СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ АСТМЫ ПОСРЕДСТВОМ ВВЕДЕНИЯ АНТАГОНИСТА IL-4R Российский патент 2023 года по МПК A61K39/00 A61P11/06 

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 61/691625, поданной 21 августа 2012 года; предварительной заявки на патент США 61/758097, поданной 29 января 2013 года; предварительной заявки на патент США 61/761279, поданной 6 февраля 2013 года; предварительной заявки на патент США 61/783796, поданной 14 марта 2013 года; предварительной заявки на патент США 61/805797, поданной 27 марта 2013 года; и заявки на патент Франции 1356994, поданной 16 июля 2013 года. Содержание каждой из вышеуказанных заявок полностью включено в настоящую заявку посредством отсылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лечению и/или предотвращению астмы и связанных состояний. Более конкретно, изобретение относится к введению антагониста рецептора интерлейкина 4 (IL-4R) с целью лечения или предотвращения астмы у пациента, нуждающегося в этом.

Уровень техники

Астма - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризующееся гиперчувствительностью дыхательных путей, острой и хронической бронхоконстрикцией, отеком дыхательных путей и их закупоркой слизью. Воспалительный компонент астмы, как полагают, включает несколько типов клеток, в том числе тучные клетки, эозинофилы, T-лимфоциты, нейтрофилы и эпителиальные клетки, а также их биологические продукты. У пациентов с астмой чаще всего проявляются такие симптомы, как хрипы, одышка, кашель и сдавленность в груди. Для большинства пациентов с астмой схема контролирующей терапии и бронхолитической терапии обеспечивает надлежащий длительный контроль приступов. Ингаляционные кортикостероиды (ИКС) считаются "золотым стандартом" в контроле симптомов астмы, при этом ингаляционные бета₂-агонисты являются наиболее эффективными из доступных в настоящее время бронхолитических средств. Исследования показали, что комбинированная терапия ИКС в сочетании с ингаляционным бета₂-агонистом длительного действия (БАДД) обеспечивает более эффективный контроль астмы, нежели высокие дозы одного ИКС. Следовательно, комбинированная терапия была рекомендованной терапией для тех больных, у которых применение одного ИКС в низких дозах не купировало симптомы астмы.

Тем не менее, по некоторым оценкам от 5% до 10% популяции с астмой имеют симптоматическую болезнь, несмотря на максимальную рекомендованную терапию с применением комбинаций противовоспалительных и бронхолитических средств. Кроме того, на эту группу с тяжелой астмой приходится до 50% от общих медицинских затрат на лечение в стационарах, использование экстренной помощи и незапланированные посещения врача. Существует неудовлетворенная потребность в новой терапии в этой группе с тяжелой астмой, так как многие из таких пациентов плохо поддаются лечению с применением ИКС вследствие множества клеточных и молекулярных механизмов. Кроме того, длительные нежелательные воздействия системных и ингаляционных кортикостероидов на метаболизм костной ткани, функции надпочечников и рост детей приводят к попыткам минимизировать используемое количество кортикостероида. Хотя у большой части больных астмой заболевание достаточно хорошо контролируется при использовании современных методов лечения, больным с тяжелой, невосприимчивой к кортикостероидам астмой доступно крайне мало вариантов терапевтического лечения, которые могут обеспечить надлежащий контроль болезни. Следствием резистентности к терапии или недостаточное соблюдение режима терапии является потеря контроля астмы и, в конечном счете, обострение астмы.

Одной из причин низкой восприимчивости к лечению у некоторых пациентов с тяжелой астмой может являться гетерогенность заболевания. К пониманию таких различных фенотипов растет интерес, поскольку направленная терапия с более высокой вероятностью будет успешна у пациентов с подобными, лежащими в основе болезни, патобиологическими особенностями. Недавние терапевтические подходы в области лечения астмы сосредоточились на попытке контроля ответа T-хэлперных клеток 2-го типа. Апрегуляция интерлейкина 4 (IL-4) и интерлейкина 13 (IL-13) была задействована как важный воспалительный компонент прогрессии астмы.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в новых способах направленной терапии для лечения и/или предотвращения астмы.

Сущность изобретения

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, предложены способы уменьшения частоты обострений астмы у субъекта, нуждающегося в этом. В связанном аспекте предложены способы улучшения одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, нуждающегося в этом. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения астмы, например, от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы, у субъекта, нуждающегося в этом.

Способы, представленные в настоящем изобретении, включают введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей антагонист рецептора интерлейкина 4 (IL-4R). Согласно некоторым вариантам осуществления, антагонист IL-4R является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые специфично связывают IL-4R. Примеры антител против IL-4R, которые могут использоваться в рамках способов настоящего изобретения, описаны в других местах в настоящей заявке, включая рабочий Пример 1. Например, в одном варианте осуществления антагонист IL-4R является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые специфично связываются с IL-4R, и включает CDR (область, определяющая комплементарность) последовательности тяжелой цепи и легкой цепи из вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) и вариабельной области легкой цепи (LCVR) - SEQ ID NO: 162 и 164, соответственно.

В одном варианте осуществления предложен способ уменьшения частоты одного или более обострений астмы у субъекта, нуждающегося в этом, посредством введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связывают IL-4R. Обострение астмы может быть одним или более из следующего: (a) 30%-ое или более сильно уменьшение относительно базового уровня утренней пиковой скорости выдоха (ПСВ) в течение двух последовательных дней; (b) шесть или более дополнительных вдохов аэрозоля альбутерола или левалбутерола для облегчения дыхания за 24-часовой период (по сравнению с базовым уровнем) в течение двух последовательных дней; и (c) ухудшение астмы, требующее: (i) системной (пероральной и/или парентеральной) терапии стероидами, или (ii) увеличения приема ингаляционных кортикостероидов по меньшей мере до 4 раз, причем последнюю дозу принимают перед прерыванием приема или госпитализацией.

В различных вариантах осуществления способы улучшения одного или более связанных с астмой параметров включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антагониста IL-4R, где улучшение связанного с астмой параметра определяется как одно из следующего: увеличение ОФВ1 относительно базового уровня; увеличение ПСВу относительно базового уровня; увеличение ПСВв относительно базового уровня; уменьшение использования альбутерола/левалбутерола относительно базового уровня; уменьшение пробуждений в ночное время относительно базового уровня и/или уменьшение оценки по шкале SNOT-22 относительно базового уровня. Примеры связанных с астмой параметров включают: (a) объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1); (b) пиковую скорость выдоха (ПСВ), включая ПСВ утром (ПСВу) и ПСВ вечером (ПСВв); (c) использование ингаляционного бронхолитика, такого как альбутерол или левалбутерол; (d) оценку по Опроснику контроля астмы, из пяти пунктов (Asthma Control Questionnaire, ACQ5); (d) пробуждения в ночное время; и (e) оценку в Тесте на исход болезней носа и околоносовых пазух, из 22 пунктов (Sino-Nasal Outcome Test, SNOT-22). В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является увеличение ОФВ1 по меньшей мере на 0,10 л относительно базового уровня. В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является увеличение ПСВ по меньшей мере на 10,0 л/мин относительно базового уровня. В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является увеличение ПСВв по меньшей мере на 1,0 л/мин относительно базового уровня. В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является уменьшение использования альбутерола/левалбутерола по меньшей мере на 1 вдох аэрозоля в день относительно базового уровня. В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является уменьшение по меньшей мере на 0,5 балла оценки ACQ5 относительно базового уровня. В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является уменьшение пробуждений в ночное время по меньшей мере в 0,2 раза за ночь относительно базового уровня. В одном варианте осуществления улучшением связанного с астмой параметра является уменьшение по меньшей мере на 5 баллов оценки SNOT-22 относительно базового уровня.

В изобретении также предложены способы уменьшения частоты возникновения обострений астмы или улучшения одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, нуждающегося в этом, где способы включают последовательное введение субъекту, нуждающемуся в этом, разовой начальной дозы фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R (например, антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент), а затем одной или более последующих доз фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R. Фармацевтическую композицию, включающую антагонист IL-4R, можно вводить подкожно, интраназально или внутривенно субъекту, нуждающемуся в этом.

Согласно некоторым вариантам осуществления в изобретении предложены способы уменьшения частоты возникновения обострений астмы или улучшения одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, нуждающегося в этом, где способы включают введение субъекту от приблизительно 75 до приблизительно 300 мг фармацевтической композиции, включающей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают IL-4R. Согласно этому аспекту фармацевтическую композицию можно вводить субъекту с частотой, например, один раз в неделю.

Изобретение также включает способы лечения астмы (например, эозинофильной астмы, от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы и т.д.) путем отбора субъекта, у которого проявляется один или более симптомов или признаков астмы, и введения пациенту фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R (например, антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент), где у субъекта проявляются один или более следующих симптомов или признаков астмы: (1) субъект проходил лечение с использованием постоянной дозы комбинации флутиказона/салметерола (250/50 мкг два раза в день или 500/50 мкг два раза в день) или комбинации будесонида/формотерола (160/9 мкг два раза в день или 320/9 мкг два раза в день) в течение по меньшей мере 3 месяцев до обследования; (2) субъект имеет уровень эозинофилов в крови больше или равный 300 клеткам/мкл.; (3) субъект имеет уровень эозинофилов в мокроте больше или равный 3%; (4) субъект имеет повышенные уровни IgE, тимусом и активацией регулируемого хемокина (TARC), эотаксина-3, раково-эмбрионального антигена (РЭА), YKL-40 или периостина; (5) субъект имеет повышенный уровень фракционного выдыхаемого оксида азота (ФВОА); и/или (6) субъект имеет оценку по Опроснику контроля астмы (ACQ5) больше или равную 1,0.

Варианты осуществления, представленные в изобретении, направлены на способы лечения, как описано выше, и дополнительно включают введение второго терапевтического средства в комбинации с антагонистом IL-4R. Второе терапевтическое средство можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, до, после или параллельно с введением антагониста IL-4R. Примеры вторых терапевтических средств включают, без ограничения перечисленными, один или больше из следующего в комбинации: ингибиторы IL-1, ингибиторы IL-5, ингибиторы IL-8, ингибиторы IgE, ингибиторы фактора некроза опухоли (ФНО), кортикостероиды, бета₂-агонисты длительного действия и ингибиторы лейкотриена.

В другом аспекте изобретения предложены способы уменьшения или устранения зависимости пациента с астмой от базисной терапии астмы, включающие отбор пациента, имеющего от умеренной до тяжелой астмы, которая не контролируется или частично контролируется базисной терапией астмы; введение пациенту определенной дозы антагониста IL-4R с сохранением базисной терапии пациента; и постепенное уменьшение дозировки одного или более компонентов базисной терапии в последующий период лечения с продолжением введения антагониста IL-4R. В некоторых вариантах осуществления базисная терапия включает ингаляционные кортикостероиды (ИКС), бета-агонист длительного действия (БАДД), или комбинацию ИКС и БАДД. В некоторых вариантах осуществления базисную терапию постепенно сокращают или отменяют в течение 2-8 недель. В некоторых вариантах осуществления один компонент базисной терапии исключают после начального периода лечения. В одном варианте осуществления базисную терапию постепенно сокращают в течение последующего периода лечения.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ идентификации пациента и лечения от умеренной до тяжелой астмы путем отбора пациента с повышенным уровнем такого биомаркера, как тимусом и активацией регулируемый хемокин (TARC), IgE, эотаксин-3, периостин, раково-эмбриональный антиген (РЭА) или YKL-40, или имеющего повышенный уровень фракционного выдыхаемого оксида азота (ФВОА); и введения пациенту терапевтически эффективного количества антагониста IL-4R.

В другом аспекте изобретения представлен способ мониторинга эффективности лечения от умеренной до тяжелой астмы у субъекта, например, посредством: (a) определения уровня экспрессии биомаркера, такого как TARC и/или эотаксин-3, или общего уровня IgE сыворотки в биологическом образце, полученном от субъекта до лечения с применением антагониста IL-4R; (b) определения уровня экспрессии биомаркера в биологическом образце, полученном от субъекта после лечения с применением антагониста IL-4R; (c) сравнения уровня экспрессии, определенного на этапе (a), с уровнем на этапе (b), и (d) заключения, что лечение является эффективным, если уровень, определенный на этапе (b), ниже, чем уровень, определенный на этапе (a), или заключения, что лечение является неэффективным, если уровень, определенный на этапе (b), является таким же или превышает уровень, определенный на этапе (a).

В одном варианте осуществления биомаркером является ФВОА, и если уровни ФВОА уменьшаются после введения антагониста, то лечение антагонистом IL-4R определяется как эффективное.

