Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 714 116

(13)

(51)

МПК

C12P21/08(2006-01-01)

C07K16/46(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2017117856, 2015-11-04

(24)

Дата начала отсчета патента

2015-11-04

(22)

дата подачи заявки

2015-11-04

(45)

опубликовано

2020-02-11

(72)

авторы

Мёсснер ЭккехардШлотауэр Тильман

(73)

патентообладатели

Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

WO 2012125850 А1, 20.09.2012WO 2009086320 А1, 09.07.2009DALL’ ACQUA et al., "Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences", JImmunol., 2002, 169: pp.5171-5180YEUNG et al., "Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in

ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ FcRn И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК C12P21/08 C07K16/46

Описание патента на изобретение RU2714116C2

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам и слитым конструкциям на основе полипептидов Fc-области, которые асимметрично модифицированы применительно к взаимодействию со своим Fc-рецептором, в частности своим неонатальным Fc-рецептором (FcRn), и к способам их применения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Неонатальный Fc-рецептор (FcRn) важен для метаболического пути антител класса IgG in vivo. Функция FcRn заключается в спасении IgG от процесса лизосомальной деградации, что приводит к уменьшению клиренса и увеличению полупериода существования. Он представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух полипептидов: белка, подобного белку главного комплекса гистосовместимости класса I с молекулярной массой (ММ) 50 кДа (α-FcRn) и β2-микроглобулина (β2m) с ММ 15 кДа. FcRn связывается с высокой аффинностью с CH2-CH3-частью (CH означает константный домен тяжелой цепи) Fc-области антитела класса IgG. Взаимодействие между антителом класса IgG и FcRn зависит от pH и осуществляется в стехиометрическом соотношении 1:2, т.е. одна молекула антитела IgG может взаимодействовать с двумя молекулами FcRn посредством двух своих полипептидов Fc-области тяжелой цепи (см., например, Huber A.H., et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1077-1083).

Таким образом, свойства/характеристики связывания молекул IgG с FcRn in vitro являются показателями его фармакокинетических свойств in vivo в кровотоке.

Во взаимодействии между FcRn и Fc-областью антитела класса IgG принимают участие разные аминокислотные остатки CH2- и CH3-домена тяжелой цепи.

Способы усиления связывания Fc-области (и также IgG) с FcRn были осуществлены путем внесения мутаций по различным аминокислотным остаткам в Fc-области: Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433 и Asn 434 (см. Kuo T.T., et al., J. Clin. Immunol., 30 (2010) 777-789; Ropeenian D.C., et al., Nat. Rev. Immunol., 7 (2007) 715-725).

В результате исследований белок-белковых взаимодействий с целью улучшения связывания с FcRn Dall'Acqua и др. была описана комбинация мутаций M252Y, S254T, T256E (Dall'Acqua W.F., et al. J. Biol. Chem., 281 (2006) 23514-23524). Исследования комплекса (Fc-область IgG человека)-(FcRn человека) показали, что остатки I253, S254, H435 и Y436 являются важнейшими остатками для данного взаимодействия (Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002; Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604). В работе Yeung Y.A. и др. (J. Immunol., 182 (2009) 7667-7671) приведены различные мутанты по остаткам 248-259, и 301-317, и 376-382, и 424-437 и проведено их изучение.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ Изобретения

Обнаружено, что связывание антитела или слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области с FcRn можно модифицировать посредством изменения аминокислотных остатков в не соответствующих этому связыванию положениях в индивидуальных полипептидах Fc-области, поскольку совместное действие этих изменений модифицирует связывание с FcRn. Антитела и слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области, описанные в данной заявке, полезны, например, для лечения заболеваний, при которых необходимы специально выбранные для системного введения времена удерживания.

Согласно данному изобретению предложены вариантные Fc-области, которые имеют модифицированные свойства в отношении связывания с FcRn по сравнению с соответствующей Fc-областью дикого типа. Эти вариантные Fc-области содержат специфические аминокислотные мутации в CH2- и/или CH3-домене. Обнаружено, что эти мутации, в случае их использования либо по отдельности, либо в комбинации, в одной и той же или в обеих тяжелых цепях в Fc-области, позволяют получить вариантную Fc-область со специально разработанным полупериодом существования in vivo.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена вариантная Fc-область класса IgG (человека), содержащая первый полипептид Fc-области и второй полипептид Fc-области, при этом

a) первый полипептид Fc-области и второй полипептид Fc-области происходят из одного и того же полипептида родительской Fc-области класса IgG (человека), и

b) первый полипептид Fc-области имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности второго полипептида Fc-области по меньшей мере в одном соответствующем положении согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat,

на основании чего вариантная Fc-область класса IgG (человека) имеет другую аффинность к Fc-рецептору человека по сравнению с Fc-областью класса IgG (человека), которая имеет те же аминокислотные остатки (что и полипептид родительской Fc-области IgG человека по пункту (a)) в соответствующих положениях согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat в первом полипептиде Fc-области и втором полипептиде Fc-области.

при этом

a) первый полипептид Fc-области имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности второго полипептида Fc-области по меньшей мере в одном соответствующем положении согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat,

на основании чего вариантная Fc-область класса IgG (человека) имеет другую аффинность к Fc-рецептору человека по сравнению с Fc-областью класса IgG, которая имеет тот же аминокислотный остаток (что и в соответствующей Fc-области IgG человека) в первом и втором полипептиде Fc-области в соответствующем положении.

при этом

a) аминокислотная последовательность первого полипептида Fc-области отличается от аминокислотной последовательности первого полипептида родительской Fc-области класса IgG по одному или более аминокислотным остаткам,

аминокислотная последовательность второго полипептида Fc-области отличается от аминокислотной последовательности второго полипептида родительской Fc-области класса IgG по одному или более аминокислотным остаткам, и

на основании чего вариантная Fc-область класса IgG (человека) имеет другую аффинность к Fc-рецептору человека по сравнению с родительской Fc-областью класса IgG, содержащей первый и второй полипептид родительской Fc-области класса IgG по пункту (a).

при этом

a) аминокислотная последовательность первого полипептида Fc-области происходит из первого полипептида родительской Fc-области класса IgG, а аминокислотная последовательность второго полипептида Fc-области происходит из второго полипептида родительской Fc-области класса IgG, и

b) в первый полипептид Fc-области и/или во второй полипептид Fc-области вносят одну или более мутаций, с тем чтобы первый полипептид Fc-области имел аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности второго полипептида Fc-области по меньшей мере в одном соответствующем положении согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat,

на основании чего вариантная Fc-область класса IgG (человека) имеет другую аффинность к Fc-рецептору человека по сравнению с Fc-областью класса IgG, содержащей первый и второй полипептид родительской Fc-области класса IgG по пункту (a)

В одном из воплощений всех аспектов вариантная Fc-область класса IgG (человека) представляет собой вариантную гетеродимерную Fc-область класса IgG (человека).

В одном из воплощений всех аспектов первый полипептид родительской Fc-области класса IgG и второй полипептид родительской Fc-области класса IgG представляют собой полипептиды Fc-области класса IgG, не относящегося к человеку.

В одном из воплощений всех аспектов первый полипептид родительской Fc-области класса IgG и второй полипептид родительской Fc-области класса IgG представляют собой один и тот же полипептид Fc-области класса IgG.

В одном из воплощений всех аспектов в результате образования пары с участием первого полипептида Fc-области и второго полипептида Fc-области с получением димерной (функциональной) Fc-области образуется гетеродимер.

В одном из воплощений всех аспектов первый и второй полипептид Fc-области отличаются независимо друг от друга по меньшей мере по одному аминокислотному остатку от соответствующего полипептида родительской Fc-области класса IgG.

В одном из воплощений всех аспектов класс IgG выбран из подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

В одном из воплощений всех аспектов Fc-рецептор человека выбран из неонатального Fc-рецептора человека и Fcγ-рецептора человека.

В одном из воплощений всех аспектов первый полипептид Fc-области отличается по 1 аминокислотному остатку, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12 аминокислотным остаткам в соответствующем(им) положении(ям) согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat от второго полипептида Fc-области.

