выше.

Концентрацию общего или свободного антигена в плазме и молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно измерять через 15 мин, 1, 2, 4, 8, 12 или 24 часов после введения для оценки кратковременного эффекта настоящего изобретения. Иными словами, кратковременную концентрацию антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 15 мин, 1, 2, 4, 8, 12 или 24 часов после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойства антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению.

Путь введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно выбирать из внутрикожной, внутривенной, проводимой в стекловидное тело, подкожной, внутрибрюшинной, парентеральной и внутримышечной инъекции.

В рамках настоящего изобретение улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы у человека является предпочтительным. Когда удержание в плазме у человека трудно определить, его можно предсказать, исходя из удержания в плазме у мышей (например, здоровых мышей, трансгенных мышей, экспрессирующих антиген человека, трансгенных мышей, экспрессирующих FcRn человека) или обезьян (например, яванские макаки).

В настоящем описании "улучшение фармакокинетики и пролонгированное удержание в плазме антигенсвязывающих молекул" означает улучшение любого параметра фармакокинетики (любой из пролонгирования вревмени полужизни в плазме, пролонгирования среднего удержания в плазме, снижения клиренса из плазмы и биодоступности) после введения in vivo антигенсвязывающей молекулы, или увеличение концентрации антигенсвязывающей молекулы в плазме за соответствующий период времени после введения. Его можно определять путем измерения любого параметра, такого как время полужизни в плазме, среднее время удержание в плазме, клиренс из плазмы и биодоступность антигенсвязывающей молекулы (Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice), (Nanzando)). Например, когда

антигенсвязывающую молекулу вводят мышам (нормальным мышам и трансгенным мышам с FcRn человека), крысам, обезьянам, кроликам, собакам, человеку и т.д., и концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме определяют и каждый из параметров вычисляют, можно считать, что фармакокинетика антигенсвязывающей молекулы улучшается, когда время полужизни в плазме и среднее время удержания в плазме пролонгируются. Эти параметры можно определять способами, известными специалистам в данной области. Например, параметры можно соответствующим образом оценивать с помощью некомпартментного анализа с использованием программного обеспечения для анализа фармакокинетики WinNonlin (Pharsight) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Без связи с конкретной теорией, поскольку антигенсвязывающая молекула, которая обладает активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, может образовывать тетрамерный комплекс, содержащий две молекулы FcRn и одну молекулу FcγR на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток, включение в антигенпредставляющие клетки ускоряется, и, таким образом, полагают, что время удержания в плазме снижается и фармакокинетика ухудшается. В цитоплазматических доменах FcγR и FcRn имеются участки фосфорилирования. Как правило, фосфорилирование цитоплазматического домена экспрессируемого на клеточной поверхности рецептора происходит при сборке рецепторов, и фосфорилирование индуцирует интернализацию рецептора. Даже если нативный IgG1 образует димерный комплекс FcγR/IgG1 на антигенпредставляющих клетках, сборка цитоплазматических доменов FcγR не происходит. Однако, когда молекула IgG, обладающая активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, образует гетеромерный тетрамерный комплекс, содержащий FcγR/две молекулы FcRn/IgG, будут собираться три цитоплазматических домена FcγR и FcRn, и, тем самым, может индуцироваться интернализация гетеромерного тетрамерного комплекса, содержащего FcγR/две молекулы FcRn/IgG. Полагают, что образование гетеромерных тетрамерных комплексов, содержащих FcγR/две молекулы FcRn/IgG, происходит на антигенпредставляющих клетках, коэкспрессирующих FcγR и FcRn, и, следовательно, количество молекул антител, включенных в антигенпредставляющие клетки, может увеличиваться, и в результате фармакокинетика может ухудшаться. Таким образом, путем ингибирования образования описанного выше комплекса на антигенпредставляющих клетках с использованием любого из способов согласно вариантам осуществления 1, 2 и 3, выявленных в рамках настоящего изобретения, может быть снижено включение в антигенпредставляющие клетки, и в результате фармакокинетика может быть улучшена.

Способ получения антигенсвязывающих молекул, активность связывания которых варьирует в зависимости от условий концентрации ионов

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения после выделения полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, активность связывания которого изменяется в зависимости от условий, выбранных как описано выше, полинуклеотид встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор. Например, когда антигенсвязывающий домен представляет собой вариабельную область антитела, после получения кДНК, кодирующей вариабельную область, кДНК расщепляют ферментами рестрикции, которые распознают участки рестрикции, встроенные на обоих концах кДНК. Предпочтительно, ферменты рестрикции распознают и расщепляют нуклеотидную последовательность, которая встречается с низкой частотой в нуклеотидной последовательности, составляющей ген антигенсвязывающей молекулы. Более того, предпочтительно встраивают ферменты рестрикции, которые обеспечивают липкие концы, чтобы встроить единичную копию расщепленного фрагмента в вектор в правильной ориентации. кДНК, кодирующую вариабельную область антигенсвязывающей молекулы, расщепленную как описано выше, встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор с получением экспрессирующего вектора для антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению. В это время ген, кодирующий константную область (С-область) антитела, можно подвергать слиянию в рамке считывания с геном, кодирующим вариабельную область.

Для получения представляющей интерес антигенсвязывающей молекулы, полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу, встраивают так, чтобы он был функционально связан с регуляторной последовательностью, в экспрессирующий вектор. Регуляторные последовательности включают, например, энхансеры и промоторы. Более того, с N-концом может быть связана соответствующая сигнальная последовательность, чтобы экспрессированная антигенсвязывающая молекула секретировалось во внешнюю среду клеток. В качестве сигнальной последовательности используют, например, пептид, имеющий аминокислотную последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3); однако также можно присоединять другие соответствующие сигнальные последовательности. Экспрессированный полипептид расщепляется на С-конце описанной выше последовательности, и расщепленный полипептид секретируется в качестве зрелого полипептида во внешнюю среду клеток. Затем соответствующие клетки-хозяева трансформируют этим экспрессирующим вектором так, чтобы можно было получить рекомбинантные клетки, экспрессирующие полинуклеотид, кодирующий представляющую интерес антигенсвязывающую молекулу. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению можно получать из рекомбинантных клеток посредством способов, описанных выше в разделе об антителах.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения после выделения полинуклеотида, кодирующего описанную выше антигенсвязывающую молекулу, активность связывания которой варьирует, в зависимости от выбранных условий, вариант полинуклеотида встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор. Такие варианты предпочтительно включают варианты, полученные путем гуманизации, на основе полинуклеотидной последовательности, кодирующей антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, полученную путем скрининга в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области сконструированной синтетической библиотеки или иммунной библиотеки, происходящей из не являющихся человеком животных. Те же способы, которые описаны выше для получения описанных выше гуманизированных антител, можно использовать в качестве способа получения гуманизированных вариантов антигенсвязывающей молекулы.

В другом варианте осуществления такие варианты предпочтительно включают варианты, полученные путем внесения изменения, которое увеличивает аффинность к антигену (созревание аффинности) антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, в выделенную полинуклеотидную последовательность для молекулы, полученной путем скрининга с использованием синтетической библиотеки или наивной библиотеки в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области. Такие варианты можно получать различными известными способами созревания аффинности, включая мутагенез CDR (Yang et al. (J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)), шаффлинг цепей (Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), использование мутантных штаммов E. coli (Low et al. (J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368)), шаффлинг ДНК (Patten et al. (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), фаговый дисплей (Thompson et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)) и половую ПЦР (Clameri et al. (Nature (1998) 391, 288-291)).

Как описано выше, антигенсвязывающие молекулы, которые получают способами получения по настоящему изобретению, включают антигенсвязывающие молекулы, имеющие Fc-область. В качестве Fc-областей можно использовать различные варианты. В одном варианте осуществления варианты по настоящему изобретению предпочтительно включают полинуклеотиды, кодирующие антигенсвязывающие молекулы, имеющие тяжелую цепь, в которой полинуклеотид, кодирующий вариант Fc-области, как описано выше, связан в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим описанную выше антигенсвязывающую молекулу, активность связывания которой варьирует в зависимости от выбранных условий.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения Fc-области предпочтительно включают, например, константные области Fc антител, таких как IgG1 SEQ ID NO: 11 (Ala добавлен на N-конец ААС82527.1), IgG2 SEQ ID NO: 12 (Ala добавлен на N-конец AAB59393.1), IgG3 SEQ ID NO: 13 (CAA27268.1) и IgG4 SEQ ID NO: 14 (Ala добавлен на N-конец AAB59394.1). Время удержания молекул IgG в плазме является относительно длительным (элиминация из плазмы является медленной), поскольку FcRn, в частности FcRn человека, функционирует в качестве рецептора спасения для молекул IgG. Молекулы IgG, включенные в эндосомы путем пиноцитоза, связываются в кислых условиях эндосом с FcRn, в частности с FcRn человека, экспрессируемым в эндосомах. Молекулы IgG, которые не могут связываться с FcRn, в частности FcRn человека, переносятся в лизосомы и деградируются в них. Между тем, молекулы IgG, связанные в FcRn, в частности FcRn человека, переносятся на клеточную поверхность, а затем возвращаются в плазму в результате диссоциации от FcRn, в частности FcRn человека, в нейтральных условиях в плазме.

Поскольку антитела, содержащие типичную Fc-область, не обладают активностью связывания с FcRn, в частности с FcRn человека, в условиях диапазона нейтральных значений рН, типичные антитела и комплексы антитело-антиген включаются в клетки посредством неспецифического эндоцитоза и переносятся на клеточную поверхность путем связывания с FcRn, в частности FcRn человека, в условиях диапазона эндосомальных кислых значений рН. FcRn, в частности FcRn человека, транспортирует антитела из эндосомы на клеточную поверхность. Таким образом, полагают, что некоторые из FcRn, в частности FcRn человека, также присутствуют на клеточной поверхности. Однако антитела рециклируют в плазму, поскольку они диссоциируют от FcRn, в частности FcRn человека, в условиях диапазона нейтральных значений рН на поверхности клетки.

Fc-области, обладающие активностью связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, которые включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, можно получать любым способом. В частности, Fc-области, обладающие активностью связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, можно получать путем изменения аминокислот иммуноглобулина человека IgG-типа в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области иммуноглобулина человека IgG-типа включают, например, Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и их вариантов). Аминокислоты в любых положениях можно изменять на другие аминокислоты, при условии, что полученные области обладают активностью связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН или увеличенной активностью связывания FcRn человека в нейтральном диапазоне. Когда антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области человека, предпочтительно, чтобы полученная область содержала изменение, которое приводит к эффекту усиления связывания FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Аминокислоты, которые допускают такие изменения, включают, например, аминокислоты в положениях 221-225, 227, 228, 230, 232, 233-241, 243-252, 254-260, 262-272, 274, 276, 278-289, 291-312, 315-320, 324, 325, 327-339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375-378, 380, 382, 385-387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426-438, 440 и 442 (указанные согласно нумерации EU). Более конкретно, такие изменения аминокислот включают изменения, приведенные в таблице 5. Изменение этих аминокислот усиливает связывание с FcRn человека Fc-области иммуноглобулина IgG-типа в диапазоне нейтральных значений рН.

Среди описанных выше, для применения в рамках настоящего изобретения выбирают подходящие изменения, которые усиливают связывание FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН. Особенно предпочтительные аминокислоты для таких вариантов Fc-области включают, например, аминокислоты в положениях 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 (указанные согласно нумерации EU). Активность связывания FcRn человека Fc-области, включенной в антигенсвязывающую молекулу, можно увеличивать в диапазоне нейтральных значений рН путем замены по меньшей мере одной аминокислоты другой аминокислотой.

Особенно предпочтительные изменения в Fc-области включают, например, замены:

Met вместо аминокислоты в положении 237;

Ile вместо аминокислоты в положении 248;

Ala, Phe, Не, Met, Gin, Ser, Val, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 250;

Phe, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 252;

Thr вместо аминокислоты в положении 254;

Glu вместо аминокислоты в положении 255;

Asp, Asn, Glu или Gln вместо аминокислоты в положении 256;

Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val вместо аминокислоты в положении 257;

His вместо аминокислоты в положении 258;

Ala вместо аминокислоты в положении 265;

Ala или Glu вместо аминокислоты в положении 286;

His вместо аминокислоты в положении 289;

Ala вместо аминокислоты в положении 297;

Ala вместо аминокислоты в положении 303;

Ala вместо аминокислоты в положении 305;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 307;

Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr вместо аминокислоты в положении 308;

Ala, Asp, Glu, Pro или Arg вместо аминокислоты в положении 309;

Ala, His или Ile вместо аминокислоты в положении 311;

Ala или His вместо аминокислоты в положении 312;

Lys или Arg вместо аминокислоты в положении 314;

Ala, Asp или His вместо аминокислоты в положении 315;

Ala вместо аминокислоты в положении 317;

Val вместо аминокислоты в положении 332;

Leu вместо аминокислоты в положении 334;

His вместо аминокислоты в положении 360;

Ala вместо аминокислоты в положении 376;

Ala вместо аминокислоты в положении 380;

Ala вместо аминокислоты в положении 382;

Ala вместо аминокислоты в положении 384;

Asp или His вместо аминокислоты в положении 385;

Pro вместо аминокислоты а в положении 386;

Glu for вместо аминокислоты в положении 387;

Ala или Ser вместо аминокислоты в положении 389;

Ala вместо аминокислоты в положении 424;

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 428;

Lys вместо аминокислоты в положении 433;

Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr вместо аминокислоты в положении 434; и

His, Ile, Leu, Phe, Thr или Val вместо аминокислоты в положении 436 в системе нумерации EU. Между тем, количество измененных аминокислот конкретно не ограничено; такие аминокислотные изменения включают единичное изменение аминокислоты и изменение аминокислот в двух или более участках. Комбинации изменений аминокислот в двух или более участках включают, например, комбинации изменений, описанные в таблице б.

Настоящее изобретение не ограничивается конкретной теорией, а обеспечивает способы получения антигенсвязывающих молекул, которые включают не только описанное выше изменение, но также изменение Fc-области, так чтобы не образовывался тетрамерный гетерокомплекс, состоящий из Fc-области, включенной в антигенсвязывающую молекулу, двух молекул FcRn и активирующего Fcγ-рецептора. Предпочтительные варианты осуществления таких антигенсвязывающих молекул включают три варианта осуществления, описанных ниже.

(Вариант осуществления 1) Антигенсвязывающие молекулы, которые содержат Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН и активность связывания которых с активирующими FcγR является более низкой, чем у нативной Fc-области

Антигенсвязывающие молекулы согласно варианту осуществления 1 образуют тримерные комплексы посредством связывания с двумя молекулами FcRn; однако они не образуют комплекса, включающего активирующий FcγR (фиг. 49). Fc-области, активность связывания которых с активирующим FcγR является более низкой, чем у нативной Fc-области, можно получать путем изменения аминокислот нативной Fc-области, как описано выше. То, является ли активность связывания измененной Fc-области с активирующим FcγR более низкой, чем у нативной Fc-области, можно соответствующим образом исследовать с использованием способов, описанных в разделе "Активность связывания" выше.

В рамках настоящего изобретения то, что активность связывания измененной Fc-области с активирующим Fcγ-рецептором является более низкой, чем у нативной Fc-области, означает, что активность связывания измененной Fc-области с любым из Fcγ-рецепторов человека: FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb, является более низкой, чем у нативной Fc-области, и, например, означает, что при сравнении на основе описанного выше аналитического способа, активность связывания антигенсвязывающей молекулы, обладающей вариантом Fc-области, составляет 95% или менее, предпочтительно 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее, в частности предпочтительно 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, 1% или менее по сравнению с активностью связывания контрольной антигенсвязывающей молекулы, имеющей нативную Fc-область. Такие нативные Fc-области включают исходную Fc-область и Fc-области из антител дикого типа различных изотипов.

Походящие антигенсвязывающие молекулы, обладающие Fc-областью в качестве контроля, включают антигенсвязывающие молекулы, обладающие Fc-областью из моноклонального IgG-антитела. Структуры таких Fc-областей представлены в SEQ ID NO: 11 (А добавлен к N-концу последовательности с номером доступа RefSeq №ААС 82527.1), 12 (А добавлен к N-концу последовательности с номером доступа RefSeq №ААВ 59393.1), 13 (номер доступа RefSeq №САА27268.1) и 14 (А добавлен к N-концу последовательности с номером доступа RefSeq №ААВ 59394.1). Между тем, когда антигенсвязывающую молекулу, которая имеет Fc-область из антитела определенного изотипа, используют в качестве исследуемого вещества, активность антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область, в отношении связывания Fcγ-рецептора можно исследовать с использованием в качестве контроля антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область из моноклонального IgG-антитела того же изотипа. Необходимо выбирать антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область, для которой было продемонстрировано, что ее активность связывания Fcγ-рецептора является высокой, как описано выше.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные Fc-области, активность связывания которых с активирующим FcγR является более низкой, чем у нативной Fc-области, включают, например, Fc-области, в которых одна или несколько аминокислот в положениях 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 и 329 (указанных согласно нумерации EU) среди аминокислот описанной выше Fc-области заменены другими аминокислотами нативной Fc-области. Такие изменения Fc-области не ограничиваются описанными выше изменениями и включают, например, изменения, такие как дегликоизированные цепи (N297A и N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A и IgG4-L236E, описанные в Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; изменения, такие как G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R и N325LL328R, описанные в WO 2008/0 92117; аминокислотные инсерции в положениях 233, 234, 235 и 237 (указанных согласно нумерации EU); и изменения в участках, описанных в WO 2000/042072.

Более того, в неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные Fc-области включают Fc-области, измененные так, чтобы они имели одно или несколько изменений из:

замены на Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr или Trp аминокислоты в положении 234;

замены на Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val или Arg аминокислоты в положении 235;

замены на Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro или Tyr аминокислоты в положении 236;

замены на Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr или Arg аминокислоты в положении 237;

замены на Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp или Arg аминокислоты в положении 238;

замены на Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr или Arg аминокислоты в положении 239;

замены на Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val аминокислоты в положении 265;

замены на Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp или Tyr аминокислоты в положении 266;

замены на Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp или Tyr аминокислоты в положении 267;

замены на Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val аминокислоты в положении 269;

замены на Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val аминокислоты в положении 270;

замены на Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp или Tyr аминокислоты в положении 271;

замены на Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp или Tyr аминокислоты в положении 295;

замены на Arg, Gly, Lys или Pro аминокислоты в положении 296;

замены на Ala аминокислоты в положении 297;

замены на Arg, Gly, Lys, Pro, Trp или Tyr аминокислоты в положении 298;

замены на Arg, Lys или Pro аминокислоты в положении 300;

замены на Lys или Pro аминокислоты в положении 324;

замены на Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr или Val аминокислоты в положении 325;

замены на Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val аминокислоты в положении 327;

замены на Arg, Asn, Gly, His, Lys или Pro аминокислоты в положении 328;

замены на Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val или Arg аминокислоты в положении 329;

замены на Pro или Ser аминокислоты в положении 330;

замены на Arg, Gly или Lys аминокислоты в положении 331; и

замены на Arg, Lys или Pro аминокислоты в положении 332 согласно системе нумерации EU в Fc-области.

(Вариант осуществления 2) Антигенсвязывающие молекулы, которые содержат Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН и активность связывания которых с ингибирующим FcγR является более высокой, чем активность связывания с активирующим Fcγ-рецептором

Антигенсвязывающие молекулы согласно варианту осуществления 2 могут образовывать тетрамерный комплекс путем связывания с двумя молекулами FcRn и одной молекулой ингибирующего FcγR. Однако поскольку одна антигенсвязывающая молекула может связываться только с одной молекулой FcγR, антигенсвязывающая молекула, связанная с ингибирующим FcγR, не может далее связываться с активирующим FcγR (фиг. 50). Более того, было описано, что антигенсвязывающие молекулы, включенные в клетки в состоянии, связанном с ингибирующим FcγR, рециклируют на клеточную мембрану и, таким образом, ускользают от внутриклеточной деградации (Immunity (2005) 23, 503-514). В частности, предполагается, что антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью селективного связывания с ингибирующим FcγR, не могут образовывать гетеромерный комплекс, содержащий активирующий FcγR, который ответственен за иммунный ответ, и две молекулы FcRn.

В рамках настоящего изобретения, "активность связывания с ингибирующим FcγR является более высокой, чем активность связывания с активирующим Fcγ-рецептором" означает, что активность связывания варианта Fc-области с FcγRIIb является более высокой, чем активность связывания с любыми Fcγ-рецепторами человека: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb. Например, это означает, что, исходя из описанного выше аналитического способа, активность связывания FcγRIIb антигенсвязывающей молекулы, имеющей вариант Fc-области, составляет 105% или более, предпочтительно 110% или более, 120% или более, 130% или более, 140% или более, в частности предпочтительно 150% или более, 160% или более, 170% или более, 180% или более, 190% или более, 200% или более, 250% или более, 300% или более, 350% или более, 400% или более, 450% или более, 500% или более, 750% или более, в 10 раз или более, в 20 раз или более, в 30 раз или более, в 40 раз или более, в 50 раз или более превышает активность связывания с любыми Fcγ-рецепторами человека: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb.

В качестве контрольных антигенсвязывающих молекул, имеющих Fc-область, можно соответствующим образом использовать антигенсвязывающие молекулы, имеющие Fc-область из моноклонального IgG-антитела. Структуры таких Fc-областей представлены в SEQ ID NO: 11 (А добавлен на N-конце последовательности с номером доступа RefSeq №ААС 82527.1), 12 (А добавлен на N-конце последовательности с номером доступа RefSeq №ААВ 59393.1), 13 (номер доступа RefSeq №САА 27268.1) и 14 (А добавлен на N-конце последовательности с номером доступа RefSeq №ААВ 59394.1). Между тем, когда антигенсвязывающую молекулу, которая имеет Fc-область из антитела определенного изотипа, используют в качестве исследуемого вещества, активность антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область, в отношении связывания Fcγ-рецептора, можно исследовать с использованием в качестве контроля антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область моноклонального IgG-антитела того же изотипа. Как описано выше, соответствующим образом выбирают антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область, для которой продемонстрировано, что ее активность связывания с Fcγ-рецептором является высокой.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные Fc-области, обладающие активностью селективного связывания с ингибирующим FcγR включают, например, Fc-области, в которых аминокислота в положении 238 или 328 (указанном согласно нумерации EU) среди аминокислот описанной выше Fc-области изменена на отличающуюся аминокислоту нативной Fc-области. Более того, в качестве Fc-областей, обладающих активностью селективного связывания с ингибирующим FcγR, также можно соответствующим образом выбирать Fc-области или изменения из тех, что описаны в US 2009/0136485.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные Fc-области включают Fc-области, в которых любая одна или несколько из: аминокислоты в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) заменен на Asp и аминокислота в положении 328 (указанном согласно нумерации EU) заменена на Glu в описанной выше Fc-области.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительные Fc-области включают замену Asp на Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU), и следующие замены:

замена на Trp аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Phe аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Val аминокислоты в положении 267 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Gln аминокислоты в положении 267 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asn аминокислоты в положении 268 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Gly аминокислоты в положении 271 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Leu аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Gln аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Glu аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Met аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asp аминокислоты в положении 239 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Ala аминокислоты в положении 267 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Trp аминокислоты в положении 234 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Tyr аминокислоты в положении 234 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Ala аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asp аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Glu аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Leu аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Met аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Tyr аминокислоты в положении 237 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Lys аминокислоты в положении 330 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Arg аминокислоты в положении 330 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asp аминокислоты в положении 233 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asp аминокислоты в положении 268 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Glu аминокислоты в положении 268 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asp аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Ser аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Thr аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Ile аминокислоты в положении 323 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Leu аминокислоты в положении 323 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Met аминокислоты в положении 323 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asp аминокислоты в положении 296 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Ala аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU),

замена на Asn аминокислоты в положении 326 (указанном согласно нумерации EU), и

замена на Met аминокислоты в положении 330 (указанном согласно нумерации EU).

(Вариант осуществления 3) Антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область, в которой один из двух полипептидов, составляющих Fc-область, обладают активностью связывания FcRn в условиях нейтрального диапазона значений рН, а другой не обладает активность связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН

Антигенсвязывающая молекула согласно варианту осуществления 3 может образовывать тримерные комплексы путем связывания с одной молекулой FcRn и одной молекулой FcγR; однако они не образуют тетрамерный гетерокомплекс, содержащий две молекулы FcRn и одну молекулу FcγR (фиг. 51). Fc-области, происходящие из биспецифических антител, можно соответствующим образом использовать в качестве Fc-областей, в которых один из двух полипептидов, составляющих Fc-область, обладают активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, а другой не обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, которые включены в антигенсвязывающую молекулу согласно варианту осуществления 3. Биспецифическое антитело относится к двум типам антител, которые обладают специфичностью к различным антигенам. Биспецифические антитела IgG-типа можно секретировать из гибридных гибридом (квадром), полученных путем слияния двух типов гибридом, продуцирующих IgG-антитела (Milstein et al. (Nature (1983) 305, 537-540).

Когда антигенсвязывающую молекулу согласно варианту осуществления 3, описанному выше, получают с использованием способов рекомбинации, таких как способы, описанные в представленном выше разделе "Антитело", можно использовать способ, в котором гены, кодирующие полипептиды, которые составляют два типа представляющих интерес Fc-областей, вводят в клетки для коэкспрессии их. Однако полученная Fc-область представляет собой смесь, которая содержит в молярном соотношении 2:1:1, Fc-область, в которой один из двух полипептидов, составляющих Fc-область, обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, а другой не обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, Fc-область, в которой оба полипептида, составляющих Fc-область, обладают активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, и Fc-область, в которой оба полипептида, составляющих Fc-область, не обладают активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН. Трудно очищать антигенсвязывающие молекулы, содержащие желаемую комбинацию Fc-областей, из трех типов IgG.

При получении антигенсвязывающих молекул согласно варианту осуществления 3 с использованием способов рекомбинации, таких как описано выше, антигенсвязывающие молекулы, содержащие гетерокомбинацию Fc-областей, можно предпочтительно секретировать путем изменения СН3-домена, который составляет Fc-область, с использованием соответствующих аминокислотных замен. В частности, этот способ представляет собой способ усиления образования гетеро-Н-цепи и ингибирования образования гомо-Н-цепи путем замены боковой цепи аминокислоты в одном СН3-домене тяжелой цепи на более объемную боковую цепь (выступ (означающий "выпуклая часть")), одновременно заменяя боковую цепь аминокислоты в другом СН3-домене тяжелой цепи на боковую цепь меньшего размера (углубление (означающее "полость")) так чтобы "выступ" помещался в "углублении" (WO 1996027011, Ridgway et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant et al. (Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).

Более того, известные способы получения биспецифических антител включают способы, в которых используют средства для регуляции ассоциации полипептидов или ассоциации для формирования гетеромерных мультимеров, образованных полипептидами, для ассоциации пары полипептидов, которые составляют Fc-область. В частности для получения биспецифических антител можно использовать способы регуляции ассоциации полипептидов путем изменения аминокислотных остатков, образующих поверхность контакта между парой полипептидов, которые составляют Fc-область, чтобы образовывался комплекс из двух полипептидов с различными последовательностями, составляющими Fc-область, при одновременном ингибировании ассоциации полипептидов, имеющих идентичную последовательность, которые составляют Fc-область (WO 2006/106905). Такие способы можно использовать для получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, описанных в варианте осуществления 3.

В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве Fc-области можно соответствующим образом использовать пару полипептидов, которые составляют описанную выше Fc-область, происходящих из биспецифического антитела. Более конкретно, предпочтительно в качестве Fc-областей используют пару полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых обладает аминокислотной последовательностью, в которой аминокислоты в положениях 349 и 366 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Cys и Trp, соответственно, а другой обладает аминокислотной последовательностью, в которой аминокислота в положении 356 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Cys, аминокислота в положении 366 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Ser, аминокислота в положении 368 представляет собой Ala, и аминокислота в положении 407 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Val.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, предпочтительно в качестве Fc-областей используют пару полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 409 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Asp, а другой имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 399 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Lys. В описанном выше варианте осуществления аминокислота в положении 409 может представлять собой Glu вместо Asp, и аминокислота в положении 399 может представлять собой Arg вместо Lys. Альтернативно предпочтительно, чтобы, когда аминокислота в положении 399 представляла собой Lys, дополнительно аминокислота в положении 360 может представлять собой Asp или аминокислота в положении 392 может представлять собой Asp.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве Fc-областей предпочтительно используют пару полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 370 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Glu, а другой имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 357 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Lys.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве Fc-областей предпочтительно используют пару полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 439 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Glu, а другой имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 356 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Lys.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения такие предпочтительные Fc-области включают Fc-области в качестве комбинации любого из описанных выше вариантов осуществления, такой как:

пара полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых обладает аминокислотной последовательностью, в которой аминокислоты в положениях 409 и 370 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Asp и Glu, соответственно, а другой из которых обладает аминокислотной последовательностью, в которой обе из аминокислот в положениях 399 и 357 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Lys (в этом варианте осуществления аминокислота в положении 370 (указанном согласно нумерации EU) может представлять собой Asp вместо Glu, или аминокислота в положении 392 может представлять собой Asp вместо Glu в положении аминокислоты 370);

пара полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых обладает аминокислотной последовательностью, в которой аминокислоты в положениях 409 и 439 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Asp и Glu, соответственно, а другой обладает аминокислотной последовательностью, в которой обе из аминокислот в положениях 399 и 356 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Lys (в этом варианте осуществления вместо Glu в положении аминокислоты 439 (указанном согласно нумерации EU), аминокислота в положении 360 может представлять собой Asp, аминокислота в положении 392 может представлять собой Asp или аминокислота в положении 439 может представлять собой Asp);

пара полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых имеет аминокислотную последовательность, в которой обе из аминокислот в положениях 370 и 439 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Glu, а другой имеет аминокислотную последовательность, в которой обе из аминокислот в положениях 357 и 356 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Lys; и

пара полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислоты в положениях 409, 370 и 439 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Asp, Glu и Glu, соответственно, а другой имеет аминокислотную последовательность, в которой все аминокислоты в положениях 399, 357 и 356 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Lys (в этом варианте осуществления аминокислота в положении 370 может не быть заменена на Glu, и, кроме того, когда аминокислота в положении 370 не заменена на Glu, аминокислота в положении 439 может представлять собой Asp вместо Glu, или аминокислота в положении 439 может представлять собой Asp вместо Glu в положении аминокислоты 392).

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно используют пару полипептидов, которые составляют Fc-область, один из которых имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 356 (указанном согласно нумерации EU) представляет собой Lys, а другой имеет аминокислотную последовательность, в которой аминокислоты в положениях 435 и 439 (указанных согласно нумерации EU) представляют собой Arg и Glu, соответственно.

Ожидается, что эти антигенсвязывающие молекулы согласно вариантам осуществления 1-3 будут иметь сниженную иммуногенность и увеличенное время удержания в плазме по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, способными образовывать тетрамерный комплекс.

Для изменения аминокислот Fc-областей можно использовать подходящие известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР с удлинением. Более того, также можно использовать различные известные способы в качестве способа изменения аминокислот для замены аминокислот на аминокислоты, отличные от природных аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, также предпочтительно использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, в которой неприродная аминокислота связана с амбер-супрессорной тРНК, которая комплементарна стоп-кодону UAG (амбер-кодон).

В одном варианте осуществления вариантов по настоящему изобретению полинуклеотиды, кодирующие антигенсвязывающие молекулы, которые имеют тяжелую цепь, где полинуклеотид, кодирующий Fc-область, модифицированный так, чтобы он имел мутацию аминокислоты, как описано выше, связанную в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим описанную выше антигенсвязывающую молекулу, активность связывания которой варьирует, в зависимости от выбранных условий.

Настоящее изобретение относится к способам получения антигенсвязывающих молекул, включающим сбор антигенсвязывающих молекул из культуральных сред клеток, в которые введены векторы, в которых полинуклеотид, кодирующий Fc-область, функционально связан в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий домен, активность связывания которого варьирует в зависимости от условий концентрации ионов. Более того, настоящее изобретение также относится к способам получения антигенсвязывающих молекул, включающим сбор антигенсвязывающих молекул из культуральных сред клеток, в которые введены векторы, сконструированные путем функционального связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, активность связывания которого варьирует в зависимости от условий концентрации ионов, с полинуклеотидом, кодирующим Fc-область, который предварительно функционально связан с вектором.

Фармацевтические композиции

Когда вводят общепринятое нейтрализующее антитело против растворимого антигена, ожидается, что удержание антигена в плазме будет пролонгированным вследствие связывания с антителом. Как правило, антитела имеют длительное время полужизни (от одной недели до трех недель), в то время как время полужизни антигена обычно является коротким (одни сутки или менее). Между тем связанные с антителом антигены имеют значительно более длительное время полужизни в плазме по сравнению с тем, когда антигены присутствуют отдельно. По этой причине введение существующего нейтрализующего антитела приводит к увеличению концентрации антигена в плазме. Такие случаи описаны для различных нейтрализующих антител, которые нацелены на растворимые антигены, включая, например, IL-6 (J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), амилоид-бета (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), МСР-1 (ARTHRITIS & RHEUMATISM (2006) 54, 2387-2392), гепцидин (AAPS J. (2010) 4, 646-657) и рецептор sIL-6 (Blood (2008) 112 (10), 3959-64). Описано, что введение существующих нейтрализующих антител увеличивает общую концентрацию антигена в плазме приблизительно в 10-1000 раз (уровень увеличения варьирует, в зависимости от антигена) от исходного уровня. В рамках настоящего изобретения общая концентрация антигена в плазме относится к концентрации в качестве общего количества антигена в плазме, т.е. сумме концентраций связанного с антителом и не связанного с антителом антигена. Увеличение общей концентрации антигена в плазме является нежелательным для таких фармацевтических средств на основе антител, которые нацелены на растворимый антиген. Причина этого состоит в том, что концентрация антитела должна быть более высокой, чем по меньшей мере общая концентрация антигена в плазме, для нейтрализации растворимого антигена. В частности, "общая концентрация антигена в плазме увеличивается в 10-1000 раз" означает, что для нейтрализации антигена концентрация антитела в плазме (т.е. доза антитела) должна быть в 10-1000 раз более высокой по сравнению с тем, когда увеличение общей концентрации антигена в плазме не происходит. Напротив, если общая концентрация антигена в плазме может быть снижена в 10-1000 раз по сравнению с существующим нейтрализующим антителом, дозу антитела также можно снижать в аналогичной степени. Таким образом, антитела, способные снижать общую концентрацию антигена в плазме путем элиминации растворимого антигена из плазмы, в высокой степени пригодны по сравнению с существующими нейтрализующими антителами.

Настоящее изобретение не ограничивается конкретной теорией, однако можно пояснить, например, следующим образом, почему количество антигенов, с которым могут связываться единичные антигенсвязывающие молекулы, увеличивается, и почему элиминация антигена из плазмы ускоряется, когда антигенсвязывающие молекулы, которые имеют антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьирует в зависимости от условий концентрации ионов, так чтобы антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН была более низкой, чем в условиях диапазона нейтральных значений рН, и, кроме того, имеют связывающий FcRn домен, такой как константная область антитела, проявляющая активность связывания FcRn человека в условиях диапазона нейтральных значений рН, вводят in vivo и захват в клетки in vivo усиливается.

Например, когда антитело, которое связывается с антигеном мембраны, вводят in vivo, после связывания с антигеном антитело в связанном с антигеном состоянии включается в эндосому путем внутриклеточной интернализации. Затем антитело переносится в лизосому, оставаясь связанным с антигеном, и деградируется там вместе с антигеном. Опосредуемую интернализацией элиминацию из плазмы называют антиген-зависимой элиминацией, и она была описана для многих молекул антител (Drug Discov Today (2006) 11(1-2), 81-88). Когда одна молекула IgG-антитела связывается с антигенами двухвалентным образом, одна молекула антитела интернализуется, оставаясь связанной с двумя антигенами, и деградируется в лизосоме. В случае типичных антител, таким образом, одна молекула IgG-антитела не может связываться с тремя молекулами антигена или более. Например, одна молекула IgG-антитела, обладающая нейтрализующей активностью, не может нейтрализовать три или более молекулы антигена.

Время удержания молекулы IgG в плазме является относительно длительным (элиминация является медленной), поскольку функционирует FcRn человека, который известен как рецептор спасения для молекулы IgG. Молекулы IgG, включенные в эндосомы путем пиноцитоза, связываются в кислых условиях эндосом с FcRn человека, экспрессируемым в эндосомах. Молекулы IgG, которые не могут связываться с FcRn человека, переносятся в лизосомы и деградируются в них. Между тем, молекулы IgG, связанные с FcRn человека, переносятся на клеточную поверхность. Молекулы IgG диссоциируют от FcRn человека в нейтральных условиях в плазме и рециклируют обратно в плазму.

Альтернативно, когда антигенсвязывающие молекулы представляют собой антитела, которые связываются с растворимым антигеном, вводимые in vivo антитела связываются с антигенами, а затем антитела включаются в клетки, оставаясь связанными с антигенами. Большинство антител, включенных в клетки, связываются с FcRn в эндосоме, а затем переносятся на клеточную поверхность. Антитела диссоциируют от FcRn человека в нейтральных условиях плазмы и высвобождаются во внешнюю среду клеток. Однако антитела, имеющие типичные антигенсвязывающие домены, антигенсвязывающая активность которых не варьирует, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, высвобождаются во внешнюю среду клеток, оставаясь связанными с молекулами и, таким образом, они не могут связываться вновь с антигеном. Таким образом, подобно антителам, которые связываются с антигенами мембраны, единичная типичная молекула IgG-антитела, антигенсвязывающая активность которой не варьирует, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, не может связываться с тремя молекулами антигенов или более.

Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосоме (антитела, которые связываются в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антитела, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция) могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом или зависимым от концентрации ионов кальция образом, когда рециклируют в плазму посредством FcRn, после диссоциации от антигенов могут вновь связываться с антигеном. Таким образом, такая единичная молекула антитела может многократно связываться с несколькими молекулами антигена. Между тем, антиген, связанный с антигенсвязывающими молекулами, диссоциируют от антитела в эндососме и деградируют в лизосоме без рециклирования в плазму. Путем введения таких антигенсвязывающих молекул in vivo, захват антигена в клетки ускоряется и является возможным снижение концентрации антигена в плазме.

Захват антигенов, связанных антигенсвязывающими молекулами, в клетки далее ускоряется путем сообщения активности связывания FcRn человека в условиях диапазона нейтральных значений рН (рН 7,4) антителам, связывающимся с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антителам, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция). В частности, путем введения таких антигенсвязывающих молекул in vivo ускоряется элиминация антигена, и является возможным снижение концентрации антигена в плазме. Типичные антитела, которые не обладают способностью связываться с антигенами рН-зависимым образом или зависимым от концентрации ионов кальция образом, и комплексы антиген-антитело таких антител включаются в клетки посредством неспецифического эндоцитоза и транспортируются на клеточную поверхность путем связывания с FcRn в кислых условиях эндосом. Они диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях на клеточной поверхности и рециклируют в плазму. Таким образом, когда антитело, которое связывается с антигеном полностью рН-зависимым образом (которое связывается в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциирует в условиях диапазона кислых значений рН) или полностью зависимым от концентрации ионов кальция образом (которое связывается в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциирует в условиях низкой концентрации ионов кальция) связывается с антигеном в плазме и диссоциирует от антигена в эндосоме, скорость элиминации антигена считается равной скорости захвата в клетки антитела или комплекса антиген-антитело посредством неспецифического эндоцитоза. Когда зависимость от рН или концентрации ионов кальция связывания антиген-антитело является недостаточной, антигены, которые не диссоциировали от антител в эндосоме, рециклируют в плазме вместе с антителами. С другой стороны, когда зависимость от рН или концентрации ионов кальция является достаточно высокой, скорость-лимитирующей стадией элиминации антигена является клеточный захват посредством неспецифического эндоцитоза. Между тем, FcRn транспортирует антитела из эндосомы на клеточную поверхность и ожидается, что часть FcRn также распределена на клеточной поверхности.

Как правило, иммуноглобулин IgG-типа, который является одним из вариантов осуществления антигенсвязывающих молекул, обладает небольшой активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Авторы настоящего изобретения сделали заключение, что иммунглобулин IgG-типа, обладающий активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, может связываться с FcRn на клеточной поверхности и включается в клетки зависимым от FcRn образом путем связывания с FcRn на клеточной поверхности. Скорость опосредуемого FcRn клеточного захвата является более высокой, чем клеточный захват посредством неспецифического эндоцитоза. Таким образом, авторы настоящего изобретения предположили, что скорость элиминации антигена антигенсвязывающими молекулами можно далее увеличивать путем сообщения антигенсвязывающим молекулам способности связывать FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. В частности, антигенсвязывающие молекулы, которые обладают способностью связывать FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, доставляют антигены в клетки быстрее, чем нативный иммуноглобулин IgG-типа; молекулы диссоциируют от антигенов в эндосоме и вновь рециклируют на клеточную поверхность или в плазму; и вновь связываются там с антигенами и включаются в клетки через FcRn. Скорость циклирования можно увеличивать путем увеличения способности связывать FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, что приводит к ускорению элиминации антигена из плазмы. Более того, скорость элиминации антигена из плазмы можно далее увеличивать путем снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в кислых значениях рН относительно активности в диапазоне нейтральных значений рН. Кроме того, количество молекул антигена, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула, согласно прогнозам, увеличится вследствие увеличения количества циклов в результате увеличения скорости циклирования. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению содержат антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен. Поскольку FcRn-связывающий домен не влияет на связывание антигена и не зависит от типа антигена, исходя из механизма, описанного выше, опосредуемый антигенсвязывающей молекулой захват антигена в клетки может быть усилен для ускорения скорости элиминации антигена путем снижения антигенсвязывающей активности (способности связываться) антигенсвязывающей молекулы так, чтобы она была более низкой в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, чем в условиях концентрация ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, и/или путем увеличения активности связывания FcRn при рН плазмы. Таким образом, ожидается, что антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению будут проявлять лучшие эффекты, чем общепринятые терапевтические антитела, с точки зрения снижения побочных эффектов антигенов, увеличения дозы антитела, улучшения динамики антител in vivo и т.д.

На фиг. 1 представлен механизм, посредством которого растворимые антигены элиминируются из плазмы при введении антитела с рН-зависимым связыванием антигена, которое имеет увеличенную активность связывания FcRn при нейтральных значениях рН по сравнению с общепринятым нейтрализующим антителом. После связывания с растворимым антигеном в плазме существующее нейтрализующее антитело, которое не обладает способностью рН-зависимого связывания антигена, медленно включается в клетки посредством неспецифического взаимодействия с клетками. Комплекс между нейтрализующим антителом и растворимым антигеном, включенным в клетку, переносится в эндосому с кислой средой, а затем рециклирует в плазму через FcRn. Между тем, антитело с рН-зависимым связыванием антигена, которое обладает увеличенной активностью связывания FcRn в нейтральных условиях, после связывания с растворимым антигеном в плазме быстро включается в клетки, экспрессирующие FcRn на их клеточной мембране. Затем растворимый антиген, связанный с антителом с рН-зависимым связыванием антигена, диссоциирует от антитела в эндосоме с кислой средой вследствие способности рН-зависимого связывания. Растворимый антиген, диссоциировавший от антитела, переносится в лизосому и деградируется посредством протеолитической активности. Между тем, антитело, диссоциировавшее от растворимого антигена, рециклирует на клеточную мембрану, а затем вновь высвобождается в плазму. Свободное антитело, рециклировавшее как описано выше, вновь может связываться с другими растворимыми антигенами. Путем повторения такого цикла: опосредуемый FcRn захват в клетки; диссоциация и деградация растворимого антигена; и рециклирование антитела, такие антитела с рН-зависимым связыванием антигена, как описано выше, имеющие увеличенную активность связывания FcRn с нейтральных условиях, могут переносить большое количество растворимого антигена в лизосому и, тем самым, снизить общую концентрацию антигена в плазме.

В частности, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, антигенсвязывающим молекулам, полученным способами изменения по настоящему изобретению, или антигенсвязывающим молекулам, полученным способами получения по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или антигенсвязывающие молекулы, полученные способами получения по настоящему изобретению, пригодны в качестве фармацевтических композиций, поскольку они при введении обладают мощным эффектом снижения концентрации антигена в плазме по сравнению с типичными антигенсвязывающими молекулами, и проявляют улучшенный иммунный ответ in vivo, фармакокинетику и т.п. у животных, которым вводят молекулы. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые носители.

В рамках настоящего изобретения фармацевтические композиции, как правило, относятся к средствам для лечения или профилактики или исследования и диагностики заболеваний.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены способами, известными специалистам в данной области. Например, их можно использовать парентерально в форме инъекций стерильных растворов или суспензий, включающих воду или другую фармацевтически приемлемую жидкость. Например, такие композиции могут быть составлены путем смешения в форме единичной дозы, требуемой повсеместно одобренной практикой производства лекарственных средств, путем комбинирования надлежащим образом с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, со стерильной водой, физиологическим раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспензией, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.п. В таких составах количество активного ингредиента корректируют так, чтобы получить соответствующее количество в заданном диапазоне.

Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены с использованием носителей, таких как дистиллированная вода для инъекций, в соответствии со стандартной практикой составления.

Водные растворы для инъекций включают, например, физиологический солевой раствор и изотонические растворы, содержащие декстрозу или другие адъюванты (например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия). Также их можно использовать в комбинации с соответствующими солюбилизаторами, например, спиртами (этанол и т.п.), полиспиртами (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), неионными поверхностно-активными веществами (полисорбат 80(ТМ), НСО-50 и т.п.).

