Тест-система для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности созданию для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа.

Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и включает в себя семь следующих сильно различающихся серотипов: O, А, Азия-1, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 [1]. При этом серотип А является разнообразным в антигенном отношении. Полные частицы вируса с коэффициентом седиментации 146S состоят из одноцепочечного позитивного генома в виде РНК и 60 копий каждого из четырех следующих структурных белков: VP₁ (1D-ген), VP₂ (1B-ген), VP₃ (1C-ген) и VP₄ (1A-ген) [2].

Для возбудителя ящура, который является представителем РНК-содержащих вирусов, вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время процесса репликации, а возникающие генотипы обусловлены мутациями и рекомбинацией. Огромному генетическому разнообразию ящура способствует подверженная ошибкам РНК-зависимая РНК-полимераза, внутривидовая и межтиповая рекомбинация, а также квазивидовая природа вируса [3-11].

Самым вариабельным белком вируса ящура является VP₁, на который приходится более 90% мутаций всех структурных генов. Наиболее высокая частота мутационных процессов отмечается для 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [12-16].

Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно наибольшее генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных прототипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов. Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура [17]. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, нового генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, представители которого стали распространяться на территории Восточной Африки и за ее пределами.

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Регионы РФ, граничащие с Китаем, Монголией, Азербайджаном и Грузией подвержены очень высокой степени риска заноса ящура [6].

В Российской Федерации вспышки ящура типа А регистрировались в 2013-2014 гг. На территории Забайкальского края и Амурской области был выявлен вирус ящура типа А, относящийся к генотипу А/ASIA/SEA-97. На территории Карачаево-Черкесской Республики и Краснодарского края вспышки ящура были вызваны вирусом, относящимся к генотипу А/ASIA/Iran-05^SIS-10 [6].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм А №550/Азербайджан/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А₂₂/Ирак 24/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А/Турция/06 (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм А №2166/Краснодарский/2013 (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм А №2155/Забайкальский/2013 (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII).

Изолят «A/IRN/2/2018» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Ирана в населенном пункте Керман (Kerman) 06.01.2018.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» при проведении научных исследований в 2022 г. получен штамм «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13).

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу ASIA, генетической линии Iran-05 сублинии SIS-13 вируса ящура серотипа А, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа А (фиг. 1).

Штамм вируса ящура «А/Иран/2018» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №379 - деп / 22-13 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «А/Иран/2018» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура, вызванного вирусом генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining [18]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (600 повторов), показан рядом с ветвями [19]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [20] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 32 нуклеотидной последовательности. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). Эволюционный анализ проводился с помощью программы MEGA [21].

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Азии, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны остаётся очень высокой. Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с появлением представителя данного генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма.

Возникла необходимость создания диагностической тест-системы для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа.

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [22-24]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями ВОЗЖ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция микронейтрализации считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 72 ч), 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием CO₂-инкубатора и другого оборудования, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.

В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [2]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. Особое внимание следует уделить жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

Robiolo B., La Torre J., Duffy S., Leon E., Seki C., Torres A., Mattion N. (2010) разработали способ определения титра антител против антигенов вируса ящура штаммов «A₂₄/Cruzeiro», «A/Argentina/01», «O1/Campos» и «C₃/Indaial» [25]. Против указанных представителей вируса достоверность определения уровня антител составляла не менее 95%, при этом данная тест-система позволяла выявлять антитела против штамма «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13) с диагностической чувствительностью не более 35% и специфичностью - не более 55%. Учитывая данные значения, актуально разработать тест-систему для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа.

Sharma G.K. и др. (2015) предложили тест-систему для выявления антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [26]. Данная методика позволяла идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 не более 38%, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов G не представляется возможным. Авторы тест-системы применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивало спектр выявления различных генотипов вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижалась специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13). Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве наборов для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются в качестве недоступных для широкого потребителя.

На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа A - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [27]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2018 года (период, когда появился производственный штамм «А/Иран/2018») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 ниже 40%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13.

На сегодняшний день с помощью жидкофазного блокирующего «сэндвич»-варианта ИФА с особенностями проведения реакции и определенным составом компонентов реакции разработаны «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации», «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации» и «Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА», «Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого сэндвич-варианта ИФА», «Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура А №2205/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» [29-33].