В одном из воплощений всех аспектов, описанных в данной заявке, либо первый полипептид Fc-области, либо второй полипептид Fc-области, либо оба полипептида Fc-области содержат одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- T307H, или

- Q311H, или

- E430H, или

- N434H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, или

- T307H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, и M252Y, и S254T, и T256E.

- T307H, или

- E430H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, или

- T307H, и M252Y, и S254T, и T256E или

- T307Q, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, и M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из воплощений всех аспектов, описанных в данной заявке,

первый полипептид Fc-области содержит, независимо от второго полипептида Fc-области, одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- T307H, или

- Q311H, или

- E430H, или

- N434H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- M252Y, и S254T, и T256E, или

- I253A, и H310A, и H435A, или

- H310A, и H433A, и Y436A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, или

- T307H, и M252Y, и S254T, и T256E или

- Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, и M252Y, и S254T, и T256E,

второй полипептид Fc-области содержит, независимо от первого полипептида Fc-области, одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- T307H, или

- T307Q, или

- Q311H, или

- E430H, или

- N434H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, или

- T307H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- N434H, и M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из воплощений всех аспектов, описанных в данной заявке,

- T307H, или

- E430H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- M252Y, и S254T, и T256E, или

- I253A, и H310A, и H435A, или

- H310A, и H433A, и Y436A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, или

- T307H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, и M252Y, и S254T, и T256E,

- T307H, или

- T307Q, или

- E430H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H, или

- T307H, и M252Y, и S254T, и T256E или

- Q311H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- E430H, и M252Y, и S254T, и T256E, или

- N434H, и M252Y, и S254, и T256E.

В одном из воплощений всех аспектов, описанных в данной заявке, первый полипептид Fc-области содержит

одну из приведенных ниже комбинаций мутаций:

- ни одной, или

- M252Y, и S254T, и T256E, или

- I253A, и H310A, и H435A, или

- H310A, и H433A, и Y436A,

одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- ни одной,

- T307H, или

- T307Q, или

- Q311H, или

- E430H, или

- N434H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307Q и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H,

и второй полипептид Fc-области содержит

одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- ни одной, если первый полипептид Fc-области содержит по меньшей мере одну мутацию, или

- T307H, или

- T307Q, если первый полипептид Fc-области не содержит исключительно мутацию T307Q, или

- Q311H, или

- E430H, или

- N434H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307Q и N434A, или

- M252Y, и S254T, и T256E, если первый полипептид Fc-области не содержит исключительно комбинацию мутаций M252Y, и S254T, и T256E, или

- I253A, и H310A, и H435A, если первый полипептид Fc-области не содержит исключительно комбинацию мутаций I253A, и H310A, и H435A, или

- H310A, и H433A, и Y436A, если первый полипептид Fc-области не содержит исключительно комбинацию мутаций H310A, и H433A, и Y436A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H.

В одном из воплощений всех аспектов, описанных в данной заявке, первый полипептид Fc-области содержит

одну из приведенных ниже комбинаций мутаций:

- ни одной, или

- M252Y, и S254T, и T256E, или

- I253A, и H310A, и H435A, или

- H310A, и H433A, и Y436A,

одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- ни одной,

- T307H, или

- T307Q, или

- E430H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307Q и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H,

и второй полипептид Fc-области содержит

одну из приведенных ниже мутаций или комбинаций мутаций:

- ни одной, если первый полипептид Fc-области содержит по меньшей мере одну мутацию, или

- T307H, или

- T307Q, если первый полипептид Fc-области не содержит исключительно мутацию T307Q, или

- E430H, или

- T307H и Q311H, или

- T307H и E430H, или

- T307H и N434A, или

- T307H и N434H, или

- T307Q и Q311H, или

- T307Q и E430H, или

- T307Q и N434H, или

- T307Q и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307H, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434A, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434H, или

- T307Q, и Q311H, и E430H, и N434Y, или

- T307Q, и V308P, и N434Y, и Y436H.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации I253A, и H310A, и H435A, а второй полипептид Fc-области содержит мутации M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, а второй полипептид Fc-области содержит мутации M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H и N434H, а второй полипептид Fc-области содержит мутации M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307Q и N434A, а второй полипептид Fc-области содержит мутации M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T250Q и M428L, а второй полипептид Fc-области содержит мутации M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307Q и N434H, а второй полипептид Fc-области содержит мутации M252Y, и S254T, и T256E, и T307Q, и N434H.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H, и Q311H, и E430H, и N434H, и второй полипептид Fc-области содержит мутации T307H, и Q311H, и E430H, и N434H.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H и N434H, и второй полипептид Fc-области содержит мутации T307H и N434H.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E, и второй полипептид Fc-области содержит мутации T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутацию N434H, и второй полипептид Fc-области содержит мутацию N434H.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307Q и N434A.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H и N434H.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутации T307H, и N434H, и M252Y, и S254T, и T256E.

В одном из предпочтительных воплощений первый полипептид Fc-области содержит мутацию N434H.

В одном из воплощений первый полипептид Fc-области дополнительно содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V (“полипептид Fc-области, формирующий впадину”), а второй полипептид Fc-области дополнительно содержит мутации S354C и T366W (“полипептид Fc-области, формирующий выступ”).

В одном из воплощений всех аспектов вариантная Fc-область класса IgG (человека) содержит первый и второй полипептид Fc-области подкласса IgG1 человека, где

a) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации L234A и L235A (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), или

b) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутацию P329G (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), или

c) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации L234A, и L235A, и P329G (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), или

d) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации L234A и L235A (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), и первый полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутацию T366W, а второй полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутации T366S, L368A и Y407V, или

e) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации L234A, и L235A, и P329G (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), и первый полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутацию T366W, а второй полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутации T366S, L368A и Y407V.

В одном из воплощений вариантная Fc-область класса IgG (человека) содержит первый и второй полипептид Fc-области подкласса IgG4 человека, где

a) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации S228P и L235E (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), или

c) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации S228P, и L235E, и P329G (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), или

d) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации S228P и L235E (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), и первый полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутацию T366W, а второй полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутации T366S, L368A и Y407V,

e) и первый, и второй полипептид Fc-области оба дополнительно содержат мутации S228P, и L235E, и P329G (нумерация соответствует системе нумерации EU-индекс по Kabat), и первый полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутацию T366W, а второй полипептид Fc-области дополнительно содержит мутацию Y349C или S354C и мутации T366S, L368A и Y407V.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложены антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области, содержащие вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке.

В одном из воплощений антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном из воплощений антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена нуклеиновая кислота, кодирующая вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, описанное в данной заявке.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена нуклеиновая кислота, кодирующая слитую конструкцию на основе полипептидов Fc-области, описанную в данной заявке.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, описанную в данной заявке.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ получения вариантной Fc-области класса IgG (человека), описанной в данной заявке, включающий культивирование клетки хозяина, описанной в данной заявке, с целью получения вариантной Fc-области класса IgG (человека).

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ получения антитела, описанного в данной заявке, включающий культивирование клетки хозяина, описанной в данной заявке, с целью получения данного антитела.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложен способ получения слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области, описанной в данной заявке, включающий культивирование клетки хозяина, описанной в данной заявке, с целью получения слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена фармацевтическая композиция, содержащая вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке, или антитело, описанное в данной заявке, или слитую конструкцию на основе полипептидов Fc-области, описанную в данной заявке.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложена вариантная Fc-область класса IgG (человека), описанная в данной заявке, или антитело, описанное в данной заявке, или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области, описанная в данной заявке, для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено применение вариантной Fc-области класса IgG (человека), описанной в данной заявке, или антитела, описанного в данной заявке, или слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области, описанной в данной заявке, для изготовления лекарственного средства.

Антитела, описанные в данной заявке, можно использовать в качестве, например, рекрутеров T-клеток, в качестве связывающегося с Fc-гамма-рецептором вещества с высокой биологической активностью (эффективностью) и быстрым выведением из кровотока (из сыворотки крови), в виде конъюгатов антитело-лекарственное средство с быстрым выведением для снижения системных побочных эффектов или в качестве антител с предварительно определенной направленной доставкой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1. Полученный при проведении FcRn-аффинной хроматографии илллюстративный схематический график элюирования антитела, содержащего разные (вариантные) Fc-области: 1: с мутациями I253A/H310A/H435A; 2: Fc-область дикого типа; 3: M252Y/S254T/T256E в одном полипептиде Fc-области; другая Fc-область дикого типа; 4: M252Y/S254T/T256E в обоих полипептидах Fc-области; 5: цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E; цепь, формирующая впадину: T307Q/N434A.

