СПОСОБ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ В ТКАНЯХ ОРГАНОВ СВИНЕЙ И НА МАЗКАХ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕПРЯМОЙ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ НА ОСНОВАНИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/49 A61K39/395 C12Q1/68 G01N33/53 

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и патологии, может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и ветеринарных лабораториях для иммунофенотипирования лейкоцитов в гистологических срезах органов и мазках крови путем выявления дифференцировочных антигенов лейкоцитов свиньи при иммуногистохимическом исследовании, основанном на применении моноклональных антител.

Уровень техники

Иммунофенотипирование позволяет идентифицировать, а также определить относительное и абсолютное количество лейкоцитов при помощи детекции метки моноклональных антител специфичных к CD-антигенам экспрессируемым на поверхности клеток определенной субпопуляции или стадии развития. Благодаря обнаружению уникальных поверхностных антигенов лейкоцитов можно определить их тип и функциональные характеристики [Хайдуков С.В., Байдун Л.В., Зурочка А.В., Арег А.Т. Стандартизованная технология "Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов". Российский иммунологический журнал. - Т. 8(17). - №4. - 2014. - С. 974-992].

Для иммунофенотипирования лейкоцитов в тканях и органах используют иммуногистохимическое исследование, основанное на применении моноклональных антител специфичных к поверхностным CD-антигенам (маркерам), позволяющее дифференцировать разные типы лейкоцитов, определить их относительное количество в тканях, а также оценить процессы гистогенеза в иммунных органах, что важно для изучения патогенеза и иммунного ответа при инфекционных заболеваниях.

В качестве прототипа для разработки использовали данные зарубежных коллег из публикации Harry D. Dawson и Joan K. Lunney в сатье Porcine cluster of differentiation (CD) markers 2018 update из журнала Research in Veterinary ScienceVolume 118, страницы с 199 по 246, а также из статьи Membrane markers of the immune cells in swine: an update, авторов Piriou-Guzylack L., Salmon H, в журнале Veterinary Research, BioMed Central, 2008 года в номере 39 (6), страницы 1-28.

Согласно методикам реакции, описанным выше, коллеги использовали непрямую иммуногистохимическую реакцию, с использованием как моноклональных, так и поликлональных антител в поточном цитометре для иммуногистохимической реакции. Такой способ подразумевает использование свежей крови и исследование проводится на форменных элементах крови в жидком состоянии. Кроме этого в публикации описывается применение непрямой ИГХ реакции на гистологических срезах органов свиней с применением первичных антител специфичных к CD маркерам как человека, так и свиньи, что подтверждает возможность применения антител к CD маркерам человека в реакции на CD маркерах свиньи.

Технической проблемой является необходимость разработки доступного способа иммунофенотипирования лейкоцитов с помощью иммуногистохимической реакции для выявления CD-антигенов лейкоцитов в тканях и органах, а также мазках крови свиней, легко выполнимого в условиях гистологических и иммунологических ветеринарных лабораторий с использованием недорогих расходных материалов и позволяющего расширить возможности иммунологических патоморфологических исследований в ветеринарной медицине.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является определение поверхностных CD-маркеров лейкоцитов в срезах органов и мазках крови свиней с целью расширения знаний об иммунологических процессах в организме здоровых и инфицированных животных.

Данный способ позволяет определить иммунофенотип клеток и их относительное количество, а также оценить гистогенез и распределение по структурным единицам органов. Использование данного способа важно для иммунологических и патоморфологических исследований, так как способствует изучению патогенеза и иммунного ответа в организме больных свиней.

Предложенный способ заключается в следующем:

Для выполнения непрямой иммуногистохимической реакции на нативных гистологических срезах органов, а также мазках крови свиней необходимы антитела специфичные к CD-маркерам лейкоцитов, которые на данный момент отсутствуют в России. Анализируя иностранную литературу было установлено, что перекрестная реактивность антител к некоторым CD-маркерам лейкоцитов человека позволяет им связываться с гомологичными CD-антигенами на поверхности лейкоцитов свиней [Piriou-Guzylack L., Salmon Н. Membrane markers of the immune cells in swine: an update. Veterinary Research, BioMed Central. - 2008. - 39 (6). - P. 1-28; Harry D. Dawson и Joan K.Lunney. Porcine cluster of differentiation (CD) markers 2018 update. Research in Veterinary Science. - 2018. - Vol. 118. - P 199-246]. Учитывая возможность перекрестной реактивности антител, для иммунофенотипирования лейкоцитов свиней непрямой иммуногистохимической реакцией использовали антитела к CD-антигенам лейкоцитов человека. Первичные моноклональные антитела мыши специфичные к маркерам CD3, CD14 и CD20 лейкоцитов человека были произведены отечественной фирмой ООО «Сорбент» (ТУ 9398-331-13180653-02 Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09339). Вторичные антитела осла против антител мыши произведены компанией SIGMA-Aldrich (США).