Масла включают кунжутное масло и соевые масла. В комбинации с солюбилизаторами можно использовать бензилбензоат и/или бензиловый спирт. Также можно комбинировать буферы (например, фосфатный буфер натрий-ацетатный буфер), успокаивающие средства (например, прокаина гидрохлорид), стабилизаторы (например, бензиловый спирт и фенол) и/или антиоксиданты. Полученными инъекционными препаратами заполняют подходящие ампулы.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно вводят парентерально. Например, вводят композиции в дозированной форме для инъекций, трансназального введения, введения через легкие или чрескожного введения. Например, их можно вводить системно или локально путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и т.п.

Способы введения можно надлежащим образом выбирать, учитывая возраст и симптомы пациента. Доза фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающую молекулу, может составлять, например, от 0,0001 до 1,000 мг/кг для каждого введения. Альтернативно доза может составлять, например, от 0,001 до 100000 мг на пациента. Однако настоящее изобретение не ограничивается числовыми величинами, описанными выше. Дозы и способы введения варьируют, в зависимости от массы тела пациента, возраста, симптомов и т.п. Специалисты в данной области могут установить подходящие дозы и способы введения, учитывая факторы, описанные выше.

Более того, настоящее изобретение относится к наборам для применения в способах по настоящему изобретению, которые содержат по меньшей мере антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению. В дополнение к описанному выше, в наборы могут быть упакованы фармацевтически приемлемые носители, среды, инструкции, в которых описано применение способа, и т.п.

Более того, настоящее изобретение относится к средствам для улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул или средствам для снижения иммуногенности антигенсвязывающих молекул, которые содержат в качестве активного ингредиента антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или антигенсвязывающую молекулу, продуцируемую способом получения по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения иммунных воспалительных заболеваний, которые включают стадию введения индивидуумам (исследуемым индивидуумам) антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению или антигенсвязывающей молекулы, получаемой способом получения по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению или антигенсвязывающих молекул, получаемых способами получения по настоящему изобретению, для получения средств для улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул или средств для снижения иммуногенности антигенсвязывающих молекул.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам по настоящему изобретению и антигенсвязывающим молекулам, полученным способами получения по настоящему изобретению, для применения в способах по настоящему изобретению.

Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях по настоящему изобретению, могут быть посттрансляционно модифицированными (например, модификация N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования хорошо известна специалистам в данной области). Естественно, такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты включены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению.

Все цитированные в описании документы уровня техники включены в настоящее описание в качестве ссылок.

[Примеры]

Ниже настоящее изобретение конкретно описано с помощью примеров, однако его не следует считать ограниченным ими.

[Пример 1] Эффект усиления связывания с FcRn человека в нейтральных условиях на время удержания в плазме и иммуногенность антитела человека с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека

Для FcRn-связывающего домена, такого как Fc-область антигенсвязывающих молекул, таких как антитела, которые взаимодействуют с FcRn (Nat. Rev. Immunol. (2007) 7 (9), 715-25), важно иметь активность связывания с FcRn в диапазоне нейтральных значений рН для элиминации растворимого антигена из плазмы. Как указано в справочном примере 5, проводили исследования мутанта FcRn-связывающего домена (замена аминокислоты), который имеет активность FcRn-связывающего домена в отношении связывания с FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. F1-F600, которые были получены в качестве мутантов Fc, оценивали в отношении их активности связывания с FcRn в области нейтральных значений рН, и было подтверждено, что элиминация антигена из плазмы ускорялась посредством усиления активности связывания с FcRn в области нейтральных значений рН. Для разработки этих мутантов Fc в качестве фармацевтических средств, в дополнение к наличию предпочтительных фармакологических свойств (таких как ускорение элиминации антигена из плазмы путем усиления связывания FcRn), также предпочтительно наличие улучшенной стабильности и чистоты антигенсвязывающих молекул, увеличенного времени удержания в плазме антигенсвязывающих молекул в организме и низкой иммуногенности.

Известно, что удержание антитела в плазме ухудшается в результате связывания с FcRn в нейтральных условиях. Если антитело оказывается связанным с FcRn в нейтральных условиях, даже если антитело возвращается на клеточную поверхность путем связывания с FcRn в кислых условиях в эндосомах, IgG-антитело не рециклирует в плазму, пока IgG-антитело не диссоциирует от FcRn в плазме в нейтральных условиях, тем самым, наоборот обеспечивая ухудшение удержания в плазме. Например, описано, что удержание антитела в плазме ухудшается в случае введения антитела мышам, для которых связывание с FcRn мыши наблюдали в нейтральных условиях (рН 7,4) в результате внесения аминокислотной замены в IgG1 (непатентный документ 10). Однако с другой стороны также было описано, что в случае, когда антитело вводили яванским макакам, у которых наблюдали связывание с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4), не происходило улучшения удержания антитела в плазме, и не наблюдали изменений в удержании в плазме (непатентные документы 10, 11 и 12).

Кроме того, было описано, что FcRn экспрессируется в антигенпредставляющих клетках и вовлечен в представление антигена. В сообщении, в котором описывалась оценка иммуногенности белка (далее обозначаемого как MBP-Fc), полученного путем слияния Fc-области IgG1 мыши с основным белком миелина (МВР), хотя это и не антигенсвязывающая молекула, Т-клетки, которые специфично реагируют с MBP-Fc, претерпевают активацию и пролиферацию в результате культивирования в присутствии MBP-Fc. Известно, что активация Т-клеток усиливается in vitro путем увеличения включения в антигенпредставляющие клетки, опосредуемого FcRn, экспрессируемым в антигенпредставляющих клетках, путем внесения модификации в Fc-область MBP-Fc, которая вызывает увеличение связывания FcRn. Однако, поскольку удержание в плазме ухудшается в результате внесения модификации, которая вызывает увеличение связывания FcRn, описано, что активация Т-клеток напротив снижается in vivo (непатентный документ 43).

Таким образом, эффект усиления связывания FcRn в нейтральных условиях на удержание в плазме и иммуногенность антигенсвязывающих молекул не был достаточно исследован. В случае разработки антигенсвязывающих молекул в качестве фармацевтических препаратов, удержание этих антигенсвязывающих молекул в плазме предпочтительно является настолько длительным, насколько это возможно, и иммуногенность предпочтительно является настолько низкой, насколько это возможно.

(1-1) Получение антител человека, связывающих рецептор IL-6 человека

Таким образом, для оценки удержания в плазме антигенсвязывающих молекул, которые содержат FcRn-связывающий домен, обладающий способностью связываться с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, и для оценки иммуногенности этих антигенсвязывающих молекул, получали связывающие рецептор IL-6 человека антитела человека, обладающие активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН в форме Fv4-IgG1, состоящего из VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36), Fv4-IgG1-F1, состоящего из VH3-IgG1-F1 (SEQ ID NO: 37) и VL3-CK, Fv4-IgG1-F157, состоящего из VH3-IgG1-F157 (SEQ ID NO: 38) и VL3-CK, Fv4-IgG1-F20, состоящего из VH3-IgG1-F20 (SEQ ID NO: 39) и VL3-CK, и Fv4-IgG1-F21, состоящего из VH3-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 40) и VL3-CK, в соответствии со способами, показанными в справочном примере 1 и справочном примере 2.

(1-2) Кинетический анализ связывания FcRn мыши

Получали антитела, содержащие VH3-IgG1 или VH3-IgG1-F1 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) в качестве легкой цепи с использованием способа, представленного в справочном примере 2, и оценивали активность связывания с FcRn мыши, аналогично тому, как описано ниже.

Связывание между антителом и FcRn мыши анализировали кинетически с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). Достаточное количество белка L (ACTIGEN) иммобилизовали на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare) посредством способа присоединения аминов, и обеспечивали улавливание на чипе представляющих интерес антител. Затем, разбавленные растворы FcRn и подвижный буфер (в качестве эталонного раствора) инжектировали для обеспечения взаимодействия FcRn мыши с антителом, уловленном на сенсорным чипе. Используемый подвижный буфер содержал 50 ммоль/л фосфата натрия, 150 ммоль/л NaCl и 0,05% (масс./об.) Tween20 (рН 7,4). FcRn разбавляли с использованием каждого буфера. Сенсорный чип регенерировали с использованием 10 ммоль/л глицина-HCl (рН 1,5). Анализы проводили исключительно при 25°С. Константу скорости ассоциации ka (1/Мс) и константу скорости диссоциации k_d (1/с), каждая из которых представляет собой кинетические параметры, рассчитывали, основываясь на сенсограммах, полученных в анализах, и из этих значений определяли KD (М) каждого антитела для FcRn мыши. Каждый параметр рассчитывали с использованием программного обеспечения Biacore Т100 Evaluation (GE Healthcare).

В результате, хотя KD (М) IgG1 не была выявлена, KD (М) продуцированного IgG1-F1 составила 1,06Е-06 (М). Это указывает на то, что активность связывания полученного IgG1-F1 с FcRn мыши усиливается в условиях области нейтральных значений рН (рН 7,4).

(1-3) Исследование PK in vivo study с использованием нормальных мышей

Исследование PK проводили с использованием способа, представленного ниже, с использованием нормальных мышей, продуцировавших антитела человека с рН-зависимым связыванием с рецептором IL-6 человека, Fv4-IgG1 и Fv4-IgG1-F1. Антитело против рецептора IL-6 человека вводили в дозе 1 мг/кг в качестве однократного введения в хвостовую вену и под кожу спины нормальных мышей (мышь C57BL/6J, Charles River Japan). Взятие крови проводили через 5 минут, 7 часов и 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Плазму получали путем немедленного центрифугирования взятой крови в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. Отделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже до времени измерения.

(1-4) Определение с помощью ELISA концентрации антитела против рецептора IL-6 человека в плазме

Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли с помощью ELISA. Сначала F(ab') 2-фрагмент антитела против IgG человека (специфичный к γ-цепи) (SIGMA) распределяли в планшеты Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International) и позволяли им стоять в течение ночи при 4°С с получением планшетов с антителом против IgG человека в твердой фазе. Получали образцы для калибровочной кривой, имеющие концентрации антитела против IgG человека в плазме 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0,0125 мкг/мл, и образцы плазмы мыши для измерения, разбавленные в 100 раз или более. Затем смесям, полученным добавлением 200 мкл растворимого рецептора IL-6 человека в концентрации 20 нг/мл к 100 мкл образцов для калибровочной кривой и образцов плазмы для измерения, позволяли стоять нетронутыми в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшету с антителом против IgG человека в твердой фазе, в каждую из лунок которого распределяли смеси, далее позволяли стоять нетронутым в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем проводили хромогенную реакцию реакционной жидкости, полученной путем реакции в течение одного часа с биотинилированным антителом против IL-6 R человека (R&D) при комнатной температуре и дальнейшей реакции в течение одного часа со стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) при комнатной температуре с использованием ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) в качестве субстрата. После остановки реакции 1 Н серной кислотой (Showa Chemical) измеряли поглощение реакционных жидкостей в каждой лунке при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме у мышей вычисляли из величин поглощения на калибровочной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices).

Концентрации антител с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека после внутривенного или подкожного введения антител человека с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека нормальным мышам представлены на фиг. 2. Исходя из результатов, представленных на фиг. 2, по сравнению с внутривенно вводимым Fv4-IgG1, было показано, что удержание в плазме ухудшается при внутривенном введении Fv4-IgG1-F1, в случае которого связывание с FcRn мыши в нейтральных условиях было усиленным. С другой стороны, хотя подкожно вводимое Fv4-IgG1 продемонстрировало сравнимое удержание в плазме с удержанием в плазме при внутривенном введении, в случае подкожно вводимого Fv4-IgG1-F1, через 7 суток после введения наблюдали внезапное снижение концентрации в плазме, которое, как полагали, было следствием продукции антитела мыши против Fv4-IgG1-F1, и на 14 сутки после введения Fv4-IgG1-F1 не выявлялось в плазме. Исходя из этого результата, было подтверждено, что удержание в плазме и иммуногенность ухудшаются в результате усиления связывания антигенсвязывающих молекул с FcRn в нейтральных условиях.

[Пример 2] получение антитела мыши, связывающегося с рецептором IL-6 человека, обладающего активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН

Антитело мыши, обладающее активность связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН получали способом, представленным ниже.

(2-1) Получение антитела мыши, связывающегося с рецептором IL-6 человека

Аминокислотную последовательность антитела мыши, обладающего способностью связываться с IL-6R человека, Mouse РМ-1 (Sato, K., et al., Cancer Res. (1993) 53 (4), 851-856) использовали в качестве вариабельной области антитела мыши. В описании ниже вариабельную область тяжелой цепи Mouse РМ-1 обозначают как mPM1H (SEQ ID NO: 42), в то время как вариабельную область легкой цепи обозначают как mPM1L (SEQ ID NO: 43).

Кроме того, встречающийся в природе IgG1 мыши (SEQ ID NO: 44, далее обозначаемый как mIgG1) использовали в качестве константной области тяжелой цепи, в то время как встречающуюся в природе последовательность каппа мыши (SEQ ID NO: 45, далее обозначаемую как mk1) использовали в качестве константной области легкой цепи.

Экспрессирующий вектор, имеющий последовательности оснований тяжелой цепи mPM1H-mIgG1 (SEQ ID NO: 46) и легкой цепи mPM1L-mk1 (SEQ ID NO: 47) получали способом согласно справочному примеру 1. Кроме того, mPM1-mIgG1, которое представляет собой антитело мыши, связывающее IL-6R человека, состоящее из mPM1H-mIgG1 и mPM1L-mk1, получали в соответствии со способом справочного примера 2.

(2-2) Получение антитела mPM1, обладающего способностью связываться с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН

Полученное mPM1-mIgG1 представляет собой антитело мыши, которое содержит встречающуюся в природе Fc-область мыши и не обладает активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН. Таким образом, в константную область тяжелой цепи mPM1-mIgG1 вносили модификацию аминокислоты для придания активности связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН.

Более конкретно, mPH1H-mIgG1-mF3 (SEQ ID NO: 48) получали путем внесения аминокислотной замены, полученной путем замены Tyr вместо Thr в положении 252 mPH1H-mIgG1, как указанно согласно нумерации EU, аминокислотной замены, полученной путем замены Glu вместо Thr в положении 256 (нумерация EU), аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо His в положении 433 (нумерация EU), и аминокислотной замены, полученной путем замены Phe вместо Asn в положении 434 (нумерация EU).

Аналогично, mPH1H-mIgG1-mF14 (SEQ ID NO: 49) получали путем внесения аминокислотной замены, полученной путем замены Tyr вместо Thr в положении 252 (нумерации EU) mPH1H-mIgG1, аминокислотной замены, полученной путем замены Glu вместо Thr в положении 256 (нумерация EU), и аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо His в положении 433 (нумерация EU).

Более того, mPM1H-mIgG1-mF38 (SEQ ID NO: 50) получали путем внесения аминокислотной замены, полученной путем замены Tyr вместо Thr в положении 252 (нумерация EU) mPH1H-mIgG1, аминокислотной замены, полученной путем замены Glu вместо Thr в положении 256 (нумерация EU), и аминокислотной замены, полученной путем замены Trp вместо Asn в положении 434 (нумерация EU).

IgG1-антитело мыши, обладающее способностью связываться с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН, mPM1-mIgG1-mF3, которое состоит из mPM1H-mIgG1-mF3 и mPM1L-mk1, получали с использованием способа справочного примера 2.

(2-3) Подтверждение активности связывания с FcRn мыши с помощью Biacore

Получали антитела, которые содержали mPM1-mIgG1 или mPM1-mIgG1-mF3 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) в качестве легкой цепи и измеряли активность связывания этих антител с FcRn мыши при рН 7,0 (константа диссоциации KD). Результаты представлены в таблице 5 ниже.

[Пример 3] Эксперимент по связыванию антигенсвязывающих молекул, обладающих Fc-областью, с FcRn и FcγR

В примере 1, было подтверждено, что удержание в плазме и иммуногенность ухудшались в результате усиления связывания антигенсвязывающих молекул с FcRn в нейтральных условиях. Поскольку встречающийся в природе IgG1 не обладает активностью связывания с FcRn человека в нейтральной области, полагали, что удержание в плазме и иммуногенность будут ухудшаться в результате сообщения способности связывания с FcRn в нейтральных условиях.

(3-1) FcRn-связывающий домен и FcγR-связывающий домен

В Fc-области антитела присутствует FcRn-связывающий домен и FcγR-связывающий домен. FcRn-связывающий домен присутствует в двух областях в Fc-области, и ранее было описано, что две молекулы FcRn способны одновременно связываться с Fc-областью одной молекулы антитела (Nature (1994) 372 (6504), 379-383). С другой стороны, хотя FcγR-связывающий домен также присутствует в двух областях в Fc-области, полагают, что две молекулы FcγR не могут связываться одновременно. Это является следствием того, что вторая молекула FcγR неспособна связываться вследствие структурных изменений в Fc-области, которые происходят вследствие связывания первой молекулы FcγR с Fc-областью (J. Biol. Chem. (2001) 276 (19), 16469-16477).

Как описано ранее, активный FcγR экспрессируется на клеточных мембранах многочисленных иммунных клеток, таких как дендритные клетки, NK-клетки, макрофаги, нейтрофилы и адипоциты. Более того, описано, что у человека FcRn экспрессируется в иммунных клетках, таких как антигенпредставляющие клетки, например, дендритные клетки, макрофаги и моноциты (J. Immunol. (2001) 166 (5), 3266-3276). Поскольку нормальный встречающийся в природе IgG1 неспособен связываться с FcRn в области нейтральных значений рН и способен только связываться с FcγR, встречающийся в природе IgG1 связывается с антигенпредставляющими клетками путем образования бинарного комплекса FcγR/IgG1. Участки фосфорилирования находятся во внутриклеточных доменах FcγR и FcRn. Как правило, фосфорилирование внутриклеточных доменов рецепторов, экспрессируемых на клеточных поверхностях, происходит путем конъюгации рецепторов, и в результате этого фосфорилирования рецепторы интернализуются. Даже если встречающийся в природе IgG1 образует бинарный комплекс FcγR/IgG1 на антигенпредставляющих клетках, конъюгация внутриклеточного домена FcγR не происходит. Однако, когда гипотетически молекула IgG, обладающая активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН образует комплекс, содержащий четыре компонента: FcγR/две молекулы FcRn/IgG, в результате может индуцироваться интернализация гетерокомплекса, содержащего четыре компонента, состоящего из FcγR/двух молекул FcRn/IgG, поскольку происходит конъюгация трех внутриклеточных доменов FcγR и FcRn. Полагают, что образование гетерокомплекса, содержащего четыре компонента, состоящих из FcγR/двух молекул FcRn/IgG, происходит на антигенпредставляющих клетках, экспрессирующих как FcγR, так и FcRn, и полагали, что в результате этого удержание в плазме молекул антитела, включенных в антигенпредставляющие клетки, ухудшается и также учитывалась возможность ухудшения иммуногенности.

Однако отсутствуют сообщения, подтверждающие путь, посредством которого антигенсвязывающие молекулы, содержащие FcRn-связывающий домен, такой как Fc-область, обладающий активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, связываются с иммунными клетками, такими как антигенпредставляющие клетки, экспрессирующие FcγR и FcRn вместе.

То, может ли образовываться четырехкомпонентный комплекс из FcγR/двух молекул FcRn/IgG, можно определять по тому, способна ли антигенсвязывающая молекула, содержащая Fc-область, обладающую активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, одновременно связываться с FcγR и FcRn. Таким образом, проводили эксперимент по одновременному связыванию с FcRn и FcγR Fc-области, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле в соответствии со способом, указанным ниже.

(3-2) Оценка одновременного связывания с FcRn и FcγR с использованием Biacore

Проводили оценку того, связывается ли одновременно FcRn человека или мыши и FcγR человека или мыши с антигенсвязывающей молекулой, с использованием системы Biacore Т100 или Т200 System (GE Healthcare). Исследуемую антигенсвязывающую молекулу улавливали с помощью FcRn человека или мыши, иммобилизованного на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare) способом присоединения аминов. Далее инжектировали разбавленные FcγR человека или мыши и подвижный буфер, используемый в качестве пустого образца, для обеспечения взаимодействия FcγR человека или мыши с антигенсвязывающей молекулой, связавшейся с FcRn на сенсорном чипе. В качестве подвижного буфера использовали буфер, состоящий из 50 ммоль/л фосфата натрия, 150 ммоль/л NaCl и 0,05% (масс./об.) Tween 20 (рН 7,4), и этот буфер также использовали для разбавления FcγR. Для регенерации сенсорного чипа использовали 10 ммоль/л Tris-HCl (рН 9,5). Все измерения связывания проводили при 25°С.

(3-3) Эксперимент по одновременному связыванию IgG человека, FcRn человека, FcγR человека или FcγR мыши

Проводили оценку того, связывается ли Fv4-IgG1-F157, полученное согласно примеру 1, которое является антителом человека, способным связываться с FcRn человека в условиях диапазона нейтральных значений рН, с различными типами FcγR человека или различными типами FcγR при одновременном связывании с FcRn человека.

Результат показал, что Fv4-IgG1-F157 было способно связываться с FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb и FcγRIIIa(F) человека одновременно со связыванием с FcRn человека (фиг. 3, 4, 5, 6 и 7). Кроме того, было показано, что Fv4-IgG1-F157 способно связываться с FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV одновременно со связыванием с FcRn (фиг. 8, 9, 10 и 11).

Исходя из вышесказанного, было показано, что антитела человека, обладающие способностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, способны связываться с различными типами FcγR человека и различными типами FcγR мыши, такими как FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb и FcγRIIIa(F) человека, а также FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV мыши одновременно со связыванием с FcRn человека.

(3-4) Эксперимент по одновременному связыванию IgG человека, FcRn мыши и FcγR мыши

Проводили оценку того, связывается ли Fv4-IgG1-F20, полученное согласно примеру 1, которое представляет собой антитело человека, обладающее активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН, с различными типами FcγR мыши одновременно со связыванием с FcRn мыши.

Результат показал, что Fv4-IgG1-F20 было способно связываться с FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV мыши одновременно со связыванием с FcRn мыши (фиг. 12).

(3-5) Эксперимент по одновременному связыванию IgG мыши, FcRn мыши и FcγR мыши

Проводили оценку того, связывается ли mPM1-mIgG1-mF3, полученное согласно примеру 2, которое представляет собой антитело мыши, обладающее активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН, с различными типами FcγR мыши одновременно со связыванием с FcRn мыши.

Результат показал, что mPM1-mIgG1-mF3 было способно связываться с FcγRIIb и FcγRIII мыши одновременно со связыванием с FcRn мыши (фиг. 13). Исходя из сообщения, что IgG1-антитело мыши не обладает способностью связываться с FcγRI и FcγRIV мыши (J. Immunol. (2011) 187 (4), 1754-1763), результат, что связывание с FcγRI и FcγRIV мыши не было подтверждено, считается правдоподобным результатом.

Исходя из этих данных, было показано, что антитела человека и антитела мыши, обладающие активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН, также способны связываться с различными типами FcγR мыши одновременно со связыванием с FcRn мыши.

Указанные выше данные указывают на возможность образования гетерокомплекса, содержащего одну молекулу Fc, две молекулы FcRn и одну молекулу FcγR, без какого-либо взаимного препятствования, хотя в Fc-области IgG человека и мыши присутствует FcRn-связывающая область и FcγR-связывающая область.

Это свойство Fc-области антитела быть способным образовывать такой гетерокомплекс ранее не было описано, и в рамках настоящего изобретения было определено впервые. Как описано ранее, на антигенпредставляющих клетках экспрессируются различные типы активных FcγR и FcRn, и полагают, что образование этого типа четырехкомпонентного комплекса на антигенпредставляющих клетках, повышает аффинность антигенпредставляющих молекул, одновременно далее ускоряя включение в антигенпредставляющие клетки путем усиления сигналов интернализации через конъюгацию внутриклеточного домена. Как правило, антигенсвязывающие молекулы, включенные в антигенпредставляющие клетки, разрушаются в лизосомах антигенпредставляющих клеток, а затем представляются Т-клеткам.

Иными словами, антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью связывания с FcRn в области нейтральных значений рН образуют гетерокомплекс, содержащий четыре компонента, включая одну молекулу активного FcγR и две молекулы FcRn, и полагают, что это является результатом включения в антигенпредставляющие клетки, тем самым ухудшая удержание в плазме и далее ухудшая иммуногенность.

Следовательно, в случае внесения мутации в антигенсвязывающую молекулу, обладающую активностью связывания с FcRn в области нейтральных значений рН, с получением антигенсвязывающей молекулы, в которой снижена способность образовывать такой четырехкомпонентный комплекс, и введения этой антигенсвязывающей молекулы в организм, время удержания в плазме этой антигенсвязывающей молекулы увеличивается, и может ингибироваться индукция иммунного ответа в организме (а именно, иммуногенность может быть снижена). Примеры предпочтительных вариантов осуществления антигенсвязывающих молекул, включенных в клетки без образования такого комплекса, включают три типа, показанных ниже.

(Вариант осуществления 1) Антигенсвязывающие молекулы, которые обладают активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и активность связывания которых с активным FcγR является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена.

Антигенсвязывающие молекулы согласно варианту осуществления 1 образуют комплекс, содержащий три компонента, путем связывания с двумя молекулами FcRn, но не образуют комплекс, содержащий активный FcγR.

(Вариант осуществления 2) Антигенсвязывающие молекулы, которые обладают активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и обладают активностью селективного связывания с ингибирующим FcγR

Антигенсвязывающие молекулы согласно варианту осуществления 2 способны образовывать комплекс, содержащий четыре компонента, путем связывания с двумя молекулами FcRn и одной молекулой ингибирующего FcγR. Однако поскольку антигенсвязывающая молекула способна связываться только с одной молекулой FcγR, одна антигенсвязывающая молекула неспособна связываться с другим активным FcγR, в то время как она связана с ингибирующим FcγR. Более того, сообщалось, что антигенсвязывающие молекулы, которые включены в клетки, все еще будучи связанными с ингибирующими FcγR, рециклируют на клеточную мембрану, чтобы избежать разрушения в клетках (Immunity (2005) 23, 503-514). То есть, полагают, что антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью селективного связывания с ингибирующим FcγR, неспособны образовывать комплекс, содержащий активный FcγR, который вызывает иммунный ответ.

(Вариант осуществления 3) Антигенсвязывающие молекулы, в которых только один из двух полипептидов, составляющих FcRn-связывающий домен, обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, в то время как другой не обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН

Хотя антигенсвязывающие молекулы согласно варианту осуществления 3 способны образовывать тройной комплекс путем связывания с одной молекулой FcRn и одной молекулой FcγR, они не образуют гетерокомплекс, содержащий четыре компонента, включающих две молекулы FcRn и одну молекулу FcγR.

Ожидается, что антигенсвязывающие молекулы согласно вариантам осуществления 1-3 будут способны повышать удержание в плазме и снижать иммуногенность по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, которые способны образовывать комплексы, содержащие четыре компонента, включающие две молекулы FcRn и одну молекулу FcγR.

[Пример 4] Оценка удержания в плазме антител человека, которые обладают активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγR человека и мыши является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена

(4-1) Получение антитела, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, и которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом

Антигенсвязывающие молекулы согласно варианту осуществления 1 среди трех вариантов осуществления, представленных в примере 3, а именно, антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и активность связывания которых с активным FcγR является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, получали аналогично тому, как описано ниже.

Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F157, полученные согласно примеру 1, представляют собой антитела, которые обладают активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, и связываются с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом. Получали варианты, у которых связывание с FcγR мыши было снижено посредством аминокислотной замены, в которой Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) в их аминокислотных последовательностях. Более конкретно, получали VH3-IgG1-F140 (SEQ ID NO: 51), в котором Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F21. Кроме того, получали VH3-IgG1-F424 (SEQ ID NO: 52), в котором Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F157.

Fv4-IgG1-F140 и Fv4-IgG1-F424, содержащие эти тяжелые цепи и легкую цепь VL3-CK, получали с использованием способа справочного примера 2.

(4-2) Подтверждение активности связывания с FcRn человека и FcγR мыши

Активность связывания (константа диссоциации KD) с FcRn человека при рН 7,0 и активность связывания с FcγR мыши при рН 7,4 антител, содержащих тяжелые цепи из полученных VH3-IgG1-F21, VH3-IgG1-F140, VH3-IgG1-F157 или VH3-IgG1-F424 и легкую цепь из L(WT)-CK, измеряли с использованием способа, представленного ниже.

(4-3) Кинетический анализ связывания с FcRn человека

Кинетический анализ связывания между FcRn человека и упомянутыми выше антителами проводили с использованием Biacore Т100 или Т200 (GE Healthcare). Исследуемые антитела улавливали на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare), на котором было соответствующим образом иммобилизовано подходящее количество белка L (ACTIGEN) способом присоединения аминов. Далее инжектировали разбавленный FcRn человека и подвижный буфер, используемый в качестве пустого образца, для обеспечения взаимодействия между FcRn человека и антителом, уловленном на сенсорном чипе. В качестве подвижного буфера использовали буфер, состоящий из 50 ммоль/л фосфата натрия, 150 ммоль/л NaCl и 0,05% (масс./об.) Tween 20 (рН 7,0 или рН 7,4), и каждый буфер также использовали для разбавления FcRn человека. Для регенерации сенсорного чипа использовали 10 ммоль/л глицин-HCl (рН 1,5). Все измерения связывания проводили при 25°С. K_D (M) каждого антитела с FcRn человека вычисляли на основе кинетических параметров, т.е. константы скорости ассоциации ka (1/Мс) и константы скорости диссоциации kd (1/с), вычисленных из сенсограммы, полученной путем измерения. Программное обеспечение Biacore Т100 или Т200 Evaluation Software (GE Healthcare) использовали для вычисления каждого параметра.

Результаты представлены в таблице 6 ниже.

Активность связывания с FcγR мыши при рН 7,4 измеряли с использованием способа, представленного ниже.

(4-4) Оценка активности связывания с FcγR мыши

Активность связывания между антителами и FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcγRIV мыши (R&D Systems, Sino Biological) (далее обозначаются как FcγR мыши) оценивали с использованием Biacore Т100 или Т200 (GE Healthcare). Исследуемые антитела улавливали с помощью белка L (ACTIGEN), который был иммобилизован в подходящих количествах на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare) способом присоединения аминов. Далее инжектировали разбавленные FcγR мыши и подвижный буфер, используемый в качестве пустого образца, для обеспечения взаимодействия с антителом, уловленном на сенсорном чипе. В качестве подвижного буфера использовали буфер, состоящий из 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl и 0,05% (масс./об.) Tween 20 (рН 7,4), и этот буфер также использовали для разбавления FcγR мыши. Для регенерации сенсорного чипа использовали 10 ммоль/л глицин-HCl (рН 1,5). Все измерения проводили при 25°С.

Активность связывания с FcγR мыши может быть представлена посредством относительной активности связывания с FcγR мыши. Антитело улавливали с помощью белка L, и величину изменения на сенсограмме до и после улавливания антитела определяли как X1. Далее FcγR мыши позволяли взаимодействовать с антителом, и величину, полученную путем вычитания активности связывания FcγR мыши, соответствующую величине изменения на сенсограмме до и после позволения подвижному буферу взаимодействовать с антителом, уловленным с помощью белка L (ΔА2), из величины, полученной путем умножения на 1500 величины, полученной делением активности связывания FcγR мыши, соответствующей величине изменения на сенсограмме до и после этого взаимодействия (ΔА1), на количество (X) каждого уловленного антитела, делили на количество каждого уловленного антитела (X), а затем умножали на 1500 с получением активности связывания FcγR мыши (Y) (уравнение 1).

[Уравнение 1]

Активность связывания FcγR мыши (Y)=(ΔА1-ΔА2)/Х×1500

Результаты представлены в таблице 7 ниже.

В соответствии с результатами, представленными в таблицах 2 и 3, Fv4-IgG1-F140 и Fv4-IgG1-F424 продемонстрировали снижение связывания с FcγR мыши без влияния на активность связывания с FcRn человека по сравнению с Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F157.

(4-5) Исследование PK in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека

Исследование PK при введении полученных антител Fv4-IgG1-F140, Fv4-IgG1-F424, Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F157 трансгенным мышам с FcRn человека проводили способом, представленным ниже.

Антитело против рецептора IL-6 человека вводили в количестве 1 мг/кг при однократном введении в хвостовую вену трансгенных мышей с FcRn человека (мышь В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линия 32+/+, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Взятие крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Плазму получали путем центрифугирования сразу собранной крови в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. Отделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже, до времени измерения.

(4-6) Измерение концентрации антитела против рецептора IL-6 человека с помощью ELISA

Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли с помощью ELISA. Сначала F(ab') 2-фрагмент антитела против IgG человека (специфичный к γ-цепи) (SIGMA) распределяли в планшеты Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International) и позволяли им стоять в течение ночи при 4°С с получением планшетов с антителом против IgG человека в твердой фазе. Получали образцы для калибровочной кривой, имеющие концентрации антитела против IgG человека в плазме 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0,0125 мкг/мл, и образцы плазмы мыши для измерения, разбавленные в 100 раз или более. Затем смесям, полученным добавлением 200 мкл растворимого рецептора IL-6 человека в концентрации 20 нг/мл к 100 мкл образцов для калибровочной кривой и образцов плазмы для измерения, позволяли стоять нетронутыми в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшету с антителом против IgG человека на твердой фазе, в каждую из лунок которого распределяли смеси, далее позволяли стоять нетронутым в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем проводили хромогенную реакцию реакционной жидкости, полученной путем реакции в течение одного часа с биотинилированным антителом против IL-6 R человека (R&D) при комнатной температуре и дальнейшей реакции в течение одного часа со стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) при комнатной температуре с использованием ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) в качестве субстрата. После остановки реакции 1 Н серной кислотой (Showa Chemical) измеряли поглощение реакционных жидкостей в каждой лунке при 4 50 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме у мышей вычисляли из величин поглощения на калибровочной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices).

Концентрации антител с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека после внутривенного введения антител с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека трансгенным мышам с FcRn человека представлены на фиг. 14.

Исходя из результатов, представленных на фиг. 14, было выявлено, что Fv4-IgG1-F140, связывание которого с FcγR мыши было более низким по сравнению с Fv4-IgG1-F21, демонстрирует увеличение времени удержания в плазме по сравнению с Fv4-IgG1-F21. Аналогично, было выявлено, что Fv4-IgG1-F424, связывание которого с FcγR мыши было более низким по сравнению с Fv4-IgG1-F157, демонстрирует пролонгированное удержание в плазме по сравнению с Fv4-IgG1-F157.

Исходя из этого, было показано, что антитело, которое обладает активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, и имеет FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR является более низкой, чем у нормального FcγR-связывающего домена, имеет более высокое удержание в плазме, чем антитело, имеющее нормальный FcγR-связывающий домен.

Хотя настоящее изобретение не связано с конкретной теорией, полагают, что причиной наблюдения такого увеличения удержания в плазме антигенсвязывающих молекул является то, что поскольку антигенсвязывающие молекулы обладают активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, и обладают FcγR-доменом, активность связывания которого с FcγR является более низкой, чем у встречающегося в природе FcγR-связывающего домена, образование четырехкомпонентного комплекса, описанного в примере 3, ингибировалось. Иными словами, полагают, что Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F157, которые образуют четырехкомпонентный комплекс на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток легче включаются в антигенпредставляющие клетки. С другой стороны, полагают, что в случае Fv4-IgG1-F140 и Fv4-IgG1-F424, которые классифицируют как вариант осуществления 1, указанный в примере 3, и которые не образуют четырехкомпонентный комплекс на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток, включение в антигенпредставляющие клетки ингибируется. В этом случае, полагают, что включение антигенсвязывающих молекул в клетки, такие как сосудисто-эндотелиальные клетки, которые не экспрессируют FcγR, в основном включает неспецифическое включение или включение, опосредуемое FcRn на клеточной мембране, и считают, что на него не влияет снижение активности связывания с FcγR. Иными словами, полагают, что увеличение удержания в плазме, которое наблюдали, как описано выше, является результатом селективного ингибирования включения в иммунные клетки, включая антигенпредставляющие клетки.

[Пример 5] Оценка удержания в плазме антител человека, которые обладают активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН, но не обладают активностью связывания с FcγR мыши

(5-1) Получение антител человека, которые не обладают активностью связывания с FcγR человека и мыши, и связываются с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом

Получали антитела аналогично тому, как показано ниже, чтобы получить антитела человека, которые не обладают активностью связывания с FcγR человека и мыши и связываются с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом. VH3-IgG1-F760 (SEQ ID NO: 53), которое не обладает активностью связывания с FcγR человека и мыши, получали путем аминокислотной замены, полученной путем замены Arg вместо Leu в положении 235 (нумерация EU) и аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо Ser в положении 239 аминокислотной последовательности VH3-IgG1.

Аналогично, получали VH3-IgG1-F821 (SEQ ID NO: 57), VH3-IgG1-F939 (SEQ ID NO: 58) и VH3-IgG1-F1009 (SEQ ID NO: 59), которые не обладают активностью связывания с FcγR человека и мыши, путем аминокислотной замены, полученной путем замены Arg вместо Leu в положении 235 (нумерация EU) и аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо Ser в положении 239 соответствующих аминокислотных последовательностей VH3-IgG1-F11 (SEQ ID NO: 54), VH3-IgG1-F890 (SEQ ID NO: 55) и VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 56).

Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 и Fv4-IgG1-F1009, содержащие эти антитела в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, получали с использованием способа справочного примера 2.

(5-2) Подтверждение активности связывания с FcRn человека и FcγR мыши

Активность связывания (константа диссоциации KD) с FcRn человека при рН 7,0 антител, содержащих VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1-F939 или VH3-IgG1-F1009 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK в качестве легкой цепи, полученные с использованием способа справочного примера 2, измеряли с использованием способа примера 4. Результаты измерения представлены ниже в таблице 8 ниже.

Активность связывания с FcγR мыши при рН 7,4 антител, содержащих VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1-F939 или VH3-IgG1-F1009 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK в качестве легкой цепи измеряли аналогично тому, как в способе примера 4. Результаты измерения представлены в таблице 9 ниже.

В соответствии с результатами, представленными в таблицах 4 и 5, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 и Fv4-IgG1-F1009 продемонстрировали снижение связывания с FcγR мыши без влияния на активность связывания с FcRn человека по сравнению с Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890 и Fv4-IgG1-F947.

(5-3) Исследование PK in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека

Исследование PK при введении полученных антител Fv4-IgG1 и Fv4-IgG1-F760 трансгенным мышам с FcRn человека проводили в соответствии со способом, представленным ниже.

Антитело против рецептора IL-6 человека вводили в количестве 1 мг/кг при однократном введении в хвостовую вену трансгенных мышей с FcRn человека (мышь В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линия 32+/+, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Взятие крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Плазму получали путем центрифугирования сразу собранной крови в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. Отделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже, до времени измерения.

Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши измеряли с помощью ELISA аналогично тому, как в способе согласно примеру 4. Результаты представлены на фиг. 15. Fv4-IgG1-F760, которое снижало активность связывания Fv4-IgG1 с FcγR мыши, продемонстрировало удержание в плазме, практически равное удержанию в плазме Fv4-IgG1-F11; однако не наблюдали эффекта улучшения удержания в плазме путем снижения активности связывания с FcγR.

(5-4) Исследование PK in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека

Исследование PK при введении полученных антител Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 и Fv4-IgG1-F1009 трансгенным мышам с FcRn человека проводили в соответствии со способом, представленным ниже.

Антитело против рецептора IL-6 человека вводили в количестве 1 мг/кг при однократном введении под кожу спины трансгенных мышей с FcRn человека (мышь В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линия 32+/+, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Взятие крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Плазму получали путем центрифугирования сразу собранной крови в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. Отделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже, до времени измерения.

Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши измеряли с помощью ELISA аналогично тому, как в способе согласно примеру 4. Результаты представлены на фиг. 16. Fv4-IgG1-F821, которое снижало активность связывания Fv4-IgG1-F11 с FcγR мыши, продемонстрировало время удержания в плазме, практически равное времени удержания в плазме Fv4-IgG1-F11. С другой стороны, было выявлено, что Fv4-IgG1-F939, которое снижало активность связывания Fv4-IgG1-F890 с FcγR мыши, демонстрирует увеличенное удержание в плазме по сравнению с Fv4-IgG1-F890. Аналогично, было выявлено, что Fv4-IgG1-F1009, которое снижало активность связывания Fv4-IgG1-F947 с FcγR мыши, демонстрирует увеличенное удержание в плазме по сравнению с Fv4-IgG1-F947.

С другой стороны, поскольку не было выявлено отличий в удержании в плазме как для Fv4-IgG1, так и для IgG1-F760, и Fv4-IgG1, которое не обладает активностью связывания FcRn в области нейтральных значений рН, способно образовывать бинарный комплекс с FcγR на иммунных клетках, но неспособно образовывать четырехкомпонентный комплекс, полагали, что не будет наблюдаться улучшение удержания в плазме, свойственное снижению активности связывания с FcγR. То есть, можно утверждать, что увеличение времени удержания в плазме наблюдалось только в результате снижения активности связывания с FcγR антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания FcRn в области нейтральных значений рН, и ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса. Исходя также из этих данных, полагают, что образование четырехкомпонентного комплекса выполняет важную роль в увеличении времени удержания в плазме.

(5-5) Получение антител человека, которые не обладают активностью связывания с FcγR человека и мыши, и связываются с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом

VH3-IgG1-F1326 (SEQ ID NO: 155), в котором активность связывания с FcγR человека и мыши снижена, получали посредством аминокислотной замены, полученной путем замены Ala вместо Leu в положении 234 (нумерация EU) и аминокислотной замены, полученной путем замены Ala вместо Leu в положении 235 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 56).

Fv4-IgG1-F1326, содержащее VH3-IgG1-F1326 в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи получали с использованием способа справочного примера 2.

(5-6) Подтверждение активности связывания с FcRn человека и FcγR мыши

Активность связывания (константа диссоциации KD) с FcRn человека при рН 7,0 антитела, содержащего VH3-IgG1-F1326 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK в качестве легкой цепи, полученного с использованием способа справочного примера 2, измеряли с использованием способа примера 4. Кроме того, активность связывания с FcγR мыши при рН 7,4 измеряли аналогично тому, как в способе примера 4. Результаты измерения представлены в таблице 10 ниже.

Согласно результатам, представленным в таблице 10, Fv4-IgG1-F1326 продемонстрировало снижение связывания с FcγR мыши без влияния на активность связывания с FcRn человека по сравнению с Fv4-IgG1-F947.

(5-7) Исследование PK in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека

Исследование PK при введении полученного антитела Fv4-IgG1-F1326 трансгенным мышам с FcRn человека проводили аналогично способу примера 5-4. Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши измеряли с помощью ELISA аналогично тому, как и в способе согласно примеру 4. Результаты представлены на фиг. 54 вместе с результатами для Fv4-IgG1-F947, полученного согласно примеру 5-4. Было выявлено, что Fv4-IgG1-F1326, которое снижало активность связывания Fv4-IgG1-F947 с FcγR мыши, демонстрирует увеличение времени удержания в плазме по сравнению с Fv4-IgG1-F947.

Исходя из указанного выше, в случае антитела человека, имеющего увеличенное связывание с FcRn человека в нейтральных условиях, было показано, что возможно увеличивать время удержания в плазме у трансгенных мышей с FcRn человека путем снижения активности связывания с FcγR мыши и ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса. В этом случае, чтобы продемонстрировать эффект увеличения времени удержания в плазме путем снижения активности связывания с FcγR мыши, аффинность (KD) в отношении FcRn человека при рН 7,0 предпочтительно должна превышать 310 нМ и более предпочтительно 110 нМ или менее.

В результате было подтверждено, что время удержания в плазме увеличивается путем сообщения свойств согласно варианту осуществления 1 антигенсвязывающим молекулам аналогично примеру 4. В этом случае полагают, что выявленное увеличение времени удержания в плазме является следствием селективного ингибирования включения в иммунные клетки, включая антигенпредставляющие клетки, и в результате этого ожидается, что является возможным ингибирование индукции иммунного ответа.

[Пример б] Оценка удержания в плазме антител мыши, которые обладают активностью связывания с FcRn мыши в области нейтральных значений рН, но не обладают активностью связывания с FcγR мыши

(6-1) Получение антител мыши, которые связываются с рецептором IL-6 человека, но не обладают активностью связывания с FcγR мыши

В примерах 4 и 5 было показано, что антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН и содержащие FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR мыши является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, демонстрируют улучшенное удержание в плазме у трансгенных мышей с FcRn человека. Аналогично, для антигенсвязывающих молекул, которые обладают активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН и содержат FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR мыши является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, проверяли увеличивалось ли их удержание в плазме у нормальных мышей.

mPM1H-mIgG1-mF40 (SEQ ID NO: 60) получали путем аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо Pro в положении 235 (нумерация EU) и аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо Ser в положении 239 в аминокислотной последовательности mPM1H-mIgG1-mF38, полученной согласно примеру 2, в то время как mPM1H-mIgG1-mF39 (SEQ ID NO: 61) получали путем аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо Pro в положении 235 (нумерация EU), и аминокислотной замены, полученной путем замены Lys вместо Ser в положении 239 аминокислотной последовательности mPM1H-mIgG1-mF14.

(6-2) Подтверждение активности связывания с FcRn мыши и FcγR мыши

Активность связывания (константа диссоциации KD) с FcRn мыши при рН 7,0 измеряли с использованием способа согласно примеру 2. Результаты представлены в таблице 11 ниже.

Активность связывания с FcγR при рН 7,4 измеряли с использованием способа примера 4. Результаты представлены в таблице 12 ниже.

(6-3) Исследование PK in vivo с использованием нормальных мышей

Исследование PK при введении полученных mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39 и mPM1-mIgG1-mF40 нормальным мышам проводили в соответствии со способом, описанным ниже.

Антитело против рецептора IL-6 человека вводили в количестве 1 мг/кг при однократном введении под кожу спины нормальных мышей (мышь C57BL/6J, Charles River Japan). Взятие крови проводили через 5 минут, 7 часов и 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Плазму получали путем немедленного центрифугирования взятой крови в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. Отделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже до времени измерения.