Уровень экспрессии биомаркера можно определить, например, через 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель или более после введения антагониста IL-4R, и сравнить с уровнем экспрессии до введения антагониста. Доза или схема введения антагониста IL-4R (например, антитела против IL-4R) может быть скорректирована после определения. Например, если экспрессия биомаркера не снижается в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель или более после введения антагониста, то лечение антагонистом может быть приостановлено, или может быть увеличена доза антагониста. Если экспрессия биомаркера после введения антагониста снижается, дозировка антагониста может быть сохранена или уменьшена, например, для определения минимальной эффективной дозы. В некоторых вариантах осуществления лечение поддерживают на уровне минимальной эффективной дозы.

В другом аспекте изобретения представлен способ мониторинга ответа субъекта на лечение антагонистом IL-4R, где субъект имеет от умеренной до тяжелой астмы, например, посредством получения информации относительно уровня экспрессии биомаркера, такого как TARC и/или эотаксин-3, или общего уровня IgE сыворотки в биологическом образце субъекта после введения антагониста IL-4R субъекту, и получения показания, согласно которому лечение нужно продолжить, если уровень экспрессии биомаркера уменьшился по сравнению с уровнем до лечения антагонистом IL-4R. В одном варианте осуществления биомаркером является ФВОА, и если было определено, что уровни ФВОА снизились после введения антитела, то получают показание к продолжению лечения антагонистом IL-4R.

Изобретение также включает антагонист IL-4R, раскрытый в настоящем описании, для применения в производстве лекарственного средства для лечения и/или предотвращения астмы (например, эозинофильной астмы, от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы и т.д.) или для лечения любого из других показаний или состояний, раскрытых в настоящем описании.

Изобретение также включает антагонист IL-4R, раскрытый в настоящем описании, для применения в лечении и/или предотвращении астмы (например, эозинофильной астмы, от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы и т.д.) или для лечении и/или предотвращения любого из других показаний или состояний, раскрытых в настоящем описании.

Изобретение включает фармацевтическую композицию, включающую антагонистическое антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении и/или предотвращении астмы и сопутствующих состояний.

Изобретение также включает фармацевтическую композицию, включающую антагонистическое антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в снижении частоты возникновения одного или более обострений астмы у субъекта, нуждающегося в этом.

Кроме того, изобретение включает фармацевтическую композицию, включающую антагонистическое антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в улучшении одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, нуждающегося в этом.

Изобретение включает фармацевтическую композицию, включающую антагонистическое антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении астмы и сопутствующих состояний у пациента, имеющего повышенный уровень биомаркера, выбранного из группы, состоящей из тимусом и активацией регулируемого хемокина (TARC), IgE, эотаксина-3, периостина, раково-эмбрионального антигена (РЭА), YKL-40 и фракционного выдыхаемого оксида азота (ФВОА).

Изобретение дополнительно включает фармацевтическую композицию, включающую антагонистическое антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении астмы или от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы у субъекта, нуждающегося в этом, где лечение включает тестирование пациента на присутствие уровня эозинофилов в крови по меньшей мере 300 клеток в микролитре и/или уровня эозинофилов в мокроте по меньшей мере 3%, и начало/продолжение введения фармацевтической композиции, если обнаружен такой уровень эозинофилов в крови и/или уровень эозинофилов в мокроте.

Другие варианты осуществления изобретения станут очевидными при просмотре следующего подробного описания.

Краткое описание фигур

Фигура 1 - диаграмма, на которой показан график Каплана-Мейера динамики обострения астмы у пациентов, получавших плацебо (незакрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (звездочки). Эффект лечения антителом mAb1 против IL-4R сохранялся в течение длительного времени, в том числе через 8 недель, когда пациенты подвергались более высокому риску развития обострений вследствие отмены стероидов. Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 2 - диаграмма, на которой показано среднее изменение объема форсированного выдоха через 1 секунду (ОФВ1) относительно базового уровня в литрах у пациентов, получавших плацебо (незакрашенные треугольники), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные кружки). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 3 - диаграмма, на которой показано среднее изменение пиковой скорости выдоха утром (ПСВу) в литрах в минуту относительно базового уровня у пациентов, получавших плацебо (открытые треугольники), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные кружки).

Фигура 4 - диаграмма, на которой показано среднее изменение пиковой скорости выдоха вечером (ПСВв) в литрах в минуту относительно базового уровня у пациентов, получавших плацебо (незакрашенные треугольники), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные кружки).

Фигура 5 - диаграмма, на которой показано среднее изменение количества ингаляций в день при использовании альбутерола относительно базового уровня у пациентов, получавших плацебо (незакрашенные треугольники), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные кружки). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 6 - диаграмма, на которой показано среднее изменение оценки по Опроснику контроля астмы из пяти пунктов (ACQ5) относительно базового уровня у пациентов, получавших плацебо (незакрашенные треугольники), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные кружки). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 7 - диаграмма, на которой показано среднее изменение количества пробуждений в ночное время относительно базового уровня у пациентов, получавших плацебо (незакрашенные треугольники), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные кружки). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 8 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение TARC относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 9 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение эотаксина-3 относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 10 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение общего IgE относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты). Сломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 11 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение периостина относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты).

Фигура 12 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение раково-эмбрионального антигена (РЭА) относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты).

Фигура 13 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение YKL-40 относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты).

Фигура 14 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение эозинофилов в крови относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 1, 2, 4, 6, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты).

Фигура 15 - диаграмма, на которой показано среднее процентное изменение уровня фракционного выдыхаемого оксида азота (NO) относительно базового уровня при посещении в неделю 0, 4, 8 и 12 в группе mITT, получавшей плацебо (закрашенные кружки), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (закрашенные квадраты). Ломанные вертикальные линии указывают отмену БАДД.

Фигура 16 - диаграмма рассеяния изменения ОФВ1 (л) относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении с базовой фракцией выдыхаемого оксида азота (ФВОА) (млрд.д.) в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 17 - диаграмма рассеяния изменения ПСВу (л/мин) относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении с базовой ФВОА (млрд.д.) в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 18 - диаграмма рассеяния изменения ПСВв (л/мин) относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении с базовой ФВОА (млрд.д.) в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 19 - диаграмма рассеяния изменения ОФВ1 относительно базового уровня в неделю 12 (л) в сравнении с количеством эозинофилов в крови (10⁹/л) в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 20 - диаграмма рассеяния изменения балла ACQ относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении с количеством эозинофилов в крови (10⁹/л) в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 21 - диаграмма рассеяния изменения при использовании альбутерола/левалбутерола в день относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении с количеством эозинофилов в крови (10⁹/л) в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 22 - диаграмма рассеяния изменения балла ACQ относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении с базовым уровнем периостина в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 23 - диаграмма рассеяния изменения балла ACQ относительно базового уровня в неделю 12 в сравнении YKL-40 в группе mITT, получавшей плацебо (незакрашенные кружки и сплошная линия), по сравнению с пациентами, получавшими антитело mAb1 против IL-4R (знак плюс и пунктирная линия).

Фигура 24 - схематическое представление режима выбора времени введения и дозы для лечения больных астмой.

Фигура 25 - диаграмма, описывающая распределение пациентов в рандомизированном, плацебо-контролируемом, двойном слепом исследовании в параллельных группах, проводимом с подкожным введением раз в неделю 300 мг mAb1 или плацебо в течение 12 недель пациентам с персистирующей эозинофильной астмой, от умеренной до тяжелой, которую частично контролировали/неконтролировали посредством терапии ингаляционным кортикостероидом (ИКС) и бета2-агонистом длительного действия (БАДД).

Фигура 26A и 26B - диаграммы рассеяния симптомов астмы утром (A) и вечером (B), измеряемых в течение 12 недель после введения плацебо (незакрашенные треугольники) или mAb1 (закрашенные кружки).

Фигура 27 - диаграмма, на которой показаны уровни IgE сыворотки у гуманизированных IL-4/IL-4R мышей (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu) после провокации аллергенами пылевого клеща (HDM) и введения либо антитела против IL-4R, либо рецептора-ловушки IL-13Ra2-Fc, либо после имитации терапии. Измерения производили на образцах, полученных в День 40 (за 24 часа до введения первой дозы терапии) и в конце эксперимента, в День 85.

Фигура 28 - диаграмма, на которой показаны уровни IgE сыворотки у мышей дикого типа (Balb/c) после провокации аллергенами пылевого клеща (HDM) и введения либо контрольного изотипа, антитела против IL-4R, либо рецептора-ловушки IL-13Ra2-Fc, либо после имитации терапии.

Фигура 29 - диаграмма, на которой показано содержание коллагена (выраженное в мкг/долю) в легких гуманизированных IL-4/IL-4R мышей после провокации HDM и назначенной терапии.

Фигура 30 - диаграмма, на которой показано содержание коллагена (выраженное в мкг/долю) в легких мышей дикого типа после провокации HDM и назначенной терапии.

Фигура 31A - диаграмма, на которой показаны уровни эозинофилов и нейтрофилов у гуманизированных IL-4/IL-4R мышей после провокации HDM и назначенной терапии, и Фигура 31B - диаграмма, на которой показаны уровни резидентных дендритных клеток и воспалительных дендритных клеток у гуманизированных IL-4/IL-4R мышей после провокации HDM и назначенной терапии.

Подробное описание

Прежде чем будет описано настоящее изобретение, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, так как способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, служит исключительно в целях описания конкретных вариантов осуществления, и не должна быть ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен лишь в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, под которым их обычно понимают средние специалисты в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

При использовании в настоящем описании, термин "приблизительно", в случае его использования в отношении конкретного указанного числового значения, означает, что значение может отклоняться от указанного значения не более чем на 1%. Например, при использовании в настоящем описании, выражение "приблизительно 100" включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).

При использовании в настоящем описании, термины "лечить", "лечение" или подобные означают облегчение симптомов, устранение этиологии симптомов на временной или постоянной основе, или предотвращение или замедление возникновения симптомов названного нарушения или состояния.

Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, могут использоваться в практическом осуществлении настоящего изобретения, далее будут описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, указанные в настоящей заявке, включены в настоящее описание посредством отсылки в полном объеме.

Способы уменьшения частоты возникновения обострений астмы

Изобретение включает способы уменьшения частоты возникновения обострений астмы у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение фармацевтической композиции, включающей антагонист рецептора интерлейкина 4 (IL-4R), субъекту. При использовании в настоящем описании, выражение "обострение астмы" означает увеличение тяжести и/или частоты, и/или продолжительности одного или более симптомов или признаков астмы. "Обострение астмы" также включает любое ухудшение здоровья дыхательных путей субъекта, которое требует и/или поддается лечению с терапевтическим вмешательством по поводу астмы (например, терапии стероидами, терапии ингаляционными кортикостероидами, госпитализации и т.д.). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, обострение астмы определяется как одно или более из следующего: (a) 30%-ое или большее уменьшение пиковой скорости выдоха утром ("ПСВу", как определено в другом месте настоящего описания) относительно базового уровня за два последовательных дня; (b) шесть или более дополнительных вдохов аэрозоля альбутерола или левалбутерола для облегчения дыхания за 24-часовой период (по сравнению с базовым уровнем) в течение двух последовательных дней; и (c) ухудшение астмы, требующее: (i) системной (пероральной и/или парентеральной) терапии стероидами, или (ii) увеличения приема ингаляционных кортикостероидов по меньшей мере до 4 раз по сравнению с базовым уровнем, или (iii) госпитализации.

В некоторых случаях, обострение астмы можно отнести к категории "тяжелого обострения астмы". Тяжелое обострение астмы означает инцидент, требующий непосредственного вмешательства в форме лечения либо системными кортикостероидами, либо ингаляционными кортикостероидами в дозе, которая в четыре или более раз превышает дозу, применяемую до инцидента. Общее выражение "обострение астмы", таким образом, включает и охватывает более специализированную подкатегорию "тяжелых обострений астмы". Соответственно, изобретение включает способы уменьшения частоты возникновения тяжелых обострений астмы у пациента, нуждающегося в этом.

"Уменьшение частоты возникновения" обострений астмы означает, что субъект, который уже получил фармацевтическую композицию настоящего изобретения, испытывает меньше обострений астмы (то есть меньше по меньшей мере на одно обострение) после лечения, чем до лечения, или не испытывает никаких обострений астмы в течение по меньшей мере 4 недель (например, 4, 6, 8, 12, 14 или более недель) после начала лечения с применением фармацевтической композиции настоящего изобретения. "Уменьшение частоты возникновения" обострений астмы альтернативно означает, что после введения фармацевтической композиции настоящего изобретения, вероятность того, что субъект будет испытывать обострение астмы, уменьшается по меньшей мере на 10% (например, на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше) по сравнению с субъектом, который не получал фармацевтической композиции настоящего изобретения.