Выполнение непрямой иммуногистохимической реакции с антителами к CD-маркерам лейкоцитов на мазках крови и гистологических срезов органов:

Для исследования мазков крови. Для исследования отбирают образцы крови. Кровь из подключичной вены свиней набирают в вакуумные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА и доставляют в лабораторию, где затем готовят мазки крови по стандартной методике. Перед началом исследования высушенные мазки фиксируют в изопропиловом спирте в течение 20 минут при комнатной температуре.

Для исследования органов. Нативный патологический материал охлаждают в холодильной камере при температуре 4°С - 6 часов. Транспортировку проб выполняют в сумке-холодильнике с хладоэлементами для поддержания температуры 2-4°С во время перевозки. Для длительного хранения пробы помещают в низкотемпературную камеру с температурным режимом -70°С. Перед использованием патологический материал размораживают. Затем из размороженных органов иссекают образцы размером 1,0×2,0×0,5 см. Иссеченные образцы фиксируют на столиках для криотомии, заполняя область между тканью и столиком криогелем. Столики с образцами помещают в камеру на 40-60 минут криотома при температуре -34°С. Готовый блок нарезают на срезы толщиной 10 мкм и наклеивают на поляризированные стекла. Подсушенные стекла обрабатывают смесью изопропилового спирта (70 мл) и 0,9% физиологического раствора (30 мл) в течение 60 минут при температуре 4°С.

Далее реакция идентична как для мазков крови, так и для срезов органов. После предварительной обработки срезы/мазки крови сушат в потоке воздуха - 40 минут. Высушенные срезы/мазки крови трижды промывают в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,2 по 5 минут в каждой порции при комнатной температуре. Для удаления эндогенной пероксидазы на срезы/мазки крови наносят 250 мкл 3% раствора перекиси водорода на 40 минут при комнатной температуре. Далее срезы/мазки крови ополаскивают в ФСБ рН 7,2-3 раза по 5 минут (комнатная температура). Затем готовят блокирующий 5% раствор БСА на ФСБ рН 7,2 из расчета 200 мкл на одно стекло и инкубируют в термостате 40 минут при температуре 37°С. После срезы/мазки крови промывают трижды в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Пока идет процесс ополаскивания, готовят рабочий раствор первичных моноклональных антител (AT) специфичных к CD маркерам лейкоцитов. Для каждого вида AT готовят индивидуальный раствор, вносят AT в ФСБ рН 7,2. Разведение антител составляет 1:100. Готовый раствор антител наносят по 200 мкл на срез/мазок крови, при этом нельзя допускать смешивания разных растворов AT, поэтому для каждого вида AT используют индивидуальное стекло. Стекла с нанесенными AT помещают в термостат при температуре 37°С в условиях влажной камеры на 120 минут. Затем срезы/мазки крови трижды промывают в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Далее готовят рабочий раствор вторичных AT меченных пероксидазой хрена. Разведение вторичных AT составляет 1:100. Для этого AT добавляют в смесь ФСБ рН 7,2 и 5% БСА. Готовый раствор наносят на срезы/мазки крови и инкубируют в термостате при температуре 37°С в условиях влажной камеры - 90 минут. Затем срезы/мазки крови ополаскивают в 3 порциях ФСБ рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. После готовят рабочий раствор субстрата на Na-ацетатном буфере для специфического окрашивания пероксидазной метки. Рабочий раствор готовят из маточного непосредственно перед применением. Состав маточного раствора хромогена: 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворенный в 3 мл N,N-диметилформамида. Рабочий раствор готовят на Na-ацетатном буфере рН 5,0-5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода. Готовый раствор наносят на срезы/мазки крови по 200 мкл и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Далее срезы/мазки крови промывают трижды в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Затем на срезы/мазки крови наносят гематоксилин Майера на 5 минут для визуализации структурных элементов ткани. Окрашенные гематоксилином срезы/мазки крови ополаскивают в дистиллированной воде 3 раза по 5 минут, наносят монтирующую среду и закрывают покровным стеклом.