(6-4) Измерение концентрации антитела мыши против рецептора IL-6 человека с помощью ELISA

Концентрацию антитела мыши против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли с помощью ELISA. Сначала растворимый рецептор IL-6 человека распределяли в планшет Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International), а затем позволяли ему стоять нетронутым в течение ночи при 4°С для получения планшета с растворимым рецептором IL-6 человека в твердой фазе. Получали образцы для калибровочной кривой, имеющие концентрацию антитела мыши против рецептора IL-6 человека в плазме 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078, 0,039 и 0,020 мкг/мл, и образцы плазмы мыши для измерения, разбавленные в 100 раз или более. Аликвоты этих образцов для калибровочной кривой и образцов плазмы для измерения объемом 100 мкл распределяли в каждую лунку планшета с растворимым рецептором IL-6 человека в твердой фазе, а затем позволяли ему стоять нетронутым в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем проводили хромогенную реакцию реакционной жидкости, полученной путем реакции с антителом против IgG мыши с пероксидазой (SIGMA) в течение 1 часа при комнатной температуре и далее реакции со стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) в качестве субстрата. После остановки реакции путем добавления 1 Н серной кислоты (Showa Chemical), измеряли поглощение реакционных жидкостей в каждой лунке при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме у мышей вычисляли из величин поглощения на калибровочной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменения концентрации антител в плазме нормальных мышей после внутривенного введения при измерении этим способом представлены на фиг. 17.

Исходя из результатов, представленных на фиг. 17, было выявлено, что mPM1-mIgG1-mF40, которое не обладает активностью связывания с FcγR мыши, демонстрирует увеличение времени удержания в плазме по сравнению с mPM1-mIgG1-mF38. Кроме того, было выявлено, что mPM1-mIgG1-mF39, которое не обладает активностью связывания с FcγR мыши, демонстрирует увеличение времени удержания в плазме по сравнению с mPM1-mIgG1-mF14.

Исходя из указанного выше, было показано, что антитело, обладающее активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН и имеющее FcγR-связывающий домен, который не обладает активностью связывания с FcγR мыши, обладает более высоким временем удержания в плазме у нормальных мышей, чем антитело, имеющее нормальный FcγR-связывающий домен.

В результате, аналогично тому, как в примерах 4 и 5, было подтверждено, что время удержания в плазме является высоким для антигенсвязывающих молекул, имеющих свойства антигенсвязывающих молекул согласно варианту осуществления 1. Хотя настоящее изобретение не связывают с конкретной теорией, полагают, что увеличение удержания в плазме, наблюдаемое в этом случае, является результатом селективного ингибирования включения в иммунные клетки, включая антигенпредставляющие клетки, и в результате этого ожидается, что является возможным ингибирование индукции иммунного ответа.

[Пример 7] Оценка in vitro иммуногенности гуманизированного антитела (антитело против рецептора IL-6 человека), обладающего активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и содержащего FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена

Для оценки иммуногенности у человека антигенсвязывающей молекулы согласно варианту 1, а именно, антигенсвязывающей молекулы, обладающей активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и содержащей антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с активным FcγR является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, оценивали ответ Т-клеток на антигенсвязывающую молекулу in vitro в соответствии со способом, показанным ниже.

(7-1) Подтверждение активности связывания с FcRn человека

Константы ассоциации (KD) VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F21 и VH3/L(WT)-IgG1-F140 с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН (рН 7,0), измеренные согласно примеру 4, представлены в таблице 13 ниже.

(7-2) Оценка активности связывания с FcγR человека

Активность связывания VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F21 и VH3/L(WT)-IgG1-F140 с FcγR человека при рН 7,4 измеряли с использованием способа, представленного ниже.

Активность связывания между антителами и FcγRIa, FcγRIIa (H), FcγRIIa (R), FcγRIIb и FcγRIIIa (F) человека (далее обозначаемыми как FcγR человека) оценивали с использованием Biacore Т100 или Т200 (GE Healthcare). Исследуемые антитела улавливали с помощью белка L (ACTIGEN), который был иммобилизован в подходящих количествах на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare) способом присоединения аминов. Далее инжектировали разбавленные FcγR человека и подвижный буфер, используемый в качестве пустого образца для обеспечения взаимодействия с антителами, уловленными на сенсорном чипе. В качестве подвижного буфера использовали буфер, состоящий из 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl и 0,05% (масс./об.) Tween 20 (рН 7,4) и этот буфер также использовали для разбавления FcγR человека. Для регенерации сенсорного чипа использовали 10 ммоль/л глицин-HCl (рН 1,5). Все измерения проводили при 25°С.

Активность связывания с FcγR может быть отражена с помощью относительной активности связывания с FcγR человека. Антитело улавливали с помощью белка L, и величину изменения на сенсограмме до и после улавливания антитела определяли как X1. Далее FcγR человека позволяли взаимодействовать с антителом, и величину, полученную путем вычитания активности связывания FcγR человека, соответствующей величине изменения на сенсограмме до и после позволения подвижному буферу взаимодействовать с антителом, уловленным с помощью белка L (ΔА2), из величины, полученной путем умножения на 1500 величины, полученной делением активности связывания FcγR человека, соответствующей величине изменения на сенсограмме до и после взаимодействия (ΔА1) на количество (X) каждого уловленного антитела, делили на количество каждого уловленного антитела (X), а затем умножали на 1500 с получением активности связывания FcγR человека (Y) (Уравнение 2).

[Уравнение 2] Активность связывания FcγR человека (Y)=(ΔА1-ΔА2)/X × 1500

Результаты представлены в таблице 14 ниже.

Согласно результатам, приведенным в таблице 14, Fv4-IgG1-F140 продемонстрировало снижение связывания с каждым FcγR человека без влияния на активность связывания с FcRn человека по сравнению с Fv4-IgG1-F21.

(7-3) Исследование иммуногенности in vitro с использованием РВМС человека

Исследование иммуногенности in vitro проводили, как показано ниже, с использованием Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F140, полученных согласно примеру 1.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из крови, взятой от здоровых добровольцев. После отделения РВМС от крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll (GE Healthcare), CD8⁺ Т-клетки выделяли из РВМС магнитным способом с использованием Dynabeads CD8 (Invitrogen) в соответствии с предоставленным стандартным протоколом. Далее CD25^hi Т-клетки выделяли магнитным способом с использованием Dynabeads CD25 (Invitrogen) в соответствии с предоставленным стандартным протоколом.

Анализ пролиферации проводили аналогично тому, как описано ниже. То есть, РВМС от каждого донора, из которых были выделены CD8⁺ Т-клетки и CD25^hi Т-клетки и которые ресуспендировали в среде AIMV (Invitrogen), содержащей 3% деактивированную сыворотку человека, до концентрации 2 × 10⁶/мл, добавляли в планшет с 24-ячейками с плоским дном в количестве 2 × 10⁶ клеток на ячейку. После культивирования в течение 2 часов в условиях 37°С и 5% CO₂, клетки, к которым добавляли исследуемое вещество до конечной концентрации 10, 30, 100 и 300 мкг/мл, культивировали в течение 8 суток. В процессе культивирования после переноса в круглодонный 9б-луночный планшет к 150 мкл суспензии добавляли BrdU (бромдезоксиуридин) на 6, 7 и 8 сутки культивирования, после чего клетки далее культивировали в течение 24 часов. BrdU, который включался в ядра этих клеток, культивированных с BrdU, окрашивали с использованием набора BrdU Flow Kit (BD Bioscience) в соответствии со стандартным предоставленным протоколом, в то время как поверхностные антигены (CD3, CD4 и CD19) окрашивали с помощью антител против CD3, против CD4 и против CD19 (BD Bioscience). Далее процент BrdU-положительных CD4⁺ Т-клеток выявляли с помощью BD FACS Calibur или BD FACS CantII (BD). Вычисляли процент BrdU-положительных CD4⁺ Т-клеток при каждой концентрации исследуемого вещества из 10, 30, 100 и 300 мкг/мл на 6, 7 и 8 сутки культивирования, а затем вычисляли его средние величины.

Результаты представлены на фиг. 18. На фиг. 18 показаны пролиферативные ответы CD4⁺ Т-клеток на Fv4-IgG1-F21 и Fv4-IgG1-F140 в РВМС пяти доноров-людей, из которых были выделены CD8⁺ Т-клетки и CD25^hi Т-клетки. Сначала увеличения пролиферативного ответа CD4⁺ Т-клеток, свойственного добавлению исследуемого вещества, не наблюдали в РВМС доноров А, В и D по сравнению с отрицательным контролем. Полагают, что эти доноры по своей природе не обладают иммунным ответом на исследуемые вещества. С другой стороны, пролиферативный ответ CD4⁺ Т-клеток, свойственный добавлению исследуемого вещества, наблюдали в РВМС доноров С и Е по сравнению с отрицательным контролем. Одним из моментов, которые необходимо отметить, является то, что пролиферативный ответ CD4⁺ Т-клеток Fv4-IgG1-F140 имел тенденцию к снижению по сравнению с Fv4-IgG1-F21 для обоих доноров С и Е. Как описано выше, Fv4-IgG1-F140 обладает более низкой активностью связывания с FcγR человека, чем Fv4-IgG1-F21, и обладает свойствами варианта осуществления 1. Исходя из представленных выше результатов, полагают, что иммуногенность можно подавлять в отношении антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и содержащих антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена.

[Пример 8] Оценка in vitro иммуногенности гуманизированного антитела (антитело против А33 человека), обладающего активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и содержащего антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена

(8-1) Получение hA33-IgG1

Поскольку РВМС человека по своей природе обладают низким иммунным ответом на Fv4-IgG1-F21, как показано в примере 7, было предположено, что они не пригодны для оценки подавления иммунного ответа на Fv4-IgG1-F140, содержащего антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с FcγR является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена. Таким образом, получали гуманизированное антитело против А33 (ha33-IgG1), которое представляет собой гуманизированное IgG1-антитело к антигену А33, для усиления способности выявления эффектов снижения иммуногенности в системе оценки иммуногенности in vitro.

В случае ha33-IgG1 в клиническом испытании было подтверждено, что анти-антитело продуцируется у от 33% до 73% (Hwang, et al. (Methods (2005) 36, 3-10) и Walle, et al. (Expert Opin. Bio. Ther. (2007) 7(3), 405-418)). Поскольку высокая иммуногенность hA33-IgG1 берет свое начало в последовательности вариабельной области, для молекул, в которых активность связывания с FcRn в области нейтральных значений рН является усиленной для ha33-IgG1, было бы легко выявлять эффекты снижения иммуногенности, которые возникают в результате ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса путем снижения активности связывания с FcγR.

Аминокислотные последовательности ha33H (SEQ ID NO: 62), используемой в качестве вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела против А33 и hA33L (SEQ ID NO: 63), используемой в качестве вариабельной области легкой цепи, получали, исходя из известной информации (British Journal of Cancer (1995) 72, 1364-1372). Кроме того, встречающийся в природе IgG1 человека (SEQ ID NO: 11, далее обозначаемый как IgG1) использовали в качестве константной области тяжелой цепи, и встречающуюся в природе последовательность каппа человека (SEQ ID NO: 64, далее обозначаемую как k0) использовали в качестве константной области легкой цепи.

Экспрессирующий вектор, содержащий последовательности оснований тяжелой цепи ha33H-IgG1 и легкой цепи hA33L-k0, получали в соответствии со способом справочного примера 1. Кроме того, получали гуманизированное антитело против А33 в форме ha33-IgG1, содержащего тяжелую цепь ha33H-IgG1 и легкую цепь hA33L-k0, в соответствии со способом справочного примера 2.

(8-2) Получение связывающего А33 антитела, обладающего активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН

Поскольку полученное ha33-IgG1 является антителом человека, имеющим встречающуюся в природе Fc-область человека, оно не обладает активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН. Таким образом, вносили аминокислотную модификацию в константную область тяжелой цепи ha33-IgG1 для сообщения способности связываться с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН.

Более конкретно, hA33H-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 65) получали путем замены Tyr вместо Met в положении 252 (нумерация EU), замены Pro вместо Val в положении 308 (нумерация EU) и замены Tyr вместо Asn в положении 434 (нумерация EU) в константной области тяжелой цепи ha33-IgG1 в форме ha33H-IgG1. С использованием способа справочного примера 2, получали связывающее А33 антитело, обладающее активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, в форме hA33-IgG1-F21, содержащего hA33H-IgG1-F21 в качестве тяжелой цепи и hA33L-k0 в качестве легкой цепи.

(8-3) Получение связывающего А33 антитела, содержащего FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека в условиях области нейтральных значений рН является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена

Получали hA33H-IgG1-F140 (SEQ ID NO: 66), в котором Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) в аминокислотной последовательности hA33H-IgG1-F21, для снижения активности связывания hA33-IgG1-F21 с FcγR человека.

(8-4) Оценка иммуногенности различных типов связывающих А33 антител с помощью анализа Т-клеток in vitro

Иммуногенность полученного ha33-IgG1-F21 и hA33-IgG1-F140 оценивали с использованием того же способа, что и в примере 7. Более того, здоровые добровольцы, служащие в качестве доноров, не были теми же индивидуумами, что и здоровые добровольцы, от которых были получены РВМС, использованные в примере 7. Иными словами, донор А в примере 7 и донор А в этом испытании были различными здоровыми добровольцами.

Результаты исследования представлены на фиг. 19. На фиг. 19 проводится сравнение между результатами для hA33-IgG1-F21, которое обладает активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН, и hA33-IgG1-F140, которое содержит FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена. Поскольку ответ на ha33-IgG1-F21 не выявлялся в РВМС, полученных от доноров С, D и F, по сравнению с отрицательным контролем, полагают, что доноры С, D и F являются донорами, у которых иммунный ответ на hA33-IgG1-F21 не возникает. Сильный иммунный ответ на hA33-IgG1-F21 наблюдали в РВМС, полученных от других семи доноров (доноры А, В, Е, G, Н, I и J) по сравнению с отрицательным контролем; и hA33-IgG1-F21 продемонстрировало высокий уровень иммуногенности in vitro, как и ожидалось. С другой стороны, наблюдали эффект, по которому иммунный ответ выделенных РВМС от всех из этих семи доноров (доноры А, В, Е, G, Н, I и J) на hA33-IgG1-F140, которое содержит FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, был снижен по сравнению с иммунным ответом на hA33-IgG1-F21. Кроме того, поскольку иммунный ответ РВМС, полученных от доноров Е и J, на hA33-IgG1-F140 также был приблизительно таким же, как и иммунный ответ на отрицательный контроль, было предположено, что иммуногенность может снижаться у антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН, путем снижения активности связывания с FcγR человека до уровня, более низкого чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена и ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса.

[Пример 9] Оценка иммуногенности in vitro гуманизированного антитела (антитело против А33 человека), которое обладает активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, но не обладает активностью связывания с FcγR человека

(9-1) Получение связывающего А33 антитела, обладающего мощной активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН

hA33H-IgG1-F698 (SEQ ID NO: 67) получали в соответствии со способом справочного примера 1 путем замены Tyr вместо Met в положении 252 (нумерация EU), замены Glu вместо Asn в положении 286 (нумерация EU), замены Gln вместо Thr в положении 307 (нумерация EU), замены Ala вместо Gln в положении 311 (нумерация EU) и замены Tyr вместо Asn в положении 434 (нумерация EU) в аминокислотной последовательности ha33H-IgG1. Связывающее А33 человека антитело, обладающее мощной активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, получали в форме hA33-IgG1-F698, содержащего hA33H-IgG1-F698 в качестве тяжелой цепи и hA33L-k0 в качестве легкой цепи.

(9-2) Получение связывающего А33 антитела, содержащего антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека в условиях области нейтральных значений рН является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена

Получали hA33H-IgG1-F699 (SEQ ID NO: 68), в котором Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) hA33H-F698 и которое содержит антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена.

Активность связывания VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 и VH3/L(WT)-IgG1-F699 с FcRn человека при рН 7,0 измеряли с использованием способа согласно примеру 4. Более того, активность связывания VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 и VH3/L(WT)-IgG1-F699 с FcγR человека при рН 7,4 измеряли с использованием способа согласно примеру 7. Результаты для обоих измерений представлены в таблице 15 ниже.

Как показано в таблице 15, VH3/L(WT)-IgG1-F699, в котором Lys заменяет Ser в положении 239 (нумерация EU) и которое содержит антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с каждым типом FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, продемонстрировало активность связывания с hFcgRI, даже несмотря на то, что связывание с hFcgRIIa (R), hFcgRIIa (H), hFcgRIIb и hFcgRIIIa (F) снижалось.

(9-3) Оценка иммуногенности различных типов связывающих А33 антител с помощью анализа Т-клеток in vitro

Иммуногенность в отношении полученных hA33-IgG1-F698 и ha33-IgG1-F699 оценивали в соответствии с тем же способом, что и в примере 7. Более того, здоровые добровольцы, служащие в качестве доноров, не были теми же индивидуумами, что и здоровые добровольцы, от которых получали РВМС, использованные согласно примерам 7 и 8. Иными словами, донор А в примерах 7 и 8 и донор А в этом исследовании были различными здоровыми добровольцами.

Результаты исследования представлены на фиг. 20. На фиг. 20, проводится сравнение между результатами для hA33-IgG1-F698, которое обладает мощной активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, и hA33-IgG1-F699, которое содержит FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания встречающегося в природе домена FcγR. Поскольку ответ на hA33-IgG1-F698 не наблюдали в РВМС, полученных от доноров G и I, по сравнению с отрицательным контролем, полагают, что доноры G и I являются донорами, у которых иммунный ответ на hA33-IgG1-F698 не возникает. Высокий иммунный ответ на hA33-IgG1-F698 наблюдали в РВМС, полученных от других семи доноров (доноры А, В, С, D, Е, F и Н) по сравнению с отрицательным контролем, и высокий уровень иммуногенности был продемонстрирован in vitro аналогично вышеупомянутому hA33-IgG1-F21. С другой стороны, наблюдали эффект, в котором иммунный ответ РВМС, полученных от пяти доноров (доноры А, В, С, D и F), на hA33-IgG1-F699, которое содержит FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, был снижен по сравнению с иммунным ответом на hA33-IgG1-F698. В частности, было подтверждено, что иммунный ответ РВМС, выделенных из доноров С и F, на hA33-IgG1-F699 является приблизительно таким же, как и в случае отрицательного контроля. Тот факт, что эффект снижения иммуногенности был подтвержден не только для hA33-IgG1-F21, но также для hA33-IgG1-F698, которое обладает высокой активностью связывания с FcRn человека, показал, что иммуногенность может быть снижена у антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН, путем обеспечения того, чтобы активность связывания с FcγR человека была ниже, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, и ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса.

(9-4) Получение связывающего А33 антитела, не обладающего активностью связывания с FcγRIa человека в условиях области нейтральных значений рН

Как описано выше в (9-3), hA33-IgG1-F699 продемонстрировало сниженную активность связывания с различными типами FcγR человека путем замены Lys вместо Ser в положении 239 (нумерация EU) в hA33-IgG1-F698, и связывание hFcgRI сохранялось, хотя связывание с hFcgRIIa (R), hFcgRIIa (H), hFcgRIIb и hFcgRIIIa (F) значительно снижалось.

Таким образом, для получения связывающего А33 антитела, которое не содержит FcγR-связывающий домен, не обладающий активностью связывания со всеми FcγR человека, включая hFcgRIa, получали hA33H-IgG1-F763 (SEQ ID NO: 69), в котором Arg заменял Leu в положении 235 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) в hA33H-IgG1-F698 (SEQ ID NO: 67).

Константы ассоциации (KD) для FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН (рН 7,0) измеряли для VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 и VH3/L(WT)-IgG1-F763 с использованием способа согласно примеру 4. Кроме того, активность связывания с FcγR человека оценивали для VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 и VH3/L(WT)-IgG1-F763 в соответствии со способом, описанным в примере 7. Эти результаты также представлены в таблице 16 ниже.

Как показано в таблице 16, было показано, что IgG1-F763, в котором Arg заменял Leu в положении 235 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU), демонстрирует сниженную активность связывания со всеми FcγR человека, включая hFcγRIa.

(9-5) Оценка иммуногенности различных типов связывающих А33 антитела с помощью анализа Т-клеток in vitro

Иммуногенность полученных hA33-IgG1-F698 и hA33-IgG1-F763 оценивали с использованием того же способа, как и в примере 7. Более того, аналогично тому, как описано выше, здоровые добровольцы, служащие в качестве доноров, не были теми же индивидуумами, что и здоровые добровольцы, от которых были получены РВМС, использованные в упомянутых выше примерах. Иными словами, донор А в упомянутых выше примерах и донор А в этом исследовании были различными здоровыми добровольцами.

Результаты исследования представлены на фиг. 21. На фиг. 21, проводится сравнение между результатами для hA33-IgG1-F698, которое обладает мощной активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН, и hA33-IgG1-F763, которое содержит FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена. Поскольку ответ на hA33-IgG1-F698 не наблюдали в РВМС, полученных от доноров В, Е, F и K, по сравнению с отрицательным контролем, полагают, что доноры В, Е, F и K являются донорами, у которых иммунный ответ на hA33-IgG1-F698 не возникает. Мощный иммунный ответ на ha33-IgG1-F698 наблюдали в РВМС, полученных от других семи доноров (доноры А, С, D, G, Н, I и J), по сравнению с отрицательным контролем. С другой стороны, наблюдали эффект, по которому иммунный ответ РВМС, полученных от четырех доноров (доноры А, С, D и Н) на hA33-IgG1-F763, которое содержит FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания встречающегося в природе FcγR-домена, был снижен по сравнению с иммунным ответом на ha33-IgG1-F698. Среди этих четырех доноров иммунный ответ РВМС, полученных от доноров С, D и Н, в частности, на hA33-IgG1-F763, был приблизительно таким же, как и на отрицательный контроль, и среди четырех доноров, у которых иммунный ответ РВМС был снижен в результате снижения связывания с FcγR, в действительности было возможно полностью ингибировать иммунный ответ РВМС от троих доноров. Также, исходя из этих данных, антигенсвязывающие молекулы, содержащие FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR человека является низкой, считаются чрезвычайно эффективными молекулами, обладающими сниженной иммуногенностью.

Исходя из результатов примеров 7, 8 и 9, было подтверждено, что иммунный ответ на антигенсвязывающие молекулы, в которых образование четырехкомпонентного комплекса ингибировалось путем снижения связывания с активным FcγR (вариант осуществления 1) ингибировался у многочисленных доноров по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, которые способны образовывать четырехкомпонентный комплекс на антигенпредставляющих клетках. Описанные выше результаты показали, что образование четырехкомпонентного комплекса на антигенпредставляющих клетках является важным для иммунного ответа антигенсвязывающих молекул, и что антигенсвязывающие молекулы, которые не образуют этот четырехкомпонентный комплекс, дают возможность снизить иммуногенность у многочисленных доноров.

[Пример 10] Оценка иммуногенности in vivo гуманизированного антитела, которое обладает активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН, но не обладает активностью связывания с FcγR мыши

С помощью эксперимента in vitro в примерах 7, 8 и 9 было продемонстрировано, что иммуногенность снижена у антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и содержащих FcγR-связывающий домен, активность связывания которого с FcγR является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, в которых активность связывания FcγR не снижена. Следующее исследование проводили для подтверждения того, демонстрируется ли этот эффект также in vivo.

(10-1) Исследование иммуногенности in vivo у трансгенных мышей с FcRn человека

Продукцию антител к Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 и Fv4-IgG1-F1009 оценивали с использованием плазмы мыши, полученной согласно примеру 5, в соответствии со способом, указанным ниже.

(10-2) Определение антитела против введенного образца в плазме с помощью электрохимической люминесценции

Антитело против введенного образца антитела, присутствующее в мыши, количественно определяли с помощью электрохимической люминесценции. Сначала введенное антитело распределяли в непокрытый планшет Uncoated Multi-Array Plate (Meso Scale Discovery), а затем позволяли ему стоять нетронутым в течение ночи при 4°С для получения планшета с введенным антителом в твердой фазе. Образцы для изменения в плазме мыши получали путем разбавления в 50 раз с последующим распределением в планшет с твердой фазой и реакцией в течение ночи при 4°С. Затем антителу против IgG мыши (цельная молекула) (Sigma), рутенированному с помощью Sulfo-Tag NHS Ester (Meso Scale Discovery) позволяли реагировать в течение 1 часа при комнатной температуре, и добавляли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery), а затем сразу проводили измерение с помощью Sector PR 400 (Meso Scale Discovery). Измерение в плазме пяти животных, которым не вводили антитело, проводили в качестве отрицательного контрольного образца для каждой системы измерения, и величину (X), полученную сложением результата умножения стандартного отклонения (SD) величин, измеренных с использованием плазмы этих пяти животных, на 1,645, и среднего значения (СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ) величин, измеренных с использованием пяти животных, использовали в качестве критерия для определения положительной реакции (уравнение 3). Животных, которые продемонстрировали реакцию, превышающую положительный критерий даже один раз в любой из дней взятия крови, считали имеющими положительный ответ в виде продукции антител на исследуемое вещество.

[Уравнение 3]

Положительный критерий для продукции антител (X) = СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ + 1,645 × SD

(10-3) Ингибиторный эффект на иммуногенность in vivo путем снижения активности связывания с FcγR

Результаты представлены на фиг. 22-27. На фиг. 22 показаны титры антител мыши, продуцированных в ответ на Fv4-IgG1-F11 через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения Fv4-IgG1-F11 трансгенным мышам с FcRn человека. Было показано, что продукция антитела мыши к Fv4-IgG1-F11 является положительной у одной из трех мышей (#3) каждый день, когда проводили взятие крови, после введения (положительный показатель: 1/3). С другой стороны, на фиг. 23 показаны титры антитела мыши, продуцированного в ответ на Fv4-IgG1-F821 через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения Fv4-IgG1-F821 трансгенным мышам с FcRn человека. Было показано, что продукция антитела мыши к Fv4-IgG1-F821 является отрицательной у всех трех мышей каждый день, когда проводили взятие крови, после введения (положительный показатель: 0/3).

На фиг. 24А и ее увеличенном изображении в форме фиг. 24В показаны титры антител мыши, продуцированных в ответ на Fv4-IgG1-F890, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения Fv4-IgG1-F890 трансгенным мышам с FcRn человека. Было показано, что продукция антител мыши к Fv4-IgG1-F890 является положительной у двух из трех мышей (#1 и #3) через 21 и 28 суток после введения (положительный показатель: 2/3). С другой стороны, на фиг. 25 представлены титры антитела мыши, продуцированного в ответ на Fv4-IgG1-F939 через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения Fv4-IgG1-F939 трансгенным мышам с FcRn человека. Было показано, что продукция антитела мыши к Fv4-IgG1-F939 является отрицательной у всех трех мышей каждый день, когда проводили взятие крови, после введения (положительный показатель: 0/3).

На фиг. 26 показаны титры антитела мыши, продуцированного в ответ на Fv4-IgG1-F947 через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения Fv4-IgG1-F947 трансгенным мышам с FcRn человека. Было показано, что продукция антитела мыши к Fv4-IgG1-F947, является положительной у двух из трех мышей (#1 и #3) через 14 суток после введения (положительный показатель: 2/3). С другой стороны, на фиг. 27 показаны титры антитела мыши, продуцированного в ответ на Fv4-IgG1-F1009, через 3, 7, 14, 21 и 28 суток после введения Fv4-IgG1-F1009 трансгенным мышам с FcRn человека. Было показано, что продукция антитела мыши к Fv4-IgG1-F1009 является положительной у двух из трех мышей (#4 и #5), начиная через 7 суток после введения (положительный показатель: 2/3).

Как указано в примере 5, Fv4-IgG1-821 обладает сниженным связыванием с различными типами FcγR мыши относительно Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F939 аналогично обладает сниженным связыванием с различными типами FcγR мыши относительно Fv4-IgG1-F890, и Fv4-IgG1-F1009 аналогично обладает сниженным связыванием с различными типами FcγR мыши в отношении Fv4-IgG1-F947.

Было показано, что иммунногенность in vivo может быть значительно снижена путем снижения связывания Fv4-IgG1-F11 и Fv4-IgG1-F890 с различными типами FcγR мыши. С другой стороны, не был продемонстрирован эффект снижения иммуногенности in vivo в результате снижения связывания Fv4-IgG1-F947 с различными типами FcγR мыши.

Без связи с конкретной теорией, полагают, что причина наблюдения этого ингибиторного эффекта в отношении иммуногенности может быть объяснена, как описано ниже.

Как описано в примере 3, полагают, что ингибирование образования четырехкомпонентного комплекса на клеточной мембране антигенпредставляющих клеток является возможным путем снижения активности связывания с FcγR антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН. Полагают, что в результате ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса ингибируется включение антигенсвязывающих молекул в антигенпредставляющие клетки, и полагают, что в результате этого индукция иммуногенности в отношении антигенсвязывающих молекул подавляется. Таким образом, полагают, что Fv4-IgG1-F11 и Fv4-IgG1-F890 обладают сниженной индукцией иммуногенности посредством снижения активности связывания с FcγR.

С другой стороны, Fv4-IgG1-F947 не продемонстрировали эффекта подавления иммуногенности в результате снижения активности связывания с FcγR. Без связи с теорией, причина для этого может быть прокомментирована так, как указано ниже.

Как показано на фиг. 16, элиминация Fv4-IgG1-F947 и Fv4-IgG1-F1009 из плазмы является чрезвычайно быстрой. В связи с этим, полагают, что Fv4-IgG1-F1009 претерпело снижение активности связывания с FcγR мыши, и полагают, что образование четырехкомпонентного комплекса на антигенпредставляющих клетках, ингибируется. Следовательно, полагают, что Fv4-IgG1-F1009 подлежит включению в клетки в результате связывания только с FcRn, экспрессированным на клеточной мембране таких клеток, как сосудисто-эндотелиальные клетки или кроветворные клетки. В связи с этим, поскольку FcRn также экспрессируется на клеточных мембранах некоторых антигенпредставляющих клеток, Fv4-IgG1-F1009 также может быть включаться в антигенпредставляющие клетки посредством связывания только с FcRn. Иными словами, помимо быстрой элиминации Fv4-IgG1-F1009 из плазмы, часть может включаться в антигенпредставляющие клетки.

Более того, Fv4-IgG1-F1009 представляет собой антитело человека, и оно является полностью чужеродным белком у мышей. Иными словами, полагают, что мыши обладают многочисленными популяциями Т-клеток, которые специфично отвечают на Fv4-IgG1-F1009. Только небольшое количество Fv4-IgG1-F1009, включенного в антигенпредставляющие клетки, представляется Т-клеткам после процессинга в клетках, и поскольку мыши имеют многочисленные популяции Т-клеток, которые специфично отвечают на Fv4-IgG1-F1009, полагают, что иммунный ответ на Fv4-IgG1-F1009 легко индуцируется. На самом деле, когда чужеродный белок в форме растворимого рецептора IL-6 человека вводят мышам, как указано в справочном примере 4, растворимый рецептор IL-6 человека элиминируется за короткий период времени, и индуцируется иммунный ответ на растворимый рецептор IL-6 человека. Полагают, что тот факт, что иммуногенность индуцировалась, даже несмотря на то, что растворимый рецептор IL-6 человека не обладает активностью связывания с FcγR и FcRn в области нейтральных значений рН, является следствием быстрой элиминации растворимого рецептора IL-6 человека и того, что большое количество включалось в антигенпредставляющие клетки.

Иными словами, в случае, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой чужеродный белок (как например, в случае введения белка человека мышам), полагают, что она труднее будет подавлять иммунный ответ путем ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса на антигенпредставляющих клетках по сравнению со случаем, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой гомологичный белок (например, как в случае введения белка мыши мышам).

В действительности, в случае, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, поскольку антитело, вводимое человеку, представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека, возникает иммунный ответ на гомологичный белок. Таким образом, в примере 11 проводили оценку в отношении того, приводило ли ингибирование образования четырехкомпонентного комплекса к снижению иммуногенности путем введения антитела мыши мышам.

[Пример 11] Оценка иммуногенности in vivo антител мыши, которые обладают активностью связывания с FcRn мыши в условиях области нейтральных значений рН, но не обладают активностью связывания с FcγR мыши

(11-1) Исследование иммуногенности in vivo у нормальных мышей

Следующее исследование проводили для проверки ингибиторного эффекта на иммуногенность, полученного путем ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса на антигенпредставляющих клетках в случае, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой гомологичный белок (как в случае введения антитела мыши мышам).

Продукцию антител к mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF40, mPM1-mIgG1-mF14 и mPM1-mIgG1-mF39 оценивали с использованием плазмы мыши, согласно примеру 6, в соответствии со способом, указанным ниже.

(11-2) Измерение антитела против вводимого образца в плазме посредством электрохимической люминесценции

Антитело против введенного образца антитела, присутствующее в мыши, измеряли с помощью электрохимической люминесценции. Сначала введенное антитело распределяли в 96-луночный планшет Multi-Array, а затем позволяли протекать реакции в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания планшета получали образцы для измерения в плазме мыши, разбавленной в 50 раз; и после реакции в течение 2 часов при комнатной температуре и промывания планшета распределяли введенный образец, рутенированный с помощью Sulfo-Tag NHS Ester (Meso Scale Discovery), а затем позволяли протекать реакции в течение ночи при 4°С. На следующий день планшет промывали, а затем распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery), а затем сразу проводили измерения с помощью устройства для считывания Sector PR 2400 Reader (Meso Scale Discovery). Измерение в плазме пяти животных, которым не вводили антитело, проводили в качестве отрицательного контрольного образца для каждой системы измерения, и величину (X), полученную сложением результата умножения стандартного отклонения (SD) величин, измеренных с использованием плазмы этих пяти животных, на 1,645, и среднего значения (СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ) величин, измеренных с использованием пяти животных, использовали в качестве критерия для определения положительной реакции (уравнение 3). Животных, которые продемонстрировали реакцию, превышающую положительный критерий даже один раз в любой из дней взятия крови, считали имеющими положительный ответ в виде продукции антител на исследуемое вещество.

[Уравнение 3]

Положительный критерий для продукции антител (X) = СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ + 1,645 × SD

(11-3) Ингибиторный эффект на иммуногенность in vivo посредством снижения активности связывания с FcγR

Результаты представлены на фиг. 28-31. На фиг. 28 представлены титры антитела мыши, продуцированного в ответ на mPM1-mIgG1-mF14, через 14, 21 и 28 суток после введения mPM1-mIgG1-mF14 нормальным мышам. Было показано, что продукция антитела мыши к mPM1-mIgG1-mF14 является положительной у всех трех мышей через 21 сутки после введения (положительный показатель: 3/3). С другой стороны, на фиг. 29 показаны титры антитела мыши, продуцированного в ответ на mPM1-mIgG1-mF39, через 14, 21 и 28 суток после введения mPM1-mIgG1-mF39 нормальным мышам. Было показано, что продукция антитела мыши к mPM1-mIgG1-mF39 является отрицательной у всех трех из мышей каждый день, когда проводили взятие крови, после введения (положительный показатель: 0/3).

На фиг. 30 показаны титры антитела мыши, продуцированного в ответ на mPM1-mIgG1-mF38, через 14, 21 и 28 суток после введения mPM1-mIgG1-mF38 нормальным мышам. Было показано, что продукция антитела мыши к mPM1-mIgG1-mF38 является положительной у двух из трех мышей (#1 и #2) через 28 суток после введения (положительный показатель: 2/3). С другой стороны, на фиг. 31 показаны титры антител мыши, продуцированных в ответ на mPM1-mIgG1-mF40, через 14, 21 и 28 суток после введения mPM1-mIgG1-mF40 нормальным мышам. Было показано, что продукция антител мыши к mPM1-mIgG1-mF40 является отрицательной у всех трех мышей каждый день, когда проводили взятие крови, после введения (положительный показатель: 0/3).

Как показано в примере 6, относительно mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF40 обладает сниженным связыванием с различными типами FcγR мыши, и аналогично относительно mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF39 обладает сниженным связыванием с различными типами FcγR мыши.

Эти результаты подтвердили, что даже когда антитела мыши mPM1-mIgG1-mF38 и mPM1-mIgG1-mF14, которые представляют собой гомологичные белки, вводили нормальным мышам, подтверждалась продукция антител в ответ на введенное антитело и подтверждался иммунный ответ. Как указано в примерах 1 и 2, полагают, что это является следствием ускорения включения в антигенпредставляющие клетки через образование четырехкомпонентного комплекса на антигенпредставляющих клетках путем усиления активности связывания с FcRn в области нейтральных значений рН.

Было показано, что можно снизить иммуногенность in vivo путем ингибирования образования четырехкомпонентного комплекса посредством снижения связывания таких антигенсвязывающих молекул, обладающих активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН, с различными типами FcγR мыши.

Эти результаты указывают на то, что путем снижения активности связывания с FcγR антигенсвязывающей молекулы, обладающей активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, иммуногенность этой антигенсвязывающей молекулы может быть снижена чрезвычайно эффективно как in vitro, так и in vivo. Иными словами, было показано, что иммуногенность антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и активность связывания которой с активным FcγR является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена (а именно, антигенсвязывающая молекула согласно варианту осуществления 1, описанному в примере 3) является значительно сниженной по сравнению с антигенсвязывающей молекулой, обладающей активностью связывания, приблизительно сопоставимой с активностью связывания нативного FcγR-связывающего домена (то есть, антигенсвязывающей молекулой, способной образовывать четырехкомпонентный комплекс, как описано в примере 3).

[Пример 12] Получение и оценка антител человека, обладающих активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена

(12-1) Получение и оценка IgG1-антител человека, обладающих активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена

В неограничивающем аспекте настоящего изобретения, хотя предпочтительные примеры Fc-области, активность связывания которой с активным FcγR является более низкой, чем активность связывания с активным FcγR встречающейся в природе Fc-области, включают Fc-области, в которых одна или несколько аминокислот в любом из положений 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 и 329 (нумерация EU) среди аминокислот упомянутой выше Fc-области модифицированы в аминокислоту, которая отличается от встречающейся в природе Fc-области, модификация Fc-области не ограничивается модификацией, описанной выше, а вместо этого может представлять собой, например, дегликозилирование (N297A, N297Q), описанное в Current Opinion in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691, модификации, такие как IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A или IgG4-L236E, а также модификации, такие как G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R или N325LL328R, описанные в WO 2008/092117, инсерция аминокислот в положениях 233, 234, 235 и 237 (нумерация EU), и модификации областей, описанные в WO 2000/042072.

Fv4-IgG1-F890 и Fv4-IgG1-F947, полученные согласно примеру 5, представляют собой антитела, которые обладают активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН и связываются с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом. Были получены различные варианты, в которых связывание с FcγR человека было снижено путем внесения аминокислотных замен в их аминокислотные последовательности (таблица 17). Более конкретно, были получены варианты, включая VH3-IgG1-F938 (SEQ ID NO: 156), в котором Lys заменял Leu в положении 235 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1315 (SEQ ID NO: 157), в котором Lys заменял Gly в положении 237 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1316 (SEQ ID NO: 158), в котором Arg заменял Gly в положении 237 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239 в аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1317 (SEQ ID NO: 159), в котором Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) и Lys заменял Pro в положении 329 в аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1318 (SEQ ID NO: 160), в котором Lys заменял Ser в положении 239 (нумерация EU) и Arg заменял Pro в положении 329 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1324 (SEQ ID NO: 161), в котором Ala заменял Leu в положении 234 (нумерация EU) и Ala заменял Leu в положении 235 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1325 (SEQ ID NO: 162), в котором Ala заменал Leu в положении 234 (нумерация EU), Ala заменял Leu в положении 235 и Ala заменял Asn в положении 297 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1333 (SEQ ID NO: 163), в котором Arg заменял Leu в положении 235 (нумерация EU), Arg заменял Gly в положении 236 и Lys заменял Ser в положении 239 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1356 (SEQ ID NO: 164), в котором Arg заменял Gly в положении 236 (нумерация EU) и Arg заменял Leu в положении 328 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1326 (SEQ ID NO: 155), в котором Ala заменял Leu в положении 234 (нумерация EU) и Ala заменял Leu в положении 235 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F947, и VH3-IgG1-F1327 (SEQ ID NO: 165), в котором Ala заменял Leu в положении 234 (нумерация EU), Ala заменял Leu в положении 235 и Ala заменял Asn в положении 297 аминокислотной последовательности VH3-IgG1-F947.

(12-2) Подтверждение активности связывания с FcRn человека и FcγR человека

Активность связывания (константа диссоциации KD) с FcRn человека при рН 7,0 антител, содержащих каждую из аминокислотных последовательностей, полученных согласно (12-1), в качестве тяжелых цепей и содержащих L(WT)-CK в качестве легкой цепи, измеряли с использованием способа согласно примеру 4. Кроме того, измеряли активность связывания с FcγR человека при рН 7,4 с использованием способа примера 7. Результаты измерения представлены в таблице 18 ниже.

В соответствии с результатами, представленными в таблице 18, отсутствуют конкретные ограничения в отношении внесенных модификаций аминокислот, для снижения активности связывания с различными типами FcγR человека по сравнению с активностью связывания нативного FcγR-связывающего домена, и это можно осуществлять с использованием различных модификаций аминокислот.

(12-3) Получение антитела, связывающегося с глипиканом-3

Проводили детальный анализ связывания с каждым FcγR вариантов аминокислотных остатков, предположительно являющихся участками связывания для FcγR в Fc-области IgG1, для выявления модификаций, при которых связывание с FcgR снижается по сравнению с встречающимся в природе IgG1. Вариабельную область антитела против глипикана 3, обладающую улучшенной динамикой в плазме, описанную в WO 2009/041062, в форме антитела против глипикана-3, содержащего CDR GpH7 (SEQ ID NO: 74) использовали в качестве Н-цепи антитела. Аналогично, GpL16-k0 антитела против глипикана-3, которое обладает улучшенной динамикой в плазме, как описано в WO 2009/041062 (SEQ ID NO: 75), обычно использовали в качестве L-цепи антитела. Кроме того, В3, полученную путем внесения мутации K439E в G1d, в котором Gly и Lys удалены с С-конца IgG1 (SEQ ID NO: 76), использовали в качестве константной области Н-цепи антитела. Эту Н-цепь впоследствии обозначили как GpH7-B3 (SEQ ID NO: 77), в то время как L-цепь впоследствии обозначили как GpL16-k0 (SEQ ID NO: 75).

(12-4) Кинетический анализ связывания с различными типами FcγR

Сначала для подтверждения надежности детального анализа с использованием GpH7-B3/GpL16-k0 в качестве контроля, проводили сравнение связывающей способности с каждым FcgR между GpH7-B3/GpL16-k0 и GpH7-G1d/GpL16-k0 (таблица 19). Связывание с каждым FcγR человека (FcγRIa, FcγRIIa (H), FcγRIIa (R), FcγRIIb и FcγRIIa (F)) обоих антител после экспрессии и очистки в соответствии со способом справочного примера 2 оценивали в соответствии со способом, указанным ниже.

Взаимодействие между каждым модифицированным антителом и Fcγ-рецептором, полученным аналогично тому, как описано выше анализировали с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare), Biacore Т200 (GE Healthcare), Biacore A100 или Biacore 4000. HBS-EP + (GE Healthcare) использовали в качестве подвижного буфера и измерения проводили при 25°С. Использованные чипы представляли собой чипы, на которых антигенные пептиды, белок А (Thermo Scientific), белок А/G (Thermo Scientific) или белок L (ACTIGEN или BioVision) были иммобилизованы на чипе Series S Sensor Chip СМ5 (GE Healthcare) или чипе Series S Sensor Chip СМ4 (GE Healthcare) способом присоединения аминов, или чипы, на которых предварительно биотинилированным антигенным пептидам позволяли взаимодействовать, а затем иммобилизовывали на Series S Sensor Chip SA (сертифицированный) (GE Healthcare). Антитела-мишени иммобилизовывали на этих сенсорных чипах, Fcγ-рецептору, разбавленному подвижным буфером, позволяли взаимодействовать, а затем проводили измерение количества связавшегося антитела. Количества связавшегося антитела сравнивали между антителами. Однако поскольку количество связанного Fcγ-рецептора зависит от количества уловленного антитела, сначала в величины, используемые для сравнения, вносили поправку путем деления количества связанного Fcγ-рецептора на количество каждого уловленного антитела. Посредством реакции с 10 мМ глицин-HCl при рН 1,5, сенсорные чипы регенерировали путем смывания антитела, уловленного на сенсорных чипах, и использовали повторно.

Прочность связывания анализировали в соответствии со способом на основе результатов анализа взаимодействия с каждым FcγR. Величину, полученную путем деления величины количества GpH7-B3/GpL16-k0, связавшегося с FcγR, на величину количества GpH7-G1d/GpL16-k0, связавшегося с FcγR, и умножения этой величины на 100, использовали в качестве показателя относительной активности связывания с каждым FcγR. Исходя из результатов, представленных в таблице 19, поскольку связывание GpH7-B3/GpL16-k0 с каждым FcgR было приблизительно равным связыванию GpH7-G1d/GpL16-k0, то было решено, что GpH7-B3/GpL16-k0 можно использовать в качестве контроля в последующих исследованиях.

(12-5) Получение и оценка мутантов Fc

Далее аминокислоты, предположительно вовлеченные в связывание FcγR и окружающие их аминокислоты в аминокислотной последовательности GpH7-B3 (от положения 234 до положения 239, от положения 265 до положения 271, положение 295, положение 296, положение 298, положение 300 и от положения 324 до положения 327 (нумерация EU)), соответственно заменяли на 18 типов аминокислот, исключая исходные аминокислоты и Cys. Эти мутанты Fc обозначают как варианты В3. Связывание вариантов В3, экспрессированных и очищенных способом справочного примера 2, с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa (H), FcγRIIa (R), FcγRIIb и FcγRIIIa (F)) детально оценивали в соответствии со способом (12-4).