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа А [28].

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30×). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5×).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200×).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (TMB).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа А, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов типа А, кроме вновь появившихся, в частности A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа А. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP₁ вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 45%.

Исходя из этого, требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа с определенными особенностями в проведении анализа и компонентного состава.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма значительно отдалена от реакции микронейтрализации по возможностям улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.

Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе контрольных сывороток крови животных в жидком нативном виде, что не позволяет длительное время хранить данный компонент в составе тест-системы.

Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличие от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения анализа уровня гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими антиген вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, актуальной является разработка тест-системы для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа с учетом выше приведенных недостатков.

В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой, которая позволила бы с высокой достоверностью детектировать антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа.

Целью изобретения является создание тест-системы для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13;

4) контроль 1 (положительный контроль) – положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с процентом ингибиции 75-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) – положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с процентом ингибиции от 50,0% до 74,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) – сыворотка крови свиней, не содержащая антитела к структурным белкам вируса ящура;

7) блокирующий компонент (0,4%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина и 0,1%-ный раствор желатина в соотношении 1:1);

8) антивидовой иммунопероксидазный конъюгат – иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидаза хрена.

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,7), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат – ABTS, «стоп»-раствор – 0,6%-ный раствор кокосульфата калия SCS.

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции микронейтрализации в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13 находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13 в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки подвергают обработке с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13 и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа на основе применения антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 и при получении иммуноспецифических компонентов реакции.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 200 раз инактивированный вирус ящура штамма «А/Иран/2018», который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность количественно определять гуморальный иммунитет против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 54% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 5 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 составляет 1:4000.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против указанного штамма вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 5 лет с активностью не менее 1:13000 и 1:7000, соответственно.

Для контроля 1 активность составляет не менее 1:4000, для контроля 2 – не менее 1:4500. Данная активность удобна для получения большого объема контролей в рабочем нативном состоянии для непосредственного проведения ИФА.

В отличие от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям оптической плотности и титру антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Активность конъюгата составляет 1:5000.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена (структурных белков) вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13.

Наличие антител к вирусу ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против Ig G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного. Интенсивность окраски в результате реакции учитывают с помощью спектрофотометра.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 – Седиментационный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13.

Фиг. 2 – Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1 – фракция 146S компонента очищенного для иммунизации животных и получения антигена вируса данного штамма, М – маркер молекулярного веса.

Фиг. 3 – Филогенетическая принадлежность штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена, кодирующего белок VP₁ штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13 вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген (структурные белки) вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объёма деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,7.

Раствор №2 (Washing solution). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% tween-20 с водородным показателем 7,5-7,7. Рабочий раствор № 2 готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего раствора № 2 с добавлением 10% раствора блокирующего компонента (эмбриональная сыворотка телят).

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 представлены ниже.

1. Иммобилизация антител кролика против структурных белков вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 готовят в разведении 1:13000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 ч при температуре (2-8)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием раствора №2 дважды.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Параллельно с иммобилизацией планшета проводят серологическую реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови животных. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 11,0; 12,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:4096) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно табл. 1. Положительной сыворотка считается при уровне антител против структурных белков вируса ящура ≥ 5,0 log₂ SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови КРС/свиней против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 – процент ингибиции (PI) 75-100%, контроля 2 – положительную сыворотку крови КРС/свиней против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A A/ASIA/Iran-05^SIS-13 – PI = 50,0-74,9%, контроля 3 – нормальную сыворотку КРС/свиней – процент ингибиции < 50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-8)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые лунки иммобилизованного планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±0,2)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:7000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±0,2)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:5000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±0,2)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 20 минут при температуре (20±0,2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,6% раствора SCS.

12. Определение значения абсорбционности и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют значение абсорбционности (А) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 410 нм, используя спектрофотометр для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения А переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:

PI (%) = (1- (А_{сыворотки 410} - А_{КК 410})/(А_{КА 410} - А_{КК 410})) × 100,

где А_{сыворотки} – среднее значение абсорбционности смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13;

А_КА410 – среднее значение абсорбционности контроля антигена;

А_КК410 – среднее значение абсорбционности контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями А_КА410 и А_КК410 не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение PI >75,0%;

- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50,0-74,9%;

- контроль 3 имеет значение PI <50,0%.