Способы улучшения связанных с астмой параметров

Изобретение также включает способы улучшения одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, нуждающегося в этом, где способы включают введение фармацевтической композиции, включающей антагонист рецептора интерлейкина 4 (IL-4R) субъекту. В рамках изобретения уменьшение частоты возникновения обострений астмы (как описано выше) может коррелировать с улучшением одного или более связанных с астмой параметров, впрочем, такая корреляция не должна обязательно наблюдаться во всех случаях.

Примеры "связанных с астмой параметров" включают: (a) объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1); (b) пиковую скорость выдоха (ПСВ), включая ПСВ утром (ПСВу) и ПСВ вечером (ПСВв); (c) использование ингаляционного бронхолитика, такого как альбутерол или левалбутерол; (d) оценку по Опроснику контроля астмы, из пяти пунктов (ACQ5); (d) пробуждения в ночное время; и (e) оценку в Тесте на исход болезней носа и околоносовых пазух, из 22 пунктов (SNOT-22). "Улучшение связанного с астмой параметра" означает увеличение относительно базового уровня одного или более из ОФВ1, ПСВу или ПСВв, и/или уменьшение относительно базового уровня одного или более из ежедневного применения альбутерола/левалбутерола, оценки ACQ5, среднего количества пробуждений в ночное время или оценки SNOT-22. При использовании в настоящем описании, термин "базовый уровень", в отношении связанного с астмой параметра, означает числовое значение связанного с астмой параметра у пациента до или во время введения фармацевтической композиции настоящего изобретения.

Для определения, улучшился ли связанный с астмой параметр, параметр оценивают количественно на базовом уровне и в момент после введения фармацевтической композиции настоящего изобретения. Например, связанный с астмой параметр может быть измерен в день 1, день 2, день 3, день 4, день 5, день 6, день 7, день 8, день 9, день 10, день 11, день 12, день 14 или в неделю 3, неделю 4, неделю 5, неделю 6, неделю 7, неделю 8, неделю 9, неделю 10, неделю 11, неделю 12, неделю 13, неделю 14, неделю 15, неделю 16, неделю 17, неделю 18, неделю 19, неделю 20, неделю 21, неделю 22, неделю 23, неделю 24 или позже, после начальной терапии с применением фармацевтической композиции настоящего изобретения. Различие между значением параметра в конкретной точке времени после начала лечения и значением параметра на базовом уровне используется для определения, было ли "улучшение" связанного с астмой параметра (например, увеличение или уменьшение, при соответствующих обстоятельствах, в зависимости от конкретного измеряемого параметра).

Термины "получать" или "получение", при использовании в настоящем описании, относятся к приобретению физического объекта или значения, например, числового значения, посредством "прямого получения" или "косвенного получения" физического объекта или значения, например, связанного с астмой параметра. "Прямое получение" означает выполнение процесса (например, выполнение метода синтеза или анализа) с получением физического объекта или значения. "Косвенное получение" относится к получению физического объекта или значения от другой стороны или из источника (например, от сторонней лаборатории, в которой непосредственно получили физический объект или значение). Прямое получение физического объекта включает выполнение процесса, который включает физическое изменение физического вещества, например, исходного вещества. Примеры изменений включают создание физического объекта из двух или более исходных веществ, резку или измельчение вещества, разделение или очистку вещества, объединение двух или более отдельных объектов в смесь, проведение химической реакции, которая включает разрыв или образование ковалентной или нековалентной связи. Прямое получение значения включает выполнение процесса, который включает физическое изменение образца или другого вещества, например, выполнение аналитического процесса, который включает физическое изменение вещества, например, образца, аналита или реагента (иногда именуемого в настоящем описании как "физический анализ").

Информацию, которую получают косвенно, можно представить в форме сообщения, например, в бумажной или электронной форме, такой как из электронной базы данных или в виде приложения ("App"). Сообщение или информация могут бы предоставлены, например, медицинским учреждением, таким как больница или клиника, или лицом, предоставляющим медицинские услуги, таким как врач или медсестра.

Объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения введение антагониста IL-4R пациенту приводит к увеличению относительно базового уровня объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1). Методы измерения ОФВ1 известны в уровне техники. Например, для измерения ОФВ1 у пациента может использоваться спирометр, который соответствует рекомендациям 2005 Американского торакального общества (ATS)/Европейского респираторного общества (ERS). Стандартизация спирометрии ATS/ERS может использоваться в качестве руководства. Спирометрию обычно проводят между 6:00 и 10:00, по меньшей мере через 6 часов после приостановки приема альбутерола. Тесты легочной функции обычно проводят в положении сидя и при этом регистрируют максимальное значение ОФВ1 (в литрах).

Изобретение включает терапевтические способы, которые приводят к увеличению ОФВ1 относительно базового уровня по меньшей мере на 0,05 л в неделю 12 после начала терапии с применением фармацевтической композиции, включающей антагонист против IL-4R. Например, согласно изобретению введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, вызывает увеличение ОФВ1 относительно базового уровня приблизительно на 0,05 л, 0,10 л, 0,12 л, 0,14 л, 0,16 л, 0,18 л, 0,20 л, 0,22 л, 0,24 л, 0,26 л, 0,28 л, 0,30 л, 0,32 л, 0,34 л, 0,36 л, 0,38 л, 0,40 л, 0,42 л, 0,44 л, 0,46 л, 0,48 л, 0,50 л или больше в неделю 12.

Пиковая скорость выдоха утром и вечером (ПСВу и ПСВв). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения введение антагониста IL-4R пациенту приводит к увеличению пиковой скорости выдоха утром и/или вечером (ПСВу и/или ПСВв) относительно базового уровня. Методы измерения ПСВ известны в уровне техники. Например, согласно одному методу измерения ПСВ пациентам выдают электронный измеритель ПСВ для регистрации ПСВ утром (ПСВу) и вечером (ПСВв) (а также ежедневного применения альбутерола, оценок утренних и вечерних симптомов астмы и числа пробуждений в ночное время вследствие проявления симптомов астмы, которые требуют применения препаратов для неотложной помощи). Пациенты проходят инструктаж по применению устройства и получают письменные инструкции по использованию электронного измерителя ПСВ. Кроме того, медицинский работник может инструктировать пациентов о том, как регистрировать соответствующие измеряемые значения на электронном измерителе ПСВ. Измерение ПСВу обычно проводят в течение 15 минут после подъема (от 6:00 до 10:00) до приема альбутерола. Измерение ПСВв обычно проводят вечером (от 18:00 до 22:00) до приема альбутерола. Субъекты должны попытаться приостановить применение альбутерола в течение по меньшей мере 6 часов до измерения их ПСВ. Пациент делает три попытки измерения ПСВ и регистрирует все 3 значения на электронном измерителе ПСВ. Обычно для оценки используется максимальное значение. Базовое значение ПСВу можно вычислить как среднее измерение, выполняемое утром, зарегистрированное в течение 7 дней до введения первой дозы фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R, и базовое значение ПСВв можно вычислить как среднее измерение, выполняемое вечером, зарегистрированное в течение 7 дней до введения первой дозы фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R.

Изобретение включает терапевтические способы, которые приводят к увеличению ПСВу и/или ПСВв относительно базового уровня по меньшей мере на 1,0 л/мин в неделю 12 после начала лечения с применением фармацевтической композицией, включающей антагонист против IL-4R. Например, согласно изобретению, введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, вызывает увеличение ПСВ относительно базового уровня приблизительно на 0,5 л/мин, 1,0 л/мин, 1,5 л/мин, 2,0 л/мин, 2,5 л/мин, 3,0 л/мин, 3,5 л/мин, 4,0 л/мин, 4,5 л/мин, 5,0 л/мин, 5,5 л/мин, 6,0 л/мин, 6,5 л/мин, 7,0 л/мин, 7,5 л/мин, 8,0 л/мин, 8,5 л/мин, 9,0 л/мин, 9,5 л/мин, 10,0 л/мин, 10,5 л/мин, 11,0 л/мин, 12,0 л/мин, 15 л/мин, 20 л/мин или больше в неделю 12.

Применение альбутерола/левалбутерола. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения введение антагониста IL-4R пациенту приводит к уменьшению ежедневного применения альбутерола или левалбутерола относительно базового уровня. Число ингаляций альбутерола/левалбутерола может регистрироваться пациентами ежедневно в дневнике, на измерителе ПСВ или другом регистрирующем устройстве. В процессе лечения фармацевтической композицией изобретения, применение альбутерола/левалбутерола обычно можно осуществлять по мере необходимости в случае проявления симптомов, на нерегулярной основе или профилактически. Базовое количество ингаляций альбутерола/левалбутерола в день может быть вычислено исходя из среднего значения за 7 дней перед введением первой дозы фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R.

Изобретение включает терапевтические способы, которые приводят к уменьшению применения альбутерола/левалбутерола относительно базового уровня по меньшей мере на 0,25 вдохов аэрозоля за день в неделю 12 после начала лечения фармацевтической композицией, включающей антагонист против IL-4R. Например, согласно изобретению, введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, вызывает уменьшение применения альбутерола/левалбутерола относительно базового уровня приблизительно на 0,25 вдохов аэрозоля в день, 0,50 вдохов аэрозоля в день, 0,75 вдохов аэрозоля в день, 1,00 вдохов аэрозоля в день, 1,25 вдохов аэрозоля в день, 1,5 вдохов аэрозоля в день, 1,75 вдохов аэрозоля в день, 2,00 вдохов аэрозоля в день, 2,25 вдохов аэрозоля в день, 2,5 вдохов аэрозоля в день, 2,75 вдохов аэрозоля в день, 3,00 вдохов аэрозоля в день или больше в неделю 12.

Оценка по Опроснику контроля астмы из пяти пунктов (ACQ). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения введение антагониста IL-4R пациенту приводит к уменьшению оценки по Опроснику контроля астмы из пяти пунктов (ACQ5) по сравнению с базовым уровнем. ACQ5 представляет собой утвержденный Опросник для оценки контроля астмы.

Изобретение включает терапевтические способы, которые приводят к уменьшению оценки ACQ5 относительно базового уровня по меньшей мере на 0,10 пункта в неделю 12 после начала лечения фармацевтической композицией, включающей антагонист против IL-4R. Например, согласно изобретению, введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, вызывает уменьшение балла ACQ по сравнению с базовым уровнем приблизительно на 0,10 пункта, 0,15 пункта, 0,20 пункта, 0,25 пункта, 0,30 пункта, 0,35 пункта, 0,40 пункта, 0,45 пункта, 0,50 пункта, 0,55 пункта, 0,60 пункта, 0,65 пункта, 0,70 пункта, 0,75 пункта, 0,80 пункта, 0,85 пункта или больше в неделю 12.

Пробуждения в ночное время. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения введение антагониста IL-4R пациенту приводит к уменьшению среднего количества пробуждений в ночное время относительно базового уровня.

Изобретение включает терапевтические способы, которые приводят к уменьшению среднего количества пробуждений в ночное время по сравнению с базовым уровнем по меньшей мере приблизительно на 0,10 раза в ночь в неделю 12 после начала лечения фармацевтической композицией, включающей антагонист против IL-4R. Например, согласно изобретению, введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, вызывает уменьшение среднего количества пробуждений в ночное время по сравнению с базовым уровнем приблизительно на 0,10 раза в ночь, 0,15 раза в ночь, 0,20 раза в ночь, 0,25 раза в ночь, 0,30 раза в ночь, 0,35 раза в ночь, 0,40 раза в ночь, 0,45 раза в ночь, 0,50 раза в ночь, 0,55 раза в ночь, 0,60 раза в ночь, 0,65 раза в ночь, 0,70 раза в ночь, 0,75 раза в ночь, 0,80 раза в ночь, 0,85 раза в ночь, 0,90 раза в ночь, 0,95 раза в ночь, 1,0 раза в ночь, 2,0 раза в ночь или больше в неделю 12.

Оценка в Тесте на исход болезней носа и околоносовых пазух из 22 пунктов (SNOT-22). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения введение антагониста IL-4R пациенту приводит к уменьшению оценки в Тесте на исход болезней носа и околоносовых пазух из 22 пунктов (SNOT-22) относительно базового уровня. SNOT-22 представляет собой утвержденный опросник для оценки влияния хронического риносинусита на качество жизни (Hopkins et al., 2009, Clin. Otolaryngol., 34:447-454).

Изобретение включает терапевтические способы, которые приводят к уменьшению оценки SNOT-22 относительно базового уровня по меньшей мере на 1 пункт в неделю 12 после начала лечения фармацевтической композицией, включающей антагонист против IL-4R. Например, согласно изобретению, введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, вызывает уменьшение оценки SNOT-22 относительно базового уровня приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 пунктов или больше в неделю 12.