Предложенный способ применим для иммунофенотипирования лейкоцитов непрямой иммуногистохимической реакцией на мазках крови и нативных срезах органов свиней с использованием моноклональных антител специфичных к CD3, CD14, CD20 маркерам лейкоцитов человека и вторичных антител, меченных пероксидазой хрена. Обнаружение CD-антигенов лейкоцитов происходит на поверхности клеток путем образования комплекса антиген-антитело и его визуализации окрашиванием пероксидазной метки в красно-коричневый цвет. Окрашенные метки хорошо видны в микроскопе как в препаратах с дополнительным окрашиванием гематоксилином Майера, так и без дополнительного окрашивания. В дополнительно окрашенных гематоксилином Майера срезах/мазках крови ядра клеток приобретают синюю окраску, тогда как выявленные непрямым иммуногистохимическим способом CD-антигены определяют на поверхности лейкоцитов по скоплению конгломератов хромогена красно-коричневого цвета.

Данный способ обладает специфичностью и чувствительностью к CD-антигенам лейкоцитов в тканях и органах свиней и позволяет осуществить подсчет клеток, а также определить их иммунофенотип, что важно для понимания механизма патогенеза и иммунного ответа в организме больных животных.

Сектор патоморфологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН успешно апробировал вышеуказанный способ иммунофенотипирования лейкоцитов непрямой иммуногистохимической реакцией в тканях и органах свиней, а также мазках крови в научной и практической деятельности. Основываясь на результатах испытаний, предложенный способ исследования может быть рекомендован для применения в ветеринарных лабораториях и научно-исследовательских институтах.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:

Пример №1 «Исследование на мазках крови»

От 10 свиней были отобраны образцы крови. Отбор крови осуществляли из подключичной вены в вакуумные пробирки с ЭДТА. Отобранные пробы доставлялись в лабораторию не позднее 8 часов с момента отбора. Температура при транспортировке была в пределах 18-24°С. Срок хранения пробы 24 часа. В лаборатории из крови готовили мазки согласно стандартной методике. Высушенные мазки крови фиксировали в изопропиловом спирте - 20 минут. Затем мазки сушили под проточным воздухом - 40 минут при комнатной температуре. Высушенные мазки трижды ополаскивали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Для удаления эндогенной пероксидазы на мазки наносили 3% раствор перекиси водорода на 40 минут при комнатной температуре. После мазки полоскали в 3 порциях ФСБ рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем готовили блокирующий 5% раствор БСА на ФСБ рН 7,2 и наносили на мазки в количестве 250 мкл. Мазки с раствором помещали в термостат при температуре 37°С на 40 минут. После мазки трижды промывали в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Далее готовили раствор первичных моноклональных антител (AT) мыши специфичных к CD маркерам лейкоцитов. Для исследования были выбраны маркеры CD3, CD14 и CD20. Раствор для каждого вида AT готовили отдельно в разведении 1:100 (1 часть антител к 100 частям ФСБ). Для этого нужное количество AT добавляли в ФСБ рН 7,2. Поскольку AT к разным CD маркерам не должны смешиваться между собой, каждому виду антител соответствовало индивидуальное стекло с мазком. На мазки наносили по 300 мкл первичных AT, создавали условия влажной камеры и помещали в термостат на 120 минут при 37°С. Далее мазки 3 раза промывали в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Затем готовили рабочий раствор вторичных AT, меченных пероксидазой хрена в разведении 1:100 (1 часть антител к 100 частям ФСБ с 5% БСА). Раствор делали в ФСБ рН 7,2 с добавлением 5% БСА. Готовый раствор наносили на мазки в количестве 300 мкл и помещали в термостат в условиях влажной камеры при температуре 37°С на 90 минут. После мазки трижды полоскали в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Затем готовили рабочий раствор субстрата на Na-ацетатном буфере для окрашивания пероксидазной метки. Рабочий раствор готовили из маточного перед применением. Состав маточного раствора хромогена: 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворенный в 3 мл N,N-диметилформамида. Рабочий раствор готовили на Na-ацетатном буфере рН 5,0-5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода. Готовый раствор наносили на мазки по 300 мкл, время экспозиции - 10 минут при комнатной температуре. Далее мазки ополаскивали трижды в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Затем на мазки наносили гематоксилин Майера на 5 минут для визуализации ядер клеток. Окрашенные гематоксилином мазки полоскали в дистиллированной воде, наносили монтирующую среду и закрывали покровным стеклом.