Сыворотки крови, для которых значение PI≥50%, считают положительными, а животные, от которых они получены, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к структурным белкам вируса ящура «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 и выражают в log₂ SN₅₀.

В результате проведенных экспериментов были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:7000, сенсибилизирующих антител – 1:13000, антивидового конъюгата – 1:5000; антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 - 1:4000, контроля 1 – 1:4000, контроля 2 – 1:4500.

С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с количественным определением уровня гуморального иммунитета и проведен сравнительный анализ с результатами РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 11,0; 12,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:4096).

Для работы применяли инактивированный антиген вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Данный штамм в настоящее время применяют исключительно в РФ для разработки серологических тест-систем.

Контроль штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 вируса ящура на специфичность.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 вируса ящура, был выделен от крупного рогатого скота на территории Ирана в населенном пункте Керман (Kerman) в 2018 году. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «А/Иран/2018» к генотипу A/ASIA/Iran-05^SIS-13 (фиг. 1). Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «А/Иран/2018» составила 2,93±0,14 мкг/мл, концентрация 146S компонента – 1,99±0,09 мкг/мл (67,93±0,97%). Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «А/Иран/2018» вируса ящура для разработки диагностических тест-систем.

Морфологические признаки

Штамм «А/Иран/2018» вируса ящура серотипа А относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «А/Иран/2018» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена белка VP₁ штамма «А/Иран/2018» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «А/Иран/2018» вируса ящура принадлежит к генотипу A/ASIA/Iran-05^SIS-13.

Антигенное родство (r₁) штамма «А/Иран/2018» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «А №550/Азербайджан/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А₂₂/Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А №2166/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм «А №2155/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII)

в реакции микронейтрализации. Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства r₁ при изучении штамма «А/Иран/2018» составили от 0,04 до 0,23, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «А/Иран/2018» вируса ящура является РНК (+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один – 3D-РНК-зависимая РНК-полимераза, участвующая в репликации РНК для сборки новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «А/Иран/2018» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при pH 7,4-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность – реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность – патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность – вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность – сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018»

Для получения антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 11-12 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин при 6000 об/мин и 4±0,2°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 4000 Д (ПЭГ-4000) до конечной концентрации 8% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,9%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин, осадок растворяли в 1/15 М растворе фосфатно-солевого буферного раствора, концентрируя в 200 раз (1/200 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «А/Иран/2018». Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура штамма «А/Иран/2018» (структурные белки вируса ящура, данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных).

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 50, 40, 30, 20, и 10% (по направлению слоев в центрифужной пробирке снизу вверх). Суспензию антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» вносили по 15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 30000 об/мин и температуре 4±0,2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1,0 мл в отдельные пробирки. 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин и температуре 4±0,2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018» в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Проведен электрофорез фракции 146S компонента очищенного в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 3).

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018»

Для получения специфических сывороток крови против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма «А/Иран/2018», полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта DMIXVAC 406V (в соотношении адъювант/антиген = 50/50 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (4-8)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018»

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «А/Иран/2018», полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018», сенсибилизирующих и детекторных антител к структурным белкам

Образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в табл. 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:11000, 1:12000, 1:13000, 1:14000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена – 1:4000, для детекторных антител – 1:7000, конъюгата – 1:5000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Из табл. 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:13000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена – 1:4000, для сенсибилизирующих антител – 1:13000, конъюгата – 1:5000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Из табл. 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:7000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител – 1:7000, для сенсибилизирующих антител – 1:13000, конъюгата – 1:5000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Из табл. 4 следует, что при разведении антигена 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы. Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «А/Иран/2018», сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:4000, 1:13000, 1:7000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Определены значения уровня гуморального иммунитета с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции микронейтрализации (РМН) в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в табл. 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» с помощью жидкофазного иммуноферментного анализа (предлагаемое изобретение)

Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) по определению титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» с помощью жидкофазного иммуноферментного анализа исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 653 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Уровень антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 5,5-12,0 log₂ SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 653 образцов сывороток крови 651 определены в качестве положительных, а 2 – в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 421 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 421 отрицательных проб – 421 определены в качестве отрицательных. Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,67-99,91%, диагностическая специфичность (DSp) – 99,13-100,00%, k-критерий - 0,994; прогностичность положительного результата (PPV) – 99,44-100,00%, прогностичность отрицательного результата (NPV) – 97,84-99,77%, общая точность (DAc) – 98,87-99,96%.