Способы лечения астмы

В изобретении, согласно некоторым вариантам осуществления, предложены способы лечения астмы, включая, например, эозинофильную астму, у субъекта, нуждающегося в этом, где способы включают введение субъекту фармацевтической композиции, включающей антагонист рецептора интерлейкина 4 (IL-4R). В некоторых вариантах осуществления способы изобретения могут применяться для лечения от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы у субъекта (например, персистирующей, от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы).

Согласно изобретению, субъекта идентифицируют как имеющего от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы, если субъект демонстрирует уровень эозинофилов крови по меньшей мере 300 клеток в микролитре и/или уровень эозинофилов в мокроте по меньшей мере 3%. Любые известные и доступные из уровня техники способы измерения уровня эозинофилов в крови и/или мокроте могут использоваться в рамках изобретения для идентификации субъекта, имеющего от умеренной до тяжелой эозинофильной астмы, который, таким образом, становится подходящим субъектом для применения терапевтических способов изобретения.

Согласно соответствующему аспекту изобретения предложены способы лечения астмы, включающие: (a) отбор пациента, который демонстрирует уровень эозинофилов в крови по меньшей мере 300 клеток в микролитре и/или уровень эозинофилов в мокроте по меньшей мере 3%; и (b) введение пациенту фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R.

В другом аспекте предложены способы уменьшения или устранения зависимости пациента с астмой от применения ингаляционных кортикостероидов (ИКС) и/или бета-агонистов длительного действия (БАДД) в процессе лечения от умеренной до тяжелой астмы. В некоторых вариантах осуществления способы включают: отбор пациента, имеющего от умеренной до тяжелой астмы, которая не контролируется или частично контролируется базисной терапией; введение пациенту определенной дозы антагониста IL-4R, предпочтительно антитела против IL-4R, в течение начального периода лечения, с сохранением базисной терапии пациента в течение начального периода лечения; и постепенное уменьшение дозировки одного или более компонентов базисной терапии в течение последующего периода лечения, с продолжением введения антагониста IL-4R. Термин "базисная терапия" относится к стандартным или обычным терапевтическим средствам, известным в уровне техники, которые применяются для лечения астмы. В некоторых вариантах осуществления базисная терапия включает ИКС, БАДД или комбинацию обоих. В некоторых вариантах осуществления дозу ИКС и/или БАДД исключают или отменяют сразу после начального периода лечения. Например, БАДД, такой как салметерол или формотерол, вводят в начальный период лечения и полностью прекращают или отменяют его введение в последующий период лечения.

Пример схемы лечения пациента с умеренной - тяжелой астмой показан на Фигуре 24, где антагонист IL-4R вводят пациенту с умеренной - тяжелой астмой. В течение начального периода лечения (также называемого "стабильной фазой"), БАДД и ИКС вводят пациенту в качестве базисной терапии. В течение последующего периода лечения (также называемого "фазой отмены") введение БАДД приостанавливают, то есть БАДД отменяют или исключают. Дозу ИКС постепенно снижают в течение последующего периода лечения, до полного исключения.

В соответствующем аспекте предложены способы лечения астмы, включающие дополнительную терапию к базисной терапии с систематической отменой базисной терапии. В некоторых вариантах осуществления антагонист IL-4R вводят в качестве дополнительной терапии больному астмой, который находится на базисной терапии в течение некоторого периода времени (например, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 5 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев или дольше) (также называемого "стабильной фазой"). В некоторых вариантах осуществления базисная терапия включает ИКС и/или БАДД. Стабильная фаза сопровождается фазой отмены базисной терапии, где один или более компонентов, входящих в базисную терапию, отменяют или снижают, или исключают, тогда как дополнительную терапию продолжают. В некоторых вариантах осуществления базисная терапия может быть снижена приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50% или больше в течение фазы отмены. Фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше. В предпочтительном варианте осуществления базисная терапия может быть уменьшена приблизительно на 5% в течение фазы отмены, при этом фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше. В предпочтительном варианте осуществления базисная терапия может быть уменьшена приблизительно на 10% в течение фазы отмены, при этом фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше. В предпочтительном варианте осуществления базисная терапия может быть уменьшена приблизительно на 20% в течение фазы отмены, при этом фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше. В предпочтительном варианте осуществления базисная терапия может быть уменьшена приблизительно на 30% в течение фазы отмены, при этом фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше. В предпочтительном варианте осуществления базисная терапия может быть уменьшена приблизительно на 40% в течение фазы отмены, при этом фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше. В предпочтительном варианте осуществления базисная терапия может быть уменьшена приблизительно на 50% или больше в течение фазы отмены, при этом фаза отмены может длиться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель или больше.

В некоторых других вариантах осуществления изобретение охватывает способы лечения или уменьшения тяжести состояний или осложнений, связанных с астмой, таких как хронический риносинусит, аллергический ринит, аллергический грибковый риносинусит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, болезнь объединенных дыхательных путей, синдром Черджа-Стросс, васкулит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и бронхоспазм, вызванный физической нагрузкой.

Изобретение также включает способы лечения персистирующей астмы. При использовании в настоящем описании, термин "персистирующая астма" означает, что у субъекта симптомы проявляются по меньшей мере один раз в неделю, днем и/или ночью, при этом симптомы длятся от нескольких часов до нескольких дней. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, персистирующая астма является "слабо персистирующей" (например, более двух раз в неделю, но не ежедневно, причем симптомы достаточно тяжелы, чтобы нарушать повседневную деятельность или сон, и/или где легочная функция является нормальной или может быть возвращена к номе с помощью ингаляции бронхолитика), "умеренно персистирующей" (например, симптомы проявляются ежедневно, при этом сон прерывается по меньшей мере раз в неделю и/или легочная функция умеренно нарушена), или "сильно персистирующей" (например, постоянные симптомы, несмотря на правильное применение одобренных препаратов и/или где легочная функция сильно нарушена).

Антагонисты рецепторов интерлейкина-4

Способы изобретения включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, включающей антагонист рецептора интерлейкина 4 (IL-4R). При использовании в настоящем описании, "антагонист IL-4R" является любым средством, которое связывается или взаимодействует с IL-4R и ингибирует нормальную биологическую функцию сигнализации IL-4R в случае экспрессии IL-4R на клетке in vitro или in vivo. Неограничивающие примеры классов антагонистов IL-4R включают низкомолекулярные антагонисты IL-4R, аптамеры против IL-4R, антагонисты IL-4R на основе пептидов (например, молекулы "peptibody" или пептитела), а также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые специфично связывают IL-4R человека.

Термин "IL-4R человека" (hIL-4R) относится к человеческому цитокиновому рецептору, который специфично связывается с интерлейкином 4 (IL-4), такому как IL-4Rα (SEQ ID NO: 274).

Термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулина, содержащим четыре полипептидных цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, которые связаны дисульфидными связями, а также к их мультимерам (например, IgM). Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно HCVR или V_H) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена: C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (сокращенно LCVR или V_L) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен - (C_L1). Области V_H и V_L можно дополнительно поделить на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца до C-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления FR области антитела против IL-4R (или их антигенсвязывающая часть) могут быть идентичны человеческим зародышевым последовательностям, или могут быть природно или искусственно модифицированы. Консенсусная аминокислотная последовательность может быть определена на основе анализа с выравниванием двух или более CDR.

Термин "антитело" также включает антигенсвязывающие фрагменты полноразмерных молекул антител. Термины "антигенсвязывающая часть" антитела, "антигенсвязывающий фрагмент" антитела и т.п., при использовании в настоящем описании, включают любой природный, получаемый при обработке ферментами, синтетический или полученный генно-инженерными методами полипептид или гликопротеин, который специфично связывается с антигеном, формируя комплекс. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из полноразмерных молекул антител, при использовании любых подходящих стандартных методов, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантных методов генной инженерии, включающих манипуляцию и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и, необязательно константные домены антитела. Такая ДНК известна и/или может быть легко получена, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (в том числе, например, фаговых библиотек антител), или может быть синтезирована. ДНК можно секвенировать и подвергать манипуляциям с использованием химических методов или методов молекулярной биологии, например, размещать один или более вариабельных и/или константных доменов в нужной конфигурации или вводить кодоны, создавать цистеиновые остатки, модифицировать, добавлять или удалять аминокислоты и т.д.

Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) Fab фрагменты; (ii) F(ab')₂ фрагменты; (iii) Fd фрагменты; (iv) Fv фрагменты; (v) одноцепочечные Fv (scFv) молекулы; (vi) dAb фрагменты; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенная определяющая комплементарность область (CDR), такая как пептид CDR3), или конформационно ограниченный пептид FR3-CDR3-FR4. Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфичные антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленными доменами, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные нанотела, бивалентные нанотела и т.д.), малые модульные иммунофармацевтические средства (SMIP) и вариабельные домены IgNAR иммуноглобулинов акул, также охвачены выражением "антигенсвязывающий фрагмент".

Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно включает по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и обычно включает по меньшей мере одну CDR, которая примыкает или находится в рамке считывания с одной или более каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, в которых V_H домен соединен с V_L доменом, V_H и V_L домены могут быть расположены относительно друг друга в любой подходящей конфигурации. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L димеры. В альтернативе антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный V_H или V_L домен.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие, примерные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут присутствовать в антигенсвязывающем фрагменте антитела настоящего изобретения, включают: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (V) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включая любую из указанных выше примерных конфигураций, вариабельные и константные домены могут быть либо связаны друг с другом непосредственно, либо могут быть связаны через полноразмерную или неполную шарнирную или линкерную область. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, что дает гибкую или полугибкую связь между сопряженными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле, предпочтительно шарнирная область может состоять из 2-60 аминокислот, предпочтительно 5-50 или предпочтительно 10-40 аминокислот. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела настоящего изобретения может включать гомодимер или гетеродимер (или другие мультимеры) с любой из конфигураций вариабельных и константных доменов, указанных выше, в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или более мономерными V_H или V_L доменами (например, через дисульфидную связь (связи)).

Как и в случае с полноразмерными молекулами антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными (например, биспецифичными). Мультиспецифичный антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно включает по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфично связываться с отдельным антигеном или с определенным эпитопом на одном антигене. Любой мультиспецифичный формат антитела может быть адаптирован для применения в рамках антигенсвязывающего фрагмента антитела изобретения при использовании стандартных способов, доступных в уровне техники.

Константная область антитела важна по отношению к способности антитела связывать комплемент и опосредовать клеточно-зависимую цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основе того, желательно ли, чтобы антитело опосредовало цитотоксичность.

Термин "антитело человека" включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, которые получены из человеческих зародышевых иммуноглобулиновых последовательностей. Антитела человека, представленные в изобретении, могут, тем не менее, включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими зародышевыми иммуноглобулиновыми последовательностями (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, CDR3. Впрочем, термин "антитело человека" не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии млекопитающего другого вида, например, мыши, были привиты на человеческие каркасные последовательности.

Термин "рекомбинантное антитело человека" включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных средств, например, антитела, экспрессированные при использовании рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (дополнительно описанные ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител (дополнительно описанные ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по человеческим генам иммуноглобулина (см. например, Taylor et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295), или антитела полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает объединение последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные и константные области, которые получены из человеческих зародышевых иммуноглобулиновых последовательностей. Впрочем, в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, в случае использования животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, in vivo соматическому мутагенезу), и, таким образом, аминокислотные последовательности V_H и V_L областей рекомбинантных антител являются последовательностями, которые хотя и были получены из последовательностей человеческих зародышевых V_H и V_L и связаны с ними, могут не существовать в репертуаре человеческих зародышевых антител in vivo.

Человеческие антитела могут существовать в двух формах, которые связаны с гетерогенностью шарнирной области. В одной из форм молекула иммуноглобулина включает стабильную четырехцепочечную конструкцию массой приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны межцепочечными дисульфидными связями, при этом образуется молекула массой приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитело). Такие формы было чрезвычайно сложно разделить, даже после аффинной очистки.

Частота образования второй формы в различных интактных изотипах IgG обусловлена, без ограничения, структурными различиями, связанными с шарнирной областью изотипа антитела. Единственная аминокислотная замена в шарнирной области человеческого IgG4 может значительно уменьшить образование второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых при использовании шарнира IgG1 человека. Настоящее изобретение охватывает антитела, имеющие одну или более мутаций в шарнирной, C_H2 или C_H3 области, которая может быть желательной, например, при получении, для повышения выхода требуемой формы антитела.