Прочность связывания оценивали в соответствии со следующим способом, исходя из результатов анализа взаимодействия с каждым FcγR. Величину количества антитела, происходящего из каждого варианта В3, связанного с FcγR, делили на величину количества сравнительного антитела, в котором в В3 не внесены мутации (антитело, обладающее последовательностью встречающегося в природе IgG1 человека в положениях от положения 234 до положения 239, от положения 265 до положения 271, положении 295, положении 296, положении 298, положении 300 и от положения 324 до положения 337, указанном согласно нумерации EU), связанного с FcγR. Затем эту величину далее умножали на 100 и полученную величину использовали в качестве показателя относительной активности связывания с каждым FcγR.

Модификации, которые снижали связывание со всеми FcgR среди проанализированных вариантов, представлены в таблице 21. 236 типов модификаций, представленных в таблице 20, представляют собой модификации, которые снижали связывание по меньшей мере с одним типом FcgR по сравнению с антителом до внесения модификации (GpH7-B3/GpL16-k0), и полагают, что они представляют собой модификации, аналогично обладающие эффектом связывания по меньшей мере с одним типом FcgR, даже при внесении во встречающийся в природе IgG1.

Следовательно, не существует конкретных ограничений аминокислотных модификаций, внесенных для снижения активности связывания с каждым типом FcγR человека, по сравнению с активностью связывания нативного FcγR-связывающего домена, и было показано, что этого можно достигать путем внесения аминокислотных модификаций, представленных в таблице 20, по меньшей мере в одну область. Кроме того, аминокислотные модификации, внесенные в этом случае, могут быть в одном положении или в комбинации нескольких положений.

(12-6) Получение и оценка IgG2-антитела человека и IgG4-антитела человека, которые обладают активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена

Fc-область, которая обладает активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которой с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания у нативного FcγR-связывающего домена, получали аналогично тому, как описано ниже, с использованием IgG2 человека или IgG4 человека.

Антитело, содержащее VH3-IgG2 (SEQ ID NO: 166) в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) в качестве легкой цепи, получали в соответствии со способом представленном в справочном примере 2, для применения в качестве антитела, связывающего рецептор IL-6 человека, имеющего IgG2 в качестве константной области. Аналогично, антитело, содержащее VH3-IgG4 (SEQ ID NO: 167) в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) в качестве легкой цепи получали в соответствии со способом, представленном в справочном примере 2, для применения в качестве антитела, связывающего рецептор IL-6 человека, имеющего IgG4 человека в качестве константной области.

Аминокислотные замены вносили в каждую константную область VH3-IgG2 и VH3-IgG4 для сообщения активности связывания FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН. Более конкретно, VH3-IgG2-F890 (SEQ ID NO: 168) и VH3-IgG4-F890 (SEQ ID NO: 169) получали посредством аминокислотной замены VH3-IgG2 и VH3-IgG4, в котором Tyr заменял Met в положении 252 (нумерация EU), Tyr заменял Asn в положении 434 и Val заменял Tyr в положении 436.

Аминокислотные замены вносили в каждую константную область VH3-IgG2-F890 и VH3-IgG4-F890 для снижения связывания с FcγR человека. Более конкретно, VH3-IgG2-F939 (SEQ ID NO: 170) получали путем аминокислотной замены VH3-IgG2-F890, в котором Arg заменял Ala в положении 235 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239. Кроме того, VH3-IgG4-F939 (SEQ ID NO: 171) получали путем аминокислотной замены VHE-IgG4-F890, в котором Arg заменял Leu в положении 235 (нумерация EU) и Lys заменял Ser в положении 239.

Антитело, содержащее полученные VH3-IgG2-F890, VH3-IgG4-F890, VH3-IgG2-F939 или VH3-IgG4-F939 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) в качестве легкой цепи, получали в соответствии со способом, представленным в справочном примере 2.

(12-7) Оценка IgG2-антитела человека и IgG4-антитела человека, которые обладают активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена

Активность связывания (константа диссоциации KD) с FcRn человека при рН 7,0 антитела (таблица 21), полученного согласно (12-6), измеряли с использованием способа примера 4. Кроме того, активность связывания с FcγR человека при рН 7,4 измеряли с использованием способа примера 7. Результаты измерения представлены в таблице 22 ниже.

Результаты, представленные в таблице 22, показали, что можно получить Fc-область, которая обладает активностью связывания с FcRn человека в области нейтральных значений рН и активность связывания которой с FcγR человека является более низкой, чем активность связывания нативного FcγR-связывающего домена, с использованием IgG1 человека без конкретных ограничений, и также можно использовать IgG2 или IgG4 человека.

[Пример 13] Получение и оценка антигенсвязывающей молекулы, в которой только один из двух полипептидов, которые составляют FcRn-связывающий домен, обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН

Антигенсвязывающую молекулу, в которой только один из двух полипептидов, которые составляют FcRn-связывающий домен, обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, в то время как другой не обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, как показано для варианта осуществления 3 в примере 3, получали, как указано ниже.

(13-1) Получение антигенсвязывающей молекулы, в которой только один из двух полипептидов, которые составляют FcRn-связывающий домен, обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, в то время как другой не обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН

Сначала получали VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 70) в соответствии со способом справочного примера 1 в качестве тяжелой цепи антитела против IL-6R человека, обладающего активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН. Кроме того, получали VH3-IgG1-F46 (SEQ ID NO: 71) путем внесения аминокислотной замены, полученной путем замены Ala вместо Ile в положении 253 (нумерация EU) VH3-IgG1 для применения в качестве антигенсвязывающей молекулы, которая не обладает активностью связывания с FcRn как в области кислых значений рН, так и в области нейтральных значений рН.

Использование Fc-областей, в которых одна Fc-область антитела содержит замены, в которых Lys заменяет Asp в положении 356 (нумерация EU) и Lys заменяет Glu в положении 357 (нумерация EU), а другая Fc-область содержит замены, в которых Glu заменяет Lys в положении 370 (нумерация EU), Arg заменяет His в положении 435 (нумерация EU) и Glu заменяет Lys в положении 439 (нумерация EU) известен в качестве способа получения гетеродимера антитела с высокой чистотой (WO 2006/106905).

Получали VH3-IgG1-FA6a (SEQ ID NO: 72), в котором Lys заменяет Asp в положении 356 (нумерация EU) и Lys заменяет Glu в положении 357 (нумерация EU) VH3-IgG1-F947 (далее обозначаемый как тяжелая цепь А). Кроме того, получали VH3-IgG1-FB4a (SEQ ID NO: 73), в котором Glu заменяет Lys в положении 370 (нумерация EU), Arg заменяет His в положении 435 (нумерация EU) и Glu заменяет Lys в положении 439 (нумерация EU) VH3-IgG1-F46 (далее обозначаемый как тяжелая цепь В) (Таблица 23).

Получали Fv4-IgG1-FA6a/FB4a в соответствии со способом справочного примера 2, которое имеет VH3-IgG1-FA6a и VH3-IgG1-FB4a в качестве тяжелых цепей, и VL3-CK в качестве легкой цепи, путем добавления равных количеств плазмид тяжелой цепи в форме VH3-IgG1-FA6a и VH3-IgG1-FB4a.

(13-2) Исследование PK антигенсвязывающей молекулы, в которой только один из двух полипептидов, которые составляют FcRn-связывающий домен, обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, в то время как другой не обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН

Проводили исследование PK в соответствии со способом, описанным ниже, при введении Fv4-IgG1-F947 и Fv4-IgG1-FA6a/FB4a трансгенным мышам с FcRn человека.

Антитело против рецептора IL-6 человека вводили в количестве 1 мг/кг при однократном введении под кожу спины трансгенных мышей с FcRn человека (мышь В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линия 32 +/+, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010)602, 93-104). Взятие крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4 и 7 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Плазму получали путем центрифугирования сразу собранной крови в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. Отделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже, до времени измерения.

Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши измеряли с помощью ELISA аналогично тому, как в способе примера 4. Результаты представлены на фиг. 32. Было показано, что Fv4-IgG1-FA6a/FB4a, которое способно связываться только с одной молекулой FcRn человека через одну связывающую область, демонстрирует сдвиг в сторону более высокой концентрации в плазме по сравнению Fv4-IgG1-F947, которое способно связываться с двумя молекулами FcRn человека через две связывающих области.

Как описано ранее, хотя существует две FcRn-связывающих области в Fc-области IgG, было описано, что молекулы, имеющие Fc, из которых удалена одна из двух FcRn-связывающих областей, элиминируются из плазмы более быстро по сравнению с молекулами, имеющими встречающуюся в природе Fc-область (Scand. J. Immunol., 1994; 40:457-465). Иными словами, известно, что IgG, обладающий двумя связывающими областями, которые связываются с FcRn в условиях области кислых значений рН, демонстрирует увеличенное удержание в плазме по сравнению с IgG, обладающим одной FcRn-связывающей областью. Было показано, что IgG, включенный в клетки, рециклирует обратно в плазму путем связывания с FcRn в эндосомах и, поскольку встречающийся в природе IgG способен связываться с двумя молекулами FcRn посредством двух связывающих FcRn областей, он связывается с FcRn с высокой связывающей способностью, и, таким образом, полагают, что рециклирует большое количество IgG. С другой стороны, IgG, обладающий только одной FcRn-связывающей областью, обладает низкой связывающей способностью в отношении FcRn в эндосомах, и, поскольку он не может в достаточной степени рециклировать, полагают, что он быстрее элиминируется из плазмы.

Следовательно, в Fv4-IgG1-FA6a/FB4a, имеющем только один участок связывания FcRn в условиях области нейтральных значений рН, как показано на фиг. 32, явление, посредством которого наблюдают увеличение удержания в плазме, было полностью неожиданным, поскольку это противоположно тому, что происходит в случае встречающегося в природе IgG.

Хотя настоящее изобретение не связано с конкретной теорией, полагают, что возможной причиной для наблюдаемого изменения этих высоких уровней удержания в плазме является увеличение скорости всасывания из-под кожи при подкожным введении антитела мышам.

Главным образом, полагают, что антитело, которое ввели подкожно, мигрирует в плазму после всасывания через лимфатическую систему (J. Pharm. Sci. (2000)89(3), 297-310). Поскольку в лимфатической системе присутствует большое количество иммунных клеток, полагают, что антитело, которое ввели подкожно, мигрирует в плазму после экспонирования большому количеству иммунных клеток. Главным образом, известно, что иммуногенность усиливается, когда фармацевтические препараты на основе антител вводят подкожно, по сравнению с их внутривенным введением, и одной из возможных причин этому является то, что подкожно вводимые антитела экспонируются большому количеству иммунных клеток в лимфатической системе. В действительности, как показано в примере Пример 1, было подтверждено, что при подкожном введении Fv4-IgG1-F1 быстро элиминировалось из плазмы и это указывает на продукцию антитела к Fv4-IgG1-F1. С другой стороны, в случае внутривенного введения, быстрая элиминация Fv4-IgG1-F1 из плазмы не была подтверждена, что указывает на то, что антитело мыши к Fv4-IgG1-F1 не продуцировалось.

Следовательно, в ходе всасывания подкожно вводимого антитела, когда антитело включается в иммунные клетки, присутствующие в лимфатической системой, это вызывает снижение биодоступности и одновременно становится причиной иммуногенности.

Однако в случае подкожного введения антигенсвязывающей молекулы, показанной в качестве примера в варианте осуществления 3 примера 3, в которой только один из двух полипептидов, которые составляют FcRn-связывающий домен, обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, в то время как другой полипептид не обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН, даже при экспонировании иммунным клеткам, присутствующим в лимфатической системе в процессе всасывания, полагают, что четырехкомпонентный комплекс не образуется на клеточной мембране иммунных клеток. Следовательно, увеличение биодоступности происходит вследствие ингибирования включения в иммунные клетки, присутствующие в лимфатической системе, и в результате считается возможным, что может произойти увеличение концентрации в плазме.

Способы обеспечения увеличения концентрации в плазме или снижения иммуногенности путем увеличения биодоступности подкожно вводимого антитела не ограничиваются антигенсвязывающими молекулами, представленными в качестве варианта осуществления 3 примера 3. Вместо этого, можно использовать любую антигенсвязывающую молекулу, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую молекулу, которая не образует четырехкомпонентный комплекс на клеточной мембране иммунных клеток. Следовательно, при введении подкожно, полагают, что любая из антигенсвязывающих молекул согласно вариантам осуществления 1, 2 и 3 способна увеличивать удержание в плазме и в то же время увеличивать биодоступность, и далее вызывать снижение иммуногенности по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, способными образовывать четырехкомпонентный комплекс.

Полагают, что часть антигенсвязывающих молекул, которые остаются в плазме, всегда мигрируют в лимфатическую систему. Кроме того, иммунные клетки также присутствуют в крови. Следовательно, хотя адаптация настоящего изобретения никоим образом не ограничивается конкретным путем введения, полагают, что примером, который продемонстрирует эффекты особенно легко, является путь введения, который опосредуется лимфатической системой в ходе всасывания антигенсвязывающей молекулы, и одним из этих примеров является подкожное введение.

[Пример 14] Получение антитела, обладающее активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН и активностью селективного связывания с ингибиторным FcγR

Кроме того, антигенсвязывающая молекула согласно варианту осуществления 2, представленному в примере 3, можно получать с использованием модификации, которая приводит к усилению активности селективного связывания с ингибирующим FcγRIIb для антигенсвязывающей молекулы, обладающей усиленным связыванием с FcRn в нейтральных условиях. Иными словами, антигенсвязывающая молекула, которая обладает активностью связывания с FcRn в нейтральных условиях и в которую внесена модификация, приводящая к усилению активности селективного связывания с ингибирующим FcγRIIb, способна образовывать четырехкомпонентный комплекс, опосредуемый двумя молекулами FcRn и одной молекулой FcγR. Однако поскольку селективное связывание с ингибирующим FcγR обуславливается эффектом этой модификации, активность связывания с активным FcγR снижается. Полагают, что в результате на антигенпредставляющих клетках предпочтительно образуется четырехкомпонентный комплекс, содержащий ингибирующий FcγR. Как описано ранее, полагают, что иммуногенность вызывается образованием четырехкомпонентного комплекса, содержащего активный FcγR, и, таким образом, в результате образования четырехкомпонентного комплекса, содержащего ингибирующий FcγR, может ингибироваться иммунный ответ.

Таким образом, следующее исследование проводили для открытия аминокислотных мутаций, которые приводят к усилению активности селективного связывания с ингибирующим FcγRIIb.

(14-1) Детальный анализ варианта Fc в отношении связывания FcγR

Проводили детальный анализ активности связывания с каждым FcγR множества вариантов IgG1-антител, в которые вносили мутацию, которая снижает опосредуемое Fc связывания с активным FcγR, в частности, с любым из полиморфизмов FcγRIIa Н-типа и R-типа, по сравнению со встречающимся в природе IgG1, и усиливает связывание с FcγRIIb.

Вариабельную область антитела против глипикана-3, обладающего улучшенной динамикой в плазме, описанного в WO 2009/041062, в форме антитела против глипикана-3, содержащего CDR из GpH7 (SEQ ID NO: 74), использовали в качестве Н-цепи антитела. Аналогично, GpL16-k0 антитела против глипикана-3, обладающего улучшенной динамикой в плазме, описанного в WO 2009/041062 (SEQ ID NO: 75), обычно использовали в качестве L-цепи антитела в комбинации с другой Н-цепью. Кроме того, В3, полученную путем внесения мутации K439E в G1d, в котором Gly и Lys удалены с С-конца IgG1 (SEQ ID NO: 76), использовали в качестве константной области Н-цепи антитела. Эту Н-цепь впоследствии обозначили как GpH7-B3 (SEQ ID NO: 77), в то время как L-цепь впоследствии обозначили как GpL16-k0 (SEQ ID NO: 75).

Аминокислоты, предположительно вовлеченные в связывание FcγR и окружающие их аминокислоты в аминокислотной последовательности GpH7-B3 (от положения 234 до положения 239, от положения 2 65 до положения 271, положение 295, положение 296, положение 298, положение 300 и от положения 324 до положения 327 (нумерация EU)), соответственно заменяли на 18 типов аминокислот, исключая исходные аминокислоты и Cys. Эти мутанты Fc обозначают как варианты В3. Связывание вариантов В3, экспрессированных и очищенных способом справочного примера 2, с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb и FcγRIIIa) детально оценивали в соответствии со способом, описанным в примере 9.

Для каждого FcγR строили диаграммы в соответствии со способом, описанным ниже. Иными словами, величину количества антитела, полученную для варианта В3, связавшегося с каждым FcγR, делили на величину количества контрольного антитела, которое не обладает мутациями, внесенными в В3 (антитело, обладающее последовательностью встречающегося в природе IgG1 человека в положении от положения 234 до положения 239, от положения 265 до положения 271, в положении 295, в положении 296, в положении 298, в положении 300 и от положения 324 до положения 337 (нумерация EU)). Затем эту величину далее умножали на 100, и полученную величину выражали в качестве величины связывания с каждым FcγR. Связывание каждого варианта с FcγRIIb отображали на горизонтальной оси, и величины каждого активного FcγR в форме FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R) и FcγRIIIa соответственно отображали на вертикальной оси (фиг. 33, 34, 35 и 36).

В результате, как указано с помощью обозначений на фиг. 33-36, среди всех модификаций мутация А (модификация, полученная путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU)) и мутация В (модификация, полученная путем замены Glu вместо Leu в положении 328 (нумерация EU)) продемонстрировали значительное усиленное связывание с FcγRIIb по сравнению со встречающимся в природе IgG1, и было выявлено, что они демонстрируют эффект значительного подавления связывания с обоими типами FcγRIIa.

(14-2) SPR-анализ вариантов с селективным связыванием FcγRIIb

Проводили более детальный анализ связывания с каждым FcγR варианта, полученного путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU), выявленного в (14-1).

Для Н-цепи IgG1, вариабельная область IL6R-H, описанного в WO 2009/125825 (SEQ ID NO: 78), которая представляет собой вариабельную область антитела против рецептора интерлейкина-6 человека, используют в качестве вариабельной области Н-цепи антитела, и IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79), содержащего константную область Gld, из которого удалены Gly и Lys с С-конца IgG1 человека, используют в качестве константной области Н-цепи антитела. Получали IL6R-G1d_v1 (SEQ ID NO: 80), в котором Asp заменял Pro в положении 238 (нумерация EU) IL6R-G1d. Далее, получали IL6R-G1d_v2 (SEQ ID NO: 81), в котором Glu заменял Leu в положении 328 (нумерация EU) IL6R-G1d. Для сравнения, получали IL6R-G1d_v3 (SEQ ID NO: 82), который представляет собой вариант IL6R-G1d, в который была внесена известная мутация (Mol. Immunol. (2008)45, 3926-3933) путем замены Glu вместо Ser в положении 267 (нумерация EU) и замены Phe вместо Leu в положении 328 (нумерация EU). IL6R-L (SEQ ID NO: 83), которая представляет собой L-цепь тоцилизумаба, обычно использовали в качестве L-цепи антитела в комбинации с этими тяжелыми цепями. Антитела экспрессировали и очищали в соответствии со способом согласно справочному примеру 2. Антитела, содержащие в качестве Н-цепи антитела IL6R-G1d, IL6R-G1d_v1, IL6R-Gld_v2 и IL6R-G1d_v3, далее соответственно обозначили как IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3.

Далее проводили анализ кинетики взаимодействий между этими антителами и FcγR с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). Измерение взаимодействия проводили при температуре 25°С с использованием HBS-EP+ (GE Healthcare) в качестве подвижного буфера. Чип Series S Sensor Chip СМ5 (GE Healthcare) использовали после иммобилизации белка А способом присоединения аминов. Связывание каждого FcγR с антителом измеряли, позволяя каждому FcγR, разбавленному подвижным буфером, действовать на чип, на котором уловлено заданное антитело. Антитело, уловленное на чипе, смывали, позволяя 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) реагировать после измерения. Чип, регенерированный таким образом, использовали повторно. Константу диссоциации KD (моль/л) вычисляли из константы скорости ассоциации ka (л/моль/с) и константу скорости диссоциации kd (1/с), вычисленную путем глобальной аппроксимации результатов измерения к модели связывания Ленгмюра 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation Software.

Поскольку связывание IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa(H) или FcγRIIIa было чрезвычайно слабым, KD нельзя было вычислить путем глобальной аппроксимации результатов измерения к упомянутой выше модели связывания Ленгмюра 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation Software. Для взаимодействия IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa(H) или FcγRIIIa KD можно было вычислить с использованием следующей модели связывания 1:1, описанной в руководстве Biacore Т100 Software Handbook BR1006-48, Edition AE.

Поведение взаимодействующих молекул в системе Biacore с использованием модели связывания 1:1 может быть отображено с помощью уравнения 4 ниже.

[Уравнение 4]

Req=С × Rmax/(KD+C)+RI

Значение каждого параметра в упомянутом выше уравнении 4 является следующим:

Req (RU): Уровень связывания в стационарном состоянии

С (М): Концентрация анализируемого соединения

С: Концентрация

Rmax (RU): Способность к поверхностному связыванию анализируемого соединения

RI (RU): Совокупный вклад индекса рефракции в образце

KD (М): Равновесная константа диссоциации

KD может быть выражена согласно уравнению 5 ниже путем преобразования уравнения 4.

[Уравнение 5]

KD=С × Rmax/(Req-RI) - С

KD можно вычислять путем подстановки величин Rmax, RI и С в это уравнение. В условиях измерения, используемых в этом примере, величины, подставляемые в это уравнение, составляли RI = 0 и С = 2 мколь/л. В качестве Rmax использовали величину, полученную делением величины Rmax, полученной при глобальной аппроксимации результатов анализа взаимодействия IgG1 с каждым FcγR с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1, на количество уловленного IgG1 и умножением на количества уловленных IgG1-v1 и IgG1-v2.

В условиях измерения, использованных в этом примере, связывание IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa(H) составляло приблизительно 2,5 ОЕ и 10 ОЕ, соответственно, и связывание IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIIa составляло приблизительно 2,5 ОЕ и 5 ОЕ, соответственно. Количества уловленных антител IgG1-v1 и IgG1-v2 на сенсорном чипе в ходе анализа взаимодействия IgG1 с FcγRIIa(H) составляли 469,2 ОЕ и 444,2 ОЕ, и количества уловленных антител IgG1-v1 и IgG1-v2 на сенсорном анализе в ходе анализа взаимодействия IgG1 с FcγRIIIa составляли 470,8 ОЕ и 447,1 ОЕ. Кроме того, величины Rmax, полученные путем глобальной аппроксимации результатов анализа взаимодействия IgG1 с FcγRIIa(H) и FcγRIIIa с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1 составляли 69,8 ОЕ и 63,8 ОЕ, соответственно, и количества антитела, уловленного на сенсорном чипе, составляли 452 ОЕ и 454,5 ОЕ, соответственно. Вычисленные с использованием этих величин величины Rmax для IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa(H) составляли 72,5 ОЕ и 68, 6 ОЕ, соответственно, в то время как вычисленные величины Rmax для IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIIa составляли 66,0 ОЕ и 62,7 ОЕ, соответственно. Величины KD для IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa(H) и FcγRIIIa вычисляли путем подстановки этих величин в уравнение 5.

[Уравнение 5]

KD=С × Rmax/(Req-RI) - С

Величины KD для IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3 в отношении каждого FcγR (величины KD каждого антитела в отношении каждого FcγR) представлены в таблице 24, в то время как относительные величины KD для IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3, полученные путем деления величин KD для IgG1 в отношении каждого FcγR на величины KD для IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3 в отношении каждого FcγR (относительные величины KD для каждого антитела в отношении каждого FcγR) представлены в таблице 25.

В таблице 24 выше звездочками указаны величины KD, которые вычисляли с использованием уравнения 5, когда связывание FcγR с IgG не наблюдали в достаточной степени.

[Уравнение 5]

KD=С × Rmax/(Req-RI) - С

Как показано в таблице 25, аффинность IgG1-v1 в отношении FcγRIa снижалась до 0,047 раз по сравнению с IgG1, аффинность в отношении FcγRIIa(R) снижалась до 0,10 раз, аффинность в отношении FcγRIIa(H) снижалась до 0,014 раз и аффинность в отношении FcγRIIIa снижалась до 0,061 раз. С другой стороны, аффинность в отношении FcγRIIb повышалась в 4,8 раз.

Кроме того, как также показано в таблице 25, аффинность IgG1-v2 в отношении FcγRIa снижалась до 0,74 раз по сравнению с IgG1, аффинность в отношении FcγRIIa(R) снижалась до 0,41 раз, аффинность в отношении FcγRIIa(H) снижалась до 0,064 раз, и аффинность в отношении FcγRIIIa снижалась до 0,14 раз. С другой стороны, аффинность в отношении FcγRIIb повышалась в 2,3 раз.

Иными словами, исходя из этих результатов, IgG1-v1, в котором Asp заменял Pro в положении 238 (нумерация EU), и IgG1-v2, в котором Glu заменял Leu в положении 328 (нумерация EU), продемонстрировали сниженное связывание со всеми активными формами FcγR, включая оба полиморфизма FcγRIIa; и связывание с FcγRIIb, который представляет собой ингибирующий FcγR, отчетливо увеличивалось. До настоящего времени не были описаны изменения, обладающие такими свойствами, и они являются очень редкими, как показано на фиг. 33-36. Изменения, полученные путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp или замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Glu являются в высокой степени пригодными для разработки лекарственных средств от иммунологических воспалительных заболеваний и т.п.

Более того, как показано в таблице 25, IgG1-v3 определенно демонстрирует усиленное в 408 раз связывание с FcγRIIb, в то время как связывание с FcγRIIa (Н) снижается до 0,51 раз, и связывание с FcγRIIa (R) усиливается в 522 раз. Таким образом, поскольку IgG1-v1 и IgG1-v2 подавляют их связывание как с FcγRIIa (R), так и с FcγRIIa (Н), и усиливают их связывание с FcγRIIb, их считают вариантами, которые связываются с большей селективностью к FcγRIIb по сравнению с IgG1-v3. В частности, изменения, полученные путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp или замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Glu являются в высокой степени пригодными для разработки лекарственных средств от иммунологических воспалительных заболеваний и т.п.

(14-3) Эффекты комбинирования модификации селективного связывания с FcγRIIb и других аминокислотных замен в Fc-области

В (14-2) было выявлено, что вариант, полученной путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU) в аминокислотной последовательности встречающегося в природе IgG1 человека, или вариант, полученный путем замены Glu вместо Leu в положении 328 (нумерация EU), демонстрирует сниженное опосредуемое Fc связывание с FcγRIa, FcγRIIIa и любым из полиморфизмов FcγRIIa, а также увеличенное связывание с FcγRIIb. Таким образом, создавали варианты Fc, чтобы они имели далее сниженное связывание с любым из FcγRI, FcγRIIa(Н), FcγRIIa(R) и FcγRIIIa, и далее увеличенное связывание с FcγRIIb в результате внесения дополнительных аминокислотных замен в вариант, полученной путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU), или вариант, полученной путем замены Glu вместо Leu в положении 328 (нумерация EU).

(14-4) Получение антител, имеющих активность связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγRIIb человека селективно усилена

Получали антитела в соответствии со способом, представленным ниже, для селективного усиления активности связывания VH3-IgG1 и VH3-IgG1-F11 с FcγRIIb человека. VH3-IgG1-F648 (SEQ ID NO: 84) получали путем внесения аминокислотной замены, полученной путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU) в VH3-IgG1 в соответствии со способом справочного примера 1. Аналогично, VH3-IgG1-F652 (SEQ ID NO: 85) получали путем внесения аминокислотной замены, полученной путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU) в VH3-IgG1-F11 в соответствии со способом справочного примера 1.

(14-5) Оценка антител, обладающих активностью связывания с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН и активность связывания которых с FcγRIIb человека селективно усилена

Антитела, содержащие VH3-IgG1, VH3-IgG1-F648, VH3-IgG1-F11 или VH3-IgG1-F652 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK в качестве легкой цепи получали в соответствии со способом справочного примера 2.

Взаимодействие этих антител с FcγRIIa(R) и FcγRIIb анализировали с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). Измерение проводили при 25°С с использованием буфера, состоящего из 20 мМ ACES, 150 мМ NaCl и 0,05% Tween 20 (рН 7,4) в качестве подвижного буфера. Чип Series S Sensor Chip СМ4 (GE Healthcare) использовали после иммобилизации белка L способом присоединения аминов. Взаимодействие каждого FcγR с антителом измеряли, позволяя каждому FcγR, разбавленному подвижным буфером, действовать на чип, на котором было уловлено антитело-мишень. Антитело, уловленное на чипе, промывали путем реакции с 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) после измерения, и чип, регенерированный таким образом, использовали повторно.

Результаты измерения анализировали с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation Software. Антитело улавливали с помощью белка L, и величину изменения на сенсограмме до и после улавливания антитела определяли как X1. Далее, FcγR человека позволяли взаимодействовать с антителом, и величину, полученную путем вычитания активности связывания FcγR человека, соответствующую величине изменения на сенсограмме до и после позволения подвижному буферу взаимодействовать с антителом, уловленным с помощью белка L (ΔА2), из величины, полученной путем умножения на 1500 величины, полученной делением активности связывания FcγR человека, соответствующей величине изменения на сенсограмме до и после этого взаимодействия (ΔА1), на количество (X) каждого уловленного антитела, делили на количество каждого уловленного антитела (X), а затем умножали на 1500 с получением активности связывания FcγR человека (Y) (уравнение 1).

[Уравнение 1]

Активность связывания FcγR мыши (Y)=(ΔА1-ΔА2)/Х × 1500

Результаты представлены в таблице 26 ниже. Было подтверждено, что эффект селективного усиления активности связывания с FcγRIIb человека путем внесения мутации, полученной путем замены Asp вместо Pro в положении 238 (нумерация EU) в равной степени наблюдался даже в случае внесения в антитело, обладающего активностью с FcRn человека в условиях области нейтральных значений рН.

IgG1-F652, полученное в этом примере, представляет собой антитело, которое обладает активностью связывания с FcRn в условиях области нейтральных значений рН и которое приводит к усилению активности селективного связывания с ингибирующим FcγRIIb. Иными словами, это антитело соответствует антигенсвязывающей молекуле согласно варианту осуществления 2, показанному в примере 3. Иными словами, IgG1-F652 способно образовывать четырехкомпонентный комплекс, опосредуемый двумя молекулами FcRn и одной молекулой FcγR; однако поскольку это приводит к усилению активности селективного связывания с ингибирующим FcγR, активность связывания с активным FcγR снижается. В результате, полагают, что на антигенпредставляющих клетках предпочтительно образуется четырехкомпонентный комплекс, содержащий ингибирующий FcγR. Как описано ранее, полагают, что иммуногенность вызвана образованием четырехкомпонентного комплекса, содержащего активный FcγR, и что, таким образом, иммунный ответ ингибируется в результате образования четырехкомпонентного комплекса, содержащего ингибирующий FcγR.

[Справочный пример 1] Конструирование экспрессирующих векторов для IgG-антител с заменой аминокислот

Мутанты получали с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) способом, описанным в прилагаемых инструкциях. Фрагменты плазмиды, содержащие мутанты, встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных для конструирования желаемых экспрессирующих векторов Н-цепи и L-цепи. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессирующих векторов определяли способами, известными специалистам в данной области.

[Справочный пример 2] Экспрессия и очистка IgG-антител

Антитела экспрессировали с использованием следующего способа. Клетки клеточной линии, происходящей из рака почки эмбриона человека HEK293H (Invitrogen) суспендировали в DMEM (Invitrogen), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Invitrogen). Клетки высевали в количестве 10 мл на чашку в чашки для не прикрепляющихся клеток (диаметром 10 см; CORNING) с плотностью клеток 5-6 × 10⁵ клеток/мл и культивировали в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течение всего дня и ночи. Затем среду удаляли аспирированием и добавляли 6,9 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen). Полученную плазмиду вводили в клетки способом липофекции. Полученные культуральные супернатанты собирали, центрифугировали (приблизительно 2000×g, 5 мин, комнатная температура) для удаления клеток и стерилизовали фильтрацией через 0,22-мкм фильтр MILLEX (зарегистрированный торговый знак)-GV (Millipore) с получением супернатантов. Антитела очищали из очищенных культуральных супернатантов способом, известным специалистам в данной области с использованием rProtein А Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Для определения концентрации очищенного антитела измеряли поглощение при 280 нм с использованием спектрофотометра. Из определенных величин вычисляли концентрации антител с использованием коэффициента поглощения, вычисленного способом, описанным в Protein Science (1995) 4: 2411-2423.

[Справочный пример 3] Получение растворимого рецептора IL-6 человека (hsIL-6R)

Рекомбинантный рецептор IL-6 человека, который является антигеном, получали следующим образом. Получали клеточную линию CHO, конститутивно экспрессирующую растворимый рецептор IL-6 человека (далее обозначаемый как hsIL-6R), имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из положений с 1 по 357 с N-конца, как описано в J. Immunol. 152: 4958-4968 (1994), способом известным специалистам в данной области. Растворимый рецептор IL-6 человека экспрессировали путем культивирования этой линии CHO. Растворимый рецептор IL-6 человека очищали из культурального супернатанта полученной линии CHO с помощью двух стадий: колоночная хроматография на Blue Sepharose 6 FF и гель-фильтрационная колоночная хроматография. Фракцию, элюированную в качестве главного пика на последней стадии, получали в качестве конечного продукта очистки.

[Справочный пример 4] Исследование PK растворимого рецептора IL-6 человека и антитела человека у нормальных мышей

Для исследования удержания в плазме и иммуногенности растворимого рецептора IL-6 человека и антител человека у нормальных мышей проводили следующее испытание.

(4-1) Исследование времени удержания в плазме и иммуногенности растворимого рецептора IL-6 человека у нормальных мышей

Для исследования удержания в плазме и иммуногенности растворимого рецептора IL-6 человека у нормальных мышей проводили следующее испытание.

Однократную дозу (50 мкг/кг) растворимого рецептора IL-6 человека (полученного согласно справочному примеру 3), вводили в хвостовую вену нормальной мыши (C57BL/6J mouse, Charles River Japan). Взятие образцов крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 14 и 21 суток после введения растворимого рецептора IL-6 человека. Образцы крови сразу центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения. Концентрацию в плазме растворимого рецептора IL-6 человека и титр растворимого антитела мыши против IL-6 человека определяли, как описано ниже.

Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли способом электрохемилюминесценции. Образец для калибровочной кривой растворимого рецептора IL-б, приготовленный в концентрации 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 или 31,25 пг/мл, и образец для измерения в плазме мыши, разбавленный в 50 раз или выше, смешивали с моноклональным антителом против IL-6R человека (R&D), рутенированным с помощью SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D), и тоцилизумабом, с последующей реакцией в течение ночи при 37°С. Тоцилизумаб получали в конечной концентрации 333 мкг/мл. Затем реакционную жидкость распределяли в планшет со стрептавидином МА400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Кроме того, после смывания реакционной жидкости, которой позволяли реагировать в течение 1 часа при комнатной температуре, распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery). Затем сразу проводили измерение в реакционной жидкости с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека вычисляли из ответа калибровочной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices).

Титр антитела мыши против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли способом электрохемилюминесценции. Сначала рецептор IL-6 человека распределяли в непокрытый планшет МА100 PR Uncoated Plate (Meso Scale Discovery). Планшету позволяли стоять нетронутым в течение ночи при 4°С для получения планшета с рецептором IL-6 человека в твердой фазе. Планшету с рецептором IL-6 человека в твердой фазе, в который был распределен образец разбавленной 50 в раз плазмы мыши для измерения, позволяли стоять нетронутым в течение ночи при 4°С. Затем указанный планшет, которому позволяли реагировать с антителом против IgG мыши (целая молекула) (Sigma-Aldrich), рутинированным с помощью SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), промывали в течение 1 часа при комнатной температуре. В указанный планшет распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery), а сразу после этого проводили измерение с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery).

Результаты представлены на фиг. 37. Результаты демонстрируют, что растворимый рецептор IL-6 человека в плазме мыши быстро исчезал. Из трех мышей, которым вводили растворимый рецептор IL-6 человека, для двух мышей (№1 и 3) был показан увеличенный титр растворимого антитела мыши против IL-6 человека в плазме. Это указывает на то, что у этих двух мышей развивался иммунный ответ на растворимый рецептор IL-6 человека, приводящий к продукции антител мыши.

(4-2) Оценка иммуногенности растворимого рецептора IL-6 человека в стационарной модели

Для исследования эффектов продукции антител мыши против растворимого рецептора IL-6 на концентрацию в плазме растворимого рецептора IL-6 человека проводили следующее испытание.

Создавали следующую модель исследования в качестве модели для поддержания концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека в стационарном состоянии (приблизительно 20 нг/мл). Инфузионный насос (MODEL2004, alzet MINI-OSMOTIC PUMP), заполненный растворимым рецептором IL-6 человека, подкожно имплантировали в спину здоровой мыши (мышь C57BL/6J, Charles River Japan) для получения модели на животных с концентрацией в плазме растворимого рецептора IL-6 человека, поддерживаемой в стационарном состоянии.

Исследование проводили в двух группах (n=4 на группу). В группе мышей, которые имитируют иммунную толерантность, вводили однократную дозу (20 мг/кг) моноклонального антитела против CD4 мыши (R&D) в хвостовую вену для ингибирования продукции антител мыши против растворимого рецептора IL-6 человека. Затем антитело аналогичным образом вводили один раз в 10 суток (далее эта группа обозначается как группа введения антитела против CD4 мыши). Другую группу использовали в качестве контрольной группы, т.е. группы без введения антитела против CD4 мыши, в которой не вводили моноклональное антитело против CD4 мыши. Затем инфузионный насос, заполненный 92,8 мкг/мл растворимого рецептора IL-6 человека, подкожно имплантировали в спину мыши. После имплантации инфузионного насоса проводили взятие образцов крови с течением времени, а затем сразу проводили центрифугирование в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. для получения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения. Концентрацию в плазме растворимого рецептора IL-6 человека (hsIL-6R) определяли аналогично тому, как в справочном примере 4-1.

Изменения концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у отдельных нормальных мышей, определенные как описано выше, представлены на фиг. 38.

В результате на 14 сутки после того, как инфузионный насос подкожно имплантировали в область спины мыши, наблюдали, что концентрации растворимого рецептора IL-6 человека были снижены у всех трех мышей в группе без введения антитела против CD4 мыши. С другой стороны, не наблюдали снижения концентраций в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у всех мышей, которым вводили антитело против CD4 для ингибирования продукции антител мыши против растворимого рецептора IL-6 человека.

Результаты (4-1) и (4-2) указывают на следующие три положения:

(1) Растворимый рецептор IL-6 человека после введения мышам быстро исчезает из плазмы;

(2) растворимый рецептор IL-6 человека представляет собой чужеродный белок для мышей, который является иммуногенным при введении мыши, индуцируя продукцию антител мыши против растворимого рецептора IL-6 человека; и

(3) если происходит продукция антител мыши против растворимого рецептора IL-6 человека, исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека далее ускоряется, даже в модели с концентрацией в плазме растворимого рецептора IL-6 человека, поддерживаемой на определенном уровне, происходит снижение концентрации в плазме.

(4-3) Исследование времени удержания в плазме и иммуногенности антитела человека у нормальной мыши

Для исследования времени удержания в плазме и иммуногенности антитела человека у нормальной мыши проводили следующее испытание.

Однократную дозу (1 мг/кг) антитела против рецептора IL-6 человека, Fv4-IgG1, вводили в хвостовую вену нормальной мыши (мышь C57BL/6J, Charles River Japan). Взятие образцов крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 14 и 21 суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Взятые образцы крови сразу центрифугировали при 15000 об./мин. в течение 15 минут при 4°С для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения.

Концентрацию в плазме антитела против рецептора IL-6 человека у мыши определяли с помощью антитело ELISA. Сначала F(ab')2-фрагмент антитела против IgG человека (специфичный к γ-цепи) (SIGMA) распределяли в планшеты Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International) и позволяли им стоять в течение ночи при 4°С с получением планшетов с антителом против IgG человека в твердой фазе. Получали образцы для калибровочной кривой, имеющие концентрации антитела против рецептора IL-6 человека в плазме 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0,0125 мкг/мл, и образцы для анализа плазмы мыши, разбавленные в 100 раз или более. Смеси 100 мкл образца для калибровочной кривой и образца плазмы для измерения и 200 мкл растворимого рецептора IL-6 человека в концентрации 20 нг/мл позволяли стоять нетронутой в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшету с антителом против IgG человека на твердой фазе, в каждую из лунок которого распределяли смеси, далее позволяли стоять нетронутым в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшету позволяли реагировать с биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D) в течение 1 часа при комнатной температуре. Проводили хромогенную реакцию реакционной жидкости, полученной путем реакции со стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием в качестве субстрата ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После остановки реакции 1 H серной кислотой (Showa Chemical) измеряли поглощение реакционных жидкостей в каждой лунке при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме у мышей вычисляли из величин поглощения на калибровочной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices).

Результаты представлены на фиг. 39. Время удержания в плазме антитела человека, когда мыши вводили однократную дозу антитела человека, было значительно более высоким, чем у растворимого рецептора IL-6 человека, когда вводили однократную дозу растворимого рецептора IL-6 человека (фиг. 37), и было продемонстрировано, что высокая концентрация в плазме сохраняется даже на 21 сутки после введения. Это, вероятно, является следствием того, что антитела человека, которые включены в клетки, связываются с FcRn мыши в эндосоме для рецилирования в плазму. С другой стороны, полагают, что растворимый рецептор IL-6 человека, который включен в клетки, быстро исчезает из плазмы, поскольку он не имеет пути для рециклирования из эндосомы.

Более того, ни у одной из трех мышей, которым вводили антитело человека, не наблюдали сниженной концентрации в плазме, наблюдаемой в стационарной модели для растворимого рецептора IL-6 человека (фиг. 38). Иными словами, было предположено, что в отличие от рецептора IL-6 человека, не продуцировалось антитело мыши против антитела человека.

Результаты (4-1), (4-2) и (4-3) могут указывать на следующее. Прежде всего, как растворимый рецептор IL-6 человека, так и антитело человека, являются чужеродными белками у мышей. Таким образом, полагают, что мыши имеют большую популяцию Т-клеток, которые специфично отвечают на них.

Когда растворимый рецептор IL-6 человека, т.е. чужеродный белок, вводили мыши, он исчезал из плазмы за короткий период времени и иммунный ответ на растворимый рецептор IL-6 человека подтверждался. В этом случае, быстрое исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека из плазмы указывает на то, что множество растворимых рецепторов IL-6 человека включается в антигенпредставляющие клетки за короткий период времени и подвергается процессингу в клетках, а затем активирует Т-клетки, которые специфично отвечают на растворимый рецептор IL-6 человека. Полагают, что в результате возникает иммунный ответ на растворимый рецептор IL-6 человека (т.е. продукция антитела мыши против растворимого рецептора IL-6 человека).

С другой стороны, когда антитело человека, т.е. чужеродный белок, вводили мыши, его удержание в плазме было значительно более низким, чем у растворимого рецептора IL-6 человека и иммунный ответ на антитело человека не возникал. Более длительное удержание в плазме указывает на присутствие только небольшого количества антител человека, которые включаются в антигенпредставляющие клетки и подвергаются процессингу. Таким образом, полагают, что даже если мышь имеет популяцию Т-клеток, которая специфично отвечает на антитело человека, Т-клетки не активируются путем представления антигена и в результате иммунный ответ на антитело человека (т.е. продукция антитела мыши против антитела человека) не возникает.

[Справочный пример 5] Получение и оценка различных вариантов Fc антител с увеличенной аффинность связывания с FcRn человека при нейтральных значениях рН

(5-1) Получение и оценка активности связывания различных вариантов Fc антител с увеличенной аффинностью связывания с FcRn человека при нейтральных значениях рН

Для увеличения аффинности связывания с FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН, вносили различные мутации в VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) для оценки. Варианты (с IgG1-F1 по IgG1-F1052), содержащие полученные тяжелые и легкие цепи L (WT)-CK (SEQ ID NO: 41) экспрессировали и очищали в соответствии со способом, описанным в справочном примере 2.

Связывание антитела с FcRn человека анализировали в соответствии со способом, описанным в примере 4. Иными словами, активность связывания вариантов FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,0), определенная с использованием Biacore, представлена в таблицах с 27-1 по 27-32.

Таблица 27-2 является продолжением таблицы 27-1.

Таблица 27-3 является продолжением таблицы 27-2.

Таблица 27-4 является продолжением таблицы 27-3.

Таблица 27-5 является продолжением таблицы 27-4.

Таблица 27-6 является продолжением таблицы 27-5.

Таблица 27-7 является продолжением таблицы 27-6.

Таблица 27-8 является продолжением таблицы 27-7.

Таблица 27-9 является продолжением таблицы 27-8.

Таблица 27-10 является продолжением таблицы 27-9.

Таблица 27-11 является продолжением таблицы 27-10.

Таблица 27-12 является продолжением таблицы 27-11.

Таблица 27-13 является продолжением таблицы 27-12.

Таблица 27-14 является продолжением таблицы 27-13.

Таблица 27-15 является продолжением таблицы 27-14.

Таблица 27-16 является продолжением таблицы 27-15.

Таблица 27-17 является продолжением таблицы 27-16.

Таблица 27-18 является продолжением таблицы 27-17.

Таблица 27-19 является продолжением таблицы 27-18.

Таблица 27-20 является продолжением таблицы 27-19.

Таблица 27-21 является продолжением таблицы 27-20.

Таблица 27-22 является продолжением таблицы 27-21.

Таблица 27-23 является продолжением таблицы 27-22.

Таблица 27-24 является продолжением таблицы 27-23.

Таблица 27-25 является продолжением таблицы 27-24.

Таблица 27-26 является продолжением таблицы 27-25.

Таблица 27-27 является продолжением таблицы 27-26.