Фиг. 2. Полученный при проведении FcRn-аффинной хроматографии график элюирования антитела, содержащего разные (вариантные) Fc-области: 1: Fc-область дикого типа; 2: подвергнутая инженерии гликозилирования Fc-область; 3: T307Q/N434A; 4: T307H/N434H; 5: T307H/N434H/M252Y/S254T/T256E; 6: N434H; 7: M252Y/S254T/T256E.

Фиг. 3. Полученный при проведении FcRn-аффинной хроматографии график элюирования антитела, содержащего разные (вариантные) Fc-области: 1: Fc-область по типу (цепь, формирующая впадину)-(цепь, формирующая выступ); 2: цепь, формирующая впадину: T307Q/N434A; цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E; 3: цепь, формирующая впадину: T307H/N434H; цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E; 4: цепь, формирующая впадину: T250Q/M428L; цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E; 5: цепь, формирующая впадину: T307Q, N434H; цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E/T307Q/N434H; 6: цепь, формирующая впадину: T307H/Q311H/E430H/N434H; цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E; 7: цепь, формирующая впадину: T307H/Q311H/E430H/N434H; цепь, формирующая выступ: M252Y/S254T/T256E/T307H/Q311H/E430H/N434H; 8: цепь, формирующая впадину/выступ: M252Y/S254T/T256E.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин “примерно” означает диапазон, составляющий +/- 20% от следующего далее численного значения. В одном из воплощений термин “примерно” означает диапазон, составляющий +/- 10% от следующего далее численного значения. В одном из воплощений термин “примерно” означает диапазон, составляющий +/- 5% от следующего далее численного значения.

“Акцепторный каркас IgG человека” для целей данного изобретения представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящего из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса IgG человека, который определен ниже. Акцепторный каркас IgG человека, “происходящий из” каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса IgG человека, может содержать такую же, как у них, аминокислотную последовательность, или он может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях количество изменений аминокислот составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше либо 2 или меньше. В некоторых воплощениях последовательность акцепторного каркаса VL иммуноглобулина человека идентична последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или последовательности консенсусного каркаса IgG человека.

Антитело с “созревшей аффинностью” относится к антителу с одним или более изменениями в одном или более чем одном гипервариабельном участке (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не претерпело таких изменений, приводящих к улучшению аффинности антитела к антигену.

Термин “изменение” означает мутацию (замену), вставку (добавление) или делецию одного или более аминокислотных остатков в родительском антителе или слитом полипептиде, например слитом полипептиде, содержащем по меньшей мере FcRn-связывающую часть Fc-области, приводящих к получению модифицированного антитела или слитого полипептида. Термин “мутация” означает, что определенный аминокислотный остаток замемен на другой аминокислотный остаток. Например, мутация L234A означает, что остаток аминокислоты лизина в положении 234 в (полипептиде) Fc-области антитела заменен на остаток аминокислоты аланина (замена лизина на аланин) (нумерация соответствует EU-индексу).

Термин “аминокислотная мутация” означает замену по меньшей мере одного имеющегося аминокислотного остатка на другой отличающийся от него аминокислотный остаток (т.е. заменяющий аминокислотный остаток). Заменяющий аминокислотный остаток может представлять собой “природный аминокислотный остаток” и быть выбран из группы, состоящей из аланина (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: A), аргинина (arg, R), аспарагина (asn, N), аспарагиновой кислоты (asp, D), цистеина (cys, C), глутамина (gln, Q), глутаминовой кислоты (glu, E), глицина (gly, G), гистидина (his, H), изолейцина (ile, I), лейцина (leu, L), лизина (lys, K), метионина (met, M), фенилаланина (phe, F), пролина (pro, P), серина (ser, S), треонина (thr, T), триптофана (trp, W), тирозина (tyr, Y) и валина (val, V). Заменяющим аминокислотным остатком может быть “неприродный аминокислотный остаток”. См., например, US 6586207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin J.W., et al., J. Am. Chem. Soc., 124 (2002) 9026-9027; Chin J.W. and Schultz P.G., ChemBioChem., 11 (2002) 1135-1137; Chin J.W. et al., PICAS United States of America, 99 (2002) 11020-11024; и Wang L. and Schultz P.G., Chem. (2002) 1-10 (все они полностью включены в данное описание посредством ссылки).

Термин “аминокислотная вставка” означает (дополнительное) встраивание по меньшей мере одного аминокислотного остатка в предварительно заданное положение в аминокислотной последовательности. В одном из воплощений вставка будет представлять собой вставку одного или двух аминокислотных остатков. Встроенный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки) может(гут) представлять собой любой(ые) природный(ые) или неприродный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки).

Термин “аминокислотная делеция” означает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка из предварительно заданного положения в аминокислотной последовательности.

Термин “антитело” используется в данном описании в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела (mAb), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, триспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют желаемую антиген-, и/или белок A-, и/или FcRn-связывающую активность.

Термин “асимметричная Fc-область” означает пару полипептидов Fc-области, которые имеют разные аминокислотные остатки в соответствующих положениях согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat.

Термин “Fc-область, асимметричная применительно к связыванию с FcRn”, означает Fc-область, состоящую из двух полипептидных цепей, которые имеют разные аминокислотные остатки в соответствующих положениях, причем данные положения определены согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat, при этом присутствие разных аминокислот в этих положениях влияет на связывание Fc-области с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) человека. В рамках данного описания различия между двумя полипептидными цепями Fc-области в “Fc-области, асимметричной применительно к связыванию с FcRn”, не включают различий, которые внесены с целью облегчения образования гетеродимерных Fc-областей, например, для получения биспецифичных антител. Эти различия также могут быть асимметричными, т.е. когда две цепи отличаются аминокислотными остатками в не соответствующих друг другу положениях согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat. Присутствие таких различий облегчает осуществление гетеродимеризации и уменьшает вероятность гомодимеризации. Примерами таких различий являются так называемые замены по типу “выступы во впадины” (см., например, US 7695936 и US 2003/0078385). Обнаружено, что вероятность образования гетеродимеров повышают следующие замены по типу “выступы” и “впадины” в индивидуальных полипептидных цепях Fc-области антитела IgG подкласса IgG1: 1) в одной цепи Y407T, а в другой цепи T366Y; 2) в одной цепи Y407A, а в другой цепи T366W; 3) в одной цепи F405A, а в другой цепи T394W; 4) в одной цепи F405W, а в другой цепи T394S; 5) в одной цепи Y407T, а в другой цепи T366Y; 6) в одной цепи T366Y и F405A, а в другой цепи T394W и Y407T; 7) в одной цепи T366W и F405W, а в другой цепи T394S и Y407A; 8) в одной цепи F405W и Y407A, а в другой цепи T366W и T394S; и 9) в одной цепи T366W, а в другой цепи T366S, L368A и Y407V, при этом из перечисленного особенно подходит последний вариант. Кроме того, образованию гетеродимеров способствуют изменения, в результате которых создаются новые дисульфидные мостики между двумя полипептидными цепями Fc-области (см., например, US 2003/0078385). Обнаружено, что вероятность образования гетеродимеров повышают следующие замены, которые приводят к появлению соответствующим образом расположенных в пространстве остатков цистеина для образования новых внутрицепочечных дисульфидных связей в индивидуальных полипептидных цепях Fc-области антитела IgG подкласса IgG1: в одной цепи Y349C, а в другой S354C; в одной цепи Y349C, а в другой E356C; в одной цепи Y349C, а в другой E357C; в одной цепи L351C, а в другой S354C; в одной цепи T394C, а в другой E397C; или в одной цепи D399C, а в другой K392C. Следующими примерами изменений аминокислот, способствующих гетеродимеризации, являются так называемые “парные замены с изменением заряда” (см., например, WO 2009/089004). Обнаружено, что вероятность образования гетеродимеров повышают следующие парные замены с изменением заряда в индивидуальных полипептидных цепях Fc-области антитела IgG подкласса IgG1: 1) в одной цепи K409D или K409E, а в другой цепи D399K или D399R; 2) в одной цепи K392D или K392E, а в другой цепи D399K или D399R; 3) в одной цепи K439D или K439E, а в другой цепи E356K или E356R; 4) в одной цепи K370D или K370E, а в другой цепи E357K или E357R; 5) в одной цепи K409D и K360D, а в другой цепи D399K и E356K; 6) в одной цепи K409D и K370D, а в другой цепи D399K и E357K; 7) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K, E356K и E357K; 8) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K; 9) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K и E356K; 10) в одной цепи K409D и K392D, а в другой цепи D399K и D357K; 11) в одной цепи K409D и K370D, а в другой цепи D399K и D357K; 12) в одной цепи D399K, а в другой цепи K409D и K360D; и 13) в одной цепи K409D и K439D, а в другой D399K и E356K.