"Выделенное антитело" означает антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или изолировано по меньшей мере от одного компонента его естественного окружения. Например, антитело, которое было отделено или удалено по меньшей мере от одного компонента организма, или из ткани или клетки, в которой антитело существует или вырабатывается в естественных условиях, является "выделенным антителом" в рамках настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела являются антителами, которые были подвергнуты по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Согласно некоторым вариантам осуществления, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических соединений.

Термин "специфично связывает" или подобный означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образуют комплекс с антигеном, который является относительно устойчивым в физиологических условиях. Методы определения, связывается ли антитело с антигеном специфично, известны в уровне техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Например, антитело, которое "специфично связывает" IL-4R, при использовании в рамках настоящего изобретения, включает антитела, которые связывают IL-4R или его часть с K_D меньше чем приблизительно 1000 нМ, меньше чем приблизительно 500 нМ, меньше чем приблизительно 300 нМ, меньше чем приблизительно 200 нМ, меньше чем приблизительно 100 нМ, меньше чем приблизительно 90 нМ, меньше чем приблизительно 80 нМ, меньше чем приблизительно 70 нМ, меньше чем приблизительно 60 нМ, меньше чем приблизительно 50 нМ, меньше чем приблизительно 40 нМ, меньше чем приблизительно 30 нМ, меньше чем приблизительно 20 нМ, меньше чем приблизительно 10 нМ, меньше чем приблизительно 5 нМ, меньше чем приблизительно 4 нМ, меньше чем приблизительно 3 нМ, меньше чем приблизительно 2 нМ, меньше чем приблизительно 1 нМ или меньше чем приблизительно 0,5 нМ, при измерении с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса. Выделенное антитело, которое специфично связывает человеческий IL-4R, может, впрочем, обладать перекрестной реактивностью по отношению к другим антигенам, таким как молекулы IL-4R из других биологических видов (кроме человека).

Антитела против IL-4R, применимые в способах изобретения, могут включать одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замен и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 вставок и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 делеций) в каркасных и/или CDR областях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи по сравнению с соответствующими зародышевыми последовательностями, из которых были получены антитела. Такие мутации могут быть с легкостью выявлены при сравнении аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, с зародышевыми последовательностями, доступными, например, в общих базах данных последовательностей антител. Изобретение включает способы, включающие применение антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые получены из любой аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем описании, где одна или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) в одной или более каркасных и/или одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 в отношении тетрамерного антитела или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 в отношении HCVR и LCVR антитела) CDR областей подвергнуты мутации с заменой на соответствующий остаток(и) зародышевой последовательности, из которой антитело было получено, или на соответствующий остаток(и) другой человеческой зародышевой последовательности, или подвергнуты консервативной аминокислотной замене на соответствующий зародышевый остаток(и) (такие изменения последовательности совокупно указаны в настоящей заявке как "зародышевые мутации"). Средний специалист в данной области, начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелых и легких цепей, раскрытых в настоящей заявке, может легко получить многочисленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые включают одну или более индивидуальных зародышевых мутаций или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления все каркасные и/или CDR остатки в V_H и/или V_L доменах подвергнуты мутации с обратной заменой на остатки, присутствующие в исходной зародышевой последовательности, из которой было получено антитело. В других вариантах осуществления лишь некоторые остатки подвергнуты мутации с обратной заменой на остатки из исходной зародышевой последовательности, например, только мутированные остатки, присутствующие в пределах первых 8 аминокислот FR1 или в пределах последних 8 аминокислот FR4, или только мутированные остатки, присутствующие в CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более каркасных и/или CDR остатков подвергнуты мутации с заменой на соответствующий остаток(и) другой зародышевой последовательности (то есть зародышевой последовательности, которая отличается от зародышевый последовательности, из которой было первоначально получено антитело). Кроме того, антитела настоящего изобретения могут содержать любую комбинацию двух или более зародышевых мутаций в каркасных и/или CDR областях, например, где определенные индивидуальные остатки подвергнуты мутации с заменой на соответствующий остаток конкретной зародышевой последовательности, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной зародышевой последовательности, сохранены или подвергнуты мутации с заменой на соответствующий остаток другой зародышевой последовательности. После получения, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или более зародышевых мутаций, могут быть легко проверены на наличие одного или более требуемых свойств, таких как повышенная специфичность связывания, увеличенная аффинность связывания, повышенные или улучшенные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от обстоятельств), пониженная иммуногенность и т.д. Применение антител и антигенсвязывающих фрагментов, полученных таким общим способом, входит в объем настоящего изобретения.

Изобретение также включает способы, включающие применение антител против IL-4R, включающих варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящей заявке, которые содержат одну или более консервативных замен. Например, изобретение включает применение антител против IL-4R, имеющих аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или меньше, 8 или меньше, 6 или меньше, 4 или меньше и т.д. консервативными аминокислотными заменами в сравнении с любой из раскрытых в настоящей заявке аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR.

Термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ взаимодействий в реальном времени при обнаружении изменений концентраций белка в матрице биосенсора, например, при использовании системы BIAcore™ (Biacore Life Sciences, подразделение GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Термин "K_D" относится к равновесной константе диссоциации конкретного взаимодействия антигена-антитела.

Термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, который известен как паратоп. Один антиген может иметь больше одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями на антигене и могут производить различные биологические эффекты. Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образуют пространственно сближенные аминокислоты из различных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп формируют смежные аминокислотные остатки в полипептидной цепи. При некоторых обстоятельствах эпитоп на антигене может включать сахаридные группы, фосфорильные группы или сульфонильные группы.

Получение антител человека

Методы получения человеческих антител в трансгенных мышах известны из уровня техники. Любые подобные известные методы могут применяться в рамках изобретения для получения человеческих антител, которые специфично связываются с человеческим IL-4R.

С применением технологии VELOCIMMUNE™ (см., например, US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals) или любого другого известного метода получения моноклональных антител, первоначально выделяют высокоаффинные химерные антитела к IL-4R, которые имеют человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Технология VELOCIMMUNE^® включает создание трансгенной мыши, геном которой включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанные с эндогенными локусами константных областей мыши таким образом, что в ответ на стимуляцию антигеном мышь вырабатывает антитело, содержащее человеческую вариабельную область и мышиную константную область. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, выделяют, и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелой и легкой цепей человека. Затем ДНК экспрессируется в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело.

Как правило, мышь VELOCIMMUNE^® стимулируют целевым антигеном, после чего у мышей выделяют лимфатические клетки (такие как B-клетки), которые экспрессируют антитела. Лимфатические клетки могут быть слиты с линией клеток миеломы для получения иммортализованных линий клеток гибридом, после чего такие линии клеток гибридом подвергают скринингу и отбору с целью идентификации линий клеток гибридом, которые продуцируют антитела, специфичные к целевому антигену. ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, может быть выделена и связана с требуемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок антитела может продуцироваться в клетке, такой как клетка CHO. В альтернативе, ДНК, кодирующая антиген-специфичные химерные антитела или вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, может быть выделена непосредственно из антиген-специфичных лимфоцитов.

Первоначально выделяют высокоаффинные химерные антитела, имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Антитела анализируют и отбирают по требуемым свойствам, включающим аффинность, селективность, эпитоп и т.д., используя стандартные методики, известные специалистам. Мышиные константные области заменяют требуемой человеческой константной областью, получая полностью человеческое антитело, представленное в изобретении, например, IgG1 или IgG4 дикого типа или модифицированный. Хотя выбранная константная область может быть различной в зависимости от конкретного применения, такие характеристики, как высокоаффинное связывание антигена и специфичность к мишени, присущи вариабельной области.

Как правило, антитела, которые могут применяться в способах изобретения, обладают высокими аффинностями, как описано выше, при измерении посредством связывания с антигеном, который либо иммобилизован на твердой фазе, либо находится в фазе раствора. Мышиные константные области заменяют требуемыми человеческими константными областями с получением полностью человеческих антител, представленных в изобретении. Хотя выбранная константная область может быть различной в зависимости от конкретного применения, такие характеристики, как высокоаффинное связывание антигена и специфичность к мишени, присущи вариабельной области.

Определенные примеры человеческих антител или антигенсвязывающих фрагментов антител, которые специфично связывают IL-4R, которые могут применяться в рамках способов настоящего изобретения, включают любое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают три CDR тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), имеющей аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258 и 262. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут включать три CDR легкой цепи (LCVR1, LCVR2, LCVR3), содержащиеся в вариабельной области легкой цепи (LCVR), имеющей аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260 и 264. Способы и методики идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR известны в уровне техники и могут использоваться для идентификации CDR в указанных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрытых в настоящей заявке. Примерные правила, которые могут использоваться для установления границ CDR, включают, например, определение Кэбата, определение Чотиа и определение AbM. В общих виде, определение Кэбата основано на вариабельности последовательности, определение Чотиа основано на местоположении областей структурных петель, и определение AbM является компромиссом между подходами Кэбата и Чотиа. См., например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). Также доступны общие базы данных для идентификации последовательностей CDR в антителе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают шесть CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3) из пар аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (HCVR/LCVR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260 и 262/264.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают шесть CDR (HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3), имеющих аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4/6/8/12/14/16; 28/30/32/36/38/40; 52/54/56/60/62/64; 76/78/80/84/86/88; 100/102/104/108/110/112; 124/126/128/132/134/136; 148/150/152/156/158/160; 172/174/176/180/182/184; 196/198/200/204/206/208; 220/222/224/228/230/232; и 244/246/248/252/254/256.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260 и 262/264.

Фармацевтические композиции

Изобретение включает способы, которые включают введение антагониста IL-4R пациенту, где антагонист IL-4R содержится в фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции, представленные в изобретении, изготавливают с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами, которые обеспечивают подходящий перенос, доставку, переносимость и т.п. Множество подходящих составов можно найти в справочнике, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воска, масла, липиды, содержащие липид (катионный или анионный) везикулы (такие как LIPOFECTIN™), ДНК-конъюгаты, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии "масло в воде" и "вода в масле", эмульсии карбовакс (полиэтиленгликоли с различной молекулярной массой), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol., 52: 238-311.

Доза антитела, которое вводят пациенту согласно способам изобретения, может изменяться в зависимости от возраста и веса пациента, симптомов, состояний, пути введения и т.п. Предпочтительную дозу обычно вычисляют в соответствии с массой тела или площадью поверхности тела. В зависимости от тяжести состояния может быть скорректирована частота и продолжительность терапии. Эффективные дозы и схемы введения фармацевтических композиций, включающих антитела против IL-4R, могут быть определены опытным путем; например, изменение состояния пациента можно отслеживать при периодическом обследовании и в зависимости от этого корректировать дозу. Кроме того, межвидовой перевод дозировок может быть выполнен при использовании известных методов (например, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

Различные системы доставки известны и могут использоваться для введения фармацевтических композиций, представленных в изобретении, например, включение в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Способы введения включают, без ограничения перечисленными, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, внутритрахеальный, перидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить любым удобным путем, например, инфузией или болюсной инъекцией, посредством абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные выстилки (например, слизистую оболочку ротовой полости, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами.

Фармацевтическую композицию изобретения можно доставлять подкожно или внутривенно при помощи стандартной иглы и шприца. Кроме того, в отношении подкожной доставки, шприц-ручка может легко применяться при доставке фармацевтической композиции изобретения. Такая шприц-ручка может быть многоразового или одноразового применения. В шприц-ручке многоразового применения обычно используется сменный картридж, который содержит фармацевтическую композицию. После полного введения всей фармацевтической композиции в картридже, пустой картридж можно выбросить и заменить новым картриджем, который содержит фармацевтическую композицию. Шприц-ручку можно затем многократно использовать. В одноразовой шприц-ручке сменный картридж отсутствует. Вместо этого одноразовая шприц-ручка поставляется предварительно заполненной фармацевтической композицией, которая содержится в резервуаре внутри шприц-ручки. После того как фармацевтическая композиция в резервуаре кончается, все устройство выбрасывают.

Множество ручек многоразового применения и автоинъекторных устройств могут применяться при подкожной доставке фармацевтической композиции изобретения. Примеры включают, без ограничения, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), ручку HUMALOG MIX 75/25™, ручку HUMALOG™, ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), ручку BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), и это лишь немногие из них. Примеры одноразовых шприц-ручек, которые могут применяться при подкожной доставке фармацевтической композиции настоящего изобретения, включают, без ограничения, ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинъектор SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) и ручку HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), и это также лишь немногие из них.

В случае прямого введения в пазухи, фармацевтические композиции изобретения можно вводить при использовании, например, микрокатетера (например, эндоскопа и микрокатетера), аэрозольного генератора, дозатора порошка, небулайзера или ингалятора. Способы включают введение антагониста IL-4R субъекту, нуждающемуся в этом, в аэрозольной форме. Например, антителами к IL-4R в форме аэрозоля можно вводить для лечения астмы у пациента. Антитела в форме аэрозоля могут быть изготовлены, как описано, например, US 8178098, который полностью включен в настоящее описание.