Таблица 27-28 является продолжением таблицы 27-27.

Таблица 27-29 является продолжением таблицы 27-28.

Таблица 27-30 является продолжением таблицы 27-29.

Таблица 27-31 является продолжением таблицы 27-30.

Таблица 27-32 является продолжением таблицы 27-31.

(5-2) Исследование in vivo антител с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека с усиленным связыванием FcRn человека в условиях нейтральных значений рН

Антитела с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека, обладающие способностью связывать FcRn человека в нейтральных условиях, получали с использованием тяжелых цепей, полученных как описано в примере 5-1, чтобы они имели способность связывать FcRn человека в нейтральных условиях. Антитела оценивали в отношении их эффекта элиминации антигена in vivo. В частности, антитела, приведенные ниже, экспрессировали и очищали способами, известными специалистам в данной области, как описано в справочном примере 2:

Fv4-IgG1, содержащее VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-v2, содержащее VH3-IgG1-v2 (SEQ ID NO: 37) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F14, содержащее VH3-IgG1-F14 (SEQ ID NO: 86) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F20, содержащее VH3-IgG1-F20 (SEQ ID NO: 39) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F21, содержащее VH3-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 40) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F25, содержащее VH3-IgG1-F25 (SEQ ID NO: 87) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F29, содержащее VH3-IgG1-F29 (SEQ ID NO: 88) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F35, содержащее VH3-IgG1-F35 (SEQ ID NO: 89) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F48, содержащее VH3-IgG1-F48 (SEQ ID NO: 90) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36);

Fv4-IgG1-F93, содержащее VH3-IgG1-F93 (SEQ ID NO: 91) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36); и

Fv4-IgG1-F94, содержащее VH3-IgG1-F94 (SEQ ID NO: 92) и VL3-CK (SEQ ID NO: 36).

Полученные антитела с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека исследовали in vivo способом, описанным ниже, с использованием трансгенных мышей с FcRn человека (мышь B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линии 276 +/+, Jackson Laboratories; Способы Mol Biol. (2010) 602: 93-104).

Трансгенным мышам с FcRn человека (мыши В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линии 276 +/+, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104) и нормальным мышам (мышь C57BL/6J, Charles River Japan), вводили hsIL-6R (растворимый рецептор IL-6 человека, полученный согласно справочному примеру 3) отдельно или вводили растворимый рецептор IL-6 человека и антитело против рецептора IL-6 человека одновременно для исследования фармакокинетики растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против рецептора IL-6 человека in vivo. Однократную дозу раствора (10 мл/кг) растворимого рецептора IL-6 человека (5 мкг/мл) или смеси растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против рецептора IL-6 человека (5 мкг/мл и 0,1 мг/мл, соответственно) вводили в хвостовую вену. В это время антитело против растворимого рецептора IL-6 человека существовало в достаточном или избыточном количестве. Таким образом, полагают, что большинство растворимых рецепторов IL-6 человека связывалось с антителом. Образцы крови собирали через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения. Полученные образцы крови сразу центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 15000 об./мин. для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения.

(5-3) Определение концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека способом электрохемилюминесценции

Образец для калибровочной кривой растворимого рецептора IL-6, человека приготовленный в концентрации 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 или 31,25 пг/мл, и образец для измерения в плазме мыши, разбавленный в 50 раз или выше, смешивали с моноклональным антителом против IL-6R человека (R&D), рутенированным с помощью SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D), и тоцилизумабом, с последующей реакцией в течение ночи при 37°С. Тоцилизумаб получали в конечной концентрации 333 мкг/мл. Затем реакционную жидкость распределяли в планшет со стрептавидином МА400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Кроме того, после смывания реакционной жидкости, которой позволяли реагировать в течение 1 часа при комнатной температуре, распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery). Затем сразу проводили измерение в реакционной жидкости с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека вычисляли из ответа калибровочной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices).

Концентрация в плазме с течением времени растворимого рецептора IL-6 человека после внутривенного введения трансгенным мышам с FcRn человека представлена на фиг. 40. Результат испытания показал, что концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека оставалась низкой с течением времени в присутствии любого из антител с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека с усиленным связыванием с FcRn человека в нейтральных условиях, по сравнению с концентрацией в присутствии Fv4-IgG1, которое практически не обладает способностью связывания с FcRn человека в нейтральных условиях. Среди прочих, антитела, которые вызывали заметный эффект, включают, например, Fv4-IgG1-F14. Было продемонстрировано, что концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека, которому одновременно вводили Fv4-IgG1-F14, снизилась приблизительно в 54 раза через одни сутки после введения по сравнению с концентрацией растворимого рецептора IL-6 человека, одновременно вводимого с Fv4-IgG1. Более того, было продемонстрировано, что концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека, одновременно вводимого с Fv4-IgG1-F21, была снижена приблизительно в 24 раза через семь часов после введения по сравнению с концентрацией растворимого рецептора IL-6 человека, одновременно вводимого с Fv4-IgG1. Кроме того, концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека, одновременно вводимого с Fv4-IgG1-F25 через семь часов после введения, была ниже предела выявления (1,56 нг/мл). Таким образом, ожидалось, что Fv4-IgG1-F25 обеспечит значительное снижение в 200 или более раз концентрации растворимого рецептора IL-6 человека относительно концентрации растворимого рецептора IL-6 человека, одновременно вводимого с Fv4-IgG1.

Данные, описанные выше, демонстрируют, что усиление связывания антитела с рН-зависимым связыванием антигена с FcRn человека в нейтральных условиях является высоко эффективным в отношении усиления эффекта элиминации антигена. Между тем, тип аминокислотного изменения для усиления связывания FcRn человека в нейтральных условиях, которое вносят для усиления эффекта элиминации антигена, конкретно не ограничен; и такие изменения включают изменения, представленные в таблице 16. Может быть предсказано, что эффект элиминации антигена усилится in vivo с помощью любого внесенного изменения.

[Справочный пример 6] Получение антител, которые связываются с рецептором IL-6 Са-зависимым образом, из библиотеки антител с использованием технологии фагового дисплея

(6-1) Получение библиотеки фагового дисплея для наивных антител человека

Библиотеку фагового дисплея для антител человека, состоящую из множества фагов, представляющих Fab-домены взаимно отличающихся последовательностей антител человека, конструировали в соответствии со способом, известным специалистам в данной области, с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека в качестве матрицы.

(6-2) Получение фрагментов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом из библиотеки посредством пэннинга гранул

Сконструированную библиотеку фагового дисплея для наивных антител человека подвергали первоначальной селекции посредством концентрирования только тех фрагментов антител, которые обладают способностью связывать антиген (рецептор IL-6), или концентрирования фрагментов антител с использованием зависимой от концентрации Са способности связывания антигена (рецептора IL-6) в качестве индикатора. Концентрирование фрагментов антител с использованием зависимой от концентрации Са способности связывать антиген (рецептор IL-6) в качестве индикатора проводили путем элюирования фагов фаговой библиотеки, связавшихся с рецептором IL-6 в присутствии ионов Са, с EDTA, которая хелатирует ионы Са. В качестве антигена использовали биотинилированный рецептор IL-6.

Фаги получали из Escherichia coli, содержащих сконструированную фагмиду фагового дисплея. Раствор фаговой библиотеки получали путем разбавления с помощью TBS популяции фагов, преципитированных добавлением 2,5 М NaCl/10% PEG к культуральному раствору Е. coli, в котором продуцировались фаги. Затем к раствору фаговой библиотеки добавляли BSA и CaCl₂ в конечной концентрации 4% BSA и концентрации ионов кальция 1,2 мМ. Обычный способ пэниннга с использованием антигена, иммобилизованного на магнитных гранулах, был назван способом пэниннга (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Способы. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-9). В качестве магнитных гранул использовали покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBeads Neutravidin-coated) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads М-280 Streptavidin).

В частности, к полученному раствору фаговой библиотеки добавляли 250 пмоль меченного биотином антигена, чтобы обеспечить контактирование указанного раствора фаговой библиотеки с антигеном в течение 60 минут при комнатной температуре. Добавляли магнитные гранулы, блокированные с помощью BSA, чтобы они связывались с комплексами антиген-фаг в течение 15 минут при комнатной температуре. Гранулы промывали один раз с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl₂/TBS (TBS, содержащий 1,2 мМ CaCl₂). Затем раствор фага выделяли с помощью общего способа элюирования для концентрирования фрагмента антитела, обладающего способностью связывать рецептор IL-6, или с помощью элюирования с гранул, суспендированных в 2 мМ EDTA/TBS (TBS, содержащий 2 мМ EDTA), для концентрирования фрагмента антитела с использованием способности связывать рецептор IL-6 зависимым от концентрации Са образом в качестве показателя. Раствор выделенного фага добавляли к 10 мл штамма Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coli культивировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение 1 часа, чтобы позволить фагам инфицировать Е. coli. Инфицированные Е. coli инокулировали в чашку 225 мм × 225 мм. Затем после инокуляции фаги выделяли из культуральной среды Е. coli для получения раствора фаговой библиотеки.

Во втором и последующем пэннинге фаги концентрировали с использованием зависимой от Са способности связывания в качестве индикатора. В частности, 40 пмоль меченного биотином антитела добавляли к полученному раствору фаговой библиотеки, чтобы обеспечить контактирование фаговой библиотеки с антигеном в течение 60 минут при комнатной температуре. Добавляли магнитные гранулы, блокированные с помощью BSA, чтобы они связывались с комплексами антиген-фаг в течение 15 минут при комнатной температуре. Гранулы промывали один раз с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl₂/TBST и 1,2 мМ CaCl₂/TBS. Затем гранулы, к которым добавляли 0,1 мл 2 мМ EDTA/TBS, суспендировали при комнатной температуре. Сразу после этого гранулы отделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора фага. Раствор выделенного фага добавляли к 10 мл штамма Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coli культивировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение 1 часа, чтобы позволить фагам инфицировать Е. coli. Инфицированные Е. coli инокулировали в чашку 225 мм × 225 мм. Затем после инокуляции фаги выделяли из культуральной среды Е. coli для получения раствора фаговой библиотеки. Пэннинг с использованием способности Са-зависимого связывания в качестве показателя повторяли несколько раз.

(6-3) Исследование с помощью ELISA фагов

Фаг, содержащий культуральный супернатант, собирали общепринятым способом (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) из единичной колонии Е. coli, полученной, как описано выше.

Культуральный супернатант, содержащий фаги, в который были добавлены BSA и CaCl₂ до конечной концентрации 4% BSA и концентрации ионов кальция 1,2 мМ, подвергали ELISA, как описано ниже. На 96-луночный микропланшет для титрования StreptaWell (Roche) наносили в течение ночи 100 мкл PBS, содержащего меченный биотином антиген. Каждую лунку указанного планшета промывали PBST для удаления антигена, а затем лунки блокировали с помощью 250 мкл 4% BSA-TBS в течение 1 часа или дольше. Указанному планшету с полученным культуральным супернатантом, добавленным в каждую лунку, из которой был удален 4% BSA-TBS, позволяли стоять нетронутым при 37°С в течение 1 часа, позволяя связываться представляющему фаг антителу с антигеном, присутствующим в каждой лунке. В каждую лунку, промытую 1,2 мМ CaCl₂/TBST, добавляли 1,2 мМ CaCl₂/TBS или 1 мМ EDTA/TBS. Планшету позволяли стоять нетронутым в течение 30 минут при 37°С для инкубации. После промывания 1,2 мМ CaCl₂/TBST, в каждую лунку добавляли конъюгироваанное с HRP антитело против М13 (Amersham Pharmacia Biotech), разбавленное TBS в конечной концентрации 4% BSA и концентрации ионизированного кальция 1,2 мМ, и планшет инкубировали в течение 1 часа. После промывания 1,2 мМ CaCl₂/TBST хромогенную реакцию раствора в каждой лунке, в которую добавляли только раствор ТМВ (ZYMED), останавливали добавлением серной кислоты. Затем указанный цвет определяли путем измерения поглощения при 450 нм.

В результате указанного выше ELISA фагов анализировали последовательность оснований гена, амплифицированного с помощью специфических праймеров и фрагмента антитела, идентифицированного как обладающего способностью зависимого от Са связывания антигена в качестве матрицы.

(6-4) Экспрессия и очистка антител

В результате описанного выше ELISA фагов, клон, идентифицированный как обладающий зависимой от Са способностью связывания антигена, вводили в экспрессирующую плазмиду для клеток животных. Антитела экспрессировали, как описано ниже. Штамм Freestyle 293-F (Invitrogen), происходящий из клеток почки эмбриона человека, суспендировали в среде Freestyle 293 Expression Medium (Invitrogen), а затем инокулировали по 3 мл в каждую лунку планшета с 6 ячейками с плотностью клеток 1,33×10⁶ клеток/мл. Полученную плазмиду вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в течение 4 суток в инкубаторе с CO₂ (37°С, 8% CO₂, 90 об./мин.). Антитела очищали из культурального супернатанта, полученного, как описано выше, способом, известным в данной области, с использованием rProtein A Sepharose (торговый знак) Fast Flow (Amersham Biosciences). Поглощение очищенного раствора антитела измеряли при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрацию антитела вычисляли из данных измерения, полученных с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[Справочный пример 7] Исследование зависимой от Са способности связывания полученных антител к рецептору IL-6 человека

Для исследования того, является ли активность связывания антител 6RL#9-IgG1 [тяжелая цепь (последовательность константной области, происходящая из IgG1, связанная с SEQ ID NO: 9) и легкая цепь (SEQ ID NO: 93)] и FH4-IgG1 [тяжелая цепь (SEQ ID NO: 94) и легкая цепь (SEQ ID NO: 95)], полученных согласно справочному примеру 6, с рецептором IL-6 человека зависимой от Са, проводили кинетический анализ реакций антиген-антитело для этих антител с рецептором IL-6 человека с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). H54/L28-IgG1 [вариабельная область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 96) и вариабельная область легкой цепи (SEQ ID NO: 97)], описанное в WO 2009/125825, использовали в качестве контрольного антитела, которое обладает Са-зависимой активностью связывания с рецептором IL-6 человека. Кинетический анализ реакций антиген-антитело проводили в растворах с концентрациями ионов кальция 2 мМ и 3 мкМ в качестве условий высокой и низкой концентрации ионов кальция, соответственно. Представляющее интерес антитело иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare), на котором было иммобилизовано подходящее количество белка A (Invitrogen) способом присоединения аминов. В качестве подвижных буферов использовали два буфера [10 мМ ACES, 150 мМ NaCl, 0,05% (масс./об.) Tween 20, и 2 мМ CaCl₂ (рН 7,4) или 10 мМ ACES, 150 мМ NaCl, 0. 05% (масс./об.) Tween 20, и 3 мколь/л CaCl₂ (рН 7,4)]. Эти буферы использовали для разбавления рецептора IL-6 человека. Все измерения проводили при 37°С.

В кинетическом анализе реакции антиген-антитело с использованием антитела H54L28-IgG1, антителу H54L28-IgG1, уловленному на сенсорном чипе, позволяли взаимодействовать с рецептором IL-6 путем инжекции разбавителя рецептора IL-6 и подвижного буфера (пустой образец) со скоростью потока 20 мкл/мин в течение 3 минут. Затем после выявления диссоциации рецептора IL-6 с использованием подвижного буфера со скоростью потока 20 мкл/мин в течение 10 минут, сенсорный чип регенерировали путем инъекции 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 30 секунд. Из сенсограмм, полученных при измерении, вычисляли параметры кинетики: константу связывания (ka) (1/Мс) и константу скорости диссоциации (kd) (1/с). Эти величины использовали для вычисления константы диссоциации (KD) (М) антитела H54L28-IgG1 в отношении рецептора IL-6 человека. Каждый параметр вычисляли с использованием программного обеспечения Biacore Т100 Evaluation Software (GE Healthcare).

В кинетическом анализе реакции антиген-антитело с использованием антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, антителу FH4-IgG1 или 6RL#9-IgG1, уловленному на сенсорном чипе, позволяли взаимодействовать с рецептором IL-6 путем инжекции разбавителя рецептора IL-6 и подвижного буфера (пустой образец) со скоростью потока 5 мкл/мин в течение 15 минут. Затем сенсорный чип регенерировали путем инжекции 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 30 секунд. Константы диссоциации (KD) (М) вычисляли из сенсограмм при измерении с использованием стационарной модели аффинности. Каждый параметр вычисляли с использованием программного обеспечения Biacore Т100 Evaluation Software (GE Healthcare). Константы диссоциации (KD) между каждым антителом и рецептором IL-6 в присутствии 2 мМ CaCl₂, определенные описанным выше способом, представлены в таблице 28.

Величину KD для антитела H54/L28-IgG1 в условиях концентрации Са 3 мкМ можно вычислять аналогично тому, как и в присутствии концентрации кальция Са 2 мМ. В условиях концентрации Са 3 мкМ наблюдали, что антитела FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1 практически не связываются с рецептором IL-6, таким образом, вычисление величин KD способом, описанным выше, является трудным. Однако величины KD для этих антител в условиях концентрации Са 3 мкМ можно оценивать с использованием формулы 5 (Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007), описанной в примере 13.

Приблизительные результаты для величин константы диссоциации KD для антител и рецептора IL-6 при концентрации Са 3 мколь/л, оцененной с использованием формулы 3, описанной в примере 13, представлены в таблице 29. В таблице 29 величины R_eq, R_max, RI и С оценены, исходя из результата анализа.

Исходя из данных, описанных выше, было предсказано, что K_D между рецептором IL-6 и антителом FH4-IgG1 или антителом 6RL#9-IgG1 увеличивалась приблизительно в 60 или 120 раз (аффинность снижалась в 60 или 120 раз или более), когда концентрацию CaCl₂ в буфере снижали от 2 мМ до 3 мкМ. В таблице 30 обобщенно представлены величины K_D при концентрациях CaCl₂ 2 мМ и 3 мкМ и зависимость от Са для трех типов антител H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1.

Не было выявлено отличий в связывании антитела H54/L28-IgG1 с рецептором IL-6 вследствие отличий в концентрации Са. С другой стороны, было выявлено, что связывание антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1 с рецептором IL-6 было значительно ослаблено в условиях низкой концентрации Са (таблица 30).

[Справочный пример 8] Исследование связывания ионов кальция с полученным антителом

Затем измеряли промежуточную температуру термической денатурации (величину Tm) с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) в качестве показателя для исследования связывания ионов кальция с антителом (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). Промежуточная температура термической денатурации (величина Tm) является показателем стабильности. Промежуточная температура термической денатурации (величина Tm) становится более высокой, когда белок стабилизирован путем связывания с ионами кальция, по сравнению с отсутствием связывания ионов кальция (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Активность связывания ионов кальция с антителом исследовали путем исследования изменений величины Tm антитела, в зависимости от изменений концентрации ионов кальция в растворе антитела. Очищенное антитело подвергали диализу (EasySEP, TOMY) с использованием внешнего раствора 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 2 мМ CaCl₂ (pH 7,4), или 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 3 мкМ CaCl₂ (pH 7,4). Измерение DSC проводили при скорости нагревания 240°С/ч от 20 до 115°C с использованием раствора антитела, приготовленного в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл с диализатом в качестве исследуемого вещества. Промежуточные температуры термической денатурации (величины Tm) Fab-доменов каждого антитела, вычисленные исходя из кривой денатурации, полученной с помощью DSC, представлены в таблице 31.

Результаты, представленные в таблице 31, показывают, что величины Tm для Fab антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, которые проявляют зависимую от кальция способность связывания, варьировали при изменении концентрации ионов кальция, в то время как величины Tm для Fab антитела H54/L28-IgG1, которое не проявляет зависимой от кальция способности связывания, не варьируют при изменении концентрации ионов кальция. Варьирование величин Tm для Fab антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1 демонстрирует, что ионы кальция, связанные с этими антителами, стабилизируют Fab-части. Описанные выше результаты показывают, что ионы кальция связывались с антителами FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, в то время как ионы кальция не связывались с антителом H54/L28-IgG1.

[Справочный пример 9] Идентификация участка связывания ионов кальция в антителе 6RL#9 с помощью рентгеновской кристаллографии

(9-1) Рентгеновская кристаллография

Как описано в справочном примере 8, измерение температуры термической денатурации Tm показало, что антитело 6RL#9 связывается с ионами кальция. Однако было непредсказуемо, какая часть антитела 6RL#9 связывается с ионом кальция. Следовательно, с использованием способа рентгеновской кристаллографии идентифицировали остатки антитела 6RL#9, которые взаимодействуют с ионом кальция.

(9-2) Экспрессия и очистка антитела 6RL#9

Антитело 6RL#9 экспрессировали и очищали для рентгеновской кристаллографии. В частности, плазмиды для экспрессии у животных, сконструированные так, чтобы они были способны экспрессировать тяжелую цепь (последовательность константной области, происходящая из IgG1, была связана с SEQ ID NO: 9) и легкую цепь (SEQ ID NO: 93) антитела 6RL#9, вводили временно в клетки животных. Сконструированные плазмиды вводили способом липофекции в клетки линии, происходящей из клеток почек эмбриона человека FreeStyle 293-F (Invitrogen), суспендированные в 800 мл среды для экспрессии FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) (конечная плотность клеток: 1×10⁶ клеток/мл). Клетки с введенной плазмидой культивировали в инкубаторе с CO₂ (37°С, 8% CO₂, 90 об./мин.) в течение пяти суток. Из культурального супернатанта, полученного, как описано выше, антитела очищали способом, известным специалистам в данной области, с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Поглощение при 280 нм очищенных растворов антитела измеряли с использованием спектрофотометра. Из измеренных значений вычисляли концентрации антител с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(9-3) Очистка Fab-фрагмента антитела 6RL#9

Антитело 6RL#9 концентрировали до 21 мг/мл с использованием ультрафильтра с пределом молекулярной массы 10000 MWCO. Образец антитела в концентрации 5 мг/мл (2,5 мл) получали разбавлением раствора антитела с использованием буфера 4 мМ L-цистеин/5 мМ EDTA/20 мМ фосфат натрия (рН 6,5). К образцу добавляли 0,125 мг папаина (Roche Applied Science). После перемешивания образец инкубировали при 35°С в течение двух часов. После инкубации таблетку с ингибиторами протеаз Protease Inhibitor Cocktail Mini, не содержащую EDTA (Roche Applied Science) растворяли в 10 мл буфера 25 мМ MES (рН 6) и добавляли к образцу. Образец инкубировали на льду для остановки протеолитического расщепления папаином. Затем образец наносили на 1-мл катионнообменную колонку HiTrap SP HP (GE Healthcare), уравновешенную 25 мМ буфером MES (рН 6), ниже которой была последовательно подсоединена 1-мл колонка с белком A HiTrap MabSelect Sure Protein A column (GE Healthcare). Очищенную фракцию Fab-фрагмента антитела 6RL#9 получали, путем проведения элюирования с помощью линейного градиента концентрации NaCl вплоть до 300 мМ в описанном выше буфере. Затем полученную очищенную фракцию концентрировали до приблизительно 0,8 мл с использованием ультрафильтра 5000 MWCO. Концентрат наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную 100 мМ буфером HEPES (рН 8), содержащим 50 мМ NaCl. Очищенный Fab-фрагмент антитела 6RL#9 для кристаллизации элюировали с колонки с использованием того же буфера. Все обработки колонок, описанные выше, проводили при низкой температуре от 6 до 7,5°С.

(9-4) Кристаллизация Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в присутствии Са

Затравочные кристаллы Fab-фрагмента 6RL#9 получали заранее согласно общим условиям. Затем очищенный Fab-фрагмент антитела 6RL#9 в 5 мМ CaCl₂ концентрировали до 12 мг/мл с помощью ультрафильтра 5000 MWCO. Далее, образец, концентрированный, как описано выше, кристаллизовали способом висячей капли посредством диффузии в парах с использованием 100 мМ буфера HEPES (рН 7,5), содержавшего 20%-29% PEG4000, в качестве резервуарного раствора. Описанные выше затравочные кристаллы, дробили в 100 мМ буфере HEPES (рН 7,5), содержавшем 29% PEG4000 и 5 мМ CaCl₂, и проводили серийное разведение в от 100 до 10000 раз. Затем 0,2 мкл разбавленных растворов комбинировали со смесью 0,8 мкл резервуарного раствора и 0,8 мкл концентрированного образца для получения кристаллизационных капель на покровном стекле. Каплям кристаллов позволяли держаться при 20°С в течение от двух до трех суток до получения плоских кристаллов. С использованием кристаллов получали данные рентгенодиффракции.

(9-5) Кристаллизация Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в отсутствие Са

Очищенный Fab-фрагмент антитела 6RL#9 концентрировали до 15 мг/мл с помощью ультрафильтра 5000 MWCO. Далее, образец, концентрированный, как описано выше, кристаллизовали способом висячей капли посредством диффузии в парах с использованием 100 мМ буфера HEPES (рН 7,5), содержавшего 18%-25% PEG4000, в качестве резервуарного раствора. Описанные выше затравочные кристаллы, дробили в 100 мМ буфере HEPES (рН 7,5), содержавшем 25% PEG4000, и проводили серийное разведение в от 100 до 10000 раз. Затем 0,2 мкл разбавленных растворов комбинировали со смесью 0,8 мкл резервуарного раствора и 0,8 мкл концентрированного образца для получения кристаллизационных капель на покровном стекле. Каплям кристаллов позволяли держаться при 20°С в течение от двух до трех суток до получения плоских кристаллов. С использованием кристаллов получали данные рентгенодиффракции.

(9-6) Рентгеновское кристаллографическое измерение кристалла Fab-фрагмента из антитела 6RL#9 в присутствии Са

Кристаллы Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученные в присутствии Са, смачивали 100 мМ раствором буфера HEPES (рН 7,5), содержавшим 35% PEG4000 и 5 мМ CaCl₂. Удалив внешней раствор с поверхности монокристалла с помощью микробулавки в виде нейлоновой петли, монокристалл замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодиффракции замороженного кристалла получали из линии пучка BL-17A Photon Factory в High Energy Accelerator Research Organization. Замороженный кристалл поддерживали в замороженном состоянии в ходе измерения путем постоянного помещения его в поток газообразного азота при -178°С. Всего было получено 180 дифракционных изображений с использованием CCD-детектора Quantum315r (ADSC), присоединенного к линии пучка, при вращении кристалла с интервалами 1°. Определение константы решетки, индексирование дифракционных пятен и анализ данных дифракции проводили с использованием программ Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) и Scala (CCP4 Software Suite). Наконец, были получены данные интенсивности дифракции с разрешением вплоть до 2,2 ангстрем. Кристалл принадлежит к группе симметрии Р212121 с константой решетки а=45,47 ангстрем, b=79,86 ангстрем, с=116,25 ангстрем, α=90°, β=90° и γ=90°.

(9-7) Рентгеновское кристаллографическое измерение кристалла Fab-фрагмента из антитела 6RL#9 в отсутствие Са

Кристаллы Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученные в отсутствие Са, смачивали 100 мМ раствором буфера HEPES (рН 7,5), содержавшим 35% PEG4000. Удалив внешней раствор с поверхности монокристалла с помощью микробулавки в виде нейлоновой петли, монокристалл замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодиффракции замороженного кристалла получали из линии пучка BL-5A Photon Factory в High Energy Accelerator Research Organization. Замороженный кристалл поддерживали в замороженном состоянии в ходе измерения путем постоянного помещения его в поток газообразного азота при -178°С. Всего было получено 180 дифракционных изображений с использованием CCD-детектора Quantum210r (ADSC), присоединенного к линии пучка, при вращении кристалла с интервалами 1°. Определение константы решетки, индексирование дифракционных пятен и анализ данных дифракции проводили с использованием программ Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch)и Scala (CCP4 Software Suite). Наконец, были получены данные интенсивности дифракции с разрешением вплоть до 2,3 ангстрем. Кристалл принадлежит к группе симметрии Р212121 с константой решетки а=45,40 ангстрем, b=79,63 ангстрем, с=116,07 ангстрем, α=90°, β=90° и γ=90°, и, таким образом, он структурно идентичен кристаллу, полученному в присутствии Са.

(9-8) Измерение способом рентгеновской кристаллографии кристалла Fab-фрагмента из антитела 6RL#9 в присутствии Са

Кристаллическую структуру Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в присутствии Са определяли способом молекулярного замещения с использованием программы Phaser (CCP4 Software Suite). Количество молекул в асимметричном элементе оценивали, исходя из размера кристаллической решетки и молекулярной массы Fab-фрагмента антитела 6RL#9. Исходя из гомологии первичной последовательности, часть из положений аминокислот 112-220 А-цепи и часть из положений аминокислот 116-218 В-цепи в конформационной координате PDB-кода 1ZA6, использовали в качестве модельных молекул для анализа областей CL и СН1. Затем часть из положений аминокислот 1-115 В-цепи в конформационной координате PDB-кода 1ZA6 использовали в качестве модельной молекулы для анализа VH-области. Наконец, часть из положений аминокислот 3-147 легкой цепи в конформационной координате PDB-кода 2А9М использовали в качестве модельной молекулы для анализа VL-области. Исходя из этого порядка, была получена первоначальная модель структуры Fab-фрагмента антитела 6RL#9 путем определения из функций сдвига и вращения положений и ориентации модельных молекул для анализа кристаллической решетки. Кристаллографический фактор достоверности R для данных отражения при разрешении от 25 до 3,0 составлял 46,9% и свободный R составлял 48,6% после детализации жесткого каркаса, где каждому из VH-, VL-, СН1- и CL-доменов позволяли отклоняться от первоначальной структурной модели. Затем детализации модели достигали путем повторения структурной детализации с использованием программы Refmac5 (CCP4 Software Suite) с последующей проверкой модели, проводимой с использованием программы Coot (Paul Emsley) на основании карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-F, где коэффициенты Fo-Fc и 2Fo-Fc вычисляли с использованием экспериментально определенного структурного фактора Fo, структурного фактора Fc, вычисленного на основе этой модели, и фаз. Конечную детализацию проводили с использованием программы Refmac5 (CCP4 Software Suite) на основе карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-F путем добавления молекулы воды и иона Са в модель. С помощью 21020 данных отражения при разрешении от 25 до 2,2 ангстрем, в конечном итоге кристаллографический фактор достоверности R составил 20,0% и свободный R составил 27,9% для модели, состоящей из 3440 атомов.

(9-9) Определение данных рентгенодиффракции кристалла Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в отсутствие Са

Кристаллическую структуру Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в отсутствие Са определяли на основе структуры кристалла, полученного в присутствии Са. Молекулами воды и ионов Са пренебрегали в конформационных координатах кристалла Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученного в присутствии Са. Кристаллографический фактор достоверности R для данных отражения при разрешении от 25 до 3,0 ангстрем составил 30,3% и свободный R составил 31,7% после детализации жесткого каркаса, где каждому из VH-, VL-, СН1- и CL-доменов позволяли отклоняться. Затем детализации модели достигали путем повторения структурной детализации с использованием программы Refmac5 (CCP4 Software Suite) с последующей проверкой модели, проводимой с использованием программы Coot (Paul Emsley) на основании карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-F, где коэффициенты Fo-Fc и 2Fo-Fc вычисляли с использованием экспериментально определенного структурного фактора Fo, структурного фактора Fc, вычисленного на основе этой модели, и фаз. Конечную детализацию проводили с использованием программы Refmac5 (CCP4 Software Suite) на основе карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-F путем добавления молекулы воды и иона Са в модель. С помощью 18357 данных отражения при разрешении от 25 до 2,3 ангстрем, в конечном итоге кристаллографический фактор достоверности R составил 20,9% и свободный R составил 27,7% для модели, состоящей из 3351 атомов.

(9-10) Сравнение данных рентгеновской кристаллографической дифракции Fab-фрагментов антитела 6RL#9 в присутствии и в отсутствие Са

При сравнении кристаллографических структур Fab-фрагментов антитела 6RL#9 в присутствии и в отсутствие Са, были выявлены значительные изменения в CDR3 тяжелой цепи. Структура CDR3 тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела 6RL#9, определенная рентгеновской кристаллографией, представлена на фиг. 41. В частности, ион кальция располагался в центре области петли CDR3 тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученного в присутствии Са. Было предположено, что ион кальция взаимодействует с положениями 95, 96 и 100а (нумерация по Kabat) CDR3 тяжелой цепи. Было предположено, что петля CDR3 тяжелой цепи, которая является важной для связывания антигена, стабилизировалась связыванием кальция в присутствии Са, и становилась оптимальной структурой для связывания антигена. Отсутствуют сообщения, демонстрирующие, что кальций связывается с CDR3 тяжелой цепи антитела. Таким образом, связанная с кальцием структура CDR3 тяжелой цепи антитела является новой структурой.

Кальций-связывающий мотив, присутствующий в CDR3 тяжелой цепи, выявленный в структуре Fab-фрагмента антитела 6RL#9, также может стать новым элементом конструкции для Са-библиотеки. Например, полагают, что является возможной библиотека, содержащая CDR3 тяжелой цепи антитела 6RL#9 и нестрогие остатки в других CDR, включая легкую цепь.

[Справочный пример 10] Получение антител, которые связываются с IL-6 Са-зависимым образом, из библиотеки антител человека с использованием способов фагового дисплея

(10-1) Конструирование библиотеки фагового дисплея наивных антител человека

Библиотеку фагового дисплея антител человека, содержавшую множество фагов, которые экспонируют различные последовательности Fab-доменов антител человека, конструировали способом, известным специалистам в данной области с использованием, в качестве матрицы, поли-А-РНК, полученной из РВМС человека, коммерчески доступной поли-А-РНК человека и т.п.

(10-2) Получение фрагментов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом, из библиотеки с помощью пэннинга на гранулах

Первичную селекцию из сконструированных библиотек фагового дисплея наивных антител человека проводили путем обогащения фрагментами антител, которые имеют активность связывания антигена (IL-6). Использованный антиген представлял меченный биотином IL-6.

Фаги получали с помощью Е. coli, несущих фагмиды фагового дисплея. К осадку фагов, полученных с помощью Е. coli, добавляли 2,5 М NaCl/10% PEG в культуральную среду для Е. coli. Фракцию фагов разбавляли TBS для получения раствора с фаговой библиотекой. Затем к раствору с фаговой библиотекой добавляли BSA и CaCl₂ до конечных концентраций 4% и 1,2 мМ ионов кальция, соответственно. Использованный способ пэннинга представлял собой общепринятый способ пэннинга с использованием магнитных гранул с иммобилизованным на них антигеном (J Immunol Methods. 2008 Mar 20, 332(1-2): 2-9; J Immunol Methods. 2001 Jan 1, 247(1-2): 191-203; Biotechnol Prog. 2002 Mar-Apr, 18(2): 212-20; Mol Cell Proteomics. 2003 Feb, 2(2): 61-9). Использованные магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) и покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads M-280 Streptavidin).

В частности, 250 пмоль биотинилированного антигена добавляли к полученному раствору с фаговой библиотекой. Таким образом, раствор контактировали с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и комплексу антиген-фаг позволяли связываться с магнитными гранулами при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали три раза 1 мл 1,2 мМ CaCl₂/TBS (TBS, содержащий 1,2 мМ CaCl₂). После этого к гранулам добавляли 0,5 мл трипсина в концентрации 1 мг/мл. После диспергирования в течение 15 минут при комнатной температуре, гранулы сразу разделяли с использованием магнитного стенда для сбора суспензии фагов. Полученную суспензию фагов добавляли к 10 мл Е. coli штамма TG1 в фазе логарифмического роста (OD600 = 0,4-0,5). Е. coli инкубировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение одного часа для инфицирования фагами. Инфицированные Е. coli высевали в чашку (225 мм × 225 мм). Затем из культуральной среды посеянных Е. coli собирали фаги для получения раствора с фаговой библиотекой.

При втором и последующих пэннингах, фаги обогащали с использованием способности к Са-зависимому связыванию в качестве индикатора. В частности, 40 пмоль меченного биотином антигена добавляли к полученному раствору фаговой библиотеки. Таким образом, фаговую библиотеку контактировали с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и комплексу антиген-фаг позволяли связаться с магнитными гранулами при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали один раз 1 мл 1,2 мМ CaCl₂/TBST (TBS содержащий 1,2 мМ CaCl₂ и 0,1% Tween-20) и 1,2 мМ CaCl₂/TBS. Затем к гранулам добавляли 0,1 мл 2 мМ EDTA/TBS. После диспергирования при комнатной температуре гранулы сразу отделяли с использованием магнитного стенда для сбора суспензии фагов. Белок pIII (белок pIII, происходящий из фага-помощника) отщепляли от фагов, которые не экспонировали Fab, добавлением 5 мкл трипсина в концентрации 100 мг/мл к собранной суспензии фага для устранения способности фагов, не экспонирующих Fab, инфицировать Е. coli. Фаги, собранные из исходного раствора с фагом после обработки трипсином, добавляли к 10 мл клеток Е. coli штамма TG1 в фазе логарифмического роста (OD600=0,4-0,7). Е. coli инкубировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение одного часа для инфицирования фагами. Инфицированные Е. coli высевали в чашку (225 мм × 225 мм). Затем из культуральной среды посеянных Е. coli собирали фаги для получения жидкого исходного раствора с фаговой библиотекой. Пэннинг проводили три раза с использованием активности Са-зависимого связывания в качестве индикатора.

(10-3) Оценка с помощью ELISA фагов

Содержащие фаг культуральные супернатанты собирали из единичных колоний Е. coli, полученных способом, описанным выше, в соответствии с общепринятым способом (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). В содержащие фаг культуральные супернатанты добавляли BSA и CaCl₂ до конечных концентраций 4% и 1,2 мМ ионов кальция, соответственно. Супернатанты подвергали ELISA по следующей методике. 96-луночные микропланшеты для титрования StreptaWell (Roche) покрывали в течение ночи с использованием 100 мкл PBS, содержащего меченный биотином антиген. Антиген удаляли из лунки путем промывания каждой лунки планшета PBST. Затем лунки блокировали 250 мкл 4% BSA-TBS в течение одного часа или более. После удаления 4% BSA-TBS в каждую лунку добавляли полученные культуральные супернатанты. Планшет инкубировали при 37°С в течение одного часа, так чтобы позволить экспонирующим антитело фагам связаться с антигеном на каждой лунке. После промывания каждой лунки 1,2 мМ CaCl₂/TBST, добавляли 1,2 мМ CaCl₂/TBS или 1 мМ EDTA/TBS. Планшет оставляли для инкубации при 37°С в течение 30 минут. После промывания 1,2 мМ CaCl₂/TBST, в каждую лунку добавляли конъюгированное с HRP антитело против М13 (Amersham Pharmacia Biotech), разбавленное TBS, содержащим BSA и ионы кальция в конечных концентрациях 4% и 1,2 мМ ионов кальция, и планшет инкубировали в течение одного часа. После промывания 1,2 мМ CaCl₂/TBST, в каждую лунку добавляли раствор только ТМВ (ZYMED). Хромогенную реакцию в растворе в каждой лунке останавливали добавлением серной кислоты. Затем проявившийся цвет оценивали путем измерения поглощения при 450 нм.

Из 96 выделенных клонов с помощью ELISA фагов было получено антитело 6KC4-1#85, имеющее Са-зависимую активность связывания IL-6. С использованием фрагментов антител, для которых было предсказано, что они имеют Са-зависимую антигенсвязывающую активность, исходя из результата фагового ELISA, описанного выше, в качестве матрицы, гены амплифицировали со специфическими праймерами и их последовательности анализировали. Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела 6KC4-1#85 представлены в SEQ ID NO: 10 и 98, соответственно. Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 10) связывали с полинуклеотидом, кодирующим последовательность, происходящую из IgG1 способом ПЦР. Полученный фрагмент ДНК встраивали в экспрессирующий вектор клеток животных для конструирования экспрессирующего вектора для тяжелой цепи SEQ ID NO: 99. Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи антитела 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 98), связывали с полинуклеотидом, кодирующим константную область природной каппа-цепи (SEQ ID NO: 100) способом ПЦР. Фрагмент ДНК, содержащий связанную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 101, встраивали в экспрессирующий вектор клеток животных. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области.

(10-4) Экспрессия и очистка антител

Клон 6KC4-1#85, который оценили как имеющий способность к Са-зависимому связыванию с помощью ELISA фагов, вводили в экспрессирующие плазмиды клеток животных. Антитела экспрессировали с использованием следующего способа. Клетки линии, происходящей из клеток почки эмбриона FreeStyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде для экспрессии FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и аликвоты объемом 3 мл высевали в каждую ячейку планшетов с 6 ячейками с плотностью клеток 1,33×10⁶ клеток/мл. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в инкубаторе CO₂ (37°С, 8% CO₂, 90 об./мин.) в течение четырех суток. Из полученных культуральных супернатантов антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Концентрации очищенных антител определяли путем измерения поглощения при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из установленных величин на основе коэффициента экстинкции, определенного способом РАСЕ (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).

[Справочный пример 11] Оценка связывания антитела 6KC4-1#85 с ионом кальция

(11-1) Оценка связывания антитела 6KC4-1#85 с ионом кальция

Антитело 6KC4-1#85 с кальций-зависимым связыванием, которое было выделено из библиотеки антител человека, оценивали в отношении связывания им кальция. Оценку того, варьирует ли измеренная величина Tm, в зависимости от концентрации ионизированного кальция, проводили способом, описанным в справочном примере 6.

Величины Tm для Fab-домена антитела 6KC4-1#85 представлены в таблице 32. Как показано в таблице 32, величина Tm для Fab-домена антитела 6KC4-1#85 варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция. Это демонстрирует, что антитело 6KC4-1#85 связывается с кальцием.

(11-2) Идентификация участка связывания ионов кальция в антителе 6KC4-1#85

Как показано в (11-1) справочного примера 11, антитело 6KC4-1#85 связывается с ионом кальция. Однако 6KC4-1#85 не имеет кальций-связывающего мотива, такого как последовательность hVk5-2, для которой путем оценки было выявлено, что она обладает кальций-связывающим мотивом. Таким образом, для идентификации остатков, ответственных за связывание ионов кальция антителом 6KC4-1#85, конструировали измененные тяжелые цепи (6_H1-11 (SEQ ID NO: 102), 6_H1-12 (SEQ ID NO: 103), 6_H1-13 (SEQ ID NO: 104), 6_H1-14 (SEQ ID NO: 105), 6_H1-15 (SEQ ID NO: 106)) и измененные легкие цепи (6_L1-5 (SEQ ID NO: 107) и 6_L1-6 (SEQ ID NO: 108)) путем замены остатка Asp (D) в CDR антитела 6KC4-1#85 остатком Ala (A), который не участвует в связывании или хелатировании ионов кальция. Способом, описанным в справочном примере 6, измененные антитела очищали из культуральных супернатантов клеток животных, в которые введены экспрессирующие векторы, несущие гены измененных антител. Очищенные измененные антитела оценивали в отношении связывания ими кальция способом, описанным в примере 6. Результат измерения представлен в таблице 33. Как показано в таблице 33, замена остатком Ala остатка в положении 95 или 101 (нумерация Kabat) в CDR3 тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85 приводила к утрате активности антитела 6KC4-1#85 в отношении связывания кальция. Это указывает на то, что эти остатки ответственны за связывание кальция. Кальций-связывающий мотив, присутствующий в области основания петли CDR3 тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85, как было выявлено из свойств связывания кальция модифицированного антитела 6KC4-1#85, также может стать новым элементом конструкции для Са-библиотеки, как описано в справочном примере 9. Иными словами, помимо библиотеки с кальций-связывающим мотивом, внесенным в вариабельную область легкой цепи, предоставленной в качестве конкретного примера в справочном примере 20 и т.д., является возможной библиотека, содержащая кальций-связывающий мотив, присутствующий, например, в CDR3 тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85 и содержащая нестрогие остатки в других аминокислотных остатках.

[Справочный пример 12] Исследование эффектов антитела с Са-зависимым связыванием на удержание в плазме антигена с использованием нормальных мышей

(12-1) Исследование in vivo с использованием нормальных мышей

Нормальной мыши (мышь C57BL/6J, Charles River Japan), вводили hsIL-6R (растворимый рецептор IL-6 человека, полученный согласно справочному примеру 3) отдельно, или вводили растворимый рецептор IL-6 человека и антитело против рецептора IL-6 человека одновременно для исследования кинетики растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против рецептора IL-6 человека in vivo. Однократную дозу (10 мл/кг) раствора растворимого рецептора IL-6 человека (5 мкг/мл) или смеси растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против рецептора IL-6 человека вводили в хвостовую вену. Указанные выше H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1 использовали в качестве антител против рецептора IL-6 человека.

Концентрация растворимого рецептора IL-6 человека во всех смесях составляет 5 мкг/мл. Концентрации антитела против рецептора IL-6 человека варьируют для антител: 0,1 мг/мл для H54/L28-IgG1 и 10 мг/мл для 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1. В это время полагали, что большинство растворимых рецепторов IL-6 человека связываются с антителом, поскольку антитело против растворимого рецептора IL-6 человека присутствует в достаточном или избыточном количестве. Взятие образцов крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения. Полученные образцы крови сразу центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 12000 об./мин. для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения.

(12-2) Определение концентрации в плазме рецептора против IL-6 человека у нормальных мышей с помощью ELISA

Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли с помощью ELISA. Сначала F(ab')2-фрагмент антитела против IgG человека (специфичный к γ-цепи) (SIGMA) распределяли в планшеты Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International) и позволяли им стоять в течение ночи при 4°C с получением планшетов с антителом против IgG человека в твердой фазе. Образцы для калибровочной кривой, имеющие концентрации в плазме 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02 или 0,01 мкг/мл, и образцы плазмы мыши для измерения, разбавленные в 100 раз или более, распределяли в планшет с антителом против IgG человека на твердой фазе, а затем проводили инкубацию в течение 1 часа при 25°С. Затем планшету позволяли реагировать с биотинилированным антителом против IL-6 R человека (R&D) в течение 1 часа при 25°С, а затем проводили реакцию со стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) в течение 0,5 часа при 25°С. Хромогенную реакцию проводили с использованием ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) в качестве субстрата. После остановки хромогенной реакции 1 Н серной кислотой (Showa Chemical) измеряли поглощение цветного раствора при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме у мышей вычисляли из величин поглощения на калибровочной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменения в концентрациях в плазме антител H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1, у нормальных мышей после внутривенного введения, измеренных как описано выше, представлено на фиг. 42.