Термин “связывание (с антигеном)” означает связывание антитела со своим антигеном в анализе in vitro, в одном из воплощений в анализе связывания, в котором антитело связывают с поверхностью и связывание антигена с антителом измеряют с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). “Связывание” означает, что аффинность связывания (K_D) составляет 10^-8 М или меньше, в некоторых воплощениях от 10^-13 до 10^-8 М, в некоторых воплощениях от 10^-13 до 10^-9 М.

Связывание можно изучать в анализе с использованием BIAcore (биосенсор AB от GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Аффинность связывания определяют в терминах k_a (константа скорости ассоциации для антитела при образовании комплекса антитело/антиген), k_d (константа диссоциации) и K_D (k_d/k_a).

Термин “химерное” антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида.

Термин “CH2-домен” означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 231 согласно EU до положения 340 согласно EU (EU система нумерации по Kabat). В одном из воплощений CH2-домен имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 01: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK.

Термин “CH3-домен” означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 341 согласно EU до положения 446 согласно EU. В одном из воплощений CH3-домен имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.

“Класс” антитела относится к типу константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существуют пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин “сопоставимая длина” означает, что два полипептида содержат одинаковое число аминокислотных остатков или могут отличаться по длине на один или более и вплоть до, самое большее, 10 аминокислотных остатков. В одном из воплощений полипептиды Fc-области содержат одинаковое число аминокислотных остатков или отличаются числом аминокислотных остатков от 1 до 10. В одном из воплощений полипептиды Fc-области содержат одинаковое число аминокислотных остатков или отличаются числом аминокислотных остатков от 1 до 5. В одном из воплощений полипептиды Fc-области содержат одинаковое число аминокислотных остатков или отличаются числом аминокислотных остатков от 1 до 3.

Термин “происходящий из” означает, что аминокислотную последовательность получают из родительской аминокислотной последовательности путем внесения изменений по меньшей мере в одно положение. Такая измененная аминокислотная последовательность отличается от соответствующей родительской аминокислотной последовательности по меньшей мере в одном соответствующем положении (нумерация для Fc-областей антител согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat). В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, отличается по одному-пятнадцати аминокислотным остаткам в соответствующих положениях. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, отличается по одному-десяти аминокислотным остаткам в соответствующих положениях. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, отличается по одному-шести аминокислотным остаткам в соответствующих положениях. Аналогичным образом, измененная аминокислотная последовательность имеет высокую идентичность аминокислотной последовательности со своей родительской аминокислотной последовательностью. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, имеет идентичность аминокислотной последовательности, составляющую 80% или более. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, имеет идентичность аминокислотной последовательности, составляющую 90% или более. В одном из воплощений аминокислотная последовательность, происходящая из родительской аминокислотной последовательности, имеет идентичность аминокислотной последовательности, составляющую 95% или более.

“Эффекторные функции” относятся к тем биологическим активностям, присущим Fc-области антитела, которые варьируют в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание с C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецепторами; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора); и активацию B-клеток.

“Эффективное количество” агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.

Термин “слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области” означает слитую конструкцию связывающего домена (например, антигенсвязывающего домена, такого как одноцепочечное антитело или полипептид, как например, лиганд рецептора) с Fc-областью антитела, которая демонстрирует желаемую активность в отношении связывания с мишенью, и/или белком A, и/или FcRn.

Термин “Fc-область человеческого происхождения” означает C-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого происхождения, которая содержит по меньшей мере часть шарнирной области, CH2-домен и CH3-домен. В одном из воплощений Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. В одном из воплощений Fc-область имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 60. Тем не менее, C-концевой остаток лизина (Lys447) Fc-области может присутствовать или может не присутствовать. Если в данном описании не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой EU-индексом, как описано в Kabat E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), публикация NIH (Национальный институт здравоохранения) 91-3242. Fc-область состоит двух полипептидов Fc-области тяжелой цепи, которые могут быть ковалентно соединены друг с другом через остатки цистеина шарнирной области, участвующие в образовании дисульфидных связей между полипептидами.

Термин “FcRn” означает неонатальный Fc-рецептор человека. Функция FcRn заключается в спасении IgG от процесса лизосомальной деградации, что приводит к уменьшению клиренса и увеличению полупериода существования. FcRn представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух полипептидов: белка, подобного белку главного комплекса гистосовместимости класса I с ММ 50 кДа (α-FcRn) и β2-микроглобулина (β2m) с ММ 15 кДа. FcRn связывается с высокой аффинностью с CH2-CH3-частью Fc-области IgG. Взаимодействие между IgG и FcRn строго зависит от pH и осуществляется в стехиометрическом соотношении 1:2, при этом одна молекула IgG связывается с двумя молекулами FcRn посредством двух своих тяжелых цепей (Huber A.H., et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1077-1083). Связывание с FcRn происходит в эндосоме при кислотных значениях pH (pH меньше 6,5), а IgG высвобождается на клеточной поверхности при нейтральных значениях pH (pH примерно 7,4). Зависимость характера этого взаимодействия от pH способствует FcRn-опосредуемой защите молекул IgG, которые попадают в клетки посредством пиноцитоза, от внутриклеточной деградации, благодаря связыванию с рецептором в кислотных условиях внутри эндосом. Кроме того, FcRn способствует возвращению IgG на поверхность клеток и последующему высвобождению в кровоток после воздействия на комплекс FcRn-IgG среды с нейтральным значением pH вне клетки.

Термин “FcRn-связывающая часть Fc-области” означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается, начиная приблизительно от положения 243 согласно EU до положения 261 согласно EU, и приблизительно от положения 275 согласно EU до положения 293 согласно EU, и приблизительно от положения 302 согласно EU до положения 319 согласно EU, и приблизительно от положения 336 согласно EU до положения 348 согласно EU, и приблизительно от положения 367 согласно EU до положения 393 согласно EU и положения 408 согласно EU, и приблизительно от положения 424 согласно EU до положения 440 согласно EU. В одном из воплощений изменен один или более чем один из следующих аминокислотных остатков, соответствующих EU нумерации по Kabat: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 и S440 (нумерация согласно EU).

Термин “каркас” или “каркасные области (FR)” относится к остаткам вариабельного домена, не являющимся остатками гипервариабельных участков (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термин “полноразмерное антитело” означает антитело, имеющее структуру, по существу аналогичную структуре нативного антитела, или имеющее тяжелые цепи, содержащие Fc-область, определенную в данном описании. Полноразмерное антитело может содержать дополнительные домены, такие как, например, одноцепочечный Fv (scFv) или scFab, конъюгированные с одной или более чем одной из цепей полноразмерного антитела. Эти конъюгаты также охватываются термином “полноразмерное антитело”.

Термины “гетеродимер” или “гетеродимерный” означают молекулу, которая содержит две полипептидные цепи (например, сопоставимой длины), причем эти две полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток в соответствующем положении будет другим, при этом данное соответствующее положение определено согласно EU-индексу по Kabat.

Термины “гомодимер” и “гомодимерный” означают молекулу, которая содержит две полипептидные цепи сопоставимой длины, причем эти две полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность, идентичную в соответствующих положениях, при этом данные соответствующие положения определены согласно EU-индексу по Kabat.