В некоторых ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления может использоваться насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В другом варианте осуществления могут использоваться полимерные материалы; см., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть помещена вблизи от мишени композиции, что требует введения лишь некоторой части системной дозы (см., например, Goodson, 1984, в Medical Applications of Controlled Release, выше, том 2, стр. 115-138). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.

Препараты для инъекций могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельного вливания и т.д. Эти препараты для инъекций могут быть изготовлены известными методами. Например, препараты для инъекций могут быть изготовлены, например, посредством растворения, суспендирования или эмульгирования антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, стандартно используемых для инъекций. В качестве водной среды для инъекций применяют, например, физиологический солевой раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные вещества, и т.д., который может использоваться в комбинации с соответствующим солюбилизатором, таким как спирт (например, этанол), полиспирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, HCO-50 (аддукт полиоксиэтилена (50 моль) с гидрогенизированным касторовым маслом)] и т.д. В качестве масляной среды используют, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которое может использоваться в комбинации с солюбилизатором, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Препаратом для инъекций, изготовленным таким образом, предпочтительно заполняют подходящую ампулу.

Предпочтительно фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения, описанные выше, изготавливают в виде лекарственных форм с единичной дозой, подходящих для регулирования дозы активных компонентов. Такие лекарственные формы с единичной дозой включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, препараты для инъекций (ампулы), суппозитории и т.д.

Примеры фармацевтических композиций, включающих антитело против IL-4R, которые могут применяться в рамках изобретения, раскрыты, например, в публикации заявки на патент США 2012/0097565.

Дозировка

Количество антагониста IL-4R (например, антитела против IL-4R), вводимое субъекту согласно способам изобретения, является, как правило, терапевтически эффективным количеством. При использовании в настоящем описании, фраза "терапевтически эффективное количество" означает количество антагониста IL-4R, которое приводит к одному или более из следующего: (a) уменьшение частоты возникновения обострений астмы; (b) улучшение одного или более связанных с астмой параметров (как определено в другом месте в настоящем описании); и/или (c) обнаружимое улучшение одного или более симптомов или признаков воспалительного заболевания верхних дыхательных путей. "Терапевтически эффективное количество" также включает такое количество антагониста IL-4R, которое ингибирует, предотвращает, уменьшает или задерживает прогрессию астмы у субъекта.

В случае антитела против IL-4R, терапевтически эффективное количество может составлять от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 600 мг, например, приблизительно 0,05 мг, приблизительно 0.1 мг, приблизительно 1,0 мг, приблизительно 1,5 мг, приблизительно 2,0 мг, приблизительно 3,0 мг, приблизительно 5,0 мг, приблизительно 7,0 мг, приблизительно 10 мг, приблизительно 20 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 40 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 60 мг, приблизительно 70 мг, приблизительно 80 мг, приблизительно 90 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 110 мг, приблизительно 120 мг, приблизительно 130 мг, приблизительно 140 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 160 мг, приблизительно 170 мг, приблизительно 180 мг, приблизительно 190 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 210 мг, приблизительно 220 мг, приблизительно 230 мг, приблизительно 240 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 260 мг, приблизительно 270 мг, приблизительно 280 мг, приблизительно 290 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 310 мг, приблизительно 320 мг, приблизительно 330 мг, приблизительно 340 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 360 мг, приблизительно 370 мг, приблизительно 380 мг, приблизительно 390 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 410 мг, приблизительно 420 мг, приблизительно 430 мг, приблизительно 440 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 460 мг, приблизительно 470 мг, приблизительно 480 мг, приблизительно 490 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 510 мг, приблизительно 520 мг, приблизительно 530 мг, приблизительно 540 мг, приблизительно 550 мг, приблизительно 560 мг, приблизительно 570 мг, приблизительно 580 мг, приблизительно 590 мг или приблизительно 600 мг антитела против IL-4R. В некоторых вариантах осуществления вводят 300 мг антитела против IL-4R.

Количество антагониста IL-4R, содержащегося в индивидуальных дозах, может быть выражено в миллиграммах антитела на килограмм массы тела пациента (то есть мг/кг). Например, антагонист IL-4R можно вводить пациенту в дозе от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 мг/кг массы тела пациента.

Комбинированные терапии

Способы изобретения, согласно некоторым вариантам осуществления, включают введение субъекту одного или более дополнительных терапевтических средств в комбинации с антагонистом IL-4R. При использовании в настоящем описании, выражение "в комбинации с" означает, что дополнительные терапевтические средства вводят до, после или параллельно с фармацевтической композицией, включающей антагонист IL-4R. В некоторых вариантах осуществления термин "в комбинации с" включает последовательное или параллельное введение антагониста IL-4R и второго терапевтического средства. Настоящее изобретение включает способы лечения астмы или связанного состояния, или осложнения, или уменьшения по меньшей мере одного обострения, включающие введение антагониста IL-4R в комбинации со вторым терапевтическим средством для аддитивной или синергической активностью.

Например, при введении "до" фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R, дополнительное терапевтическое средство можно вводить за приблизительно 72 часа, приблизительно 60 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 12 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 4 часа, приблизительно 2 часа, приблизительно 1 час, приблизительно 30 минут, приблизительно 15 минут или за приблизительно 10 минут до введения фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R. При введении "после" фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R, дополнительное терапевтическое средство можно вводить через приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов или через приблизительно 72 часа после введения фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R. Введение "параллельно" с фармацевтической композицией, включающей антагонист IL-4R, подразумевает, что дополнительное терапевтическое средство вводят субъекту в отдельной лекарственной форме в пределах менее чем 5 минут (до, после или в то же время) от введения фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R, или вводят субъекту в виде одной комбинированной лекарственной формы, включающей и дополнительное терапевтическое средство, и антагонист IL-4R.

Дополнительное терапевтическое средство может быть, например, другим антагонистом IL-4R, антагонистом IL-1 (включая, например, антагонист IL-1, как изложено в патенте США 6,927,044), антагонистом IL-6, антагонистом IL-6R (включая, например, антитело против IL-6Р, как изложено в патенте США 7,582,298), антагонистом ФНО, антагонистом IL-8, антагонистом IL-9, антагонистом IL-17, антагонистом IL-5, антагонистом IgE, антагонистом CD48, ингибитором лейкотриена, противогрибковым средством, НПВС, бета₂-агонистом длительного действия (например, салметеролом или формотеролом), ингаляционным кортикостероидом (например, флутиказоном или будесонидом), системным кортикостероидом (например, пероральным или внутривенным), метилксантином, недокромилом натрия, кромолином натрия или их комбинациями. Например, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию, включающую антагонист IL-4R, вводят в комбинации с комбинацией, включающей бета₂-агонист длительного действия и ингаляционный кортикостероид (например, флутиказон + салметерол [например, Адваир® (GlaxoSmithKline)]; или будесонид + формотерол [например, Симбикорт® (Astra Zeneca))]).

Схемы введения

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, многократные дозы антагониста IL-4R можно вводить субъекту в течение определенного периода времени. Такие способы включают последовательное введение субъекту многократных доз антагониста IL-4R. При использовании в настоящем описании, "последовательное введение" означает, что каждую дозу антагониста IL-4R вводят субъекту в различные моменты времени, например, в различные дни, разделенные заданным интервалом (например, часами, днями, неделями или месяцами). Настоящее изобретение включает способы, которые включают последовательное введение пациенту одну начальную дозу антагониста IL-4R с последующим введением одной или более вторичных доз антагониста IL-4R и, необязательно, с последующим введением одной или более третичных доз антагониста IL-4R.

Изобретение включает способы, включающие введение субъекту фармацевтической композиции, включающей антагонист IL-4R, с частотой введения приблизительно четыре раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в пять недель, один раз в шесть недель, один раз в восемь недель, один раз в двенадцать недель или реже, пока не будет достигнут терапевтический ответ. В некоторых вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в неделю дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в две недели дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в три недели дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в четыре недели дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в пять недель дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в шесть недель дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в восемь недель дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. В других вариантах осуществления, включающих введение фармацевтической композиции, включающей антитело против IL-4R, может использоваться введение один раз в двенадцать недель дозы в количестве приблизительно 75 мг, 150 мг или 300 мг. Предпочтительный путь введения является подкожным.

Термин "неделя" или "недели" относится к периоду (n×7 дней) ± 2 дня, предпочтительно (n×7 дней) ± 1 день, более предпочтительно (n×7 дней), где "n" определяет число недель, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 или больше.

Термины "начальная доза", "вторичная доза" и "третичная доза" относятся к временной последовательности введения антагониста IL-4R. Таким образом, "начальная доза" является дозой, которую вводят в начале схемы лечения (также ее называют "исходной дозой"); "вторичные дозы" являются дозами, которые вводят после начальной дозы; и "третичные дозы" являются дозами, которые вводят после вторичных доз. Начальные, вторичные и третичные дозы могут содержать одинаковое количество антагониста IL-4R, но обычно могут отличаться друг от друга по частоте введения. Впрочем, в некоторых вариантах осуществления, количество антагониста IL-4R, содержащегося в начальной, вторичной и/или третичной дозах, различается (например, его увеличивают или снижают, при необходимости) в ходе лечения. В некоторых вариантах осуществления, две или более (например, 2, 3, 4 или 5) доз вводят в начале схемы лечения в качестве "насыщающих доз", сопровождаемых последующими дозами, которые вводят с меньшей частотой (например, "поддерживающие дозы"). В одном варианте осуществления поддерживающая доза может быть меньше насыщающей дозы. Например, можно вводить одну или более 600 мг насыщающих доз антагониста IL-4R с последующим введением поддерживающих дозами от приблизительно 75 мг до приблизительно 300 мг.

В одном примере осуществления изобретения каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-14 (например, через 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 1 1, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½ или больше) недель после непосредственно предшествующей дозы. Фраза "непосредственно предшествующая доза" означает, в последовательности многократных введения, дозу антагониста IL-4R, которую вводят пациенту до введения ближайшей последующей дозы в последовательности, без введения промежуточных доз.

Способы могут включать введение пациенту любого количества вторичных и/или третичных доз антагониста IL-4R. Например, в некоторых вариантах осуществления пациенту вводят только одну вторичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) вторичных доз. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления пациенту вводят только одну третичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) третичных доз.

В вариантах осуществления, включающих многократные вторичные дозы, каждую вторичную дозу можно вводить с такой же частотой, что и другие вторичные дозы. Например, каждую вторичную дозу можно вводить пациенту через 1-2 недели после непосредственно предшествующей дозы. Аналогичным образом, в вариантах осуществления, включающих многократные третичные дозы, каждую третичную дозу можно вводить с такой же частотой, что и другие третичные дозы. Например, каждую третичную дозу можно вводить пациенту через 2-4 недели после непосредственно предшествующей дозы. В альтернативе, частота, с которой пациенту вводят вторичные и/или третичные дозы, в ходе лечения может изменяться. Частоту введения в ходе лечения также может корректировать врач в зависимости от потребностей индивидуального пациента после клинического обследования.

Изобретение включает способы, включающие последовательное введение антагониста IL-4R и второго терапевтического средства пациенту для лечения астмы или связанного состояния. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение одной или более доз антагониста IL-4R с последующим введением одной или более доз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) второго терапевтического средства. Например, можно вводить одну или более доз от приблизительно 75 мг до приблизительно 300 мг антагониста IL-4R, после чего можно вводить одну или более доз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) второго терапевтического средства (например, ингаляционного кортикостероида или бета₂-агониста, или любого другого терапевтического средства, как описано в другом месте в настоящей заявке) для лечения, частичного снятия, облегчения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов астмы. В некоторых вариантах осуществления антагонист IL-4R вводят в одной или более дозах (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше), что приводит к улучшению одного или более связанных с астмой параметров, с последующим введением второго терапевтического средства для предотвращения рецидива по меньшей мере одного симптома астмы. Альтернативные варианты осуществления относятся к параллельному введению антагониста IL-4R и второго терапевтического средства. Например, вводят одну или более доз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) антагониста IL-4R, после чего второе терапевтическое средство вводят в отдельной дозе, с такой же или другой частотой по сравнению с антагонистом IL-4R. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство вводят до, после или одновременно с антагонистом IL-4R.