Таким образом предлагаемая «Тест-система для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа» является специфичной и чувствительной, позволяющей провести анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Азии и соседних регионов. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа»:

1. Ijaz M., Ali M.M., Awan F., Ishaq M., Ahmad A. FMD virus spillover from domestic livestock caused outbreak in captive wild ungulates: First report from Pakistan. Acta Trop. 2022 Jul; 231: 106439. doi: 10.1016/j.actatropica.2022.106439. Epub 2022 Apr 1. PMID: 35378060.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. – Paris, 2022. – Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2012. – Т. 10. – С. 31-41.

4. Brooksby, J. B. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18: 1-23.

5. Woldemariyam F.T., Kariuki C.K., Kamau J., De Vleeschauwer A., De Clercq K., Lefebvre D.J., Paeshuyse J. Epidemiological Dynamics of Foot-and-Mouth Disease in the Horn of Africa: The Role of Virus Diversity and Animal Movement. Viruses. 2023 Apr 14; 15(4): 969. doi: 10.3390/v15040969. PMID: 37112947; PMCID: PMC10143177.

6. Grubman, M.J. 1980. The 5′ end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp. Arch. Virol. 63: 311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, C.M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J.I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91: 47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2007. – Т. 5. – С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong H.K., Ho K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. – 2020 Aug 21. – V.7. – P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson T., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. – 1992. – V. 228(4). – P. 1263-1268.

12. King, A.M., D. McCahon, K. Saunders, J.W. Newman, and W.R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C., D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson T., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP₀ cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

22. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. – 2007. – V. 25(20). – P. 4112-412.

23. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. – 1991. – V. 65(12). – P. 6572-6580.

24. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. – 2009. – V. 137(1-2). – P. 10-17.

25. Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Mohapatra J.K., Pattnaik B. Quantitative single dilution liquid phase blocking ELISA for sero-monitoring of foot-and-mouth disease in India. Biologicals. 2015 May; 43(3): 158-64.

26. Robiolo B., La Torre J., Duffy S., Leon E., Seki C., Torres A., Mattion N. Quantitative single serum-dilution liquid phase competitive blocking ELISA for the assessment of herd immunity and expected protection against foot-and-mouth disease virus in vaccinated cattle. J Virol Methods. 2010 Jun; 166(1-2): 21-7.

27. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis__Brocchi_.pdf (Дата обращения: 15.05.2023).

28. PrioCHECK ELISA. URL: http://vetprofilab.ru/f/priocheck_fmdv_antibody_elisa_kit_cut.pdf (Дата обращения: 14.05.2023).

29. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022108324.

30. Патент РФ №2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022119118.

31. Патент РФ №2796393, 23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022113420.

32. Патент РФ №2798510, 23.06.2023. Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура А №2205/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022122687 / Доронин М.И., Луговская Н.Н., Михалишин Д.В., Гочиурадов Ы.М., Борисов А.В., Воеводина М.Э.

33. Патент РФ №2804845, 09.10.2023. Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого сэндвич-варианта ИФА // Заявка № 2023112446 / Доронин М.И., Луговская Н.Н., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Разумова А.А., Шарыпов А.С., Оковытая Т.В.

Таблица 5

Корреляция результатов титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и в реакции микронейтрализации