Антитело или слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области, описанные в данной заявке, могут быть гомодимерными или гетеродимерными применительно к своей Fc-области, что определяется в плане рассматриваемых мутаций или свойств. Например, что касается связывания с FcRn и/или белком A (т.е. при обращении внимания на эти свойства), то Fc-область (антитело) является гомодимерной(ым) (т.е. оба полипептида Fc-области тяжелой цепи содержат эти мутации) в плане наличия мутаций H310A, H433A и Y436A (эти мутации рассматриваются в отношении свойства слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области или антитела связываться с FcRn и/или белком A), но в то же самое время является гетеродимерной(ым) в плане наличия мутаций Y349C, T366S, L368A и Y407V (эти мутации не учитываются, поскольку эти мутации касаются гетеродимеризации тяжелых цепей и не затрагивают свойств, относящихся к связыванию с FcRn/белком A), а также в плане наличия мутаций S354C и T366W, соответственно (первый набор содержится только в первом полипептиде Fc-области, в то время как второй набор содержится только во втором полипептиде Fc-области). Кроме того, например, слитая конструкция на основе полипептидов Fc-области или антитело, описанные в данной заявке, могут быть гетеродимерными в плане наличия мутаций I253A, H310A, H433A, H435A и Y436A (т.е. все эти мутации направлены на свойства димерного полипептида связываться с FcRn и/или белком A), т.е. один полипептид Fc-области содержит мутации I253A, H310A и H435A, в то время как другой полипептид Fc-области содержит мутации H310A, H433A и Y436A.

Термины “клетка-хозяин”, “линия клеток хозяина” и “культура клеток хозяина” используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки хозяина включают “трансформанты” и “трансфицированные клетки”, которые включают первичную трансфицированную клетку и ее потомство безотносительно числа пересевов. Потомство может быть не полностью идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может содержать мутации. Мутантное потомство, которое обладает той же функцией или биологической активностью, по которой проводят скрининг или отбирают первоначально трансфицированную клетку, включено в данное изобретение.

“Человеческое антитело” представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, вырабатываемого человеком или продуцируемого человеческой клеткой, или происходящее из источника, не являющегося человеком, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Такое определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки, не относящиеся к человеческому антителу.

“Консенсусным каркасом IgG человека” является каркас, который представляет собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при выборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно, выбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, эта подгруппа последовательностей представляет собой ту же подгруппу, что и в Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, vol. 1-3. В одном из воплощений для VL данная подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как и у Kabat и др., выше. В одном из воплощений для VH данная подгруппа представляет собой подгруппу III, как и у Kabat и др., выше.

Термин “полипептид Fc-области IgG человека” относится к аминокислотной последовательности, которая идентична “нативному” полипептиду Fc-области IgG человека или полипептиду Fc-области человеческого IgG “дикого типа”. Термин “полипептид вариантной Fc-области (IgG человека)” относится к аминокислотной последовательности, получающейся из полипептида “нативной” Fc-области человеческого IgG или полипептида Fc-области человеческого IgG “дикого типа” в результате по меньшей мере “изменения одной аминокислоты”. “Fc-область IgG человека” состоит из двух полипептидов Fc-области IgG человека. “Вариантная Fc-область (IgG человека)” состоит из двух полипептидов Fc-области, при этом оба могут быть полипептидами вариантной Fc-области (IgG человека), или один представляет собой полипептид Fc-области IgG человека, а другой представляет собой полипептид вариантной Fc-области.

В одном из воплощений полипептид Fc-области IgG человека имеет аминокислотную последовательность полипептида Fc-области человеческого IgG1 с SEQ ID NO: 03, или полипептида Fc-области человеческого IgG2 с SEQ ID NO: 04, или полипептида Fc-области человеческого IgG3 с SEQ ID NO: 05, или полипептида Fc-области человеческого IgG4 с SEQ ID NO: 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) происходит из полипептида Fc-области с SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06 и имеет по меньшей мере одну аминокислотную мутацию по сравнению с полипептидом Fc-области человеческого IgG, имеющим SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) содержит/имеет от примерно одной до примерно двенадцати аминокислотных мутаций, а в одном из воплощений от примерно одной до примерно восьми аминокислотных мутаций. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) имеет по меньшей мере примерно 80% гомологии с полипептидом Fc-области IgG человека с SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) имеет по меньшей мере примерно 90% гомологии с полипептидом Fc-области IgG человека с SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06. В одном из воплощений полипептид вариантной Fc-области IgG (человека) имеет по меньшей мере примерно 95% гомологии с полипептидом Fc-области IgG человека с SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06.

Полипептид вариантной Fc-области IgG (человека), происходящий из полипептида Fc-области человеческого IgG с SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06, определяется теми аминокислотными изменениями, которые в нем содержатся. Так, например, термин P329G относится к происходящему из полипептида вариантной Fc-области IgG (человека) полипептиду Fc-области человеческого IgG с мутацией пролин→глицин в аминокислотном положении 329 по сравнению с полипептидом Fc-области человеческого IgG с SEQ ID NO: 03, или 04, или 05, или 06.

Как использовано в данном описании, аминокислотные положения во всех константных областях и доменах тяжелой и легкой цепи нумеруют согласно системе нумерации по Kabat, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), и в данном описании в этом отношении используют фразу “нумерация согласно Kabat”. Как правило, систему нумерации по Kabat (см. стр. 647-660) в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) используют для константных доменов легкой цепи (CL) изотипа каппа и лямбда, а систему нумерации EU-индекс по Kabat (см. стр. 661-723) используют для константных доменов тяжелой цепи (CH1, шарнирной области, CH2 и CH3).

Полипептид Fc-области IgG1 человека имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 03).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 07).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями Y349C, T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 08).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 09).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A и S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A и мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутацией P239G и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G и мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A, P329G и Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 16).

Происходящий из Fc-области IgG1 человека полипептид Fc-области с мутациями L234A, L235A, P329G и мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 17).

Полипептид Fc-области IgG4 человека имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 06).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P и L235E имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 18).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E и мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 19).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 21).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E и S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 22).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E и Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 23).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 24).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутацией P239G и мутациями Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 25).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутацией P329G и мутациями S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 26).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E, P329G и Y349C, T366S, L368A, Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 27).

Происходящий из Fc-области IgG4 человека полипептид Fc-области с мутациями S228P, L235E, P329G и S354C, T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 28).

“Гуманизированное” антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR антител, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки из FR человеческих антител. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все или по меньшей мере один и в типичном случае два вариабельных домена, в которых все или по существу все HVR (например, определяющие комплементарность участки (CDR)) соответствуют HVR антитела, не являющегося человеческим, а все или по существу все FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. “Гуманизированный вариант” антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое подвергнуто гуманизации.

Термин “гипервариабельный участок” или “HVR”, использованный в данном описании, относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности (“определяющими комплементарность участками” или “CDR”), и образуют петли определенной структуры (“гипервариабельные петли”), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки (“места контакта с антигеном”). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, указанные в данном описании, включают:

(a) гипервариабельные петли, образуемые аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia C. and Lesk A.M., J. Mol. Biol., 196 (1987) 901-917;

(b) CDR образуемые аминокислотными остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);

(c) места контакта с антигеном, образуемые аминокислотными остатками 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)); и

(d) комбинации (a), (b) и/или (c), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) и 94-102 (H3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном описании согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat (Kabat и др., выше).

“Индивидуумом” или “субъектом” является млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, одомашенных животных (например, крупный рогатый скот, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся людьми, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.

“Выделенное” антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонентов своего природного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до чистоты более 95% или 99%, как определено, например, электрофоретически (например, по данным электрофореза в полиакриамидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), изоэлектрофокусирования (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографически (например, посредством гель-проникающей хроматографии или ионообменной либо обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC)). В качестве обзора методов оценки чистоты антител см., например, Flatman S. et al., J. Chromatogr. B, 848 (2007) 79-87.

“Выделенная” нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонентов своего природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула данной нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в таком месте хромосомы, которое отличается от ее природного расположения в хромосоме.