(12-3) Определение концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека способом электрохемилюминесценции

Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли способом электрохемилюминесценции. Образец для калибровочной кривой растворимого рецептора IL-6, приготовленный в концентрации 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 или 31,25 пг/мл, и образец плазмы мыши для измерения, разбавленный в 50 раз или выше, смешивали с моноклональным антителом против IL-6R человека (R&D), рутенированным с помощью SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D), и тоцилизумабом (тяжелая цепь SEQ ID NO: 109, легкая цепь SEQ ID NO: 83), с последующей реакцией в течение ночи при 4°С. К этому времени буфер для анализа содержал 10 мМ EDTA для снижения концентрации свободного Са в образце и диссоциации практически всех растворимых рецепторов IL-6 человека в образце от 6RL#9-IgG1 или FH4-IgG1 для связывания с добавленным тоцилизумабом. Затем указанную реакционную жидкость распределяли в планшет со стрептавидином МА400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Кроме того, после промывания каждой лунки планшета, которому позволяли реагировать в течение 1 часа при 25°С, в каждую лунку распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery). Сразу после этого реакционную жидкость подвергали измерению с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека вычисляли из ответа калибровочной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменения концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у нормальной мыши после внутривенного введения, определенные как описано выше, представлены на фиг. 43.

В результате, исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека было очень быстрым, когда растворимый рецептор IL-6 человека вводили отдельно, в то время как исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека было значительно замедленным, когда растворимый рецептор IL-6 человека вводили одновременно с H54/L28-IgG1, обычным антителом, не обладающим активностью связывания Са с растворимым рецептором IL-6 человека. Напротив, исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека было значительно ускорено, когда растворимый рецептор IL-6 человека вводили одновременно с 6RL#9-IgG1 или FH4-IgG1, обладающим в 100 раз или более высокой зависимой от Са способностью связывания с растворимым рецептором IL-6 человека. Концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека через одни сутки после введения растворимого рецептора IL-6 человека одновременно с 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1 были снижены в 39 раз и 2 раза, соответственно, по сравнению с одновременным введением с H54/L28-IgG1. Таким образом, было подтверждено, что антитела с зависимым от кальция связывания способны ускорять исчезновение антигена из плазмы.

[Справочный пример 13] Испытания по улучшению эффекта ускорения элиминации антигена с помощью зависимого от Са связывания антигена (получение антител)

(13-1) Связывание IgG-антитела с FcRn

IgG-антитела имеют более длительное время удержания в плазме в результате связывания FcRn. Связывание между IgG и FcRn наблюдают только в кислых условиях (рН 6,0). Напротив, связывание практически не поддается выявлению в нейтральных условиях (рН 7,4). IgG-антитело захватывается в клетки неспецифическим образом. Антитело возвращается на клеточную поверхность путем связывания с эндосомальным FcRn в кислых условиях эндосом, а затем диссоциирует от FcRn в нейтральных условиях плазмы. Когда связывание FcRn в кислых условиях утрачивается вследствие внесения мутаций в Fc-домен IgG, время удержания антитела в плазме значительно снижается, поскольку антитело более не рециклирует в плазму из эндосомы.

Описанным способом увеличения удержания в плазме IgG-антитела является усиление связывания FcRn в кислых условиях. Аминокислотные мутации вносят в Fc-домен IgG-антитела для увеличения его связывания с FcRn в кислых условиях. Это увеличивает эффективность рециклирования в плазму из эндосомы, что приводит к увеличению удержания в плазме IgG-антитела. При внесении замены считается важным не увеличить связывание с FcRn в нейтральных условиях. IgG-антитела, которые связываются с FcRn в нейральных условиях, могут возвращаться на клеточную поверхность путем связывания с FcRn в кислых условиях эндосомы, однако IgG антитела не диссоциируют от FcRn в плазме в нейтральных условиях и не рециклируют в плазму, и, таким образом, полагали, что удержание в плазме IgG-антител напротив ухудшится.

Например, как описано в Dall' Acqua et al. (J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180), удержание в плазме IgG1-антитела, которому позволяли связываться с FcRn мыши в нейтральных условиях (рН 7,4), усиливалось в результате внесения аминокислотной замены у мыши. Кроме того, как описано Yeung et al. (J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671), Datta-Mannan et al. (J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717), и Dall' Acqua et al. (J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180), выявлено, что варианты IgG1-антител, связывание которых с FcRn человека в кислых условиях (рН 6,0) улучшается путем внесения аминокислотной замены, также связываются с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4). Согласно сообщениям, время удержания в плазме указанного антитела, введенного яванскому макаку, не повышалось, не демонстрируя изменений в удержании в плазме. Таким образом, в технологии инженерии антител для повышения функций антител, были предприняты попытки для повышения удержания в плазме антитела путем увеличения его связывания с FcRn человека в кислых условиях без увеличения его связывания с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4). Иными словами, не было опубликовано сообщений в отношении преимуществ IgG1-антител, активность связывания которых с FcRn человека в нейтральных условиях (рН 7,4) увеличена путем внесения аминокислотных замен в Fc-область.

Антитела, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом, являются чрезвычайно полезными, поскольку они обладают эффектом ускорения исчезновения растворимого антигена и повторного связывания единичной молекулы антитела с растворимым антигеном. Способ усиления связывания с FcRn в нейтральных условиях (рН 7,4) исследовали в качестве способа дальнейшего улучшения эффекта ускорения исчезновения антигена.

(13-2) Получение антител с Са-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека, обладающих способностью связывания FcRn в нейтральных условиях

Аминокислотную мутацию вносили в Fc-области FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, обладающих способностью кальций-зависимого связывания антигена, и H54/L28-IgG1, не обладающего способностью кальций-зависимого связывания антигена (используемого в качестве контроля) с получением вариантов, обладающих способностью связываться с FcRn в нейтральных условиях (рН 7,4). Аминокислотную мутацию вносили способом, известным в данной области, с использованием ПЦР. В частности, получали FH4-N434W (тяжелая цепь SEQ ID NO: 110, легкая цепь SEQ ID NO: 95), 6RL#9-N434W (тяжелая цепь SEQ ID NO: 111, легкая цепь SEQ ID NO: 93), и H54/L28-N434W (тяжелая цепь SEQ ID NO: 112, легкая цепь SEQ ID NO: 97) с Asn (аминокислота в положении 434, указанном согласно нумерации EU), замененным на Trp, в константной области тяжелой цепи IgG1. Экспрессирующий вектор для клеток животных, в который был встроен полинуклеотид, кодирующий вариант с аминокислотной заменой, получали с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutahenesis Kit (Stratagene) способом, описанным в прилагаемых инструкциях. Экспрессию и очистку антитела и измерение концентрации проводили в соответствии со способом, описанным в справочном примере 6.

[Справочный 14] Исследование эффекта ускорения исчезновения антител с Са-зависимым связыванием с использованием нормальных мышей

(14-1) Исследование in vivo с использованием нормальных мышей

Нормальным мышам (мышь C57BL/6J; Charles River Japan) вводили hsIL-6R (растворимый рецептор IL-6 человека, полученный, как описано в справочном примере 3) отдельно или вводили растворимый рецептор IL-6 человека и антитело против IL-6 человека одновременно для исследования кинетики растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против рецептора IL-6 человека in vivo. Однократную дозу (10 мл/кг) раствора растворимого рецептора IL-6 человека (5 мкг/мл) или смеси растворимого рецептора IL-6 человека и антитела против IL-6 человека вводили в хвостовую вену. Описанные выше H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W и FH4-N434W использовали в качестве антител против рецептора IL-6 человека.

Концентрация растворимого рецептора IL-6 человека во всех смесях составляет 5 мкг/мл. Концентрации антитела против рецептора IL-6 человека варьируют для антител: приготавливали в концентрации 0,042 мг/мл для H54/L28-N434W, в концентрации 0,55 мг/мл для 6RL#9-N434W, и в концентрации 1 мг/мл для FH4-N434W. В это время полагали, что большая часть растворимых рецепторов IL-6 человека связалась с антителом, поскольку антитело против растворимого рецептора IL-6 человека существует в достаточном или избыточном количестве. Взятие образцов крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения. Образцы крови сразу центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 12000 об./мин. для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения.

(14-2) Определение концентрации антитела против рецептора IL-6 человека у нормальных мышей с помощью ELISA

Концентрацию в плазме антитела против рецептора IL-6 человека у мыши определяли с помощью ELISA, как описано в справочном примере 12. Изменения концентрации в плазме антител H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W и FH4-N434W, у нормальных мышей после внутривенного введения, измеренные как описано выше, представлены на фиг. 44.

(14-3) Определение концентрации растворимого рецептора IL-6 человека способом электрохемилюминесценции

Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли способом электрохемилюминесценции. Образец для калибровочной кривой растворимого рецептора IL-6, приготовленный в концентрации 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 или 31,25 пг/мл, и образец для измерения в плазме мыши, разбавленный в 50 раз или выше, смешивали с моноклональным антителом против IL-6R человека (R&D), рутенированным с помощью SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery) и биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D), с последующей реакцией в течение ночи при 4°С. К этому времени буфер для анализа содержал 10 мМ EDTA для снижения концентрации свободного Са в образце и диссоциации практически всех растворимых рецепторов IL-6 человека в образце от 6RL#9-N434W или FH4-N434W, чтобы они существовали в свободном состоянии. Затем указанную реакционную жидкость распределяли в планшет со стрептавидином МА400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Кроме того, после промывания каждой лунки планшета, которому позволяли реагировать в течение 1 часа при 25°С, в каждую лунку распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery). Сразу после этого реакционную жидкость подвергали измерению с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека вычисляли из ответа калибровочной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменения концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у нормальной мыши после внутривенного введения, определенные как описано выше, представлены на фиг. 45.

В результате по сравнению с введением растворимого рецептора IL-6 человека отдельно, одновременное введение растворимого рецептора IL-6 человека с антителом H54/L28-N434W, которое обладает активностью связывания FcRn при рН 7,4 и не обладает зависимой от Са активностью связывания с растворимым рецептором IL-6 человека, имело значительно замедленное исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека. Напротив, исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека было ускоренным, когда растворимый рецептор IL-6 человека вводили одновременно с антителом 6RL#9-N434W или FH4-N434W, которое имеет в 100 раз или более превышающую зависимую от Са способность связывания с растворимым рецептором IL-6 человека и активность связывания FcRn при рН 7,4 по сравнению с введением растворимого рецептора IL-6 человека отдельно. Концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека через одни сутки после введения растворимого рецептора IL-6 человека одновременно с антителом 6RL#9-N434W или FH4-N434W были снижены в 3 раза и 8 раз, соответственно, по сравнению с введением растворимого рецептора IL-6 человека отдельно. В результате было подтверждено, что исчезновение антигена из плазмы можно далее ускорять путем сообщения активности связывания FcRn при рН 7,4 антителу, которое связывается с антигеном кальций-зависимым образом.

Было подтверждено, что антитело 6RL#9-IgG1 или FH4-IgG1, обладающее в 100 раз или более увеличенной зависимой от Са активностью связывания с растворимым рецептором IL-6 человека увеличивает исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека, по сравнению с антителом H54/L28-IgG1, не обладающим зависимой от Са активностью связывания с растворимым рецептором IL-6 человека. Было подтверждено, что антитело 6RL#9-N434W или FH4-N434W, которое обладает в 100 раз или более увеличенной Са-зависимой активностью связывания с растворимым рецептором IL-6 человека и активностью связывания FcRn при рН 7,4, в большей степени ускоряет исчезновение растворимого рецептора IL-6 человека, по сравнению с введением растворимого рецептора IL-6 человека отдельно. Эти данные указывают на то, что антитело, которое связывается с антигеном зависимым от Са образом, диссоциирует от антигена в эндосоме, аналогично антителу, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом.

[Справочный пример 15] Исследование последовательностей человека эмбрионального типа, которые связываются с ионами кальция

(15-1) Антитело, которое связывается с антигеном зависимым от кальция образом

Антитела, которые связываются с антигеном зависимым от Са образом (антитела с зависимым от Са связыванием антигена) представляют собой антитела, взаимодействия которых с антигеном изменяются, в зависимости от концентрации кальция. Полагают, что антитело с зависимым от Са связыванием связывается с антигеном через ион кальция. Таким образом, аминокислоты, которые образуют эпитоп на одной стороне антигена представляют собой отрицательно заряженные аминокислоты, которые могут хелатировать ионы кальция, или аминокислоты, которые могут являться акцептором водородной связи. Эти свойства аминокислот, которые образуют эпитоп, позволяют нацеливание на эпитоп, отличное от связывающих молекул, которые получают внесением остатков гистидина и которые связываются с антигеном рН-зависимым образом. Полагают, что применение антигенсвязывающих молекул, обладающих свойствами кальций- и рН-зависимого связывания, позволит образование антигенсвязывающих молекул, которые могут быть индивидуально нацелены на различные эпитопы, имеющие широкие свойства. Таким образом, если конструируют совокупность молекул, содержащих кальций-связывающий мотив (Са-библиотека), из которых получают антигенсвязывающие молекулы, полагают, что будут эффективным путем получены антитела с зависимым от Са связыванием антигена.

(15-2) Получение последовательностей человека эмбрионального типа

Примером совокупности молекул, содержащих кальций-связывающий мотив, является пример, в котором указанные молекулы представляют собой антитела. Иными словами, библиотека антител, содержащих кальций-связывающий мотив, может представлять собой Са-библиотеку.

Антитела с зависимым от ионов кальция связыванием, содержащие последовательности человека эмбрионального типа не были описаны. Таким образом, последовательности антител эмбрионального типа, обладающие последовательностями человека эмбрионального типа, клонировали с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной из поли-РНК селезенки эмбриона (Clontech) для оценки того, связываются ли антитела, обладающие последовательностями человека эмбрионального типа, с ионом кальция. Клонировенные фрагменты ДНК встраивали в экспрессируюище векторы клеток животных. Нуклеотидные последовательности сконструированных экспрессирующих векторов определяли способом, известным специалистам в данной области. SEQ ID представлены в таблице 34. С помощью ПЦР полинуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3), SEQ ID NO: 8 (Vk4) и SEQ ID NO: 4 (Vk5), связывали с полинуклеотидом, кодирующим природную константную область каппа-цепи (SEQ ID NO: 100). Связанные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Более того, полинуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO: 113 (Vk1), SEQ ID NO: 114 (Vk2), SEQ ID NO: 115 (Vk3), SEQ ID NO: 116 (Vk4), и SEQ ID NO: 117 (Vk5), связывали способом ПЦР с полинуклеотидом, кодирующим полипептид (SEQ ID NO: 11), имеющий делецию двух аминокислот на С-конце IgG1. Полученные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области.

(15-3) Экспрессия и очистка антител

Сконструированные экспрессирующие векторы клеток животных, в которые встроены фрагменты ДНК, имеющие пять типов последовательностей человека эмбрионального типа, вводили в клетки животных. Экспрессию антитела проводили следующим способом. Клетки клеточной линии, происходящей из почки эмбриона человека Freestyle 293-F (Invitrogen) суспендировали в среде Freestyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и высевали с плотностью клеток 1,33×10⁶ клеток/мл (3 мл) в каждую лунку планшета с 6 ячейками. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в течение четырех суток в инкубаторе с CO₂ (37°С, 8% CO₂, 90 об./мин.). Из культуральных супернатантов, полученных как описано выше, антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение растворов очищенного антитела при 280 измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).

(15-4) Оценка антител, имеющих последовательности человека эмбрионального типа, в отношении их активности связывания ионов кальция

Очищенные антитела оценивали в отношении их активности связывания ионов кальция. Промежуточную температуру термической денатурации (величину Tm) измеряли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) в качестве показателя для исследования связывания ионов кальция с антителом (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). Промежуточная температура термической денатурации (величина Tm) является показателем стабильности. Она становится более высокой, когда белок стабилизирован путем связывания с ионами кальция, по сравнению с отсутствием связывания ионов кальция (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Активность связывания ионов кальция с антителом исследовали путем исследования изменений величины Tm антитела, в зависимости от изменений концентрации ионов кальция в растворе антитела. Очищенное антитело подвергали диализу (EasySEP, TOMY) с использованием внешнего раствора 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 2 мМ CaCl₂ (pH 7,4), или 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 3 мкМ CaCl₂ (pH 7,4). Измерение DSC проводили при скорости нагревания 240°С/ч от 20 до 115°C с использованием раствора антитела, приготовленного в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл с диализатом в качестве исследуемого вещества. Промежуточные температуры термической денатурации (величины Tm) Fab-доменов каждого антитела, вычисленные исходя из кривой денатурации, полученной с помощью DSC, представлены в таблице 35.

Результат показал, что величины Tm Fab-доменов антител, имеющих последовательность Vk1, Vk2, Vk3 или Vk4, не варьировали в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах, содержащих Fab-домен. Между тем, величина Tm для Fab-домена антитела, имеющего последовательность Vk5, варьировала в зависимости от концентрации ионов кальция в растворе, содержащем Fab-домен. Это демонстрирует, что последовательность Vk5 связывается с ионами кальция.

[Справочный пример 16] Оценка последовательности Vk5 человека (hVk5)

(16-1) Последовательность hVk5

Единственной последовательностью hVk5, зарегистрированной в базе данных Kabat, является последовательность hVk5-2. Далее hVk5 и hVk5-2 используются в качестве синонимов.

В WO 2010/136598 описано, что относительная распространенность последовательности hVk5-2 в последовательности эмбрионального типа составляет 0,4%. Также существуют другие сообщения, согласно которым относительная распространенность последовательности hVk5-2 в последовательности эмбрионального типа составляет 0-0,06% (J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86; Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). Как описано выше, поскольку последовательность hVk5-2 представляет собой последовательность с низкой частотой появления в последовательности эмбрионального типа, полагали, что она является неэффективной для получения антитела с кальций-зависимым связыванием из библиотеки антител, состоящей из последовательностей человека эмбрионального типа, или В-клеток, полученных путем иммунизации мыши, экспрессирующей антитела человека. Таким образом, считалось возможным сконструировать Са-библиотеку, содержащую последовательность hVk5-2 человека. Однако осуществимость этой возможности неизвестна, поскольку не опубликовано сообщение о физических свойствах последовательности hVk5-2.

(16-2) Конструирование, экспрессия и очистка негликозилированной формы последовательности hVk5-2

Последовательность hVk5-2 имеет последовательность для N-гликозилирования в положении аминокислоты 20 (нумерация по Kabat). Цепи сахаров, присоединенные к белкам, проявляют гетерогенность. Таким образом, желательно устранить гликозилирование с точки зрения гомогенности вещества. В этом контексте, конструировали вариант hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 118), в котором остаток Asn (N) в положении 20 (нумерация по Kabat) заменен на Thr (Т). Аминокислотную замену проводили способом, известным специалистам в данной области, с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). ДНК, кодирующую вариант hVk5-2_L65, встраивали в экспрессирующий вектор животных. Экспрессирующий вектор животных, в который встроена конструированная ДНК, кодирующая вариант hVk5-2_L65, в комбинации с экспрессирующим вектором животных, имеющим вставку для экспрессии CIM_H (SEQ ID NO: 117) в качестве тяжелой цепи, встраивали в клетки животных способом, описанным в справочном примере 6. Антитело, содержащее hVk5-2_L65 и CIM_Н, которые экспрессировались в клетках животных, в которые были введены векторы, очищали способом, описанным в справочном примере 6.

(16-3) Оценка антитела, имеющего негликозилированную последовательность hVk5-2, в отношении физических свойств

Выделенное антитело, имеющее модифицированную последовательность hVk5-2_L65, анализировали ионообменной хроматографией для исследования того, является ли она менее гетерогенной, чем антитело, имеющее исходную последовательность hVk5-2, до модификации. Методика ионообменной хроматографии представлена в таблице 36. Результат анализа показал, что hVk5-2_L65, модифицированное в участке гликозилирования, было менее гетерогенным, чем исходная последовательность hVk5-2, как показано на фиг. 46.

Далее оценку того, связывается ли антитело, содержащее менее гетерогенную последовательность hVk5-2_L65, с ионом кальция, оценивали способом, описанным в справочном примере 15. Результат показал, что величина Tm для Fab-домена антитела, имеющего hVk5-2_L65 с измененным участком гликозилирования, также варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах антител, как показано в таблице 37. В частности, было продемонстрировано, что Fab-домен антитела, имеющего hVk5-2_L65 с измененным участком гликозилирования, связывается с ионом кальция.

[Справочный пример 17] Оценка активности связывания ионов кальция молекул антител, имеющих последовательность CDR из последовательности hVk5-2

(17-1) Конструирование, экспрессия и очистка модифицированных антител, имеющих последовательность CDR из последовательности hVk5-2

Последовательность hVk5-2_L65 представляет собой последовательность с измененными аминокислотами в участке гликозилирования каркасной области последовательности Vk5-2 человека. Как описано в справочном примере 16, было продемонстрировано, что связывание ионов кальция происходило даже после изменения участка гликозилирования. Между тем, с точки зрения иммуногенности, главным образом, желательно, чтобы каркасная последовательность представляла собой последовательность эмбрионального типа. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали, может ли каркасная последовательность антитела быть заменена каркасной последовательностью негликозилированной последовательности эмбрионального типа при сохранении активности антитела в отношении связывания ионов кальция.

Полинуклеотиды, кодирующие химически синтезированные последовательности, которые содержат измененную последовательность каркасной области из последовательности hVk5-2, hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4 (CaVk1 (SEQ ID NO: 119), CaVk2 (SEQ ID NO: 120), CaVk3 (SEQ ID NO: 121) или CaVk4 (SEQ ID NO: 122), соответственно) связывали способом ПЦР с полинуклеотидом, кодирующим константную область (SEQ ID NO: 100) природной каппа-цепи. Связанные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области. Каждую плазмиду, сконструированную, как описано выше, встраивали в клетки животных в комбинации с плазмидой, в которую встроен полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь CIM_H (SEQ ID NO: 117), способом, описанным в примере 6. Экспрессированные молекулы представляющего интерес антитела очищали из культуральной среды клеток животных, в которые были введены плазмиды.

(17-2) Оценка измененных антител, имеющих последовательность CDR из последовательности hVk5-2, в отношении их активности связывания ионов кальция

Оценку того, связываются ли ионы кальция с измененными антителами, имеющими последовательность CDR из последовательности hVk5-2 и каркасные последовательности из последовательностей эмбрионального типа, отличные от hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 и hVk4), оценивали с использованием способа, описанного в примере 6. Результат оценки представлен в таблице 38. Было выявлено, что величина Tm Fab-домена каждого из измененных антител варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах антител. Это демонстрирует, что антитела, имеющие каркасную последовательность, отличную от каркасных последовательностей из последовательности hVk5-2, также связываются с ионами кальция.

Было продемонстрировано, что температура термической денатурации (величина Tm), в качестве индикатора термической стабильности Fab-домена каждого антитела, измененного так, чтобы оно имело последовательность CDR из последовательности hVk5-2 и каркасную последовательность эмбрионального типа, отличную от последовательности hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4) является более высокой, чем температура термической денатурации Fab-домена исходного антитела, имеющего последовательность hVk5-2. Этот результат показывает, что антитела, имеющие последовательность CDR из последовательности hVk5-2 и каркасную последовательность hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4, не только обладают активностью связывания ионов кальция, но также являются превосходными молекулами с точки зрения термической стабильности.

[Справочный пример 18] Идентификация участка связывания ионов кальция в последовательности hVk5-2 человека эмбрионального типа

(18-1) Конструирование участка мутации в последовательности CDR из последовательности hVk5-2

Как описано в справочном примере 17, также было показано, что антитела, имеющие легкую цепь, полученную в результате введения CDR-домена последовательности hVk5-2 в каркасную последовательность отличающейся последовательности эмбрионального типа, связываются с ионом кальция. Этот результат указывает на то, что в hVk5-2 участок связывания ионов кальция локализован в его CDR. Аминокислоты, которые связываются с ионом кальция, т.е. хелатируют ион кальция, включают отрицательно заряженные аминокислоты и аминокислоты, которые могут быть акцептором водородной связи. Таким образом, исследовали, связываются ли антитела, имеющие мутантную последовательность hVk5-2 с заменой остатком Ala (А) остатка Asp (D) или Glu (Е) в последовательности CDR из последовательности hVk5-2, с ионом кальция.

(18-2) Конструирование последовательностей вариантов hVk5-2 с заменой на Ala, и экспрессия и очистка антител

Молекулы антител получали так, чтобы они содержали легкую цепь с заменой остатка Asp и/или Glu остатком Ala в последовательности CDR из последовательности hVk5-2. Как описано в справочном примере 16, негликозилированный вариант hVk5-2_L65 проявлял связывание ионов кальция, и было предположено, что он является эквивалентным последовательности hVk5-2 с точки зрения связывания ионов кальция. В этом примере аминокислотные замены вносили в hVk5-2_L65 в качестве матричной последовательности. Сконструированные варианты представлены в таблице 39. Аминокислотные замены проводили способами, известными специалистам в данной области, такими как использование набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), ПЦР или набора In fusion Advantage PCR Cloning Kit (TAKARA) для конструирования экспрессирующих векторов для измененных легких цепей, имеющих аминокислотную замену.

Нуклеотидные последовательности сконструированных экспрессирующих векторов подтверждали способом, известным специалистам в данной области. Экспрессирующие векторы, сконструированные для измененных легких цепей, временно вводили, в комбинации с экспрессирующим вектором для тяжелой цепи CIM_Н (SEQ ID NO: 117), в клетки линии, происходящей из клеток почки эмбриона человека HEK293H (Invitrogen) или FreeStyle293 (Invitrogen) для экспрессии антител. Из полученных культуральных супернатантов антитела очищали с использованием rProtein А SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение растворов очищенного антитела при 280 нм измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).

(18-3) Оценка антител, имеющих замену Ala в последовательности hVk5-2, в отношении активности связывания ионов кальция

Проводили исследование, связываются ли полученные очищенные антитела с ионами кальция, способом, описанным в справочном примере 15. Результат представлен в таблице 40. Было выявлено, что некоторые антитела, имеющие замену остатка Asp или Glu в последовательности CDR из последовательности hVk5-2 на остаток Ala, который не может быть вовлечен в связывание или хелатирование ионов кальция, имеют Fab-домен, Tm которого не варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах антител. Было показано, что участки замены, в которых замена на Ala не изменяла Tm (положения 32 и 92 (нумерация по Kabat)) являются в значительной степени важными для связывания антителом ионов кальция.

[Справочный пример 19] Оценка антител, имеющих последовательность hVk1 со связывающим ионы кальция мотивом, в отношении связывания ионов кальция

(19-1) Конструирование последовательности hVk1 со связывающим ионы кальция мотивом, и экспрессия и очистка антител

Результат, описанный в справочном примере 18, в отношении активности связывания кальция в случае замены Ala, демонстрирует, что остатки Asp или Glu в последовательности CDR из последовательности hVk5-2 были важными для связывания кальция. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали, может ли антитело связываться с ионом кальция, когда остатки в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) отдельно вносили в другую последовательность вариабельной области эмбрионального типа. В частности, вариант LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 131) конструировали путем замены остатками в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) в последовательности hVk5-2 остатков в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) последовательности hVk1 (последовательность человека эмбрионального типа). В частности исследовали, могут ли антитела, имеющие последовательность hVk1, в которую встроено только 5 остатков из последовательности hVk5-2, связывать кальций. Варианты получали тем же способом, который описан в справочном примере 17. Полученные варианты легкой цепи LfVk1_Ca и LfVk1, имеющие последовательность легкой цепи hVk1 (SEQ ID NO: 132) совместно экспрессировали с тяжелой цепью CIM_H (SEQ ID NO: 117). Антитела экспрессировали и очищали тем же способом, который описан в справочном примере 18.

(19-2) Оценка антител, имеющих последовательность hVk1 человека со связывающим ионы кальция мотивом, в отношении активности связывания ионов кальция

Оценку того, связывает ли очищенное антитело, полученное как описано выше, ионы кальция, проводили способом, описанным в справочном примере 15. Результаты представлены в таблице 41. Величина Tm для Fab-домена антитела, имеющего LfVk1 с последовательностью hVk1, не варьировала, в зависимости от концентрации кальция в растворах антител. Между тем, Tm антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca, сдвигалась на 1°С или более при изменении концентрации кальция в растворах антител. Таким образом, было показано, что антитело, имеющее LfVk1_Ca, связывается с кальцием. Результаты, описанные выше, демонстрирует, что полная последовательность CDR hVk5-2 не требуется, в то время как остатки, внесенные для конструирования последовательности LfVk1_Ca отдельно, являются достаточными для связывания ионов кальция.

[Справочный пример 20] Конструирование совокупности молекул антител (Са-библиотека) со связывающим ионы кальция мотивом, встроенным в вариабельную область, для эффективного получения связывающих антител, которые связываются с антигеном зависимым от концентрации Са образом

Предпочтительные кальций-связывающие мотивы включают, например, последовательность hVk5-2 и последовательность CDR, а также остатки в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация Kabat). Другие кальций-связывающие мотивы включают мотив EF-hand, которым обладают кальций-связывающие белки (например, кальмодулин) и лектин С-типа (например, ASGPR).

Са-библиотека состоит из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Последовательность антитела человека использовали в качестве вариабельной области, и кальций-связывающий мотив вносили в вариабельную область легкой цепи. Последовательность hVk1 была выбрана в качестве матричной последовательности вариабельной области легкой цепи для встраивания кальций-связывающего мотива. Было показано, что антитело, содержащее последовательность LfVk1_Ca, полученную путем встраивания последовательности CDR hVk5-2 (один из кальций-связывающих мотивов) в последовательность hVk1, связывается с ионами кальция, как показано в справочном примере 19. Множеству аминокислот позволяли оказаться в матричной последовательности, чтобы разнообразить антигенсвязывающие молекулы, которые составляют библиотеку. Положения, экспонированные на поверхности вариабельной области, которые, вероятно, взаимодействуют с антигеном, выбирали в качестве положений, где позволяли оказаться множеству аминокислот. В частности, в качестве нестрогих остатков были выбраны положения 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 и 96 (нумерация Kabat).

Определяли тип и частоту появления аминокислотных остатков, которым впоследствии позволяли появиться. Анализировали частоту появления аминокислотных остатков в нестрогих остатках последовательностей hVk1 и hVk3, зарегистрированных в базе данных Kabat (KABAT, E.A. ET AL.: "Sequence of proteins of immunological interest", vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Исходя из результатов анализа, отбирали тип аминокислот, которым позволяли появиться в Са-библиотеке, из аминокислот с более высокой частотой появления в каждом положении. В это время, аминокислоты, для которых было определено, что частота их появления является низкой, исходя из результатов анализа, также отбирали для избежания отклонения свойств аминокислот. Частоту появления выбранных аминокислот определяли, ссылаясь на результаты анализа в базе данных Kabat.

Са-библиотеку, содержащую кальций-связывающий мотив с акцентом на разнообразии последовательностей, чтобы она содержала множество аминокислот в каждом остатке, отличном от мотива, конструировали в качестве Са-библиотеки с учетом аминокислот и частоты появления, как описано выше. Детальные конструкции Са-библиотеки представлены в таблицах 1 и 2 (где положения в каждой таблице соответствуют нумерации EU). Кроме того, если положение 92, соответствующее нумерации Kabat, представляет собой Asn (N) для частот появления аминокислот, как описано в таблицах 1 и 2, положение 94 может представлять собой Leu (L) вместо Ser (S).

[Справочный пример 21] Получение Са-библиотеки

Библиотеку генов вариабельных областей тяжелой цепи антител амплифицировали способом ПЦР с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека, и т.д. в качестве матрицы. Как описано в справочном примере 20, для вариабельных областей легкой цепи антитела конструировали вариабельные области легкой цепи, которые увеличивают частоту появления антител, которые сохраняют кальций-связывающий мотив и могут связываться с антигеном зависимым от концентрации кальция образом. Кроме того, для аминокислотных остатков среди нестрогих остатков, отличных от остатков с внесенным кальций-связывающим мотивом, конструировали библиотеку вариабельных областей легкой цепи антитела с равномерно распределенными аминокислотами с высокой частотой появления в природных антителах человека, ссылаясь на информацию о частоте появления аминокислот в природных антителах человека (KABAT, Е.А. ЕТ AL.: "Seqeuences of proteins of immunological interest", vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Комбинацию библиотек генов вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител, полученных как описано выше, встраивали в фагмидный вектор для конструирования библиотеки фагового дисплея антител человека, которая представляет Fab-домены, состоящие из последовательностей антител человека (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100). Для конструирования библиотеки использовали линкерную часть, соединяющую фагмидный Fab с белком фага pIII, и последовательности библиотеки фагового дисплея с последовательностью расщепления трипсином, встроенной между доменами N2 и СТ гена белка pIII хелперного фага. Идентифицировали последовательности частей генов антител, выделенных из Е. coli, в которые были введены библиотеки генов антител, для получения информации о последовательности для 290 клонов. Намеченное распределение аминокислот и распределение аминокислот в идентифицированных последовательностях представлено на фиг. 52. Конструировали библиотеку, содержащую различные последовательности, соответствующие намеченному распределению аминокислот.

[Справочный пример 22] Исследование активность связывания ионов кальция у молекул, содержащихся в Са-библиотеке

(22-1) Активность связывания ионов кальций у молекул, содержащихся в Са-библиотеке

Как описано в справочном примере 14, последовательность hVk5-2, для которой было продемонстрировано, что она связывается с ионами кальция, представляет собой последовательность с низкой частотой появления в последовательности эмбрионального типа. Таким образом, полагали, что является недостаточным получение кальций-связывающего антитела из библиотеки антител, состоящей из последовательностей человека эмбрионального типа или из В-клеток, полученных путем иммунизации мыши, экспрессирующей антитела человека. В результате конструировали Са-библиотеку согласно справочному примеру 21. Исследовали наличие или отсутствие клона, демонстрирующего связывание кальция, в сконструированной Са-библиотеке.

(22-2) Экспрессия и очистка антител

Клоны, включенные в Са-библиотеку, встраивали в экспрессирующие плазмиды клеток животных. Антитела экспрессировали с помощью следующего способа. Клетки, происходящие из клеток почки эмбриона человека Freestyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде Freestyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и высевали с плотностью клеток 1,33×10⁶ клеток/мл (3 мл) в каждую лунку планшета с 6 ячейками. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в течение четырех суток в инкубаторе с СО₂ (37°С, 8% СО₂, 90 об./мин.). Из культуральных супернатантов, полученных как описано выше, очищали антитела с использованием rProtein А Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение растворов очищенного антитела при 280 нм измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).

(22-3) Оценка полученных антител в отношении связывания ионов кальция

То, связывается ли очищенное антитело, полученное как описано выше, с ионами кальция, определяли способом, описанным в справочном примере 6. Результаты представлены в таблице 42. Величина Tm для Fab-доменов множества антител, содержащихся в Са-библиотеке, варьировала в зависимости от концентрации ионов кальция, демонстрируя присутствие молекул, связывающих ионы кальция.

[Справочный пример 23] Конструирование библиотеки антител с рН-зависимым связыванием

(23-1) Способ получения антител с рН-зависимым связыванием

В WO 2009/125825 описано антитело с рН-зависимым связыванием антигена, свойства которого изменяются в области нейтральных и кислых значений рН, вследствие внесения гистидина в антигенсвязывающую молекулу. Описанное антитело с рН-зависимым связыванием получают путем модификации для замены части аминокислотной последовательности представляющей интерес антигенсвязывающей молекулы гистидином. Для более эффективного получения антитела с рН-зависимым связыванием без предварительного получения представляющей интерес антигенсвязывающей молекулы, подлежащей модификации, одним из способов может быть получение антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с желаемым антигеном из совокупности антигенсвязывающих молекул (обозначаемой как His-библиотека) с гистидином, внесенным в вариабельную область (более предпочтительно, область, потенциально вовлеченную в связывание антигена). Может быть возможным эффективное получение антигенсвязывающей молекулы, обладающей желаемыми свойствами, из библиотеки His, поскольку гистидин встречается более часто в антигенсвязывающих молекулах из His-библиотеки, чем из общепринятых библиотек антител.

(23-2) Конструирование популяции молекул антител (His-библиотеки) с остатком гистидина, внесенным в их вариабельную область, для эффективного получения связывающих антител, которые связываются с антигеном рН-зависимым образом

Сначала выбирали положения для встраивания гистидина в His-библиотеке. В WO 2009/125825 описано получение антител с рН-зависимым связыванием антигена путем замены аминокислотных остатков в последовательностях антител против рецептора IL-6, IL-6 и рецептора IL-31 на гистидин. Кроме того, получали антитела против лизоцима яичного белка (FEBS Letter 11483, 309, 1, 85-88) и против гепцидина (WO 2009/139822), обладающие способностью рН-зависимого связывания антигена, путем замены в аминокислотной последовательности антигенсвязывающей молекулы на гистидин. Положения, где вносили остатки гистидина в антитело против рецептора IL-6, антитело против IL-6, антитело против рецептора IL-31, антитело против лизоцима яичного белка и антитело против гепцидина, представлены в таблице 43. Положения, представленные в таблице 43, могут быть приведены в качестве положений-кандидатов, которые контролируют связывание антиген-антитело. Кроме того, помимо положений, представленных в таблице 43, также пригодными для внесения остатков гистидина считали положения, которые вероятно контактируют с антигеном.

В His-библиотеке, состоящей из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, последовательность антитела человека использовали в качестве вариабельной области тяжелой цепи, и в вариабельную область легкой цепи вносили остатки гистидина. Положения, приведенные выше, и положения, которые могут быть вовлечены в связывание антигена, т.е. положения 30, 32, 50, 53, 91, 92 и 93 (нумерация Kabat, Kabat ЕА et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH) в легкой цепе отбирали в качестве положений для внесения остатков гистидина в His-библиотеку. Кроме того, последовательность Vk1 отбирали в качестве матричной последовательности вариабельной области легкой цепи для внесения остатков гистидина. Множеству аминокислот позволяли появляться в матричной последовательности, чтобы разнообразить антигенсвязывающие молекулы, которые составляют библиотеку. Положения, экспонированные на поверхности вариабельной области, которые вероятно будут взаимодействовать с антигеном, отбирали в качестве положений, где позволяли появиться множеству аминокислот. В частности, в качестве нестрогих остатков были выбраны положения 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 и 96 легкой цепи (нумерация Kabat, Kabat ЕА et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH).

Определяли тип и частоту появления аминокислотных остатков, которым впоследствии позволяли появиться. Анализировали частоту появления аминокислот в нестрогих остатках в последовательностях hVk1 и hVk3, зарегистрированных в базе данных Kabat (KABAT, Е.А. ET AL.: "Sequences of proteins of immunological interest", vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Исходя из результатов анализа, отбирали тип аминокислот, которым позволяли появиться в His-библиотеке, из аминокислот с более высокой частотой появления в каждом положении. В то же время, аминокислоты, для которых было определено, что частота их появления является низкой, исходя из результатов анализа, также отбирали для избежания смещения свойств аминокислот. Частоту появления выбранных аминокислот определяли, ссылаясь на результаты анализа в базе данных Kabat.

В качестве His-библиотек конструировали His-библиотеку 1, которая зафиксирована так, чтобы обязательно включать один остаток гистидина в каждую CDR, и His-библиотеку 2, которая более сфокусирована на разнообразии последовательностей, чем His-библиотека 1, учитывая аминокислоты и частоту появления, как описано выше. Детальные конструкции His-библиотек 1 и 2 представлены в таблицах 3 и 4 (причем положения в каждой таблице соответствовали нумерации Kabat). Ser (S) в положении 94 может быть исключен, если в положении 92, соответствующем нумерации Kabat, находится Asn (N), для частоты появления аминокислот, как описано в таблице 3 и 4.

[Справочный пример 24] Получение библиотеки фагового дисплея для антител человека (His-библиотека 1) для получения антитела, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом.

Библиотеку генов вариабельных областей тяжелой цепи антител амплифицировали способом ПЦР с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека в качестве матрицы. Библиотеку генов вариабельных областей легкой цепи антител, сконструированную в качестве His-библиотеки 1, как описано в примере 1, амплифицировали с использованием ПЦР. Комбинацию библиотек генов вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител, полученных как описано выше, встраивали в фагмидный вектор для конструирования библиотеки фагового дисплея антител человека, которая представляет Fab-домены, состоящие из последовательностей антител человека. Для способа конструирования использовали (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100) в качестве справочных материалов. Для конструирования библиотеки использовали линкерную часть, соединяющую фагмидный Fab с белком фага pIII, и последовательности библиотеки фагового дисплея с последовательностью расщепления трипсином, встроенной между доменами N2 и СТ гена белка pIII хелперного фага. Идентифицировали последовательности частей генов антител, выделенных из Е. coli, в которые были введены библиотеки генов антител, и получали информацию о последовательности для 132 клонов. Намеченное распределение аминокислот и распределение аминокислот в идентифицированных последовательностях представлено на фиг. 53. Конструировали библиотеку, содержащую различные последовательности, соответствующие намеченному распределению аминокислот.

[Справочный пример 25] Получение библиотеки фагового дисплея антител человека (His-библиотека 2) для получения антител, которые связываются с антигеном рН-зависимым образом

Библиотеку генов вариабельных областей тяжелой цепи антител амплифицировали способом ПЦР с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека в качестве матрицы. Как описано в справочном примере 23, из частей легкой цепи из вариабельных областей антитела конструировали части легких цепей с увеличенной частотой появления остатков гистидина, имеющих высокий потенциал к тому, чтобы быть областью контакта с антигеном, для увеличения частоты появления антител, обладающих рН-зависимой способностью связывания антигена. Кроме того, для аминокислотных остатков, отличных от остатков, в которые внесены остатки гистидина среди нестрогих остатков, конструируют библиотеку вариабельных областей легкой цепи антител с равномерно распределенными аминокислотами с высокой частотой появления, идентифицированными с использованием информации о частоте появления аминокислот в природных антителах человека. Синтезировали библиотеку генов вариабельных областей легкой цепи антитела, сконструированную, как описано выше. Библиотеку можно коммерчески синтезировать на условиях консигнации. Комбинацию библиотек генов вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител, полученных как описано выше, встраивали в фагмидный вектор для конструирования библиотеки фагового дисплея антител человека, которая представляет Fab-домены, состоящие из последовательностей антител человека, известным способом (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100). Часть гена антитела, выделенная из Е. coli с введенной библиотекой генов антител, секвенировали, как описано в справочном примере 24.

[Справочный пример 26] Эффекты комбинирования модификации селективного связывания с FcγRIIb с другими аминокислотными заменами Fc-области

Была предпринята попытка для дальнейшего усиления селективности к FcγRIIb путем модификации варианта посредством замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp, которая повышает селективность к FcγRIIb, как выявлено в примере 14.

Сначала, что касается IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 80), которое получали путем внесения модификации, состоящей в замене Pro в положении 238 (нумерация EU) IL6R-G1d на Asp, получали вариант IL6R-G1d-v4 (SEQ ID NO: 172), в котором Leu в положении 328 (нумерация EU) был заменен на Glu, для увеличения селективности к FcγRIIb, как описано в примере 14. IL6R-G1d-v4, экспрессированное в комбинации с IL6R-L (SEQ ID NO: 83), которую использовали в качестве L-цепи, получали, как описано в справочном примере 2. Антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, происходящей из IL6R-G1d-v4 в качестве Н-цепи антитела, полученное в этом примере, описано как IgG1-v4. Активность связывания IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v4 с FcγRIIb, исследованная так, как описано в примере 14, представлена в таблице 44. Модификации в таблице соответствуют модификациям, внесенным в IL6R-G1d.

Из результатов, представленных в таблице 44, ожидалось, что, поскольку L328E повышает активность связывания FcγRIIb в 2,3 раза по сравнению с IgG1, то комбинирование этой замены с P238D, которая аналогично повышает активность связывания FcγRIIb в 4,8 раза по сравнению с IgG1, далее увеличит степень повышения активности связывания FcγRIIb; однако, в действительности, активность связывания FcγRIIb у варианта, содержащего комбинацию этих изменений, была снижена в 0,47 раза по сравнению с IgG1. Этот результат представляет собой эффект, который не мог быть предсказан, исходя из соответствующих изменений.

Аналогично, в IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 80), полученное путем внесения в IL6R-G1d изменения путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp, вносили замену Ser в положении 267 (указанном согласно нумерации EU) на Glu и Leu в положении 328 (указанном согласно нумерации EU) на Phe, как описано в примере 2, которые повышают активность связывания FcγRIIb, и вариант IL6R-G1d-v5 (SEQ ID NO: 173) получали в соответствии со способом справочного примера 2. Полученное антитело, имеющее аминокислотную последовательность, происходящую из IL6R-G1d-v5, в качестве Н-цепи антитела, было названо IgG1-v5. Активность связывания FcγRIIb у IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3 и IgG1-v5, как оценивали в соответствии со способом примера 14, представлена в таблице 45.

S267E/L328F, которая представляет собой модификацию с усиливающим эффектом в отношении FcγRIIb в примере 14, вносили в вариант P238D. Изменения активности связывания FcγRIIb до и после внесения этого изменения представлены в таблице 45.

Из результатов, представленных в таблице 45, ожидалось, что, поскольку S267E/L328F увеличивает активность связывания FcγRIIb в 408 раз по сравнению IgG1, то комбинирование этих замен с P238D, которая аналогично повышает активность связывания FcγRIIb в 4,8 раза по сравнению IgG1, далее увеличит степень повышения активности связывания FcγRIIb; однако в действительности, аналогично предшествующему примеру активность связывания FcγRIIb у варианта, содержащего комбинацию этих изменений, повышалась только в 12 раз или около того по сравнению с IgG1. Этот результат также представляет собой эффект, который не мог быть предсказан из эффектов соответствующих изменений.

