Способ моделирования нарушений гемостаза при сочетанном поражении легких бактериальным воспалением и тромбозом легочных сосудов Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к области воспроизведения болезней человека в эксперименте, и может быть использовано для моделирования нарушений коагуляционного звена системы гемостаза в условиях бактериального воспаления и тромбоза легких.

Одним из наиболее распространенных осложнений при воспалениях легких разного генеза является нарушение в системе гемостаза. Так помимо иммунных причин повреждения легких у пациентов с атипичными пневмониями, свой вклад вносит и синдром микрососудистого повреждения, связанный с активацией путей комплемента и ассоциированным прокоагулянтным состоянием [1]. Выявлено, что новая короновирусная инфекция COVID-19 может предрасполагать пациентов к тромботической болезни, как в венозном, так и в артериальном кровообращении, из-за чрезмерного воспаления, активации тромбоцитов, эндотелиальной дисфункции и циркуляторного стаза [3]. Таким образом, наряду с концепцией первичного поражения альвеолярно-бронхиального аппарата, спровоцированного вирусной или бактериальной инфекцией и гипериммунным ответом, весьма перспективной является и гипотеза вторичного легочного повреждения, обусловленного нарушениями микроциркуляторного русла и дисфункцией сосудистого эндотелия.

Известен способ моделирования тромбообразования у подопытных животных [Патент РФ №2570162, опубл. 10.12.2015], характеризующийся тем, что для стимуляции тромбообразования у наркотизированного животного выделяют сонную артерию и яремную вену. Затем под сонную артерию помещают изолирующий ее от окружающих тканей материал, а в яремную вену вводят препарат антикоагулянта или контрольного раствора. После этого сонную артерию приводят в соприкосновение с тонкой стальной иглой, которая сообщается с источником постоянного тока с напряжением 3 В. При этом второй электрод размещают подкожно в область бедра животного и пропускают через него ток силой 200-250 микроампер в течение одной минуты. Анализ результатов оценивают по проводимой под микроскопом видеосъемке, посредством компьютерной программы для определения размера образовавшегося тромба.

Недостатком данного способ является то, что он не подходит для моделирования тромбоэмболии легких в условиях их бактериального воспаления. Способ моделирования тромбообразования включает в себя проведение хирургических манипуляций с животными, что предполагает владение определенными навыками и использование дорогостоящего оборудования, что значительно усложняет способ.

Известен способ моделирования, при котором у мышей линии C57BL/6 перекрывают кровоток в нижней полой вене под левой почечной веной путем наложения лигатуры. Перевязывают все боковые и задние притоки нижней полой вены до места слияния подвздошных вен таким образом, что нижняя полая вена оказывается оголенной. Окклюзию сохраняют до 48 часов для достижения тромбоза легочной артерии.

Данный метод предполагает инвазивное хирургическое вмешательство, что требует определенных навыков, а так же моделирует только тромбоэмболии легочной артерии и ее мелких ветвей, наш же способ предполагает нарушение гемостаза при тромбозе легочных сосудов на фоне бактериального воспаления.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.

Задачей решаемой настоящим изобретением является создание способа моделиривания нарушений гемостаза при сочетанном поражении легких бактериальным воспалением и тромбозом легочных сосудов, позволяющего в дальнейшем использовать данную модель для изучения возможности фармакологической коррекции нарушений свертывающей системы крови.

Поставленная задача решается путем введения самцам и самкам аутбредных крыс следующей комбинации препаратов: интратрахеально липополисахарида E.coli («Sigma-Aldrich» далее ЛПС) в дозе 0,5 мг/кг и после применения ЛПС E.coli через 1 час внутривенным введением 3% раствора тромбопластина («Технология стандарт»). На 7 сутки после введения препаратов осуществляют взятие крови, для анализа показателей активности коагуляционного звена гемостаза и легких для гистологического исследования.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что для постановки модели используется сочетанное введение ЛПС E.coli в дозе 0,5 мг/кг и 3% раствора тромбопластина самцам и самкам аутбредных крыс.

Новые признаки проявили в заявляемой совокупности свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно - медицинской литературе.

Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован для изучения возможности фармакологической коррекции нарушений свертывающей системы крови, при комплексном влиянии тромбоза легочных сосудов (а также венозных сосудов организма) и бактериального воспаления.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур.

В условиях общей анестезии (внутрибрюшинно: ксилазин 0,3 мл/кг «Interchemiewerken», Нидерланды и золетил 0,2 мл/кг ВИРБАК, Франция) самцам и самкам аутбредных крыс вводят комбинацию препаратов: интратрахеально ЛПС в дозе 0,5 мг/кг и через 1 час после применения ЛПС E.coli внутривенно 3% раствор тромбопластина в объеме 0,3 мл. Затем на 7 сутки осуществляют забор крови для анализа показателей коагуляционного звена гемостаза и легких для гистологического исследования.

Способ осуществляют следующим образом. В условиях общей анестезии (внутрибрюшинно: ксилазин 0,3 мл/кг и золетил 0,2 мл/кг) самцам и самкам аутбредных крыс вводят комбинацию препаратов ЛПС E.coli и раствора тромбопластина в схеме описанной выше, затем на 7 сутки осуществляют забор крови и легких. Для гистологического исследования, легкие фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологические препараты изготавливают по стандартной методике, срезы окрашивают гематоксилином и эозином [2]. Забор крови осуществляют путем пункции сердца, в пластиковые пробирки с добавлением в качестве стабилизатора крови 3,8%-го раствора цитрата натрия в соотношении 9:1. Кровь центрифугируют для получения плазмы в течение 15 минут на 3000 об/мин. Далее осуществляют анализ показателей активности коагуляционного звена - активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПВ), концентрация фибриногена, активность антитромбина III (AT III) на полуавтоматическом коагулометре Helena С-4 (Helena Biosciences Europe, Великобритания) с использованием реактивов производства «Технология-Стандарт» (г. Барнаул, Россия).