Термин “моноклональное антитело”, использованный в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или появляющихся в процессе приготовления препарата на основе моноклональных антител, при этом такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В противоположность препаратам на основе поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате на основе моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение “моноклональное” указывает на характер антитела, полученного по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать в смысле требования получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными методами, включая, но не ограничиваясь этим, гибридомный метод, методы рекомбинантных ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих весь локус или часть локуса иммуноглобулина человека, при этом такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител изложены в данном описании.

“Нативные антитела” относятся к молекулам природных иммуноглобулинов различной структуры. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с ММ примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями. В направлении от N-конца к C-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Аналогично, в направлении от N-конца к C-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин “инструкция по применению” используется для обозначения инструкций, обычно вкладываемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

“Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности” применительно к референсной полипептидной последовательности определяют как процентную долю аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, разрывов, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивания, необходимого для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, можно достичь различными способами, известными специалисту в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST (средство поиска основного локального выравнивания), BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако же, для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают, используя компьютерную программу для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана Genentech, Inc., и исходная программа с документацией для пользователя подана в бюро по охране авторских прав США (U.S. Copyright Office), Вашингтон, округ Колумбия (D.C.), 20559, где она зарегистрирована под № TXU510087 в бюро регистрации авторского права США. Программа ALIGN-2 общедоступна через Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или ее можно компилировать с исходной программы. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, включая Digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.

В тех ситуациях, когда для сравнений аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, % идентичности аминокислотных последовательностей для заданной аминокислотной последовательности A относительно, по сравнению с или против заданной аминокислотной последовательности B (что можно альтернативно перефразировать как “заданная аминокислотная последовательность A, которая имеет или содержит определенный % аминокислотной последовательности, идентичной относительно, по сравнению с или против заданной аминокислотной последовательности B”) вычисляют так, как приведено ниже:

100 умножить на отношение X/Y,

где X представляет собой количество аминокислотных остатков, отмечаемых как идентичные совпадения программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании A и B этой программой, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в B. Будет очевидно, что там, где длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A относительно B не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности B относительно A. Если конкретно не указано иное, то все используемые в данном описании значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают так, как описано в непосредственно предшествующем абзаце, с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин “фармацевтическая композиция” относится к препарату, форма которого способствует эффективному проявлению биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит никаких дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введена данная композиция.

“Фармацевтически приемлемый носитель” относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличающемуся от активного ингредиента и являющемуся нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается этим, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Термин “пептидный линкер”, использованный в данном описании, означает пептид с разными аминокислотными последовательностями, который в одном из воплощений имеет синтетическое происхождение. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере 30 аминокислот, в одном из воплощений длиной 32-50 аминокислот. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность длиной 32-40 аминокислот. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой (G_xS)_n, где G означает глицин, S означает серин (× равно 3, n равно 8, 9 или 10, либо × равно 4, и n равно 6, 7 или 8), в одном из воплощений × равно 4, n равно 6 или 7, в одном из воплощений × равно 4, n равно 7. В одном из воплощений пептидный линкер представляет собой (G₄S)₆G₂.

Термин “рекомбинантное антитело” означает все антитела (химерное, гуманизированное и человеческое), которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных методов. Термин включает в себя антитела, выделенные из клетки хозяина, такой как клетка NS0 или клетка яичников китайского хомячка (CHO), или из животного (например, мыши), генетически модифицированного генами иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, которым трансфицирована клетка хозяина. Такие рекомбинантные антитела имеют вариабельную и константную области в реаранжированной форме). Рекомбинантные антитела, описанные в данной заявке, могут быть подвергнуты in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи происходящими из последовательностей и родственными последовательностям VH и VL антител зародышевой линии человека, не могут естественным образом существовать в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Использованный в данном описании термин “лечение” (и такие его грамматические варианты, как “лечить” или “подвергание лечению”) относится к клиническому воздействию в попытке изменить естественное течение болезни у подвергаемого лечению индивидуума, и оно может быть проведено либо с целью профилактики, либо в процессе курса лечения клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предупреждение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, сведение к минимуму любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности симптомов или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых воплощениях, антитела или слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области, описанные в данной заявке, используют для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин “валентный”, который используется в рамках настоящей заявки, относится к наличию конкретного количества сайтов связывания в молекуле (антитела). По существу, термины “бивалентный”, “тетравалентный” и “гексавалентный” относятся к наличию двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно, в молекуле (антитела). Биспецифичные антитела, описанные в данной заявке, в одном из предпочтительных воплощений являются “бивалентными”.

Термин “вариабельная область” или “вариабельный домен” относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) антитела обычно имеют аналогичные структуры, при этом каждый домен содержит четыре каркасные области (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов можно выделить антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с данным антигеном, соответственно. См., например, Portolano S. et al., J. Immunol., 150 (1993) 880-887; Clarkson T. et al., Nature, 352 (1991) 624-628.

Термин “сосудистое заболевание глаз” включает, но не ограничивается этим, интраокулярные неоваскулярные синдромы, такие как диабетическая ретинопатия, диабетический макулярный отек, ретинопатия недоношенных, неоваскулярная глаукома, окклюзии вен сетчатки, окклюзии центральной вены сетчатки, макулярная дегенерация, возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит, ретинальная ангиоматозная пролиферация, макулярная телеангиэктазия, ишемическая ретинопатия, неоваскуляризация радужной оболочки глаза, интраокулярная неоваскуляризация, роговичная неоваскуляризация, неоваскуляризация сетчатки, хориоидальная неоваскуляризация и дегенеративные изменения сетчатки (см., например, Garner A., “Vascular diseases” в: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner A. and Klintworth G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710).

Термин “вектор”, использованный в данном описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью репродуцировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Термин включает в себя вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, а также вектор, встроенный в геном клетки хозяина, в которую он введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном описании “экспрессирующими векторами”.

Термин “с мутацией IHH-AAA”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) и H435A (His435Ala), термин “с мутацией HHY-AAA”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) и Y436A (Tyr436Ala), а термин “с мутацией YTE”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций M252Y (Met252Tyr), S254T (Ser254Thr) и T256E (Thr256Glu) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1 или IgG4, при этом нумерация соответствует EU-индексу по Kabat.

Термин “с мутациями P329G LALA”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) и P329G (Pro329Gly) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG1, при этом нумерация соответствует EU-индексу по Kabat. Термин “с мутацией SPLE”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций S228P (Ser228Pro) и L235E (Leu235Glu) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG4, при этом нумерация соответствует EU-индексу по Kabat. Термин “с мутацией SPLE и P239G”, использованный в данном описании, относится к комбинации мутаций S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) и P329G (Pro329Gly) в константной области тяжелой цепи подкласса IgG4, при этом нумерация соответствует EU-индексу по Kabat.

II. НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В основе данного изобретения лежит, по меньшей мере и помимо всего прочего, обнаружение того, что связывание антитела или слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области с FcRn можно модифицировать посредством изменения аминокислотных остатков в не соответствующих этому связыванию положениях в индивидуальных полипептидах Fc-области, поскольку совместное действие этих изменений модифицирует связывание с FcRn. Fc-области, антитела и слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области, описанные в данной заявке, полезны, например, для лечения заболеваний, при которых необходимы специально выбранные для системного введения времена удерживания.

A. Неонатальный Fc-рецептор (FcRn)

Неонатальный Fc-рецептор (FcRn) важен для метаболического пути антител класса IgG in vivo. Функция FcRn заключается в спасении IgG дикого типа от процесса лизосомальной деградации, что приводит к уменьшению клиренса и увеличению полупериода существования. Он представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух полипептидов: белка, подобного белку главного комплекса гистосовместимости класса I с ММ 50 кДа (α-FcRn) и β2-микроглобулина (β2m) с ММ 15 кДа. FcRn связывается с высокой аффинностью с CH2-CH3-частью Fc-области антитела класса IgG. Взаимодействие между антителом класса IgG и FcRn зависит от pH и осуществляется в стехиометрическом соотношении 1:2, т.е. одна молекула IgG антитела может взаимодействовать с двумя молекулами FcRn посредством своих двух полипептидов Fc-области тяжелой цепи (см., например, Huber A.H., et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1077-1083).