Положительный результат иммуногистохимической реакции на маркер CD3 представлен на фигуре 1, хромоген, окрашенный в красно-коричневый цвет, сконцентрирован на поверхности зрелых Т-лимфоцитов свиней. На фигуре 2 для сравнения показан результат иммуногистохимической реакции на маркер CD3 в мазках крови человека, где хромоген, также расположен на поверхности зрелых Т-лимфоцитов.

На фигуре 3 продемонстрирован положительный результат реакции на маркер CD14, что позволило иммунофенотипировать моноциты в мазках крови.

Положительный результат иммуногистохимической реакции на маркер CD20 представлен на фигуре 4, где окрашенные хромогеном клетки являются зрелыми В-лимфоцитами.

Пример №2 «Исследование на гистологических срезах»

От 25 павших свиней отбирали бронхиальные лимфатические узлы. Пробы охлаждали в камере холодильника при температуре 4°С в течение 6 часов. После патологический материал помещали в сумку холодильник с хладоэлементами и перевозили в лабораторию при температуре 2-4°С. Из охлажденных проб отбирали образцы 1,0×1,0×0,5 см. Иссеченные участки органов фиксировали на столиках для криотомии, заполняя область между столиком и тканью специальным криогелем. Затем сформированные криогелем блоки помещали в камеру криотома при температуре -34°С на 40-60 минут. Из готового блока нарезали срезы толщиной 10 мкм и наклеивали на поляризированные стекла. Подсушенные стекла со срезами обрабатывали смесью изопропилового спирта 30 мл и физиологического раствора 70 мл в течение 60 минут при температуре +4°С. После обработки срезы 40 минут сушили в потоке воздуха. Сухие срезы ополаскивали в 3 порциях фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем на срезы наносили 3% раствор перекиси водорода по 300 мкл на 40 минут при комнатной температуре. После трижды ополаскивали срезы в ФСБ рН 7,2 по 5 минут при комнатной температуре. Далее готовили блокирующий 5% БСА на ФСБ рН 7,2 из расчета 200 мкл на одно стекло и инкубировали в термостате в течение 40 минут при температуре 37°С. После срезы промывали в 3 порциях ФСБ рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Параллельно готовили рабочий раствор первичных антител (AT) специфичных к CD маркерам лейкоцитов. Для этого к AT добавляли ФСБ рН 7,2 в разведении 1:100 (1 часть антител к 100 частям ФСБ). Готовый раствор наносили на срезы (индивидуальные стекла), не допуская смешивания разных видов антител, создавали условия влажной камеры и помещали в термостат на 120 минут при температуре 37°С. Далее срезы полоскали в 3 порциях ФСБ рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Следом готовили рабочий раствор вторичных AT, меченных пероксидазой хрена. Раствор AT делали в ФСБ рН 7,2 с добавлением 5% БСА. Разведение вторичных AT составляет 1:100 (1 часть антител к 100 частям ФСБ с 5% БСА). На срезы наносили по 200 мкл готового раствора, создавали условия влажной камеры и помещали в термостат при температуре 37°С на 90 минут. Затем срезы трижды промывали ФСБ рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. После готовили рабочий раствор субстрата на Na-ацетатном буфере для окрашивания пероксидазной метки. Рабочий раствор делали из маточного непосредственно перед применением. Для получения маточного раствора хромогена 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворяли в 3 мл N,N-диметилформамида. Рабочий раствор готовили на Na-ацетатном буфере рН 5,0 - 5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода. Готовый раствор наносили на срезы по 200 мкл на 10 минут при комнатной температуре. Далее срезы ополаскивали в 3 порциях ФСБ рН 7,2 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем на срезы наносили гематоксилин Майера на 5 минут для визуализации структурных элементов ткани. Окрашенные гематоксилином срезы промывали в дистиллированной воде, наносили монтирующую среду и закрывали покровным стеклом.