Эти результаты показали, что, хотя замена Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp отдельно повышает активность связывания FcγRIIb, эффект не проявляется, когда ее комбинируют с другими изменениями, которые повышают активность связывания FcγRIIb. Причина для этого может состоять в том, что структура на поверхности взаимодействия между Fc и FcγR изменяется при внесении замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp, и эффекты изменений, наблюдаемых во встречающемся в природе антителе, более не отражаются в результатах. Таким образом, посчитали, что крайне трудно создать Fc с превосходной селективностью в отношении FcγRIIb с использованием Fc, содержащего замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp, в качестве матрицы, поскольку информация в отношении эффектов изменений, полученных в случае встречающихся в природе антител, информация об эффектах изменений, полученных в случае встречающихся в природе антител, не могла быть использована.

[Справочный пример 27] Детальный анализ связывания FcγRIIb для вариантов, в которые внесено изменение в шарнирной области в дополнение к изменению P238D

Как показано в справочном примере 26, в Fc, полученной путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp во встречающемся в природе IgG1 человека, ожидаемый комбинаторный эффект не мог быть достигнут даже путем комбинирования его с другим изменением, для которого предсказано, что оно далее повышает связывание FcγRIIb, исходя из анализа встречающихся в природе антител. Таким образом, чтобы найти варианты, которые далее усиливают связывание FcγRIIb, вносили всесторонние модификации в измененную Fc, полученную путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp. IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174) получали путем внесения изменения в виде замены Met в положении 252 (указанном согласно нумерации EU) на Tyr и изменения путем замены Asn в положении 434 (указанном согласно нумерации EU) на Tyr в IL6R-G1d (SEQ ID NO: 20), которую использовали в качестве Н-цепи антитела. Более того, IL6R-F652 (SEQ ID NO: 175) получали путем внесения изменения путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp в IL6R-F11. Экспрессирующие плазмиды, содержащие последовательность Н-цепи антитела, получали для каждой из последовательностей Н-цепи антитела, полученных путем замены области вблизи остатка в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) (положения с 234 по 237, и 239 (указанные согласно нумерации EU)) в IL6R-F652, в каждом случае на 18 аминокислот, за исключением исходных аминокислот и Cys. Для всех антител в качестве общей L-цепи антитела использовали IL6R-L (SEQ ID NO: 83). Эти варианты экспрессировали и очищали способом справочного примера 2. Эти варианты Fc названы вариантами PD. Взаимодействия каждого варианта PD с FcγRIIa типа R и FcγRIIb 5 детально оценивали способом примера 14.

График, на котором показаны результаты анализа взаимодействия с соответствующими FcγR, строили в соответствии со следующим способом. Величина, полученная делением значения величины связывания каждого варианта PD с каждым FcγR на значение величины связывания FcγR предварительно измененного антитела, которое использовали в качестве контроля (IL6R-F652/IL6R-L, который имеет изменение в виде замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp, а затем умножения результата на 100, показана в качестве относительной величины активности связывания каждого варианта PD с каждым FcγR. На горизонтальной оси показаны относительные величины активности связывания FcγRIIb для каждого варианта PD, и на вертикальной оси показаны относительные величины активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта PD (фиг. 55).

В результате было выявлено, что связывание FcγRIIb в случае одиннадцати типов изменений усиливалось по сравнению с антителом до внесения изменений, и они обладают эффектами сохранения или усиления связывания FcγRIIa типа R. Активность этих одиннадцати вариантов в отношении связывания FcγRIIb и FcγRIIa типа R обобщенно представлена в таблице 46. В таблице SEQ ID NO относится к SEQ ID NO Н-цепи оцениваемого варианта, и изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174).

На фиг. 56 показаны относительные величины для активности связывания FcγRIIb, полученной путем дальнейшего внесения указанных выше одиннадцати изменений в вариант, имеющий изменение P238D, и относительные величины для активности связывания FcγRIIb варианта, полученного путем внесения этих изменений в Fc, который не содержит P238D. Эти одиннадцать изменений усиливали связывание FcγRIIb по сравнению с тем, что было до внесения, когда их дополнительно вносили в вариант P238D. Напротив, наблюдали эффект снижения связывания FcγRIIb для восьми из этих изменений, за исключением G237F, G237W и S239D, когда их вносили в вариант, который не содержит P238D (GpH7-B3/GpL16-k0), использованный в примере 14. Справочный пример 26 и эти результаты показали, что, исходя из эффектов внесения изменений во встречающийся в природе IgG1 трудно предсказать эффекты комбинирования и внесения тех же изменений в вариант, содержащий изменение P238D. Иными словами, невозможно выявить эти восемь изменений, идентифицированных в этот раз, без этого исследования, в котором указанные изменения комбинируют и вносят в вариант, содержащий изменение P238D.

Результаты измерения величин KD вариантов, указанных в таблице 46 для FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIaV способом примера 14, обобщенно представлены в таблице 47. В таблице SEQ ID NO относится к SEQ ID NO Н-цепи оцененного варианта и изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174). Матрица, использованная для получения IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*). Более того, KD(IIaR)/KD(IIb) и KD(IIaH)/KD(IIb) в таблице, соответственно, показывают величину, полученную путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaR на величину KD каждого варианта для FcγRIIb, и величины, полученной делением величины KD каждого варианта для FcγRIIaH на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. KD(IIb) исходного полипептида/KD(IIb) измененного полипептида относится к величине, полученной путем деления величины KD исходного полипептида в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. Кроме того, в таблице 47 показаны величины KD для более сильной активности связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH каждого варианта/величины KD для более сильной активности связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. В этом случае, исходный полипептид относится к варианту, который имеет IL6R-F11 (SEQ ID NO: 27) в качестве Н-цепи. Было определено, что, вследствие слабого связывания FcγR с IgG, его было невозможно точно проанализировать с помощью анализа кинетики, и, таким образом, закрашенные серым цветом ячейки в таблице 47 показывают величины, вычисленные с использованием уравнения 5 примера 14.

[Уравнение 5]

KD=CxRmax/(Req-RI)-С

В таблице 47 показано, что у всех вариантов аффинность связывания с FcγRIIb повышалась по сравнению с IL6R-F11, и диапазон улучшения составлял от 1,9 раза до 5,0 раз. Соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb, и соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaH/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb, соответствует активности связывания FcγRIIb относительно активности связывания FcγRIIaR и активности связывания FcγRIIaH, соответственно. Следовательно, эти величины показывают степень селективности связывания каждого варианта в отношении FcγRIIb, и более высокая величина указывает на более высокую селективность связывания в отношении FcγRIIb. Для исходного полипептида IL6R-F11/IL6R-L, соотношение величина KD для FcγRIIaR/величина KD для FcγRIIb и соотношение величина KD для FcγRIIaH/величина KD для FcγRIIb в обоих случаях равно 0,7, и, соответственно, все варианты, представленные в таблице 47, продемонстрировали увеличение селективности связывания в отношении FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом. Когда отношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида равно 1 или более, это означает, что более сильная из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта имеет эквивалентное или сниженное связывание по сравнению со связыванием при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Поскольку эта величина составляла от 0,7 до 5,0 для вариантов, полученных на этот раз, можно сказать, что связывание при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH вариантов, полученных на этот раз, было практически таким же или сниженным по сравнению с исходным полипептидом. Эти результаты показали, что, по сравнению с исходным полипептидом, варианты, полученные в этом случае, имеют сохраненную или сниженную активность связывания с FcγRIIa типа R и типа Н, и увеличенную селективность в отношении FcγRIIb. Более того, по сравнению с IL6R-F11, все варианты имели более низкую аффинность в отношении FcγRIa и FcγRIIIaV.

[Справочный пример 28] Рентгеноструктурный анализ комплекса, образованного между Fc, содержащей P238D, и внеклеточной областью FcγRIIb

Как показано ранее в справочном примере 27, даже несмотря на то, что вносят изменение, для которого из анализа встречающихся в природе IgG1-антител предсказано, что оно повышает активность связывания FcγRIIb или селективность к FcγRIIb, в Fc, содержащую P238D, было выявлено, что активность связывания FcγRIIb снижается, и причиной для этого может быть то, что структура на поверхности взаимодействия между Fc и FcγRIIb изменяется вследствие внесения P238D. Таким образом, для установления причины этого явления определяли трехмерную структуру комплекса, образованного между Fc IgG1, содержащей мутацию P238D (далее, Fc(P238D)), и внеклеточной областью FcγRIIb с помощью рентгеновской кристаллографии, и ее сравнивали с трехмерной структурой комплекса, образованного между Fc встречающегося в природе IgG1 (далее Fc(WT)) и внеклеточной областью FcγRIIb, и сравнивали способы связывания. Было сделано множество сообщений о трехмерной структуре комплекса, образованного между Fc и внеклеточной областью FcγR; и были проанализированы трехмерные структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIb (Nature, 2000, 400: 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276: 16469-16477), комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108: 12669-126674), и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa (J. Imunol. 2011, 187: 3208-3217). Хотя трехмерная структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb не была проанализирована, трехмерная структура комплекса, образованного с Fc(WT), известна для FcγRIIa, и внеклеточные области FcγRIIa и FcγRIIb совпадают на 93% по аминокислотной последовательности и имеют очень высокую гомологию. Таким образом, трехмерная структура Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb была предсказана путем моделирования с использованием кристаллической структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa.

Трехмерная структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb была определена с помощью рентгеновской кристаллографии при разрешении 2,6 Структура, полученная в результате этого анализа, представлена на фиг. 57. Внеклеточная область FcγRIIb связывается между двумя СН2-доменами Fc, и это было аналогично трехмерным структурам комплексов, образованных между Fc(WT) и соответствующей внеклеточной областью FcγRIIIa, FcγRIIIb или FcγRIIa, проанализированных до настоящего времени.

Далее для детального сравнения кристаллическую структуру комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb накладывали друг на друга с помощью аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα в отношении внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена A Fc (фиг. 58). В этом случае, степень перекрывания между СН2-доменами В Fc не была удовлетворительной, и в этой части были выявлены конформационные различия. Более того, с использованием кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, отбирали пары атомов, которые имеют расстояние 3,7 или менее между отобранной внеклеточной областью FcγRIIb и СН2-доменом В Fc и сравнивали для сравнения межатомного взаимодействия между FcγRIIb и СН2-доменом В в Fc(WT) с межатомным взаимодейсттвием между FcγRIIb и Fc(P238D). Как показано в таблице 48, межатомные взаимодействия между СН2-доменом В Fc и FcγRIIb в Fc(P238D) и Fc(WT) не совпадали.

Более того, детальные структуры в области P238D сравнивали путем наложения рентгеновской кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточный домен FcγRIIb на модельную структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточный домен FcγRIIb с использованием метода наименьших квадратов на основе атомного расстояния Сα между СН2-доменами А и В Fc отдельно. Поскольку положение аминокислотного остатка в положении 238 (нумерация EU), т.е. положение мутагенеза Fc(P238D), изменено относительно Fc(WT), было выявлено, что структура петли в области аминокислотного остатка в положении 238 после шарнирной области отличается между Fc(P238D) и Fc(WT) (фиг. 59). Pro в положении 238 (нумерация EU) первоначально расположен внутри Fc(WT), образуют гидрофобную сердцевину с остатками в области положения 238. Однако если Pro в положении 238 (нумерация EU) изменен на высоко гидрофильный и заряженный Asp, присутствие измененного остатка Asp в гидрофобной сердцевине является энергитически преимущественным с точки зрения десольватации. Таким образом, в Fc(P238D) для устранения этой энергетически невыгодной ситуации, аминокислотный остаток в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) изменяет его ориентацию в сторону растворителя, и это может вызвать это изменение в структуре петли вблизи аминокислотного остатка в положении 238. Более того, поскольку эта петля расположена недалеко от шарнирной области, сшитой связью S-S, ее структурное изменение не будет ограничено локальным изменением, и повлияет на относительно расположение СН2-домена А и домена В Fc. В результате, изменяются межатомные взаимодействия между FcγRIIb и СН2-доменом В Fc. Таким образом, предсказанные эффекты нельзя было наблюдать, когда изменения, которые повышают селективность и активность связывания с FcγRIIb во встречающемся в природе IgG комбинировали с Fc, содержащим изменение P238D.

Более того, в результате структурных изменений вследствие внесения P238D в СН2-домен A Fc, была выявлена водородная связь между основной цепью Gly в положении 237 (указанном согласно нумерации EU), которое является сосденим с мутантным P238D и Tyr в положении 160 в FcγRIIb (фиг. 60). Остаток в FcγRIIa, который соответствует этому Tyr160, представляет собой Phe; и, когда происходит связывание с FcγRIIa, эта водородная связь не образуется. Учитывая, что аминокислота в положении 160 представляет собой одно из небольшого количества отличий между FcγRIIa и FcγRIIb на границе взаимодействия с Fc, и присутствие этой водородной связи, которая является специфичной к FcγRIIb, предположительно привело к повышению активности связывания FcγRIIb и снижению активности связывания FcγRIIa в Fc(P238D) и повышению его селективности.

Более того, в СН2-домене В Fc наблюдают электростатическое взаимодействие между Asp в положении 270 (указанном согласно нумерации EU) и Arg в положении 131 в FcγRIIb (фиг. 61). В FcγRIIa типа Н, который является одним из аллотипов FcγRIIa, остаток соответствующий Arg в положении 131 FcγRIIb представляет собой His, и, таким образом, он не может образовывать это электростатическое взаимодействие. Это может объяснить, почему активность связывания Fc(P238D) снижается в FcγRIIa типа Н по сравнению с FcγRIIa типа R. Наблюдения, сделанные на основе таких результатов рентгеновской кристаллографии, показали, что изменение структуры петли рядом с P238D вследствие внесения P238D и сопутствующего изменения в относительном расположении доменов вызывает формирование новых взаимодействий, которые не встречаются при связывании встречающегося в природе IgG и FcγR, и это могло привести к селективному профилю связывания вариантов P238D в отношении FcγRIIb.

[Экспрессия и очистка Fc(P238D)]

Fc, содержащую изменение P238D, получали следующим образом. Сначала Cys в положении 220 (указанном согласно нумерации EU) hIL6R-IgG1-v1 (SEQ ID NO: 80) заменяли на Ser. Затем генетическую последовательность Fc(P238D) от Glu в положении 236 (указанном согласно нумерации EU) до ее С-конца клонировали способом ПЦР. С использованием этой клонированной генетической последовательности проводили продуцирование экспрессирующих векторов и экспрессию и очистку Fc(P238D) в соответствии со способом справочных примеров 1 и 2. Cys в положении 220 (указанном согласно нумерации EU) образует дисульфидную связь с Cys L-цепи в общем IgG1. L-цепь не коэкспрессируется, когда получают Fc отдельно, и, таким образом, остаток Cys заменяли на Ser, чтобы избежать образования ненужных дисульфидных связей.

[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIb]

Внеклеточную область FcγRIIb получали в соответствии со способом примера 14.

[Очитка комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]

К 2 мг образца внеклеточной области FcγRIIb, полученного для применения в кристаллизации, добавляли 0,29 мг Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-2622), экспрессированного и очищенного из Escherichia coli, в качестве слитого белка глутатион-S-трансферазы. Смеси позволяли стоять при комнатной температуре в течение трех суток в 0,1 М буфере Bis-Tris при 6,5, и N-связанный олигосахарид отщепляли, за исключением N-ацетилглюкозамина прямо связанного с Asn внеклеточной области FcγRIIb. Далее образец внеклеточного домена FcγRIIb, подвергнутый обработке для отщепления углевода, который концентрировали путем ультрафильтрации с 5000 MWCO, очищали гель-фильтрацией (Superdex200 10/300) с использованием колонки, уравновешенной в 20 мМ HEPS при рН 7,5, содержавшем 0,05 М NaCl. Более того, к полученной после отщепления углевода фракции внеклеточной области FcγRIIb добавляли Fc(P238D), так чтобы внеклеточная область FcγRIIb в молярном соотношении присутствовала в небольшом избытке. Смесь, концентрированную путем ультрафильтрации с 10000 MWCO, подвергали очистке гель-фильтрацией (Superdex200 10/300) с использованием колонки, уравновешенной в 20 мМ HEPS при рН 7,5, содержащем 0,05 М NaCl. Таким образом, получали образец комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

[Кристаллизация комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]

С использованием образца комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb, который концентрировали до приблизительно 10 мг/мл путем ультрафильтрации с 10000 MWCO, проводили кристаллизацию компплекса способом паровой диффузии с сидячей каплей. Для кристаллизации использовали Hydra II Plus One (MATRIX); и в качестве резервуарного раствора, содержавшего 100 мМ Bis-Tris рН 6,5, 17% PEG3350, 0,2 М ацетат аммония, и 2,7% (масс./об.) D-галактозу, кристаллизационную каплю получали путем смешения соотношения резервуарный раствор : образец для кристаллизации = 0,2 мкл:0,2 мкл. Емкость закрывали, и красталлам позволяли стоять при 20°С, и, таким образом, получали плоские кристаллы.

[Измерение данных рентгенодифракции в кристалле комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]

Один из полученных монокристаллов комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb погружали в раствор 100 мМ Bis-Tris рН 6,5, 20% PEG3350, ацетат аммония, 2,7% (масс./об.) D-галактоза, 22,5% (об./об.) этиленгликоль. Монокристалл вылавливали из раствора с использованием булавки с прикрепленной тонкой нейлоновой петлей и замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодиффракции кристалла измеряли на оборудовании с магнитотормозным излучением Photon Factory BL-1A in High Energy Accelerator Research Organization. В ходе измерения кристалл постоянно помещали в поток азота при -178°С для поддержания в замороженном состоянии, и было получено всего 225 рентгенограмм с использованием детектора Quantum 270 CCD (ADSC), подсоединенного к линии пучка, с вращением кристалла 0,8° за один раз. Определение параметров ячейки, индексирование дифракционных пятен, и обработку дифракционных данных из полученных рентгенограмм проводили с использованием программы Xia2 (ССР4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) и Scala (CCP4 Software Suite); и, наконец, получали данные об интенсивности дифракции кристалла при разрешении вплоть до 2,46 . Кристалл относится к пространственной группе P2₁, и имеет следующие параметры ячейки; а=48,85 , b=76,01 , с=115,09 , α=90°, β=100,70°, γ=90°.

[Рентгеновский кристаллографический анализ комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]

Кристаллическую структуру комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb определяли способом молекулярного замещения с использованием программы Phaser (ССР4 Software Suite). Из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb было предсказано, что количество комплексов в асимметричном элементе равно единице. Из структурных координат кода PDB: 3SGJ, который представляет собой кристаллическую структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, участки аминокислотных остатков А-цепи в положениях 239-340 и В-цепи в положениях 239-340 брали в качестве отдельных координат, и они были приняты, соответственно, в качестве моделей для поиска СН2-доменов Fc. Участки аминокислотных остатков А-цепи в положениях 341-444 и В-цепи в положениях 341-443 брали в качестве единого набора координат из тех же структурных координат кода PDB: 3SGJ; и они были приняты в качестве модели для поиска СН3-доменов Fc. Наконец, из структурных координат кода PDB: 2FCB, что соответствует кристаллической структуре внеклеточной области FcγRIIb, участки аминокислотных остатков А-цепи в положениях 6-178 выбирали и они были приняты в качестве модели для поиска внеклеточной области FcγRIIb. Ориентацию и положение каждой поисковой модели в кристаллической решетке определяли в порядке СН3-домен Fc, внеклеточная область FcγRIIb и СН2-домен Fc, исходя из функции вращения и функции трансляции, с получением первоначальной модели кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. Когда на полученной первоначальной модели проводили уточнение жесткого тела, которое осуществляет движение двух СН2-доменов Fc, двух СН3-доменов Fc и внеклеточной области FcγRIIb, кристаллографический фактор достоверности, R-величина, становилась равной 40,4%, и свободная R-величина становилась равной 41,9% для данных интенсивности дифракции от 25 до 3,0 в этот момент времени. Более того, уточнение структуры с использованием программы Refmac5 (ССР4 Software Suite), и пересмотр модели для выявления карт электронной плотности, коэффициент которых имеет 2Fo-Fc или Fo-Fc, которые вычисляют, исходя из экспериментально определенного структурного фактора Fo, вычисленного структурного фактора Fc и вычисленной фазы с использованием модели, проводили с помощью программы Coot (Paul Emsley). Уточнение модели проводили путем повторения этих стадий. Наконец, в результате включения молекул воды в модель на основе карт электронной плотности, в которых используются 2Fo-Fc или Fo-Fc в качестве коэффициента, и последующего уточнения, кристаллографический фактор достоверности, R-величина, и свободная R-величина модели, содержащей 4846 не являющихся водородом атомами, становились равными 23,7% и 27,6% для 24291 данных интенсивности дифракции при разрешении от 25 до 2,6 , соответственно.

[Получение модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb]

Исходя из структурных координат кода PDB: 3RY6, что соответствует кристаллической структуре комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa, функцию Build Mutants программы Discovery Studio 3.1 (Accelrys) использовали для внесения мутаций, чтобы они соответствовали аминокислотной последовательности FcγRIIb, в FcγRIIa в этих структурных координатах. В этом случае уровень оптимизации был установлен на высокий, радиус отсечения был установлен на 4,5, получали пять моделей, и модель с наилучшей энергетической оценкой среди них устанавливали в качестве модельной структуры для комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb.

[Справочный пример 29] Анализ связывания FcγR вариантами Fc, в которых участки изменения были определены на основе кристаллических структур.

Исходя из результатов рентгеноструктурного анализа комплекса, образованного между Fc(P238D) и внеклеточной областью FcγRIIb, полученной в справочном примере 28, конструировали варианты путем внесения комплексных изменений в участки измененной Fc, имеющей замену Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp, которые, как было предсказано, повлияют на взаимодействие с FcγRIIb (остатки положений 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 и 334 (указанных согласно нумерации EU)), и исследовали, можно ли получить комбинации изменений, которые далее усиливают связывание FcγRIIb, в дополнение к изменению P238D.

IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) получали путем внесения в IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79), полученный согласно примеру 14, изменения, полученного путем замены Lys в положении 439 (указанном согласно нумерации EU) на Glu. Далее, получали IL6R-BF648 путем внесения в IL6R-B3 замены, полученной путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp. IL6R-L (SEQ ID NO: 83) использовали в качестве общей L-цепи антитела. Эти экспрессированные варианты антител очищали в соответствии со способом справочного примера 2. Связывание каждого из этих вариантов антител с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa типа Н, FcγRIIa типа R, FcγRIIb и FcyRIIIa типа V) детально оценивали способом примера 14.

В соответствии со следующим способом строили график, чтобы показать результаты анализа взаимодействий с соответствующими FcγR. Значение величины связывания каждого варианта с каждым FcγR делили на величину связывания предварительно измененного контрольного антитела (IL6R-BF648/IL6R-L, изменение путем замены Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp) с каждым FcγR, а затем полученную величину умножали на 100 и она показана в качестве величины относительной активности связывания каждого варианта с каждым FcγR. На горизонтальной оси показана величина относительной активности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и на вертикальной оси показана величина относительной активности связывания каждого варианта с FcγRIIa типа R (фиг. 62).

Как показано на фиг. 62, результаты показывают, что из всех изменений, как было выявлено, 24 типа изменений сохраняют или усиливают связывание FcγRIIb по сравнению с предварительно измененным антителом. Связывание этих вариантов с каждым из FcγR представлено в таблице 49. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*).

Результаты измерения величин KD вариантов, представленных в таблице 49 в отношении FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIa типа V с помощью способа примера 14, обобщенно представлены в таблице 50. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*). Более того, KD(IIaR)/KD(IIb) и KD(IIaH)/KD(IIb) в таблице, соответственно, соответствуют величине, полученной путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaR на величину KD каждого варианта для FcγRIIb, и величине, полученной делением величины KD каждого варианта для FcγRIIaH на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. KD(IIb) исходного полипептида/KD(IIb) измененного полипептида относится к величине, полученной делением величины KD исходного полипептида в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. Кроме того, величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaFI каждого варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида представлена в таблице 50. Здесь исходный полипептид относится к варианту, который имеет IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) в качестве Н-цепи. Было определено, что, вследствие слабого связывания FcγR с IgG, его было невозможно точно проанализировать с помощью анализа кинетики, и, таким образом, закрашенные серым цветом ячейки в таблице 50 показывают величины, вычисленные с использованием уравнения 5 примера 14.

[Уравнение 5]

KD=CxRmax/(Req-RI)-С

В таблице 50 показано, что, по сравнению с IL6R-B3, все варианты показали улучшение аффинности в отношении FcγRIIb, и диапазон улучшения составлял от 2,1 раза до 9,7 раз. Соотношение величина KD каждого варианта для FcγRIIaR/величина KD каждого варианта для FcγRIIb, и соотношение величина KD каждого варианта для FcγRIIaH/величина KD каждого варианта для FcγRIIb соответствует активности связывания FcγRIIb относительно активности связывания FcγRIIaR и активности связывания FcγRIIaH, соответственно. Следовательно, эти величины показывают степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и более высокая величина указывает на более высокую селективность связывания с FcγRIIb. Поскольку соотношение величина KD для FcγRIIaR/величина KD для FcγRIIb, и соотношение величина KD для FcγRIIaH/величина KD для FcγRIIb в исходном полипептиде IL6R-B3/IL6R-L составляло 0,3 и 0,2, соответственно, все варианты в таблице 50 показали улучшение селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом. Когда соотношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида равно 1 или более, это означает, что более сильная из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта имеет эквивалентное или сниженное связывание по сравнению со связыванием при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Поскольку эта величина составляла от 4,6 до 34,0 для вариантов, полученных на этот раз, можно сказать, что по сравнению с исходным полипептидом варианты, полученные на этот раз, имели сниженное связывание при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH. Эти результаты показали, что, по сравнению с исходным полипептидом, варианты, полученные на этотраз, имеют сохраненную или сниженную активность связывания FcγRIIa типа R и типа Н, усиленную активность связывания FcγRIIb и увеличенную селективность в отношении FcγRIIb. Более того, по сравнению с IL6R-B3, все варианты имели более низкую аффинность к FcγRIa и FcγRIIIaV.

Что касается перспективных вариантов среди полученных комбинированных вариантов, факторы, обеспечивающие их эффекты,

исследовали с использованием кристаллической структуры. На фиг. 63 показана кристаллическая структура комплекса Fc (P238D) / внеклеточная область FcγRIIb. На этой фигуре Н-цепь, расположенная слева, представляет собой А-цепь Fc, и Н-цепь, расположенная справа, представляет собой В-цепь Fc. Здесь можно видеть, что участок в положении 233 (указанном согласно нумерации EU) в А-цепи Fc, расположен вблизи Lys в положении 113 FcγRIIb. Однако в этой кристаллической структуре боковая цепь Е233 находится в состоянии в значительной степени высокой подвижности, и ее электронная плотность четко не выявляется. Таким образом, изменение, полученное путем замены Glu в положении 233 (указанном согласно нумерации EU) на Asp, приводит к снижению степени свободы боковой цепи, поскольку боковая цепь становится на один атом углерода короче. В результате, может быть снижена потеря энтропии при формировании взаимодействия с Lys в положении 113 FcγRIIb, и, следовательно, предположительно, это приводит к повышению свободной энергии связывания.

Аналогично, на фиг. 64 показано окружение вблизи участка в положении 330 (указанном согласно нумерации EU) в структуре комплекса Fc (P238D) / внеклеточная область FcγRIIb. На этой фигуре показано, что окружение участка в положении 330 (указанном согласно нумерации EU) А-цепи Fc в Fc (P238D) представляет собой гидрофильное окружение, состоящее из Ser в положении 85, Glu в положении 86, Lys в положении 163 и т.п. FcγRIIb. Таким образом, изменение, полученное путем замены Ala в положении 330 (указанном согласно нумерации EU) на Lys или Arg, предположительно приводит к упрочнению взаимодействия с Ser в положении 85 или Glu в положении 86 в FcγRIIb.

На фиг. 65 представлены структуры Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU) В-цепи Fc после наложения друг на друга кристаллической структуры комплекса Fc (P238D) / внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc (WT) / внеклеточная область FcγRIIIa путем аппроксимации с помощью метода наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα в отношении В-цепи Fc. Эти две структуры хорошо соответствуют, но имеют различные трехмерные структуры Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU). Когда также учитывают слабую электронную плотность в этой области в кристаллической структуре комплекса Fc (P238D) / внеклеточная область FcγRIIb, предполагается, что существует возможность того, что Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU) в Fc (P238D) / FcγRIIb вызывает большое напряжение в структуре, таким образом, нарушая равновесие структуры петли для достижения оптимальной структуры. Таким образом, изменение, полученное путем замены Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU) на Gly, обеспечивает подвижность этой структуры петли и предположительно приводит к усилению связывания путем снижения энергетического барьера, когда позволяют образоваться оптимальной структуре в ходе взаимодействия с FcγRIIb.

[Пример 30] Исследование комбинаторного эффекта изменений, которые усиливают связывание FcγRIIb, при комбинировании с P238D.

Из изменений, полученных согласно справочным примерам 27 и 29, изменения, которые усиливали связывание FcγRIIb или сохраняли связывание FcγRIIb и продемонстрировали эффекты подавления связывания с другими FcγR, комбинировали друг с другом, и их эффект исследовали.

Особенно удачные изменения, выбранные из таблиц 46 и 49, вносили в Н-цепь антитела IL6R-BF648 аналогично способу справочного примера 29. IL6R-L использовали в качестве общей L-цепи, экспрессированные антитела очищали в соответствии со способом примера 12. Связывание с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb, и FcγRIIIa V-типа) детально оценивали способом примера 14.

В соответствии со следующим способом, относительную активность связывания вычисляли для результатов анализа взаимодействий с соответствующими FcγR. Значение величины связывания каждого варианта с каждым FcγR делили на значение величины связывания предварительно измененного контрольного антитела (IL6R-BF648 / IL6R-L с заменами Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp с каждым FcγR, и умножали на 100; а затем эту величину представляли в качестве относительной активности связывания каждого варианта с каждым FcγR (таблица 51).

В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*).

Результаты измерения величин KD вариантов, представленных в таблице 51, для FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FCγRIIIa

типа V способом примера 14, обобщенно представлены в таблицах 51-2 и 52-2. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*). Более того, KD(IIaR)/KD(IIb) и KD(IIaH)/KD(IIb) в таблице, соответственно, соответствуют величине, полученной путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaR на величину KD каждого варианта для FcγRIIb, и величине, полученной путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaH на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. KD(IIb) исходного полипептида/KD(IIb) измененного полипептида относится к величине, полученной путем деления величины KD исходного полипептида в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. Кроме того, в таблицах 51-2 и 52-2 представлено соотношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH каждого варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Здесь, исходный полипептид относится к варианту, который имеет IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) в качестве Н-цепи. Было определено, что вследствие слабого связывания FcγR с IgG, его было невозможно точно проанализировать путем анализа кинетики, и, таким образом, закрашенные серым цветом ячейки в таблицах 51-2 и 52-2 показывают величины, вычисленные с использованием уравнения 5 примера 14.

[Уравнение 5]

KD=CxRmax/(Req-RI)-С

В таблицах 51-2 и 52-2 показано, что, по сравнению с IL6R-B3, все варианты продемонстрировали увеличение аффинности к FcγRIIb, и диапазон улучшения составлял от 3,0 раз до 99,0 раз. Соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb, и соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaH/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb соответствует активности связывания FcγRIIb относительно активности связывания FcγRIIaR и активности связывания FcγRIIaH, соответственно. Следовательно, эти величины показывают степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и более высокая величина указывает на более высокую селективность связывания с FcγRIIb. Поскольку соотношение величина KD в отношении FcγRIIaR/величина KD в отношении FcγRIIb, и соотношение величина KD в отношении FcγRIIaH/величина KD для в отношении FcγRIIb исходного полипептида IL6R-B3/IL6R-L составляло 0,3 и 0,2, соответственно, все варианты в таблицах 51-2 и 52-2 показали увеличение селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом. Когда соотношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания исходного полипептида равно 1 или более, это означает, что более сильная из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта имеет эквивалентное или сниженное связывание по сравнению со связыванием при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Поскольку эта величина составляла от 0,7 до 29,9 для вариантов, полученных на этот раз, можно сказать, что связывание при более сильной из активностей связывания вариантов FcγRIIaR и FcγRIIaH, полученных на этот раз, практически эквивалентно или снижено по сравнению с исходным полипептидом. Эти результаты показали, что, по сравнению с исходным полипептидом, варианты, полученные на этот раз, имеют сохраненную или сниженную активность связывания FcγRIIa типа R и типа Н, усиленную активность связывания FcγRIIb и увеличенную селективность в отношении FcγRIIb. Более того, по сравнению с IL6R-B3, все варианты имели более низкую аффинность в отношении FcγRIa и FcγRIIIaV.

Таблица 52-2 является продолжением таблицы 52-1.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение относится к способам улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул и к способам снижения иммуногенности антигенсвязывающих молекул. Настоящее изобретение относится к терапии антителами, не вызывающей неблагоприятных эффектов in vivo по сравнению с общепринятыми антителами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты способа улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, где способ включает модификацию Fc-области антигенсвязывающей молекулы. Антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело IgG человека, содержащее антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьируется в зависимости от рН, и Fc-область, имеющую активность связывания FcRn при pH 7,4. Настоящее изобретение продемонстрировало, что модификация Fc-области антигенсвязывающей молекулы в Fc-область, которая не образует в диапазоне нейтральных значений рН гетеротетрамерный комплекс, содержащий две молекулы FcRn и активный Fcγ-рецептор, улучшала фармакокинетику антигенсвязывающей молекулы и снижала иммунный ответ на антигенсвязывающую молекулу. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 65 ил., 84 табл., 14 пр.

1. Способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, где способ включает модификацию Fc-области антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен, чья а) антигенсвязывающая активность варьируется в зависимости от рН, и б) Fc-область имеет активность связывания FcRn при pH 7,4, Fc-области, связывающая активность которой в отношении активирующего Fcγ-рецептора ниже, чем связывающая активность Fc-области нативного IgG человека в отношении активирующего Fcγ-рецептора,

где указанная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело IgG человека,

где антигенсвязывающая активность ниже при рН 5,8, чем при рН 7,4, где отношение величины КД для антигенсвязывающей активности при рН 5,8 к величине КД для антигенсвязывающей активности при рН 7,4 (КД (рН 5,8)/КД (рН 7,4)) равно 2 или больше, причем антигенсвязывающий домен содержит остаток гистидина в каждом одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из положений вариабельной области тяжелой цепи H, таких как 27, 31, 32, 33, 35, 50, 58, 59, 61, 62, 99, 100b и 102, и положений вариабельной области легкой цепи L, таких как 24, 27, 28, 31, 32, 34, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94 и 95а (нумерация по Кэботу),

где модификация Fc-области включает замену аминокислоты указанной Fc-области, согласно нумерации EU, в любом одном или нескольких положениях из:

аминокислота в положении 234 на любую из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr и Trp;

аминокислота в положении 235 на любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Arg;

аминокислота в положении 236 на любую из Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro и Tyr;

аминокислота в положении 237 на любую из Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr и Arg;

аминокислота в положении 238 на любую из Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp и Arg;

аминокислота в положении 239 на любую из Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr и Arg;

аминокислота в положении 265 на любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 266 на любую из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 267 на любую из Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 269 на любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 270 на любую из Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 271 на любую из Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 295 на любую из Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 296 на любую из Arg, Gly, Lys и Pro;

аминокислота в положении 297 на Ala;

аминокислота в положении 298 на любую из Arg, Gly, Lys, Pro, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 300 на любую из Arg, Lys и Pro;

аминокислота в положении 324 на Lys или Pro;

аминокислота в положении 325 на любую из Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 327 на любую из Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val;

аминокислота в положении 328 на любую из Arg, Asn, Gly, His, Lys и Pro;

аминокислота в положении 329 на любую из Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val и Arg;

аминокислота в положении 330 на Pro или Ser;

аминокислота в положении 331 на любую из Arg, Gly и Lys; или

аминокислота в положении 332 на любую из Arg, Lys и Pro;

где Fc-область согласно (б), обладающая большей FcRn-связывающей активностью при pH 7,4, содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в положениях в Fc-домене, согласно нумерации ЕU:

N434W;

N434Y;

M252Y/S254T/T256E/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/N434W;

M252Y/N434Y;

M252Y/N434W;

M252W/N434Y;

M252W/N434W;

P257L/N434Y;

V308F/N434Y;

M252Y/V308P/N434Y;

M428L/N434S;

M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W;

I332V;

I332V/N434Y;

G237M/V308F;

S254T/N434W;

S254T/N434Y;

T256E/N434W;

T256E/N434Y;

S254T/T256E/N434W;

S254T/T256E/N434Y;

M252Y/S254T/N434W;

M252Y/S254T/N434Y;

M252Y/T256E/N434W;

M252Y/T256E/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/N434A;

M252Y/N434A;

M252W/N434A;

M252Y/T256Q/N434W;

M252Y/T256Q/N434Y;

M252F/T256D/N434W;

M252F/T256D/N434Y;

H433K/N434F/Y436H;

I332V/N434W;

V308P/N434W;

I332V/M428L/N434Y;

G385D/Q386P/N389S/N434W;

G385D/Q386P/N389S/N434Y;

G385H/N434W;

G385H/N434Y;

N434F;

M252Y/S254T/T256E/N434F;

M252Y/S254T/T256E/N434H;

M252Y/N434F;

M252Y/N434H;

M428L/N434W;

M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y;

M252Y/M428L/N434W;

M252Y/M428L/N434Y;

M252Y/M428L/N434A;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A;

T256E/M428L/N434Y;

S254T/M428L/N434W;

M252Y /T256Q/N434A;

M252Y/T256E/N434A;

T256Q/N434W;

T256Q/N434Y;

M252W/T256Q/N434W;

M252W/T256Q/N434Y;

S254T/T256Q/N434W;

M252Y/S254T/T256Q/N434W;

M252Y/S254T/T256Q/N434Y;

M252Y/T256E/V308P/N434W;

M252Y/V308P/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W;

M252W/M428L/N434W;

P257L/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F;

M252Y/T256E/N434H;

M252W/T256Q/P257L/N434Y;

P238A/M252Y/V308P/N434Y;

M252Y/D265A/V308P/N434Y;

M252Y/T307A/V308P/N434Y;

M252Y/V303A/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/D376A/N434Y;

M252Y/V305A/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/V308P/K317A/N434Y;

M252Y/V308P/E380A/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/N434Y;

M252Y/V308P/S424A/N434Y;

P257L/V308P/M428L/N434Y;

M252Y/T256E/V308P/M428L/N434W;

M252Y/T256E/M428L/N434W;

M252Y/T256E/V308P/N434Y;

M252Y/T256E/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434Y;

P257L/M428L/N434W;

P257A/M428L/N434Y;

P257G/M428L/N434Y;

P257I/M428L/N434Y;

P257M/M428L/N434Y;

P257N/M428L/N434Y;

P257S/M428L/N434Y;

P257T/M428L/N434Y;

P257V/M428L/N434Y;

M252W/V308P/N434W;

S239K/M252Y/V308P/N434Y;

M252Y/S298G/V308P/N434Y;

M252Y/D270F/V308P/N434Y;

M252Y/V308A/N434Y;

M252Y/V308F/N434Y;

M252Y/V308I/N434Y;

M252Y/V308L/N434Y;

M252Y/V308M/N434Y;

M252Y/V308Q/N434Y;

M252Y/V308T/N434Y;

P257A/V308P/M428L/N434Y;

P257T/V308P/M428L/N434Y;

P257V/V308P/M428L/N434Y;

M252W/M428I/N434Y;

M252W/M428Y/N434Y;

M252W/M428F/N434Y;

P238A/M252W/N434Y;

M252W/D265A/N434Y;

M252W/T307Q/N434Y;

M252W/V303A/N434Y;

M252W/D376A/N434Y;

M252W/V305A/N434Y;

M252W/Q311A/N434Y;

M252W/D312A/N434Y;

M252W/K317A/N434Y;

M252W/E380A/N434Y;

M252W/E382A/N434Y;

M252W/S424A/N434Y;

S239K/M252W/N434Y;

M252W/S298G/N434Y;

M252W/D270F/N434Y;

M252W/N325G/N434Y;

P257A/M428L/N434W;

P257T/M428L/N434W;

P257V/M428L/N434W;

M252W/I332V/N434Y;

P257I/Q311I;

M252Y/T307A/N434Y;

M252Y/T307Q/N434Y;

P257L/T307A/M428L/N434Y;

P257A/T307A/M428L/N434Y;

P257T/T307A/M428L/N434Y;

P257V/T307A/M428L/N434Y;

P257L/T307Q/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/M428L/N434Y;

P257T/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/M428L/N434Y;

M252Y/T307D/N434Y;

M252Y/T307F/N434Y;

M252Y/T307G/N434Y;

M252Y/T307H/N434Y;

M252Y/T307I/N434Y;

M252Y/T307K/N434Y;

M252Y/T307L/N434Y;

M252Y/T307M/N434Y;

M252Y/T307N/N434Y;

M252Y/T307P/N434Y;

M252Y/T307R/N434Y;

M252Y/T307S/N434Y;

M252Y/T307V/N434Y;

M252Y/T307W/N434Y;

M252Y/T307Y/N434Y;

M252Y/K334L/N434Y;

M252Y/G385H/N434Y;

M252Y/T289H/N434Y;

M252Y/Q311H/N434Y;

M252Y/D312H/N434Y;

M252Y/N315H/N434Y;

M252Y/K360H/N434Y;

M252Y/L314R/N434Y;

M252Y/L314K/N434Y;

M252Y/N286E/N434Y;

M252Y/L309E/N434Y;

M252Y/R255E/N434Y;

M252Y/P387E/N434Y;

K248I/M428L/N434Y;

M252Y/M428A/N434Y;

M252Y/M428D/N434Y;

M252Y/M428F/N434Y;

M252Y/M428G/N434Y;

M252Y/M428H/N434Y;

M252Y/M428I/N434Y;

M252Y/M428K/N434Y;

M252Y/M428N/N434Y;

M252Y/M428P/N434Y;

M252Y/M428Q/N434Y;

M252Y/M428S/N434Y;

M252Y/M428T/N434Y;

M252Y/M428V/N434Y;

M252Y/M428W/N434Y;

M252Y/M428Y/N434Y;

M252W/T307Q/M428Y/N434Y;

M252W/Q311A/M428Y/N434Y;

M252W/T307Q/Q311A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307Q/M428Y/N434Y;

M252Y/D270F/N434Y;

M252Y/T307A/Q311A/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311H/N434Y;

M252Y/E382A/N434Y;

M252Y/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307A/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307Q/E382A/M428Y/N434Y;

P238A/M252Y/M428F/N434Y;

M252Y/V305A/M428F/N434Y;

M252Y/N325G/M428F/N434Y;

M252Y/D376A/M428F/N434Y;

M252Y/E380A/M428F/N434Y;

M252Y/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/E382A/N434Y;

M252Y/D270F/V308P/E382A/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428Y/N434Y;

M252Y/T307Q/V308P/E382A/N434Y;

M252Y/V308P/Q311H/E382A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/M428L/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/V308P/M428Y/N434Y;

M252Y/V308P/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/V308P/E380A/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/T256E/E382A/N434Y;

M252Y/T256E/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/E382A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/E382A/M428I/N434Y;

M252Y/V308P/E380A/E382A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/Q311A/M428Y/N434Y;

M252Y/D312A/M428Y/N434Y;

M252Y/Q311A/D312A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/Q311A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/D312A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/Q311A/D312A/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/T307P/N434Y;

M252Y/T307P/M428Y/N434Y;

M252W/V308P/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/V308P/E382A/N434Y;

M252W/V308P/E382A/N434Y;

S239K/M252W/V308P/E382A/N434Y;

S239K/M252W/V308P/E382A/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/V308P/E382A/M428I/N434Y;

S239K/M252W/V308P/M428F/N434Y;

S239K/M252W/E380A/E382A/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/T307P/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/Q311A/D312A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307P/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/T307Q/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/P387E/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/L309P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/L309R/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/L309P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/L309R/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/V308P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/P387E/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/N434Y;

P257V/T307Q/M428I/N434Y;

P257V/T307Q/M428V/N434Y;

P257V/T307Q/N325G/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y;

P257V/V305A/T307Q/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/E258H/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428I/N434Y;

S239K/M252W/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/V308P/Q311A/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/T256E/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/N286E/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/N286E/V308P/N434Y;

S239K/M252W/T307P/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/T256E/V308P/Q311A/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/T256E/N286E/V308P/M428Y/N434Y;

P257V/T307A/Q311A/M428L/N434Y;

P257V/V305A/T307A/M428L/N434Y;

M252Y/V308P/L309E/N434Y;

M252Y/V308P/L309D/N434Y;

M252Y/V308P/L309A/N434Y;

M252W/V308P/L309E/M428Y/N434Y;

M252W/V308P/L309D/M428Y/N434Y;

M252W/V308P/L309A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/P387E/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/P387E/M428I/N434Y;

P257V/T307Q/M428L/N434W;

P257V/T307A/M428L/N434W;

P257A/T307Q/L309P/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/L309P/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/L309R/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/L309R/M428L/N434Y;

P257V/N286E/M428L/N434Y;

P257V/P387E/M428L/N434Y;

P257V/T307H/M428L/N434Y;

P257V/T307N/M428L/N434Y;

P257V/T307G/M428L/N434Y;

P257V/T307P/M428L/N434Y;

P257V/T307S/M428L/N434Y;

P257V/N286E/T307A/M428L/N434Y;

P257V/T307A/P387E/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/T307P/N325G/M428Y/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/K360H/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/P387E/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/M428A/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/E382A/N434Y;