Группы лечения

Способы изобретения включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, включающей антагонист IL-4R. Выражение "субъект, нуждающийся в этом" означает человека или не относящееся к человеку животное, у которых проявляется один или более симптомов или признаков астмы (например, эозинофильной астмы, включая умеренную - тяжелую эозинофильную астму), или у которых диагностировали астму. Например, "субъект, нуждающийся в этом" может включать, например, субъектов, которые до лечения демонстрируют (или демонстрировали) один или более связанных с астмой параметров, таких как, например, нарушенный ОФВ1 (например, меньше 2,0 л), нарушенный ПСВу (например, меньше 400 л/мин), нарушенный ПСВв (например, меньше 400 л/мин), оценка ACQ5 по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 1 пробуждение за ночь, и/или оценка SNOT-22 по меньшей мере 20. В различных вариантах осуществления могут применяться способы лечения умеренной, умеренной - тяжелой и тяжелой астмы у пациентов, нуждающихся в этом.

В связанном варианте осуществления "субъект, нуждающийся в этом" может быть субъектом, которому до приема антагониста IL-4R был предписан прием, или который в настоящее время принимает, комбинацию ингаляционного кортикостероида (ИКС)/бета₂-адренергического антагониста длительного действия (БАДД). Примеры терапии ИКС/БАДД включают комбинированную терапию флутиказоном/салметеролом и комбинированную терапию будесонидом/формотеролом. Например, изобретение включает способы, которые включают введение антагониста IL-4R пациенту, который проходил регулярный курс ИКС/БАДД в течение двух или более недель, непосредственно предшествующих введению антагониста IL-4R (такие предшествующие терапии именуются в настоящем описании как "базисные лечения"). Изобретение включает терапевтические способы, в которых базисные лечения приостанавливают во время или непосредственно перед (например, за 1 день - 2 недели перед) первым введением антагониста IL-4R. В альтернативе базисные лечения могут быть продолжены в комбинации с введением антагониста IL-4R. В других вариантах осуществления количество компонента ИКС, компонента БАДД или обоих компонентов постепенно уменьшают до или после начала введения антагониста IL-4R. В некоторых вариантах осуществления изобретение включает способы лечения пациентов с персистирующей астмой в течение по меньшей мере ≥12 месяцев. В одном варианте осуществления пациент с персистирующей астмой может быть резистентен к лечению таким терапевтическим средством, как кортикостероид, и при этом ему могут вводить антагонист IL-4R согласно настоящим способам.

В некоторых вариантах осуществления "субъект, нуждающийся в этом" может быть субъектом с повышенными уровнями связанного с астмой биомаркера. Примеры связанных с астмой биомаркеров включают, без ограничения перечисленными, IgE, тимусом и активацией регулируемый хемокин (TARC), эотаксин-3, РЭА, YKL-40 и периостин. В некоторых вариантах осуществления "субъект, нуждающийся в этом" может быть субъектом с уровнем эозинофилов в крови ≥300/мкл или с уровнем эозинофилов в мокроте ≥3%. В одном варианте осуществления "субъект, нуждающийся в этом" может быть субъектом с повышенным уровнем воспаления бронхов или дыхательных путей, согласно измерению фракционного выдыхаемого оксида азота (ФВОА).

В рамках изобретения нормальный уровень IgE у здоровых субъектов составляет меньше чем приблизительно 100 кЕд/л (например, при измерении с использованием теста ImmunoCAP^® [Phadia, Inc. Portage, MI]). Таким образом, изобретение включает способы, включающие отбор субъекта, который демонстрирует повышенный уровень IgE сыворотки, который является уровнем IgE сыворотки больше чем приблизительно 100 кЕд/л, больше чем приблизительно 150 кЕд/л, больше чем приблизительно 500 кЕд/л, больше чем приблизительно 1000 кЕд/л, больше чем приблизительно 1500 кЕд/л, больше чем приблизительно 2000 кЕд/л, больше чем приблизительно 2500 кЕд/л, больше чем приблизительно 3000 кЕд/л, больше чем приблизительно 3500 кЕд/л, больше чем приблизительно 4000 кЕд/л, больше чем приблизительно 4500 кЕд/л или больше чем приблизительно 5000 кЕд/л, и введение субъекту фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество антагониста IL-4R.

Уровни TARC у здоровых субъектов находятся в пределах от 10⁶ нг/л до 431 нг/л, со средним значением приблизительно 239 нг/л (примером системы анализа для измерения уровня TARC является набор для количественного определения TARC методом ELISA, предоставляемый под номером DDN00 по каталогу R&D Systems, Minneapolis, MN). Таким образом, изобретение включает способы, включающие отбор субъекта, который демонстрирует повышенный уровень TARC, который является уровнем TARC в сыворотке больше чем приблизительно 431 нг/л, больше чем приблизительно 500 нг/л, больше чем приблизительно 1000 нг/л, больше чем приблизительно 1500 нг/л, больше чем приблизительно 2000 нг/л, больше чем приблизительно 2500 нг/л, больше чем приблизительно 3000 нг/л, больше чем приблизительно 3500 нг/л, больше чем приблизительно 4000 нг/л, больше чем приблизительно 4500 нг/л или больше чем приблизительно 5000 нг/л, и введение субъекту фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество антагониста IL-4R.

Эотаксин-3 относится к группе хемокинов, секретируемых эпителиальными клетками дыхательных путей, и регулируется Th2 цитокинами IL-4 и IL-13 (Lilly et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol., 104: 786-790). Изобретение включает способы, включающие введение антагониста IL-4R для лечения пациентов с повышенными уровнями эотаксина-3, например, больше чем приблизительно 100 пг/мл, больше чем приблизительно 150 пг/мл, больше чем приблизительно 200 пг/мл, больше чем приблизительно 300 пг/мл или больше чем приблизительно 350 пг/мл. Уровни эотаксин-3 в сыворотке можно измерить, например, с помощью ELISA.

Периостин является белком внеклеточного матрикса, участвующим в Th2-опосредованных воспалительных процессах. Уровни периостина, как было установлено, повышены у пациентов с астмой (Jia et al., 2012 J. Allergy Clin. Immunol., 130:647-654.e10. doi: 10.1016/j.jaci.2012.06.025. Epub 2012 Aug 1). Настоящее изобретение включает способы, включающие введение антагониста IL-4R для лечения пациентов с повышенными уровнями периостина.

Фракционный выдыхаемый NO (ФВОА) является биомаркером воспаления бронхов или дыхательных путей. ФВОА вырабатывается эпителиальными клетками дыхательных путей в ответ на воспалительные цитокины, включающие IL-4 и IL-13 (Alwing et al., 1993, Eur. Respir. J., 6: 1368-1370). Уровни ФВОА у здоровых взрослых изменяются в пределах 2-30 миллиардных долей (млрд.д.). Примером анализа для измерения ФВОА является анализ с использованием аппарата NIOX (Aerocrine AB, Solna, Sweden). Оценку можно проводить до спирометрии и после воздержания от приема пищи, по меньшей мере в течение часа. Изобретение включает способы, включающие введение антагониста IL-4R пациентам с повышенными уровнями выдыхаемый NO (ФВОА), например, больше чем приблизительно 30 млрд.д., больше чем приблизительно 31 млрд.д., больше чем приблизительно 32 млрд.д., больше чем приблизительно 33 млрд.д., больше чем приблизительно 34 млрд.д. или больше чем приблизительно 35 млрд.д.

Раково-эмбриональный антиген (РЭА) является онкомаркером, который, как было установлено, коррелировал с не связанными с новообразованиями болезнями легких (Marechal et al 1988, Anticancer Res. 8: 677-680). Уровни РЭА в сыворотке могут быть измерены с помощью ELISA. Изобретение включает способы, включающие введение антагониста IL-4R пациентам с повышенными уровнями РЭА, например, больше чем приблизительно 1,0 нг/мл, больше чем приблизительно 1,5 нг/мл, больше чем приблизительно 2,0 нг/мл, больше чем приблизительно 2,5 нг/мл, больше чем приблизительно 3,0 нг/мл, больше чем приблизительно 4,0 нг/мл или больше чем приблизительно 5,0 нг/мл.

YKL-40 [названный по его N-концевым аминокислотам: тирозину (Y), лизину (K) и лейцину (L), и его молекулярной массе 40 кДа] представляет собой хитиназа-подобный белок, повышение уровня которого, как было обнаружено, коррелировало с обострением астмы, IgE и эозинофилами (Tang et al., 2010, Eur. Respir. J., 35: 757-760). Уровни YKL-40 в сыворотке измеряют, например, с помощью ELISA. Изобретение включает способы, включающие введение антагониста IL-4R пациентам с повышенными уровнями YKL-40, например, больше чем приблизительно 40 нг/мл, больше чем приблизительно 50 нг/мл, больше чем приблизительно 100 нг/мл, больше чем приблизительно 150 нг/мл, больше чем приблизительно 200 нг/мл или больше чем приблизительно 250 нг/мл.

Эозинофилы и нейтрофилы в индуцированной мокроте являются известными прямыми маркерами воспаления дыхательных путей (Djukanovic et al., 2002, Eur. Respire. J., 37: 1S-2S). Отделение мокроты вызывают путем ингаляции над гипертоническим раствором хлорида натрия, а затем в мокроте подсчитывают клетки в соответствии с известными методами, например, согласно методическим указаниям Европейского Респираторного Общества. Изобретение включает способы, включающие введение антагониста IL-4R пациентам с повышенными уровнями эозинофилов в мокроте, например, больше чем приблизительно 2,5% или больше чем приблизительно 3%.

Способы оценки связанных с астмой фармакодинамических параметров

Изобретение также включает способы оценки одного или более связанных с астмой фармакодинамических параметров у субъекта, нуждающегося в этом, вызванных введением фармацевтической композиции, включающей антагонист рецептора интерлейкина 4 (IL-4R). Уменьшение частоты возникновения обострения астмы (как описано выше) или улучшения одного или более связанных с астмой параметров (как описано выше) может коррелировать с улучшением одного или более связанных с астмой фармакодинамических параметров, однако такая корреляция не должна обязательно соблюдаться во всех случаях.

Примеры "связанных с астмой фармакодинамических параметров" включают, например, следующее: (a) уровни экспрессии биомаркеров; (b) анализ белка сыворотки и РНК; (c) уровни эозинофилов и нейтрофилов в индуцированной мокроте; (d) выдыхаемый оксид азота (ФВОА); и (e) содержание эозинофилов в крови. "Улучшение связанного с астмой фармакодинамического параметра" означает, например, уменьшение относительно базового уровня одного или более биомаркеров, таких как TARC, эотаксин-3 или IgE, уменьшение эозинофилов или нейтрофилов в мокроте, ФВОА, или содержания эозинофилов крови. При использовании в настоящем описании, термин "базовый уровень", в отношении связанного с астмой фармакодинамического параметра, означает числовое значение связанного с астмой фармакодинамического параметра у пациента до или во время введения фармацевтической композиции, представленной в изобретении.

Для оценки связанного с астмой фармакодинамического параметра, параметр определяют количественно на базовом уровне и в момент времени после введения фармацевтической композиции настоящего изобретения. Например, связанный с астмой фармакодинамический параметр может быть измерен в день 1, день 2, день 3, день 4, день 5, день 6, день 7, день 8, день 9, день 10, день 11, день 12, день 14 или в неделю 3, неделю 4, неделю 5, неделю 6, неделю 7, неделю 8, неделю 9, неделю 10, неделю 1 1, неделю 12, неделю 13, неделю 14, неделю 15, неделю 16, неделю 17, неделю 18, неделю 19, неделю 20, неделю 21, неделю 22, неделю 23, неделю 24 или больше, после первоначального применения в лечении фармацевтической композиции настоящего изобретения. Различие между значением параметра в конкретной точке времени после начала лечения и значением параметра на базовом уровне используют для определения, имело ли место изменение, такое как "улучшение", связанного с астмой фармакодинамического параметра (например, увеличение или уменьшение, в зависимости от обстоятельств, в зависимости от определенного измеряемого параметра).

В некоторых вариантах осуществления введение антагониста IL-4R пациенту вызывает изменение, такое как уменьшение или увеличение, экспрессии конкретного биомаркера. Связанные с астмой биомаркеры включают следующее: (a) общий IgE; (b) тимусом и активацией регулируемый хемокин (TARC); (c) YKL-40 и (d) раково-эмбриональный антиген (РЭА (CEA), также известный как CEA молекула клеточной адгезии 5 [CEACAM5]) в сыворотке и (e) эотаксин-3 в плазме. Например, введение антагониста IL-4R пациенту с астмой может вызвать одно или более из уменьшения уровней TARC или эотаксина-3, или уменьшения уровней общего IgE сыворотки. Уменьшение может быть обнаружено в неделю 1, неделю 2, неделю 3, неделю 4, неделю 5 или более после введения антагониста IL-4R. Экспрессия биомаркера может быть проанализирована с помощью методов, известных в уровне техники. Например, уровни белка могут быть измерены с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), или уровни РНК могут быть измерены при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Экспрессия биомаркера, как обсуждается выше, может быть проанализирована посредством обнаружения белка или РНК в сыворотке. Образцы сыворотки также могут использоваться для контроля дополнительных белковых или РНК биомаркеров, связанных с ответом на терапию антагонистом IL-4R, IL-4/IL-13 сигнализацией, астмой, атопическими или эозинофильными заболеваниями (например, посредством измерения растворимого IL-4Rα, IL-4, IL-13, периостина). В некоторых вариантах осуществления образцы РНК используются для определения уровней РНК (негенетический анализ), например, уровней РНК биомаркеров; а в других вариантах осуществления образцы РНК используются для секвенирования транскриптомов (например, генетического анализа).