Во взаимодействии между FcRn и Fc-областью антитела класса IgG принимают участие разные аминокислотные остатки CH2- и CH3-домена тяжелой цепи. Аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии с FcRn, локализованы, начиная приблизительно от положения 243 согласно EU до положения 261 согласно EU, приблизительно от положения 275 согласно EU до положения 293 согласно EU, приблизительно от положения 302 согласно EU до положения 319 согласно EU, приблизительно от положения 336 согласно EU до положения 348 согласно EU, в положении 408 согласно EU, и приблизительно от положения 424 согласно EU до положения 440 согласно EU. Более конкретно, во взаимодействие между Fc-областью и FcRn вовлечены следующие аминокислотные остатки, соответствующие EU нумерации по Kabat: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 и S440.

Исследованиями с использованием сайт-специфического мутагенеза доказано, что в Fc-области IgG критичными сайтами для связывания с FcRn, являются гистидин 310, гистидин 435 и изолейцин 253 и в меньшей степени гистидин 433 и тирозин 436 (см., например, Kim J.K., et al., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825; Raghavan M., et al., Biochem., 34 (1995) 14649-14657; Medesan C., et al., J. Immunol., 158 (1997) 2211-2217).

Способы усиления связывания IgG с FcRn были осуществлены путем внесения мутаций в различные аминокислотные остатки в IgG: треонин 250, метионин 252, серин 254, треонин 256, треонин 307, глутаминовую кислоту 380, метионин 428, гистидин 433 и аспарагин 434 (см. Kuo T.T., et al., J. Clin. Immunol., 30 (2010) 777-789).

В некоторых случаях желательны антитела с более низким полупериодом существования в кровотоке. Например, лекарственные средства для интравитреального введения должны иметь продолжительный полупериод существования в глазу и короткий полупериод существования в кровотоке пациента. Кроме того, преимущество таких антител заключается в их усиленном воздействии в месте заболевания, например в глазу.

Известны различные мутации, оказывающие влияние на связывание с FcRn и тем самым на полупериод существования в кровотоке. С использованием сайт-специфического мутагенеза идентифицированы аминокислотные остатки Fc-области, критичные для взаимодействия Fc-области IgG мыши и мышиного FcRn (см., например, Dall'Acqua W.F., et al., J. Immunol., 169 (2002) 5171-5180). В это взаимодействие вовлечены остатки I253, H310, H433, N434 и H435 (согласно EU нумерации по Kabat) (Medesan C., et al., Eur. J. Immunol., 26 (1996) 2533-2536; Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002; Kim J.K., et al., Eur. J. Immunol., 24 (1994) 542-548). Обнаружено, что присутствие остатков I253, H310 и H435 критично для взаимодействия Fc-области IgG человека с мышиным FcRn (Kim J.K., et al., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825). В результате исследований белок-белковых взаимодействий с целью улучшения связывания с FcRn Dall'Acqua и др. были описаны мутации по остаткам M252Y, S254T, T256E (Dall'Acqua W.F., et al. J. Biol. Chem., 281 (2006) 23514-23524). Исследования комплекса Fc-область IgG человека-FcRn человека показали, что остатки I253, S254, H435 и Y436 являются важнейшими для данного взаимодействия остатками (Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002; Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604). В работе Yeung Y.A. и др. (J. Immunol., 182 (2009) 7667-7671) описаны различные мутанты по остаткам 248-259, и 301-317, и 376-382, и 424-437 и проведено их изучение. Типичные мутации и их влияние на связывание с FcRn приведены в следующей таблице.

Таблица

Мутации Влияние на связывание с FcRn Полупериод существования в кровотоке Ссылка H285
H310Q/H433N
(мышиный IgG1) ослабляли связывание
(с FcRn мыши) уменьшали
(у мыши) Kim J.K., Scand. J. Immunol., 40 (1994) 457-465 I253A
H310A
H435A
H436A
(мышиный IgG1) ослабляли связывание
(с FcRn мыши) уменьшали
(у мыши) Ghetie V. and Ward E.S., Immunol. Today, 18 (1997) 592-598 T252L/T254S/T256F
T252A/T254S/T256A
(мышиный IgG1) усиливали связывание
(с FcRn мыши) увеличивали
(у мыши) Ghetie V. and Ward E.S., Immunol. Today, 18 (1997) 592-598 I253A
H310A
H435A
H436A
H433A/N434Q
(мышиный IgG1) ослабляли связывание
(с FcRn мыши) уменьшали
(у мыши) Medesan C., et al., J. Immunol., 158 (1997) 2211-2217 I253A
H310A
H435A
H435R
(человеческий IgG1) ослабляли;
H310A: <0,1 отн. связывания с muFcRn
(FcRn мыши) уменьшали
(у мыши) Kim J.K., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825 H433A
(человеческий IgG1) 1,1 отн. связывания с FcRn мыши; 0,4 отн. связывания с FcRn человека
(мыши) Kim J.K., Eur. J. Immunol., 29 (1999) 2819-2825 I253A
S254A
H435A
Y436A
(человеческий IgG1) ослабляли;
<0,1 относительно связывания с FcRn человека уменьшали Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604 R255A
K288A
L309A
S415A
H433A
(человеческий IgG1) ослабляли связывание
(с FcRn человека) уменьшали Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604 P238A
T256A
E272A
V305A
T307A
Q311A
D312A
K317A
D376A
A378Q
E380A
E382A
S424A
N434A
K288A/N434A
E380A/N434A
T307A/E380A/N434A
(человеческий IgG1) усиливали связывание
(с FcRn человека) увеличивали Shields R.L., et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604 H435A
(гуманизированный IgG1) ослабляли;
<0,1 относительно связывания с FcRn человека уменьшали Firan M., et al., Int. Immunol., 13 (2001) 993-1002 I253A (отсутствие связывания)
M252W
M252Y
M252Y/T256Q
M252F/T256D
N434F/Y436H
M252Y/S254T/T256E
G385A/Q386P/N389S
H433K/N434F/Y436H
H433R/N434Y/Y436H
G385R/Q386T/P387R/N389P
M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H
M252Y/S254T/T256E/G385R /Q386T/P387R/N389P
(человеческий IgG1) усиливали связывание
(с FcRn мыши и человека) уменьшали
(у мыши) Dall'Acqua J. Immunol., 169 (2002) 5171-5180 M428L
T250Q/M428L
(человеческий IgG2) усиливали связывание
(с FcRn человека) увеличивали
(у макака) Hinton P.R., et al., J. Biol. Chem., 279 (2004) 6213-6216 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
(человеческий IgG) усиливали связывание
(с FcRn человека) увеличивали
(у мыши) Vaccaro C., et al., Nat. Biotechnol., 23 (2005) 1283-1288 T307A/E380A/N434A
(химерный IgG1) усиливали увеличивали у трансгенной мыши Pop L.M., et al., Int. Immuno-pharmacol., 5 (2005) 1279-1290 T250Q
E380A
M428L
N434A
K288A/N434A
E380A/N434A
T307A/E380A/N434A
(человеческий IgG1) усиливали связывание
(с FcRn человека) увеличивали у трансгенной мыши Petkova S.B., et al., Int. Immunol., 18 (2006) 1759-1769 I253A
(человеческий IgG1) ослабляли связывание
(с FcRn человека) уменьшали у трансгенной мыши Petkova S.B., et al., Int. Immunol., 18 (2006) 1759-1769 S239D/A330L/I332E
M252Y/S254T/T256E
(гуманизированный) усиливали связывание
(с FcRn человека и яванского макака) увеличивали у яванского макака Dall'Acqua W.F., et al., J. Biol. Chem., 281 (2006) 23514-23524 T250Q
M428L
T250Q/M428L
(человеческий IgG1) усиливали связывание
(с FcRn человека) увеличивали у макака-резус Hinton P.R., et al., J. Immunol., 176 (2006) 346-356 T250Q/M428L
P257I/Q311I
(гуманизированный IgG1) усиливали связывание
(с FcRn мыши и яванского макака) никакого изменения у яванского макака;
увеличивали у мыши Datta-Mannan A., et al., J. Biol. Chem., 282 (2007) 1709-1717 P257I/Q311I
P257I/N434H
D376V/N434H
(гуманизированный IgG1) усиливали связывание
при pH 6
(с FcRn человека, яванского макака, мыши) уменьшали у мышей;
P257I/N434H: уменьшали у яванского макака Datta-Mannan A., et al., Drug Metab. Dispos., 35 (2007) 86-94 аннулировали связывание с FcRn:
I253,
H310,
H433,
H435;
ослабляли связывание с FcRn:
Y436;
усиливали связывание с FcRn:
T250,
N252,
S254,
T256,
T307,
M428,
N434 усиливали и ослабляли снижение способности IgG связываться с FcRn уменьшало время его существования в сыворотке крови; взаимодействие FcRn-IgG с более высокой аффинностью пролонгировало полупериоды существования IgG- и Fc-связанных лекарственных средств в сыворотке крови Ropeenian D.C. and Akilesh S., Nat. Rev. Immunol., 7 (2007) 715-725 N434A
T307Q/N434A
T307Q/N434S
V308P/N434A
T307Q/E380A/N434A
(человеческий IgG1) усиливали связывание
(с FcRn яванского макака) увеличивали у яванского макака Yeung Y.A., et al., Cancer Res., 70 (2010) 3269-3277 256P
280K
339T
385H
428L
434W/Y/F/A/H
(человеческий IgG) усиливали при нейтральных pH WO 2011/122011