Достигаемый технический результат заключается в том, что сочетанное введение ЛПС E.coli и раствора тромбопластина приводит к поражению легких, что в свою очередь вызывает значимые изменения в системе гемостаза крови, которые свидетельствуют о сдвиге его параметров в сторону тромбообразования.

Пример

При проведении экспериментов аутбредные крысы были распределены по группам:

1. Контроль самки - аутбредные крысы самки, которым внутривенно вводили физиологический раствор по 0,3 мл.

2. ЛПС+тромбопластин (ЛПС+Т/п) самки - аутбредные крысы самки, которым интратрахеально вводили ЛПС E.coli в дозе 0,5 мг/кг, затем через 1 час внутривенно вводили 3% раствор тромбопластина в объеме 0,3 мл.

3. Контроль самцы - аутбредные крысы самцы, которым внутривенно вводили физиологический раствор по 0,3 мл.

4. ЛПС+тромбопластин (ЛПС+Т/п) самцы - аутбредные крысы самцы, которым интратрахеально вводили ЛПС E.coli в дозе 0,5 мг/кг, затем через 1 час внутривенно вводили 3% раствор тромбопластина в объеме 0,3 мл.

Забор крови для исследования осуществляют в пластиковые пробирки путем пункции сердца. В качестве стабилизатора крови используют 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Кровь центрифугируют для получения плазмы в течение 15 минут на 3000 об/мин.

Исследование показателей системы коагуляционного гемостаза выполняют на поуавтоматическом коагулометре Helena С-4 (Helena Biosciences Europe, Великобритания) с использованием реактивов «Технология-Стандарт» (г.Барнаул, Россия). Показателями активности коагуляционного звена системы гемостаза являются: активированное парциальное тромбопластиновое время, протромбиновое время, международное нормализованное отношение, концентрация фибриногена.

Статистическую обработку полученных результатов проводят с использованием пакета программ StatPlus версии 7.6.5. Межгрупповые различия оценивают с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия определяют при 0,05% уровне достоверности и отражаются значком *.

Для гистологического исследования легкие фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологические препараты изготавливают по стандартной методике, срезы окрашивают гематоксилином и эозином.

На фигуре 1 изображен срез легкого контрольных животных. На фигуре 2 изображен срез легкого с многочисленными тромбами в сосудах легких, отеком, очаговыми кровоизлияниями и инфильтрацией межальвеолярных прослоек лимфоцитами, макрофагами и нейтрофилами. Гистологическая картина поражения легких у самцов и самок не различалась.

В эксперименте на крысах самцах и самках показано, что при применении препаратов в заданной комбинации на 7-е сутки исследования отмечалось снижение протромбинового времени (на 12% и 17% Р<0,05 соответственно), АПТВ (на 16% и 20% Р<0,05 соответственно) и активности ATIII (на 40% и 33% Р<0,05 соответственно), повышение содержания фибриногена (на 88% и 182% Р<0,05 соответственно).

Способ обеспечивает приближенную к клиническим условиям картину тромбообразования при воспроизведении нарушений системы гемостаза вследствие поражения легких тромбозом легочных сосудов на фоне бактериального воспаления легких, и может быть использовано для моделирования и коррекции патологических состояний системы гемостаза.

Список литературы

1. Военнов О.В. Механизмы развития легочного повреждения у пациентов с новой коронавирусной инфекцией (обзор литературы)/ Военнов О.В., Загреков В.И., Бояринов Γ.А. и др. // Медицинский альманах. - 2020. - Т. 64. - №3. - С. 15-26.

2. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Медицина, Ленинградское отделение, 1969. 422 с.

3. Bikdeli В., Global COVID-19 Thrombosis / Bikdeli В., Madhavan M.V., Jimenez D., et all, Collaborative Group, Endorsed by the ISTH, NATF, ESVM, and the IUA, Supported by the ESC Working Group on Pulmonary Circulation and Right Ventricular Function. J Am Coll Cardiol 2020; 75(23): 2950-2973, https://doi.org/10.1016/i.iacc.2020.04.031.

4. Патент РФ №2570162, опубл. 10.12.2015.

5. Патент РФ №2770355, опубл. 15.04.2022.

Изобретение относится к области медицины, а именно к области воспроизведения болезней человека в эксперименте, и может быть использовано для моделирования нарушений коагуляционного звена системы гемостаза в условиях бактериального воспаления и тромбоза легких. Для этого самцам и самкам аутбредных крыс вводят липополисахарид E. coli интратрахеально в дозе 0,5 мг/кг. Затем через час внутривенно вводят 3% раствор тромбопластина в объеме 0,3 мл. На 7 сутки после введения препаратов забирают кровь и анализируют показатели активности коагуляционного звена гемостаза. Изобретение обеспечивает приближенную к клиническим условиям картину нарушения системы гемостаза при повреждении легких в результате тромбоза легочных сосудов на фоне бактериального воспаления. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования нарушений гемостаза при сочетанном поражении легких бактериальным воспалением и тромбозом легочных сосудов, характеризующийся тем, что самцам и самкам аутбредных крыс вводят липополисахарид E. coli интратрахеально в дозе 0,5 мг/кг, затем через час внутривенно вводят 3% раствор тромбопластина в объеме 0,3 мл и на 7 сутки после введения препаратов забирают кровь и анализируют показатели активности коагуляционного звена гемостаза.