№ п/п Характеристика пробы Титр антител, log₂SN₅₀ Степень корреляции, % в ИФА (предлагаемое изобретение) в РМН 1 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 14 ДПВ 6,0 6,0 100% 2 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 21 ДПВ 6,5 6,5 100% 3 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 28 ДПВ 8,5 8,5 100% 4 Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 14 ДПВ 7,0 7,0 100% 5 Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 21 ДПВ 8,5 8,5 100% 6 Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 28 ДПВ 8,5 8,5 100% 7 Сыворотка 3 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 14 ДПВ 5,5 5,5 100% 8 Сыворотка 4 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 28 ДПВ 9,0 9,0 100% 9 Сыворотка 5 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 21 ДПВ 7,0 7,0 100% 10 Сыворотка 6 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 21 ДПВ 7,5 7,5 100% 11 Сыворотка 7 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 42 ДПВ 11,5 11,5 100% 12 Сыворотка 8 КРС против ВЯ штамма «А/Иран/2018», 42 ДПВ 12,0 12,0 100% 13 КА ОП=1,111 - соответствует 14 КК ОП=0,039 - соответствует 15 К1 (PI>75%) PI = 94,77% - соответствует 16 К2 (50%<PI<75%) PI = 62,14% - соответствует 17 К3 (PI<50%) PI = 5,98% - соответствует Примечание: условие: ОП_КА – ОП_КК >0,400
КА – контроль антигена,
КК – контроль конъюгата,
К1 – положительный контроль 1,
К2 – положительный контроль 2,
К3 – отрицательный контроль 3,
ДПВ – день после вакцинации,
ИФА – иммуноферментный анализ,
ВЯ – вирус ящура,
РМН – реакция микронейтрализации.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ELISA FMD

SIS-13.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-10-27">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-27</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>550</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-27</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для определения

антител к структурным белкам вируса ящура генотипа

A/ASIA/Iran-05SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего

иммуноферментного анализа</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccaccgccggggagtcagcagaccctgttaccaccaccgttgaga

actacggcggtgaaacacaggtgcagcgacgtcaacacactgacgtcggtttcatcatggacaggtttgt

gaaaatcaaccctgtgagccccacgcacgtcatcgatctcatgcaaacgcaccagcacgcgctggtaggt

gcccttttgcgtgcagccacgtactacttctccgacttggagattgtggtgcgtcacgatggcaatttga

cgtgggtgcccaatggagcacctgaaggagccttggctaacacaagcaatcccactgcttaccacaggca

gccattcaccagacttgccctcccttacaccgcgccgcaccgagtgctggcaacagtgtacaacggggtg

aacaagtactccacaactagtgatagcagaaggggcgatctgggctctcttgcggcgcgagtcgccgcac

agctacccagttctttcaattttggtgcaatccgggccacgaccatccatgagcttctcgtgcgcatgaa

acgcgctgagctctattgccctaggcccctgctggcagtggaagtgttgtcttcggacagacacaaacaa

aagatcattgcccctgcaaaacagcttttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVGFIMDRFVKINPVSPTH

VIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPEGALANTSNPTAYHRQPFTRLALPY

TAPHRVLATVYNGVNKYSTTSDSRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRP

LLAVEVLSSDRHKQKIIAPAKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к тест-системе для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13. Указанное определение осуществляют с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа. Тест-система содержит иммуноспецифические лиофилизированные компоненты, в том числе антиген вирус ящура штамма «А/Иран/2018», сенсибилизирующие антитела и детекторные антитела, а также неспецифические компоненты. Настоящее изобретение обеспечивает специфическую против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/ Iran-05^SIS-13 и чувствительную тест-систему, предназначенную для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Тест-система для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные компоненты: антиген вирус ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, лиофилизированный с активностью в ИФА 1:4000; сенсибилизирующие антитела – иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, лиофилизированные с активностью в ИФА 1:13000; детекторные антитела – иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, лиофилизированные с активностью в ИФА 1:7000; контроль 1 – положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, лиофилизированная с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 – положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13, лиофилизированная с процентом ингибиции от 50% до 74,9%; контроль 3 – отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура; блокирующий компонент, состоящий из 0,4%-ного бычьего сывороточного альбумина и 0,1%-ного желатина, взятых в соотношении 1:1; антивидовой иммунопероксидазный конъюгат – иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:5000;

- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,7; 20-кратный концентрат буферного раствора; хромогенный субстрат – ABTS, «стоп»-раствор – 0,6%-ный раствор кокосульфата калия SCS.

2. Тест-система по п. 1, являющаяся специфичной и чувствительной и позволяющая определять титр антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Иран/2018» генотипа A/ASIA/Iran-05^SIS-13 с количественным показателем уровня гуморального иммунитета в широком диапазоне от 4,0 до 12,0 log₂ SN₅₀.