Положительный результат иммуногистохимической реакции с антителами к маркеру CD3 в тканях бронхиального лимфатического узла свиньи представлен на фигуре 5, где на поверхности зрелых Т-лимфоцитов визуализируются скопления хромогена красно-коричневого цвета.

Фигура 6 демонстрирует срез бронхиального лимфатического узла свиньи с иммуногистохимической реакцией с антителами к маркеру CD 14, где конгломераты хромогена выявлены на поверхности макрофагов.

Результат иммуногистохимической реакции с антителами к CD20 маркеру В-лимфоцитов в срезе бронхиального лимфатического узла свиньи показан на фигуре 7, хромоген красно-коричневой окраски сконцентрирован на поверхности восприимчивых клеток.

Краткое описание чертежей (графических материалов)

Фиг. 1 - Мазок крови свиньи. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD3 на поверхности зрелых Т-лимфоцитов. Зрелый Т-лимфоцит с наличием рецептора CD3 на поверхности клетки, красно-коричневое окрашивание цитоплазмы. Дополнительное окрашивание ядер клеток гематоксилином Майера. Ув. 630х.

Фиг. 2 - Мазок крови человека. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD3 на поверхности зрелых Т-лимфоцитов. Зрелый Т-лимфоцит с наличием рецептора CD3 на поверхности клетки, красно-коричневое окрашивание цитоплазмы. Дополнительное окрашивание ядер клеток гематоксилином Майера. Ув. 630х.

Фиг. 3 - Мазок крови свиньи. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD14 на поверхности моноцитов. Моноцит с рецептором CD14 на поверхности клетки, красно-коричневое окрашивание цитоплазмы. Дополнительное окрашивание ядер клеток гематоксилином Майера. Ув. 400х.

Фиг. 4 - Мазок крови свиньи. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD20 на поверхности зрелых В-лимфоцитов. Зрелые В-лимфоциты с рецептором CD20 на поверхности клетки, красно-коричневое окрашивание цитоплазмы. Дополнительное окрашивание ядер клеток гематоксилином Майера. Ув. 630х.

Фиг. 5 - Бронхиальный лимфатический узел. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD3 с образованием конгломератов хромогена (коричневого цвета) на поверхности зрелых Т-лимфоцитов. С докраской гематоксилином Майера. Ув. 200х.

Фиг. 6 - Бронхиальный лимфатический узел. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD 14 с образованием конгломератов хромогена (коричневого цвета) на поверхности макрофагов. С докраской гематоксилином Майера. Ув. 200х.

Фиг. 7 - Бронхиальный лимфатический узел. Результат ИГХА с антителами к маркеру CD20 с образованием конгломератов хромогена (коричневого цвета) на поверхности зрелых В-лимфоцитов. С докраской гематоксилином Майера. Ув. 200х.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и ветеринарных лабораториях для иммунофенотипирования лейкоцитов в мазках крови и срезах органов свиней с целью выявления CD-антигенов на поверхности лейкоцитов при иммуногистохимическом исследовании на основе моноклональных антител. Изобретение представляет собой способ иммунофенотипирования лейкоцитов с помощью непрямой иммуногистохимической реакции, основанный на применении моноклональных антител, при котором исследуются мазки крови и органы свиней, с целью определения различных поверхностных антигенных маркеров клеток, используя моноклональные антитела мыши специфичные к CD 3, CD 20, CD 14 - маркерам лейкоцитов человека и вторичные антитела осла специфичные к Ig мыши, меченные пероксидазой хрена с последующим окрашиванием метки и выявлением конгломератов хромогена красно-коричневого цвета в качестве положительного результата. 7 ил., 2 пр.

Способ иммунофенотипирования лейкоцитов в тканях органов, а также на мазках крови свиней с использованием непрямой иммуногистохимической реакции, основанной на применении моноклональных антител, включающий исследование на гистологических срезах органов свиней непрямой реакцией с использованием первичных антител специфичных к CD маркерам как человека, так и свиньи, отличающийся тем, что объектом исследования служат мазки крови и нативные срезы органов свиней, где в качестве первичных антител используют моноклональные антитела мыши к маркерам CD 3, CD 20, CD 14 лейкоцитов человека, а в качестве вторичных, используют антитела осла специфичные к Ig мыши, меченные пероксидазой хрена, с дальнейшим окрашиванием пероксидазной метки и образованием конгломератов хромогена красно-коричневого цвета на поверхности клеток.