Обнаружено, что для существенного ослабления связывания с Fc-рецептором достаточно одной односторонней мутации в одном полипептиде Fc-области. Чем больше мутаций внесено в Fc-область, тем слабее становится связывание с FcRn. Однако, односторонних асимметричных мутаций не достаточно для полного ингибирования связывания с FcRn. Для полного ингибирования связывания с FcRn необходимы мутации, располагающиеся на обеих сторонах.

Таким образом, вариантная Fc-область класса IgG (человека) представляет собой гетеродимер, и в результате образования пары с участием первого полипептида Fc-области (тяжелой цепи) и второго полипептида Fc-области (тяжелой цепи) с получением функциональной Fc-области образуется гетеродимер.

Результаты симметричного конструирования Fc-области IgG1 с целью оказания влияния на связывание с FcRn показаны в следующей далее таблице (выравнивание мутаций и время удерживания на колонке для хроматографии на основе аффинности к FcRn).

Таблица

Мутации, влияющие на эффекторные функции Мутация 1, влияющая на связывание с FcRn Мутация 2, влияющая на связывание с FcRn Мутация 3, влияющая на связывание с с FcRn Время удержив. на колонке на основе аффинности к FcRn [мин] L234A/L235A/P329G --- --- --- 45,3 L234A/L235A/P329G I253A H310A H435A 2,3 L234A/L235A/P329G I253A --- --- 2,7 L234A/L235A/P329G --- H310A --- 2,4 L234A/L235A/P329G --- --- H435A 2,7 L234A/L235A/P329G I253A H310A --- 2,3 L234A/L235A/P329G I253A --- H435A 2,3 L234A/L235A/P329G --- H310A H435A 2,4 L234A/L235A/P329G --- H310A Y436A 2,3 L234A/L235A/P329G H310A H433A Y436A 2,4 L234A/L235A/P329G --- --- Y436A 41,3

Времена удерживания меньше 3 минут соответствуют отсутствию связывания, поскольку вещество находится в проходящем потоке (“проскоке”) (в пике, выходящем со “свободным” объемом).

Одиночная мутация H310A является “самой сильной” молчащей симметричной мутацией с точки зрения ликвидации любого связывания с FcRn.

Симметричные одиночные мутации I253A и H435A приводят к относительному смещению времени удерживания на 0,3-0,4 мин. В общем случае, это можно рассматривать как недетектируемое связывание.

Внесение одиночной мутации Y436A приводит к детектированию сильного взаимодействия с колонкой при хроматографии на основе аффинности к FcRn. Не вдаваясь в теоретические рассуждения, отметим, что эта мутация может оказать влияние на FcRn-опосредуемый полупериод существования, в отличие от случая отсутствия взаимодействия, как например, при внесении комбинации мутаций I253A, H310A и H435A (мутация IHH-AAA).

Результаты, полученные с использованием симметрично модифицированного антитела к HER2, приведены в следующей далее таблице (в качестве ссылки см. WO 2006/031370).

Таблица

Мутация Время удерживания
[мин] I253H отсутствие связывания M252D отсутствие связывания S254D отсутствие связывания R255D 41,4 M252H 43,6 K288E 45,2 L309H 45,5 E258H 45,6 T256H 46,0 K290H 46,2 D98E 46,2 дикий тип 46,3 K317H 46,3 Q311H 46,3 E430H 46,4 T307H 47,0 N434H 52,0

Fc-область в слитой конструкции на основе полипептидов Fc-области придает своему партнеру слияния описанные выше характеристики. Партнером слияния могут быть любые молекулы, обладающие биологической активностью, полупериод существования которых in vivo должен быть уменьшен или увеличен, т.е. полупериод существования которых in vivo должен быть четко определен и специально выбран для его предполагаемого применения.

Слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области могут содержать, например, вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке, и рецепторный белок, который связывается с мишенью, включая лиганд, такие как, например, слитая с TNFR конструкция на основе полипептидов Fc-области (TNFR означает рецептор фактора некроза опухоли человека), или слитая с IL-1R конструкция на основе полипептидов Fc-области (IL-1R означает рецептор интерлейкина-1 человека), или слитая с VEGFR конструкция на основе полипептидов Fc-области (VEGFR означает рецептор сосудистого эндотелиального ростового фактора человека), или слитые с ANG2R конструкции на основе полипептидов Fc-области (ANG2R означает рецептор 2 ангиопоэтина человека).

Слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области могут содержать, например, вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке, и фрагмент антитела, который связывается с мишенью, в том числе, такой как, например, Fab фрагмент антитела, scFγ фрагменты (см., например, Nat. Biotechnol., 23 (2005) 1126-1136) или однодоменные антитела (dAb) (см., например, WO 2004/058821, WO 2003/002609).

Слитые конструкции на основе полипептидов Fc-области могут содержать, например, вариантную Fc-область класса IgG (человека), описанную в данной заявке, и лиганд рецептора (или природный, или искусственный).

B. Иллюстративные Fc-области и антитела, содержащие эти Fc-области

Согласно одному из аспектов изобретения предложены Fc-области, обладающие модифицированными свойствами в отношении связывания с FcRn, т.е. эти Fc-области связываются с FcRn человека с более высокой или более низкой аффинностью, чем у Fc-области, не имеющей никаких мутаций, влияющих на связывание с FcRn.

Согласно одному из аспектов изобретения предложены выделенные антитела, обладающие модифицированными свойствами в отношении связывания с FcRn, т.е. эти антитела связываются с FcRn человека с более высокой или более низкой аффинностью, чем у антитела, не имеющего никаких мутаций, влияющих на связывание с FcRn.

Согласно одному из аспектов, описанных в данной заявке, предложено антитело, содержащее (вариантную) Fc-область, содержащую первый полипептид Fc-области и второй полипептид Fc-области,

при этом

a) первый полипептид Fc-области и второй полипептид Fc-области происходят из полипептида одной и той же Fc-области IgG человека, и

b) первый полипептид Fc-области модифицирован таким образом, что его аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности второго полипептида Fc-области по меньшей мере в одном соответствующем положении согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat, и второй полипептид Fc-области модифицирован таким образом, что его аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности первого полипептида Fc-области по меньшей мере в одном соответствующем положении согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat, в результате чего модифицированное положение в первом полипептиде Fc-области и модифицированное положение во втором полипептиде Fc-области отличаются, и

c) данная Fc-область имеет другую аффинность к Fc-рецептору человека по сравнению с Fc-областью, которая содержит в качестве первого и второго полипептида Fc-области полипептид Fc-области IgG человека по пункту (a) (т.е. которая имеет те же аминокислотные остатки, что и полипептид Fc-области IgG человека по пункту (a) в соответствующих положениях согласно системе нумерации EU-индекс по Kabat).