M252Y/T307W/Q311H/N434Y;

S239K/P257A/V308P/M428L/N434Y;

P257A/V308P/L309E/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428V/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428Y/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428F/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428V/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428Y/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428F/N434Y;

P257A/T307Q/M428V/N434Y;

P257A/T307Q/N434Y;

P257A/T307Q/M428Y/N434Y;

P257A/T307Q/M428F/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y;

P257A/Q311A/M428L/N434Y;

P257A/Q311H/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/Q311A/M428L/N434Y;

P257A/T307A/Q311A/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/Q311H/M428L/N434Y;

P257A/T307A/Q311H/M428L/N434Y;

P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y;

P257A/N286E/T307A/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/T307P/L309E/N325G/M428Y/N434Y;

P257S/T307A/M428L/N434Y;

P257M/T307A/M428L/N434Y;

P257N/T307A/M428L/N434Y;

P257I/T307A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/M428Y/N434Y;

P257V/T307Q/M428F/N434Y;

S239K/P257V/V308P/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/V308P/Q311A/N325G/M428L/N434Y;

P257V/T307A/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257A/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257A/T307A/V308P/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/V308P/M428L/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/N325G/M428L/N434Y;

T256E/P257V/N434Y;

T256E/P257T/N434Y;

S239K/P257T/V308P/M428L/N434Y;

P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y;

T256E/P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257T/V308P/N325G/E382A/M428L/N434Y;

P257T/V308P/N325G/P387E/M428L/N434Y;

P257T/V308P/L309P/N325G/M428L/N434Y;

P257T/V308P/L309R/N325G/M428L/N434Y;

T256E/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/E382A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/P387E/M428L/N434Y;

P257L/V308P/N434Y;

P257T/T307Q/N434Y;

P257V/T307Q/N325G/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N434Y;

P257V/V305A/T307Q/N434Y;

P257V/N286E/T307A/N434Y;

P257V/T307Q/L309R/Q311H/M428L/N434Y;

P257V/V308P/N325G/M428L/N434Y;

S239K/P257V/V308P/Q311H/M428L/N434Y;

P257V/V305A/T307A/N325G/M428L/N434Y;

S239K/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y;

P257T/T307A/M428V/N434Y;

P257A/M428V/N434Y;

P257A/T307A/M428V/N434Y;

P257S/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/N297A/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/N286A/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N315A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N384A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N389A/M428L/N434Y;

P257V/N434Y;

P257T/N434Y;

P257V/N286E/N434Y;

P257T/N286E/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/M428Y/N434Y;

P257V/V305A/T307Q/M428Y/N434Y;

P257T/T307Q/M428Y/N434Y;

P257V/T307Q/V308P/N325G/M428Y/N434Y;

P257T/T307Q/M428F/N434Y;

P257A/N286E/T307Q/M428F/N434Y;

P257A/N286E/T307Q/M428Y/N434Y;

T250A/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250F/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250I/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250M/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250S/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250V/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250W/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

M252Y/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/S254T/V308P/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311A

M252Y/S254T/N286E/N434Y;

M252Y/S254T/V308P/N434Y;

M252Y/S254T/T307A/N434Y;

M252Y/S254T/T307Q/N434Y;

M252Y/S254T/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/Q311H/N434Y;

M252Y/S254T/T307A/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/M428I/N434Y;

M252Y/T256E/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/T256Q/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/S254T/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/N286E/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/M428I/N434Y;

M252Y/T256E/T307Q/Q311H;

M252Y/N286E/T307A/Q311A;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A;

M252Y/N286E/T307Q/Q311H;

M252Y/T256E/N286E/N434Y;

S239K/M252Y/V308P;

S239K/M252Y/V308P/E382A;

S239K/M252Y/T256E/V308P;

S239K/M252Y/N286E/V308P;

S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I;

M252Y/N286E/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/E382A/N434Y;

S239K/M252Y/S254T/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/M428I/N434Y;

M252Y/D312A/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/E382A/P387E/N434Y;

M252Y/D312A/P387E/N434Y;

M252Y/P387E/M428Y/N434Y;

M252Y/T256Q/E382A/N434Y;

M252Y/N286E/V308P/N434Y;

M252Y/V305T/T307P/V308I/L309A/N434Y;

M252Y/T307P/V308I/L309A/N434Y;

S239K/N434W;

S239K/V308F/N434Y;

S239K/M252Y/N434Y;

S239K/M252Y/S254T/N434Y;

S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

S239K/M252Y/T256Q/N434Y;

S239K/M252W/N434W;

S239K/P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y;

S239K/P257A/T307Q/M428L/N434Y;

V308P;

M252Y/V279L/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V279L/V308P/N434Y;

M252Y/V282D/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V282D/V308P/N434Y;

M252Y/V284K/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V284K/V308P/N434Y;

M252Y/K288S/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/K288S/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/G385R/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/G385R/N434Y;

M252Y/V308P/Q386K/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/Q386K/N434Y;

L235G/G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/L328R/N434Y;

S239K/M252Y/N297A/V308P/N434Y;

P238D/M252Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/N434Y;

S239K/M252Y/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

G237K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

P238R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/P329K/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/P329R/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/N286A/V308P/N434Y;

M252Y/N286D/V308P/N434Y;

M252Y/N286F/V308P/N434Y;

M252Y/N286G/V308P/N434Y;

M252Y/N286H/V308P/N434Y;

M252Y/N286I/V308P/N434Y;

M252Y/N286K/V308P/N434Y;

M252Y/N286L/V308P/N434Y;

M252Y/N286M/V308P/N434Y;

M252Y/N286P/V308P/N434Y;

M252Y/N286Q/V308P/N434Y;

M252Y/N286R/V308P/N434Y;

M252Y/N286S/V308P/N434Y;

M252Y/N286T/V308P/N434Y;

M252Y/N286V/V308P/N434Y;

M252Y/N286W/V308P/N434Y;

M252Y/N286Y/V308P/N434Y;

M252Y/K288A/V308P/N434Y;

M252Y/K288D/V308P/N434Y;

M252Y/K288E/V308P/N434Y;

M252Y/K288F/V308P/N434Y;

M252Y/K288G/V308P/N434Y;

M252Y/K288H/V308P/N434Y;

M252Y/K288I/V308P/N434Y;

M252Y/K288L/V308P/N434Y;

M252Y/K288M/V308P/N434Y;

M252Y/K288N/V308P/N434Y;

M252Y/K288P/V308P/N434Y;

M252Y/K288Q/V308P/N434Y;

M252Y/K288R/V308P/N434Y;

M252Y/K288V/V308P/N434Y;

M252Y/K288W/V308P/N434Y;

M252Y/K288Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/N325G/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/V308P/L328E/N434Y;

M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N325S/N434Y;

P238D/M252Y/N325M/N434Y;

P238D/M252Y/N325L/N434Y;

P238D/M252Y/N325I/N434Y;

P238D/M252Y/Q295M/N434Y;

P238D/M252Y/N325G/N434Y;

M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/T307Q/V308P/Q311A/M4281/N434Y;

P238D/M252Y/A327G/N434Y;

P238D/M252Y/L328D/N434Y;

P238D/M252Y/L328E/N434Y;

L235K/G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

L235K/P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

T307A/Q311A/N434Y;

T307Q/Q311A/N434Y;

T307A/Q311H/N434Y;

T307Q/Q311H/N434Y;

M252Y/L328E/N434Y;

G236D/M252Y/L328E/N434Y;

M252Y/S267M/L328E/N434Y;

M252Y/S267L/L328E/N434Y;

P238D/M252Y/T307P/N434Y;

M252Y/T307P/Q311A/N434Y;

M252Y/T307P/Q311H/N434Y;

P238D/T250A/M252Y/N434Y;

P238D/T250F/M252Y/N434Y;

P238D/T250G/M252Y/N434Y;

P238D/T250H/M252Y/N434Y;

P238D/T250I/M252Y/N434Y;

P238D/T25UL/M252Y/N434Y;

P238D/T250M/M252Y/N434Y;

F751 5.30E-07 P238D/T250N/M252Y/N434Y;

P238D/T250Q/M252Y/N434Y;

P238D/T250S/M252Y/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/N434Y;

P238D/T250W/M252Y/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/N434Y;

P238D/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

T307A/L309E/Q311A/N434Y;

T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

T307A/L309E/Q311H/N434Y;

T307Q/L309E/Q311H/N434Y;

M252Y/T256A/K434Y;

M252Y/E272A/N434Y;

M252Y/K274A/N434Y;

M252Y/V282A/N434Y;

M252Y/N286A/N434Y;

M252Y/K338A/N434Y;

M252Y/K340A/N434Y;

M252Y/E345A/N434Y;

M252Y/N361A/N434Y;

M252Y/Q362A/N434Y;

M252Y/S375A/N434Y;

M252Y/Y391A/N434Y;

M252Y/D413A/N434Y;

M252Y/L309A/N434Y;

M252Y/L309H/N434Y;

M252Y/S254T/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

M252Y/N315A/N434Y;

M252Y/N315D/N434Y;

M252Y/N315E/N434Y;

M252Y/N315F/N434Y;

M252Y/N315G/N434Y;

M252Y/N315I/N434Y;

M252Y/N315K/N434Y;

M252Y/N315L/N434Y;

M252Y/N315M/N434Y;

M252Y/N315Q/N434Y;

M252Y/N315R/N434Y;

M252Y/N315S/N434Y;

M252Y/N315T/N434Y;

M252Y/N315V/N434Y;

M252Y/N315W/N434Y;

M252Y/N315Y/N434Y;

M252Y/N325A/N434Y;

M252Y/N384A/N434Y;

M252Y/N389A/N434Y;

M252Y/N389A/N390A/N434Y;

M252Y/S254T/T256S/N434Y;

M252Y/A378V/N434Y;

M252Y/E380S/N434Y;

M252Y/E382V/N434Y;

M252Y/S424E/N434Y;

M252Y/N434Y/Y436I;

M252Y/N434Y/T437R;

P238D/T250V/M252Y/T307P/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N286E/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/W313Y/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/W313F/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/1253V/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255A/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255D/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255E/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255F/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255H/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/K2551/M434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255K/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255L/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255M/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255N/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255Q/N434Y;

P238D/T250V/ M252Y/ R255S/ N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255W/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255Y/N434Y;

M252Y/D280A/N434Y;

M252Y/D280E/N434Y;

M252Y/D280G/N434Y;

M252Y/D280H/N434Y;

M252Y/D280K/N434Y;

M252Y/D280N/N434Y;

M252Y/D280Q/N434Y;

M252Y/D280R/N434Y;

M252Y/D280S/N434Y;

M252Y/D280T/N434Y;

M252Y/N384A/N389A/N434Y;

G236A/S239D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y;

M252Y/N434Y/Y436A;

M252Y/N434Y/Y436E;

M252Y/N434Y/Y436F;

M252Y/N434Y/Y436G;

M252Y/N434Y/Y436H;

M252Y/N434Y/Y436K;

M252Y/N434Y/Y436L;

M252Y/N434Y/Y436M;

M252Y/N434Y/Y436N;

M252Y/N434Y/Y436S;

M252Y/N434Y/Y436T;

M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436W;

M252Y/S254T/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y;

M252Y/N315D/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N315E/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N315D/G316A/N434Y;

M252Y/N315D/G316D/N434Y;

M252Y/N315D/G316E/N434Y;

M252Y/N315D/G316F/N434Y;

M252Y/N315D/G316H/N434Y;

M252Y/N315D/G316I/N434Y;

M252Y/N315D/G316K/N434Y;

M252Y/N315D/G316L/N434Y;

M252Y/N315D/G316M/N434Y;

M252Y/N315D/G316N/N434Y;

M252Y/N315D/G316P/N434Y;

M252Y/N315D/G316Q/N434Y;

M252Y/N315D/G316R/N434Y;

M252Y/N315D/G316S/N434Y;

M252Y/N315D/G316T/N434Y;

M252Y/N315D/G316V/N434Y;

M252Y/N315D/G316W/N434Y;

M252Y/N286S/N434Y;

M252Y/D280E/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/D280G/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N286S/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N286E/N384A/N389A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436I;

T250V/M252Y/N434Y;

L234R/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

G236K/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

G237K/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

G237R/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

P238D/S239K/T250V/M252Y/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/V308P/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/H435K/Y436V;

M252Y/N434Y/H435N/Y436V;

M252Y/N434Y/H435R/Y436V;

M252Y/S254A/N434Y;

M252Y/S254G/N434Y;

M252Y/S254H/N434Y;

M252Y/S2541/N434Y;

M252Y/S254Q/N434Y;

M252Y/S254V/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/N325G/N434Y;

L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y;

L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

K248I/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

K248Y/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/E258H/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

T250V/M252Y/V308P/N434Y;

L235R/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/N325G/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N325G/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/N325A/N434Y;

S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V;

G236A/S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/I332E/N434Y/Y436V;

G236A/S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/I332E/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N325G/N434Y/Y436V;

P238D/N434W;

L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/K434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

L235K/P238D/S239K/M252Y/N434Y;

L235K/P238D/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

L235K/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y;

L235K/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434; Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/Q386E/N434Y/Y436V;

M252Y/Q386R/N434Y/Y436V;

M252Y/Q386S/N434Y/Y436V;

M252Y/P387E/N434Y/Y436V;

M252Y/P387R/N434Y/Y436V;

M252Y/P387S/N434Y/Y436V;

M252Y/V422E/N434Y/Y436V;

M252Y/V422R/N434Y/Y436V;

M252Y/V422S/N434Y/Y436V;

M252Y/S424E/N434Y/Y436V;

M252Y/S424R/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438S;

M252Y/N434Y/Y436V/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/S440R;

S239D/M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

S239D/M252Y/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

K248N/M252Y/N434Y;

M252Y/E380N/E382S/N434Y;

M252Y/E382N/N384S/N434Y;

M252Y/S424N/N434Y;

M252Y/N434Y/Y436N/Q438T;

M252Y/N434Y/Q438N;

M252Y/N434Y/S440N;

M252Y/N434Y/S442N;

M252Y/S383N/G385S/N434Y;

M252Y/Q386T/N434Y;

M252Y/G385N/P387S/N434Y;

S239D/M252Y/N434Y;

M252Y/K326D/L328Y/N434Y;

S239D/M252Y/K326D/L328Y/N434Y;

S239D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y;

S239D/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y;

M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V;

M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/V422D/N434Y/Y436V;

M252Y/V422K/N434Y/Y436V;

M252Y/V422T/N434Y/Y436V;

M252Y/V422Q/N434Y/Y436V;

M252Y/S424K/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438K;

M252Y/N434Y/Y436V/S440D;

M252Y/N434Y/Y436V/S440Q;

M252Y/S424N/N434Y/Y436V;

M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/V422E/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424R/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/V422E/S424R/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/S440E;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T307Q/N434Y/Y436V;

M252Y/T307A/N434Y/Y436V;

M252Y/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/Q311H/N434Y/Y436V;

M252Y/T307Q/Q311H/N434Y/Y436V;

M252Y/T307A/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422S/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/S424R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S424N/N434Y/Y436V;

M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S 440E;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S424N/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Q438R/S440E;

S424N/N434W;

V308F/S424N/N434Y;

I332V/S424N/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/N434Y/Y436V;

P238D/T250Y/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/T307Q/Q311A/M434Y/Y436V;

P238D/T250Y/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

P2571/N434H;

V308F;

V259I/V308F/M428L;

E380A/M428L/N434S;

T307A/M428L/N434S;

T307A/E380A/M428L/N434S;

T307A/E380A/N434H;

M252Y/H4330/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/H433E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/T437A/Q438R/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/T437G/Q438R/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/K439D/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E/L441A;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E/L441E;

M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

I332E/M428L/N434S;

L251A/M252Y/N434Y/Y436V;

L251H/M252Y/N434Y/Y436V;

L251N/M252Y/N434Y/Y436V;

L251S/M252Y/N434Y/Y436V;

L251T/M252Y/N434Y/Y436V;

L251V/M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/I253V/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256G/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256N/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254A/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254A/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254A/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256A/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256A/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256A/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256G/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256G/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256G/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256N/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256N/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256N/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/H433D/N434W/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422A/S424A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422L/S424L/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438A/S440A;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438L/S440L;

L235R/S239K/M252Y/V422A/S424A/H433D/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422L/S424L/H433D/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438A/S440A;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438L/S440L;

G237K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

G237R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

S239K/M252Y/P329K/N434Y/Y436V;

S239K/M252Y/P329R/N434Y/Y436V;

M252Y/L328Y/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L234A/L235A/M252Y/N434Y/Y436V;

L234A/L235A/M252Y/N297A/N434Y/Y436V;

L234A/L235A/T25OV/M252Y/T307Q/V3O8P/Q311A/N434Y/Y436V;

L234A/L235A/T25OV/M252Y/N297A/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

G236R/M252Y/L328R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y /Y436V;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T; или

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F.

2. Способ по п. 1, где активирующий Fcγ-рецептор представляет собой FcγRIa человека, FcγRIIa(R) человека, FcγRIIa(H) человека, FcγRIIIa(V) человека или FcγRIIIa(F) человека.

3. Способ по п. 1, который включает замену аминокислоты указанной Fc-области в одном или нескольких из положений аминокислот 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 и 329, как указано согласно нумерации EU.

4. Способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, где способ включает модификацию Fc-области антигенсвязывающей молекулы, содержащей а) антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьируется в зависимости от рН, и б) Fc-область, которая имеет активность связывания FcRn при рН 7,4 в Fc-области, в которой один из двух полипептидов, составляющих Fc-область, имеет активность связывания FcRn при рН 7,4, а другой не обладает активностью связывания FcRn при рН 7,4,

где указанная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело IgG человека,

где антигенсвязывающая активность ниже при рН 5,8, чем при рН 7,4, где отношение величины КД для антигенсвязывающей активности при рН 5,8 к величине КД для антигенсвязывающей активности при рН 7,4 (КД (pH 5,8)/КД (pH 7,4)) равно 2 или больше, причем антигенсвязывающий домен содержит остаток гистидина в каждом одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из положений вариабельной области тяжелой цепи Н, таких как 27, 31, 32, 33, 35, 50, 58, 59, 61, 62, 99, 100b и 102, и положений вариабельной области легкой цепи L, таких как 24, 27, 28, 31, 32, 34, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94 и 95а (нумерация по Кэботу);

где Fc-область согласно (б), обладающая большей FcRn-связывающей активностью при pH 7,4, содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в положениях в Fc-домене, согласно нумерации ЕU:

N434W;

N434Y;

M252Y/S254T/T256E/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/N434W;

M252Y/N434Y;

M252Y/N434W;

M252W/N434Y;

M252W/N434W;

P257L/N434Y;

V308F/N434Y;

M252Y/V308P/N434Y;

M428L/N434S;

M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W;

I332V;

I332V/N434Y;

G237M/V308F;

S254T/N434W;

S254T/N434Y;

T256E/N434W;

T256E/N434Y;

S254T/T256E/N434W;

S254T/T256E/N434Y;

M252Y/S254T/N434W;

M252Y/S254T/N434Y;

M252Y/T256E/N434W;

M252Y/T256E/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/N434A;

M252Y/N434A;

M252W/N434A;

M252Y/T256Q/N434W;

M252Y/T256Q/N434Y;

M252F/T256D/N434W;

M252F/T256D/N434Y;

H433K/N434F/Y436H;

I332V/N434W;

V308P/N434W;

I332V/M428L/N434Y;

G385D/Q386P/N389S/N434W;

G385D/Q386P/N389S/N434Y;

G385H/N434W;

G385H/N434Y;

N434F;

M252Y/S254T/T256E/N434F;

M252Y/S254T/T256E/N434H;

M252Y/N434F;

M252Y/N434H;

M428L/N434W;

M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y;

M252Y/M428L/N434W;

M252Y/M428L/N434Y;

M252Y/M428L/N434A;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A;

T256E/M428L/N434Y;

S254T/M428L/N434W;

M252Y /T256Q/N434A;

M252Y/T256E/N434A;

T256Q/N434W;

T256Q/N434Y;

M252W/T256Q/N434W;

M252W/T256Q/N434Y;

S254T/T256Q/N434W;

M252Y/S254T/T256Q/N434W;

M252Y/S254T/T256Q/N434Y;

M252Y/T256E/V308P/N434W;

M252Y/V308P/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W;

M252W/M428L/N434W;

P257L/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F;

M252Y/T256E/N434H;

M252W/T256Q/P257L/N434Y;

P238A/M252Y/V308P/N434Y;

M252Y/D265A/V308P/N434Y;

M252Y/T307A/V308P/N434Y;

M252Y/V303A/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/D376A/N434Y;

M252Y/V305A/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/V308P/K317A/N434Y;

M252Y/V308P/E380A/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/N434Y;

M252Y/V308P/S424A/N434Y;

P257L/V308P/M428L/N434Y;

M252Y/T256E/V308P/M428L/N434W;

M252Y/T256E/M428L/N434W;

M252Y/T256E/V308P/N434Y;

M252Y/T256E/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434Y;

P257L/M428L/N434W;

P257A/M428L/N434Y;

P257G/M428L/N434Y;

P257I/M428L/N434Y;

P257M/M428L/N434Y;

P257N/M428L/N434Y;

P257S/M428L/N434Y;

P257T/M428L/N434Y;

P257V/M428L/N434Y;

M252W/V308P/N434W;

S239K/M252Y/V308P/N434Y;

M252Y/S298G/V308P/N434Y;

M252Y/D270F/V308P/N434Y;

M252Y/V308A/N434Y;

M252Y/V308F/N434Y;

M252Y/V308I/N434Y;

M252Y/V308L/N434Y;

M252Y/V308M/N434Y;

M252Y/V308Q/N434Y;

M252Y/V308T/N434Y;

P257A/V308P/M428L/N434Y;

P257T/V308P/M428L/N434Y;

P257V/V308P/M428L/N434Y;

M252W/M428I/N434Y;

M252W/M428Y/N434Y;

M252W/M428F/N434Y;

P238A/M252W/N434Y;

M252W/D265A/N434Y;

M252W/T307Q/N434Y;

M252W/V303A/N434Y;

M252W/D376A/N434Y;

M252W/V305A/N434Y;

M252W/Q311A/N434Y;

M252W/D312A/N434Y;

M252W/K317A/N434Y;

M252W/E380A/N434Y;

M252W/E382A/N434Y;

M252W/S424A/N434Y;

S239K/M252W/N434Y;

M252W/S298G/N434Y;

M252W/D270F/N434Y;

M252W/N325G/N434Y;

P257A/M428L/N434W;

P257T/M428L/N434W;

P257V/M428L/N434W;

M252W/I332V/N434Y;

P257I/Q311I;

M252Y/T307A/N434Y;

M252Y/T307Q/N434Y;

P257L/T307A/M428L/N434Y;

P257A/T307A/M428L/N434Y;

P257T/T307A/M428L/N434Y;

P257V/T307A/M428L/N434Y;

P257L/T307Q/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/M428L/N434Y;

P257T/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/M428L/N434Y;

M252Y/T307D/N434Y;

M252Y/T307F/N434Y;

M252Y/T307G/N434Y;

M252Y/T307H/N434Y;

M252Y/T307I/N434Y;

M252Y/T307K/N434Y;

M252Y/T307L/N434Y;

M252Y/T307M/N434Y;

M252Y/T307N/N434Y;

M252Y/T307P/N434Y;

M252Y/T307R/N434Y;

M252Y/T307S/N434Y;

M252Y/T307V/N434Y;

M252Y/T307W/N434Y;

M252Y/T307Y/N434Y;

M252Y/K334L/N434Y;

M252Y/G385H/N434Y;

M252Y/T289H/N434Y;

M252Y/Q311H/N434Y;

M252Y/D312H/N434Y;

M252Y/N315H/N434Y;

M252Y/K360H/N434Y;

M252Y/L314R/N434Y;

M252Y/L314K/N434Y;

M252Y/N286E/N434Y;

M252Y/L309E/N434Y;

M252Y/R255E/N434Y;

M252Y/P387E/N434Y;

K248I/M428L/N434Y;

M252Y/M428A/N434Y;

M252Y/M428D/N434Y;

M252Y/M428F/N434Y;

M252Y/M428G/N434Y;

M252Y/M428H/N434Y;

M252Y/M428I/N434Y;

M252Y/M428K/N434Y;

M252Y/M428N/N434Y;

M252Y/M428P/N434Y;

M252Y/M428Q/N434Y;

M252Y/M428S/N434Y;

M252Y/M428T/N434Y;

M252Y/M428V/N434Y;

M252Y/M428W/N434Y;

M252Y/M428Y/N434Y;

M252W/T307Q/M428Y/N434Y;

M252W/Q311A/M428Y/N434Y;

M252W/T307Q/Q311A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307Q/M428Y/N434Y;

M252Y/D270F/N434Y;

M252Y/T307A/Q311A/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311H/N434Y;

M252Y/E382A/N434Y;

M252Y/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307A/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/T307Q/E382A/M428Y/N434Y;

P238A/M252Y/M428F/N434Y;

M252Y/V305A/M428F/N434Y;

M252Y/N325G/M428F/N434Y;

M252Y/D376A/M428F/N434Y;

M252Y/E380A/M428F/N434Y;

M252Y/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/E382A/N434Y;

M252Y/D270F/V308P/E382A/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428Y/N434Y;

M252Y/T307Q/V308P/E382A/N434Y;

M252Y/V308P/Q311H/E382A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/M428L/N434Y;

M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/V308P/M428Y/N434Y;

M252Y/V308P/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/V308P/E380A/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/T256E/E382A/N434Y;

M252Y/T256E/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/E382A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/E382A/M428I/N434Y;

M252Y/V308P/E380A/E382A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y;

M252Y/Q311A/M428Y/N434Y;

M252Y/D312A/M428Y/N434Y;

M252Y/Q311A/D312A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/Q311A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/D312A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/Q311A/D312A/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/T307P/N434Y;

M252Y/T307P/M428Y/N434Y;

M252W/V308P/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/V308P/E382A/N434Y;

M252W/V308P/E382A/N434Y;

S239K/M252W/V308P/E382A/N434Y;

S239K/M252W/V308P/E382A/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/V308P/E382A/M428I/N434Y;

S239K/M252W/V308P/M428F/N434Y;

S239K/M252W/E380A/E382A/M428F/N434Y;

S239K/M252Y/T307P/M428Y/N434Y;

M252Y/T256E/Q311A/D312A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307P/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/T307Q/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/P387E/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/L309P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/L309R/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/L309P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/L309R/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/V308P/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/P387E/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/N434Y;

P257V/T307Q/M428I/N434Y;

P257V/T307Q/M428V/N434Y;

P257V/T307Q/N325G/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y;

P257V/V305A/T307Q/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/E258H/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428I/N434Y;

S239K/M252W/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/V308P/Q311A/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/T256E/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/N286E/V308P/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/D270F/N286E/V308P/N434Y;

S239K/M252W/T307P/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/T256E/V308P/Q311A/M428Y/N434Y;

S239K/M252W/T256E/N286E/V308P/M428Y/N434Y;

P257V/T307A/Q311A/M428L/N434Y;

P257V/V305A/T307A/M428L/N434Y;

M252Y/V308P/L309E/N434Y;

M252Y/V308P/L309D/N434Y;

M252Y/V308P/L309A/N434Y;

M252W/V308P/L309E/M428Y/N434Y;

M252W/V308P/L309D/M428Y/N434Y;

M252W/V308P/L309A/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/P387E/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/P387E/M428I/N434Y;

P257V/T307Q/M428L/N434W;

P257V/T307A/M428L/N434W;

P257A/T307Q/L309P/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/L309P/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/L309R/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/L309R/M428L/N434Y;

P257V/N286E/M428L/N434Y;

P257V/P387E/M428L/N434Y;

P257V/T307H/M428L/N434Y;

P257V/T307N/M428L/N434Y;

P257V/T307G/M428L/N434Y;

P257V/T307P/M428L/N434Y;

P257V/T307S/M428L/N434Y;

P257V/N286E/T307A/M428L/N434Y;

P257V/T307A/P387E/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/T307P/N325G/M428Y/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/K360H/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/P387E/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/M428A/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/E382A/N434Y;

M252Y/T307W/Q311H/N434Y;

S239K/P257A/V308P/M428L/N434Y;

P257A/V308P/L309E/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428V/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428Y/N434Y;

M252Y/P257V/T307Q/M428F/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428V/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428Y/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428F/N434Y;

P257A/T307Q/M428V/N434Y;

P257A/T307Q/N434Y;

P257A/T307Q/M428Y/N434Y;

P257A/T307Q/M428F/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y;

P257A/Q311A/M428L/N434Y;

P257A/Q311H/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/Q311A/M428L/N434Y;

P257A/T307A/Q311A/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/Q311H/M428L/N434Y;

P257A/T307A/Q311H/M428L/N434Y;

P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y;

P257A/N286E/T307A/M428L/N434Y;

S239K/M252Y/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y;

S239K/M252Y/T307P/L309E/N325G/M428Y/N434Y;

P257S/T307A/M428L/N434Y;

P257M/T307A/M428L/N434Y;

P257N/T307A/M428L/N434Y;

P257I/T307A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/M428Y/N434Y;

P257V/T307Q/M428F/N434Y;

S239K/P257V/V308P/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/V308P/Q311A/N325G/M428L/N434Y;

P257V/T307A/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257A/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257A/T307A/V308P/M428L/N434Y;

P257A/T307Q/V308P/M428L/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/N325G/M428L/N434Y;

T256E/P257V/N434Y;

T256E/P257T/N434Y;

S239K/P257T/V308P/M428L/N434Y;

P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y;

T256E/P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y;

P257T/V308P/N325G/E382A/M428L/N434Y;

P257T/V308P/N325G/P387E/M428L/N434Y;

P257T/V308P/L309P/N325G/M428L/N434Y;

P257T/V308P/L309R/N325G/M428L/N434Y;

T256E/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/E382A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/P387E/M428L/N434Y;

P257L/V308P/N434Y;

P257T/T307Q/N434Y;

P257V/T307Q/N325G/N434Y;

P257V/T307Q/Q311A/N434Y;

P257V/V305A/T307Q/N434Y;

P257V/N286E/T307A/N434Y;

P257V/T307Q/L309R/Q311H/M428L/N434Y;

P257V/V308P/N325G/M428L/N434Y;

S239K/P257V/V308P/Q311H/M428L/N434Y;

P257V/V305A/T307A/N325G/M428L/N434Y;

S239K/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y;

P257T/T307A/M428V/N434Y;

P257A/M428V/N434Y;

P257A/T307A/M428V/N434Y;

P257S/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/N297A/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/N286A/T307Q/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N315A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N384A/M428L/N434Y;

P257V/T307Q/N389A/M428L/N434Y;

P257V/N434Y;

P257T/N434Y;

P257V/N286E/N434Y;

P257T/N286E/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/N434Y;

P257V/N286E/T307Q/M428Y/N434Y;

P257V/V305A/T307Q/M428Y/N434Y;

P257T/T307Q/M428Y/N434Y;

P257V/T307Q/V308P/N325G/M428Y/N434Y;

P257T/T307Q/M428F/N434Y;

P257A/N286E/T307Q/M428F/N434Y;

P257A/N286E/T307Q/M428Y/N434Y;

T250A/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250F/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250I/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250M/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250S/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250V/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250W/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

T250Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y;

M252Y/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/S254T/V308P/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311A

M252Y/S254T/N286E/N434Y;

M252Y/S254T/V308P/N434Y;

M252Y/S254T/T307A/N434Y;

M252Y/S254T/T307Q/N434Y;

M252Y/S254T/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/Q311H/N434Y;

M252Y/S254T/T307A/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/M428I/N434Y;

M252Y/T256E/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/T256Q/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/S254T/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/N286E/T307A/Q311H/N434Y;

M252Y/T307A/Q311H/M428I/N434Y;

M252Y/T256E/T307Q/Q311H;

M252Y/N286E/T307A/Q311A;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A;

M252Y/N286E/T307Q/Q311H;

M252Y/T256E/N286E/N434Y;

S239K/M252Y/V308P;

S239K/M252Y/V308P/E382A;

S239K/M252Y/T256E/V308P;

S239K/M252Y/N286E/V308P;

S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I;

M252Y/N286E/M428L/N434Y;

M252Y/S254T/E382A/N434Y;

S239K/M252Y/S254T/V308P/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/M428I/N434Y;

M252Y/D312A/E382A/M428Y/N434Y;

M252Y/E382A/P387E/N434Y;

M252Y/D312A/P387E/N434Y;

M252Y/P387E/M428Y/N434Y;

M252Y/T256Q/E382A/N434Y;

M252Y/N286E/V308P/N434Y;

M252Y/V305T/T307P/V308I/L309A/N434Y;

M252Y/T307P/V308I/L309A/N434Y;

S239K/N434W;

S239K/V308F/N434Y;

S239K/M252Y/N434Y;

S239K/M252Y/S254T/N434Y;

S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

S239K/M252Y/T256Q/N434Y;

S239K/M252W/N434W;

S239K/P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y;

S239K/P257A/T307Q/M428L/N434Y;

V308P;

M252Y/V279L/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V279L/V308P/N434Y;

M252Y/V282D/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V282D/V308P/N434Y;

M252Y/V284K/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V284K/V308P/N434Y;

M252Y/K288S/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/K288S/V308P/N434Y;

M252Y/V308P/G385R/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/G385R/N434Y;

M252Y/V308P/Q386K/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/Q386K/N434Y;

L235G/G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/L328R/N434Y;

S239K/M252Y/N297A/V308P/N434Y;

P238D/M252Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/N434Y;

S239K/M252Y/T256E/N434Y;

S239K/M252Y/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

G237K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

P238R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/P329K/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/P329R/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/N286A/V308P/N434Y;

M252Y/N286D/V308P/N434Y;

M252Y/N286F/V308P/N434Y;

M252Y/N286G/V308P/N434Y;

M252Y/N286H/V308P/N434Y;

M252Y/N286I/V308P/N434Y;

M252Y/N286K/V308P/N434Y;

M252Y/N286L/V308P/N434Y;

M252Y/N286M/V308P/N434Y;

M252Y/N286P/V308P/N434Y;

M252Y/N286Q/V308P/N434Y;

M252Y/N286R/V308P/N434Y;

M252Y/N286S/V308P/N434Y;

M252Y/N286T/V308P/N434Y;

M252Y/N286V/V308P/N434Y;

M252Y/N286W/V308P/N434Y;

M252Y/N286Y/V308P/N434Y;

M252Y/K288A/V308P/N434Y;

M252Y/K288D/V308P/N434Y;

M252Y/K288E/V308P/N434Y;

M252Y/K288F/V308P/N434Y;

M252Y/K288G/V308P/N434Y;

M252Y/K288H/V308P/N434Y;

M252Y/K288I/V308P/N434Y;

M252Y/K288L/V308P/N434Y;

M252Y/K288M/V308P/N434Y;

M252Y/K288N/V308P/N434Y;

M252Y/K288P/V308P/N434Y;

M252Y/K288Q/V308P/N434Y;

M252Y/K288R/V308P/N434Y;

M252Y/K288V/V308P/N434Y;

M252Y/K288W/V308P/N434Y;

M252Y/K288Y/V308P/N434Y;

S239K/M252Y/V308P/N325G/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/V308P/L328E/N434Y;

M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y;

S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N325S/N434Y;

P238D/M252Y/N325M/N434Y;

P238D/M252Y/N325L/N434Y;

P238D/M252Y/N325I/N434Y;

P238D/M252Y/Q295M/N434Y;

P238D/M252Y/N325G/N434Y;

M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

M252Y/T307Q/V308P/Q311A/M4281/N434Y;

P238D/M252Y/A327G/N434Y;

P238D/M252Y/L328D/N434Y;

P238D/M252Y/L328E/N434Y;

L235K/G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

L235K/P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y;

T307A/Q311A/N434Y;

T307Q/Q311A/N434Y;

T307A/Q311H/N434Y;

T307Q/Q311H/N434Y;

M252Y/L328E/N434Y;

G236D/M252Y/L328E/N434Y;

M252Y/S267M/L328E/N434Y;

M252Y/S267L/L328E/N434Y;

P238D/M252Y/T307P/N434Y;

M252Y/T307P/Q311A/N434Y;

M252Y/T307P/Q311H/N434Y;

P238D/T250A/M252Y/N434Y;

P238D/T250F/M252Y/N434Y;

P238D/T250G/M252Y/N434Y;

P238D/T250H/M252Y/N434Y;

P238D/T250I/M252Y/N434Y;

P238D/T25UL/M252Y/N434Y;

P238D/T250M/M252Y/N434Y;

F751 5.30E-07 P238D/T250N/M252Y/N434Y;

P238D/T250Q/M252Y/N434Y;

P238D/T250S/M252Y/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/N434Y;

P238D/T250W/M252Y/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/N434Y;

P238D/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

T307A/L309E/Q311A/N434Y;

T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

T307A/L309E/Q311H/N434Y;

T307Q/L309E/Q311H/N434Y;

M252Y/T256A/K434Y;

M252Y/E272A/N434Y;

M252Y/K274A/N434Y;

M252Y/V282A/N434Y;

M252Y/N286A/N434Y;

M252Y/K338A/N434Y;

M252Y/K340A/N434Y;

M252Y/E345A/N434Y;

M252Y/N361A/N434Y;

M252Y/Q362A/N434Y;

M252Y/S375A/N434Y;

M252Y/Y391A/N434Y;

M252Y/D413A/N434Y;

M252Y/L309A/N434Y;

M252Y/L309H/N434Y;

M252Y/S254T/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/S254T/T307Q/L309E/Q311A/N434Y;

M252Y/N315A/N434Y;

M252Y/N315D/N434Y;

M252Y/N315E/N434Y;

M252Y/N315F/N434Y;

M252Y/N315G/N434Y;

M252Y/N315I/N434Y;

M252Y/N315K/N434Y;

M252Y/N315L/N434Y;

M252Y/N315M/N434Y;

M252Y/N315Q/N434Y;

M252Y/N315R/N434Y;

M252Y/N315S/N434Y;

M252Y/N315T/N434Y;

M252Y/N315V/N434Y;

M252Y/N315W/N434Y;

M252Y/N315Y/N434Y;

M252Y/N325A/N434Y;

M252Y/N384A/N434Y;

M252Y/N389A/N434Y;

M252Y/N389A/N390A/N434Y;

M252Y/S254T/T256S/N434Y;

M252Y/A378V/N434Y;

M252Y/E380S/N434Y;

M252Y/E382V/N434Y;

M252Y/S424E/N434Y;

M252Y/N434Y/Y436I;

M252Y/N434Y/T437R;

P238D/T250V/M252Y/T307P/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/M252Y/N286E/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/W313Y/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/W313F/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/1253V/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255A/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255D/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255E/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255F/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255H/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/K2551/M434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255K/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255L/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255M/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255N/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255Q/N434Y;

P238D/T250V/ M252Y/ R255S/ N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255W/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/R255Y/N434Y;

M252Y/D280A/N434Y;

M252Y/D280E/N434Y;

M252Y/D280G/N434Y;

M252Y/D280H/N434Y;

M252Y/D280K/N434Y;

M252Y/D280N/N434Y;

M252Y/D280Q/N434Y;

M252Y/D280R/N434Y;

M252Y/D280S/N434Y;

M252Y/D280T/N434Y;

M252Y/N384A/N389A/N434Y;

G236A/S239D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y;

M252Y/N434Y/Y436A;

M252Y/N434Y/Y436E;

M252Y/N434Y/Y436F;

M252Y/N434Y/Y436G;

M252Y/N434Y/Y436H;

M252Y/N434Y/Y436K;

M252Y/N434Y/Y436L;

M252Y/N434Y/Y436M;

M252Y/N434Y/Y436N;

M252Y/N434Y/Y436S;

M252Y/N434Y/Y436T;

M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436W;

M252Y/S254T/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y;

M252Y/N315D/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N315E/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N315D/G316A/N434Y;

M252Y/N315D/G316D/N434Y;

M252Y/N315D/G316E/N434Y;

M252Y/N315D/G316F/N434Y;

M252Y/N315D/G316H/N434Y;

M252Y/N315D/G316I/N434Y;

M252Y/N315D/G316K/N434Y;

M252Y/N315D/G316L/N434Y;

M252Y/N315D/G316M/N434Y;

M252Y/N315D/G316N/N434Y;

M252Y/N315D/G316P/N434Y;

M252Y/N315D/G316Q/N434Y;

M252Y/N315D/G316R/N434Y;

M252Y/N315D/G316S/N434Y;

M252Y/N315D/G316T/N434Y;

M252Y/N315D/G316V/N434Y;

M252Y/N315D/G316W/N434Y;

M252Y/N286S/N434Y;

M252Y/D280E/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/D280G/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N286S/N384A/N389A/N434Y;

M252Y/N286E/N384A/N389A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

L235K/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I;

P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436I;

T250V/M252Y/N434Y;

L234R/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

G236K/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

G237K/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

G237R/P238D/T250V/M252Y/N434Y;

P238D/S239K/T250V/M252Y/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/V308P/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/H435K/Y436V;

M252Y/N434Y/H435N/Y436V;

M252Y/N434Y/H435R/Y436V;

M252Y/S254A/N434Y;

M252Y/S254G/N434Y;

M252Y/S254H/N434Y;

M252Y/S2541/N434Y;

M252Y/S254Q/N434Y;

M252Y/S254V/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/N325G/N434Y;

L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y;

L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

K248I/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

K248Y/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/E258H/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

T250V/M252Y/V308P/N434Y;

L235R/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/N325G/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N325G/N434Y;

P238D/T250V/M252Y/N325A/N434Y;

S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V;

G236A/S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/I332E/N434Y/Y436V;

G236A/S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/I332E/N434Y/Y436V;

P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N325G/N434Y/Y436V;

P238D/N434W;

L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/K434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

L235K/P238D/S239K/M252Y/N434Y;

L235K/P238D/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y;

L235K/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y;

L235K/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y;

L235K/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434; Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/Q386E/N434Y/Y436V;

M252Y/Q386R/N434Y/Y436V;

M252Y/Q386S/N434Y/Y436V;

M252Y/P387E/N434Y/Y436V;

M252Y/P387R/N434Y/Y436V;

M252Y/P387S/N434Y/Y436V;

M252Y/V422E/N434Y/Y436V;

M252Y/V422R/N434Y/Y436V;

M252Y/V422S/N434Y/Y436V;

M252Y/S424E/N434Y/Y436V;

M252Y/S424R/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438S;

M252Y/N434Y/Y436V/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/S440R;

S239D/M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

S239D/M252Y/K326D/L328Y/N434Y/Y436V;

K248N/M252Y/N434Y;

M252Y/E380N/E382S/N434Y;

M252Y/E382N/N384S/N434Y;

M252Y/S424N/N434Y;

M252Y/N434Y/Y436N/Q438T;

M252Y/N434Y/Q438N;

M252Y/N434Y/S440N;

M252Y/N434Y/S442N;

M252Y/S383N/G385S/N434Y;

M252Y/Q386T/N434Y;

M252Y/G385N/P387S/N434Y;

S239D/M252Y/N434Y;

M252Y/K326D/L328Y/N434Y;

S239D/M252Y/K326D/L328Y/N434Y;

S239D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y;

S239D/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y;

M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V;

M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/V422D/N434Y/Y436V;

M252Y/V422K/N434Y/Y436V;

M252Y/V422T/N434Y/Y436V;

M252Y/V422Q/N434Y/Y436V;

M252Y/S424K/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438K;

M252Y/N434Y/Y436V/S440D;

M252Y/N434Y/Y436V/S440Q;

M252Y/S424N/N434Y/Y436V;

M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/V422E/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424R/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/V422E/S424R/N434Y/Y436V;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/S440E;

T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T307Q/N434Y/Y436V;

M252Y/T307A/N434Y/Y436V;

M252Y/Q311A/N434Y/Y436V;

M252Y/Q311H/N434Y/Y436V;

M252Y/T307Q/Q311H/N434Y/Y436V;

M252Y/T307A/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422S/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/S424R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S424N/N434Y/Y436V;

M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S 440E;

T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S424N/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424N/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Q438R/S440E;

S424N/N434W;

V308F/S424N/N434Y;

I332V/S424N/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/N434Y/Y436V;

P238D/T250Y/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y;

P238D/T250Y/M252Y/T307Q/Q311A/M434Y/Y436V;

P238D/T250Y/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

P2571/N434H;

V308F;

V259I/V308F/M428L;

E380A/M428L/N434S;

T307A/M428L/N434S;

T307A/E380A/M428L/N434S;

T307A/E380A/N434H;

M252Y/H4330/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/H433E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/T437A/Q438R/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/T437G/Q438R/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/K439D/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E/L441A;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E/L441E;

M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

T250V/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

I332E/M428L/N434S;

L251A/M252Y/N434Y/Y436V;

L251H/M252Y/N434Y/Y436V;

L251N/M252Y/N434Y/Y436V;

L251S/M252Y/N434Y/Y436V;

L251T/M252Y/N434Y/Y436V;

L251V/M252Y/N434Y/Y436V;

M252Y/I253V/N434Y/Y436V;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256G/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256N/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254A/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254A/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254A/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256Q/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256A/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256A/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256A/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256G/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256G/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256G/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256N/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256N/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256N/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/H433D/N434W/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/V422A/S424A/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422L/S424L/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438A/S440A;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438L/S440L;

L235R/S239K/M252Y/V422A/S424A/H433D/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/V422L/S424L/H433D/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438A/S440A;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438L/S440L;

G237K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

G237R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

S239K/M252Y/P329K/N434Y/Y436V;

S239K/M252Y/P329R/N434Y/Y436V;

M252Y/L328Y/N434Y;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L234A/L235A/M252Y/N434Y/Y436V;

L234A/L235A/M252Y/N297A/N434Y/Y436V;

L234A/L235A/T25OV/M252Y/T307Q/V3O8P/Q311A/N434Y/Y436V;

L234A/L235A/T25OV/M252Y/N297A/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440D;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

G236R/M252Y/L328R/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E;

L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y /Y436V;

L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V;

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T; или

L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где антигенсвязывающий домен представляет собой вариабельную область антитела.