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предложены для предоставления средним специалистам полного раскрытия и описания того, как можно осуществить и применить способы и композиции, представленные в изобретении, и не должны ограничивать объем того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Были предприняты усилия по обеспечению точности в отношении используемых чисел (например, величин, температуры и т.д.), однако следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части являются частями по весу, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура указана в градусах Цельсия, а давление равно или приблизительно равно атмосферному.

Пример 1. Создание человеческих антител к человеческому IL-4R

Антитела человека против hIL-4R были созданы, как описано в патенте США 7608693. В Таблице 1 приведены идентификаторы последовательностей для пар аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, а также аминокислотных последовательностей CDR, выбранных антител против IL-4R и обозначения соответствующих им антител.

Таблица 1 SEQ ID NO: Обозначение антитела HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Н1Н095-а 2 4 6 8 10 12 14 16 Н1Н095-b 18 4 6 8 20 12 14 16 Н1Н095-c 22 4 6 8 24 12 14 16 Н1Н097-а 26 28 30 32 34 36 38 40 Н1Н097-b 42 28 30 32 44 36 38 40 Н1Н097-c 46 28 30 32 48 36 38 40 Н1Н093-а 50 52 54 56 58 60 62 64 Н1Н093-b 66 52 54 56 68 60 62 64 Н1Н093-c 70 52 54 56 72 60 62 64 H1H093-d 74 76 78 80 82 84 86 88 Н1Н093-е 90 76 78 80 92 84 86 88 H1H093-f 94 76 78 80 96 84 86 88 Н1Н094-а 98 100 102 104 106 108 110 112 H1H094-b 114 100 102 104 116 108 110 112 Н1Н094-c 118 100 102 104 120 108 110 112 Н1Н096-а 122 124 126 128 130 132 134 136 H1H096-b 138 124 126 128 140 132 134 136 Н1Н096-c 142 124 126 128 144 132 134 136 Н1Н098-а 146 148 150 152 154 156 158 160 H1H098-b 162 148 150 152 164 156 158 160 H1H098-c 166 148 150 152 168 156 158 160 H1H099-a 170 172 174 176 178 180 182 184 H1H099-b 186 172 174 176 188 180 182 184 H1H099-c 190 172 174 176 192 180 182 184 H4H083-a 194 196 198 200 202 204 206 208 H4H083-b 210 196 198 200 212 204 206 208 H4H083-c 214 196 198 200 216 204 206 208 H4H121-a 218 220 222 224 226 228 230 232 H4H121-b 234 220 222 224 236 228 230 232 H4H121-c 238 220 222 224 240 228 230 232 H4H118-a 242 244 246 248 250 252 254 256 H4H118-b 258 244 246 248 260 252 254 256 H4H118-c 262 244 246 248 264 252 254 256

Примером антагониста IL-4R, используемого в следующих Примерах, является человеческое антитело против IL-4R, обозначенное в Таблице 1 как H1H098-b (также именуется в настоящей заявке как "mAb1").

Пример 2: Клиническое исследование вводимого подкожно антитела против IL-4R (mAb1) У больных персистирующей умеренной - тяжелой эозинофильной астмой, включая больных астмой с хроническим гиперпластическим эозинофильным синуситом

A. Цели и краткий обзор исследования

Рандомизированное, плацебо-контролируемое, двойное слепое исследование в параллельных группах проводили с подкожным введением один раз в неделю либо 300 мг mAb1, либо плацебо, в течение 12 недель, пациентам с персистирующей умеренной - тяжелой эозинофильной астмой, которая являлась частично контролируемой/неконтролируемой посредством терапии ингаляционными кортикостероидами (ИКС) и бета₂-агонистами длительного действия (БАДД). Основная цель исследования состояла в изучении эффектов mAb1, которое вводили подкожно, раз в неделю, в течение 12 недель, по сравнению с плацебо в отношении снижения частоты развития обострений астмы у пациентов с персистирующей умеренной - тяжелой эозинофильной астмой. Дополнительные цели исследования состояли в оценке безопасности и переносимости mAb1, которое вводили подкожно, раз в неделю, в течение 12 недель, у пациентов с персистирующей умеренной - тяжелой эозинофильной астмой, и в оценке концентрации mAb1 в сыворотке после подкожного введения, раз в неделю, в течение 12 недель, у пациентов с персистирующей умеренной - тяжелой эозинофильной астмой.

Перед скринингом пациенты должны были постоянно принимать любую из следующих доз и композиций комбинированной терапии ИКС/БАДД (также называемой "базисной терапией") в течение по меньшей мере 1 месяца:

Комбинированная терапия флутиказоном/салметеролом

- Advair® Diskus - ингалятор сухого порошка (DPI): 250/50 мкг два раза в день или 500/50 мкг два раза в день; или

- Advair® HFA - дозирующий ингалятор (MDI): 230/42 мкг два раза в день или 460/42 мкг два раза в день; или

Комбинированная терапия будесонидом/формотеролом (Симбикорт® 160/9 мкг два раза в день или 320/9 мкг два раза в день); или

Комбинированная терапия мометазоном/формотеролом (Дулера® 200/10 мкг два раза в день или 400/10 мкг два раза в день).

Пациентов, принимавших будесонид/формотерол или мометазон/формотерол, переводили на эквивалентную дозу флутиказона/салметерола при рандомизации (День 1), а пациентов, которые принимали флутиказон/салметерол, продолжали принимать тоже в качестве базисной терапии.

Пациентов, которые удовлетворяли критериям включения и исключения (см. ниже), рандомизировали в группу с одной из следующих терапий: 300 мг mAb1, которое вводили подкожно, раз в неделю, в течение 12 недель; или плацебо, которое вводили подкожно, раз в неделю, в течение 12 недель.

Исследование включало 2-недельный период скрининга, 12-недельный период лечения, включающий стабильную фазу 4-недельной базисной терапии, и 8-недельную базисную терапию фазы отмены после рандомизации, сопровождаемую 8-недельным периодом наблюдения после лечения.

Алгоритм отмены базисной терапии (ИКС/БАДД):

Пациенты продолжали курс базисной терапии флутиказоном/салметеролом, два раза в день, в течение 4 недель после начальной дополнительной терапии или лечения с 300 мг mAb1 (или плацебо). Через 4 недели после рандомизации, пациентов переводили с комбинированной терапии флутиказоном/салметеролом два раза в день на эквивалентную дозу монотерапии флутиказоном ИКС (включающей либо Flovent® Diskus - DPI композицию, 250 мкг или 500 мкг два раза в день; или Flovent® HFA - MDI композицию, 220 мкг или 440 мкг два раза в день). Компонент БАДД (то есть салметерол) отменяли. При последующих посещениях, начиная с недели 6, дозу флутиказона понижали приблизительно на 50%, при условии, что пациент не соответствовал ни одному из критериев обострения астмы (как определено ниже). Если обострения астмы не возникали, отмену ИКС проводили согласно следующей схеме приема:

Стабильная фаза базисной терапии Фаза отмены базисной терапии Неделя 4 Неделя 6 Неделя 7 Неделя 8 Неделя 9 Флутиказон/салметерол (DPI): 250/50 мкг BID Флутиказон (DPI): 250 мкг BID 100 мкг BID 50 мкг BID 0 мкг BID 0 мкг BID Флутиказон/салметерол (DPI): 500/50 мкг BID Флутиказон (DPI): 500 мкг BID 250 мкг BID 100 мкг BID 50 мкг BID 0 мкг BID Флутиказон/салметерол (MDI): 230/42 мкг BID Флутиказон (MDI): 220 мкг BID 110 мкг BID 44 мкг BID 0 мкг BID 0 мкг BID Флутиказон/салметерол (MDI): 460/42 мкг BID Флутиказон (MDI): 440 мкг BID 220 мкг BID 110 мкг BID 44 мкг BID 0 мкг BID BID - два раза в день

После завершения 12 недель лечения с применением исследуемого продукта (или после преждевременного прекращения), пациентов переводили на их исходную дозу флутиказона/салметерола, будесонида/формотерола или мометазона/формотерола (доза на начало участия в исследовании) и альбутерола или левалбутерола, при необходимости контроля их симптомов в течение еще 8 недель приема лекарственных препаратов в исследовании перед заключительной оценкой безопасности.

Взрослых пациентов включали в исследование исходя из следующих критериев: (1) поставленный врачом диагноз персистирующей астмы на протяжении по меньшей мере ≥12 месяцев, основанный на руководстве Глобальной инициативы по бронхиальной астме (GINA) 2009, с вероятным эозинофильным воспалением дыхательных путей; и (2) астма поддается частичному контролю или не поддается контролю с применением комбинированной терапии ингаляционными кортикостероидами/бета-агонистами длительного действия в соответствии со следующими критериями: (i) постоянная доза либо комбинированной терапии флутиказоном/салметеролом (DPI композиция: 250/50 мкг два раза в день или 500/50 мкг два раза в день, или MDI композиция: 230/42 мкг два раза в день или 460/42 мкг два раза в день), либо комбинированной терапии будесонидом/формотеролом (160/9 мкг два раза в день или 320/9 мкг два раза в день), либо комбинированной терапии мометазоном/формотеролом (200/10 мкг два раза в день или 400/10 мкг два раза в день) в течение по меньшей мере 1 месяца до скрининга; (ii) эозинофилы крови ≥300 клеток/мкл или эозинофилы мокроты ≥3% в ходе фазы скрининга; (iii) оценка по Опроснику контроля астмы (вариант с 5 вопросами, ACQ, Juniper) ≥1,5 и ≥3,0 при скрининге; (iv) ОФВ1 ≥50% от расчетного нормального значения в ходе фазы скрининга (максимум 3 попытки) и в день рандомизации до приема первой дозы (максимум 3 попытки); (v) имел в течение 2 лет до скрининга или лечения одним или более системными (пероральными и/или парентеральными) стероидами приступы с ухудшением астмы или помещение в стационар, или приход работников скорой медицинской помощи в связи с ухудшением астмы; и (vi) зарегистрированный случай обратимости в течение 12 месяцев после скрининга, который удовлетворяет критерию - по меньшей мере 12% и 200 мл в ОФВ1 после приема от 200 мкг до 400 мкг (2-4 ингаляции) альбутерола в ходе фазы скрининга (максимум 3 попытки), или зарегистрированный случай положительной провокации метахолином (PD20 метахолина ≤8 мг) в течение 12 месяцев до скрининга. Пациенты с умеренной - тяжелой астмой, которая поддается частичному контролю или не поддается контролю умеренными - высокими дозами комбинированной терапии ингаляционными кортикостероидами и бета-агонистами длительного действия (Адваир®, Симбикорт® или Дулера®) и с содержанием эозинофилов в крови, больше или равным 300 клеток в микролитре, или эозинофилов в мокроте, больше или равным 3% в ходе фазы скрининга, были включены в исследование.

Пациенты, которые удовлетворяли всем критериям включения, участвовали в скрининге по следующим критериям исключения: (1) пациенты младше 18 лет или старше 65 лет; (2) клинически значимые отклонения от нормы в результатах лабораторных анализов, которые могут указывать на неизвестную болезнь и требуют дополнительной оценки; (3) хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и/или другие болезни легких, нарушающие результат тестов функции легких; (4) пациенты, нуждающиеся в блокаторах бета-адренергических рецепторов по какой-либо причине; (5) курение или отказ от курения в течение 6 месяцев до скрининга; (6) курение в прошлом с анамнезом курения >10 пачек сигарет-лет; (7) госпитализация в стационаре или приход работников скорой помощи из-за обострения астмы за последние 2 месяца до скрининга; (8) планы по началу аллерговакцинации в течение исследования; (9) воздействие другого экспериментального антитела в течение периода времени до скрининга продолжительностью меньше 5 полупериодов существования антитела, но не меньше 30 дней, или, если полупериод существования антитела не известен, то в течение периода времени до скрининга, которое составляет по меньшей мере 6 месяцев; (10) предыдущая регистрация в текущем исследовании; (11) пациент был исследователем, члены его семьи, или служащим в исследовательском центре; (12) известное или подозреваемое несоблюдение режима, употребление алкоголя или наркотическая зависимость; (13) неспособность выполнять процедуры исследования (например, вследствие языковых трудностей или психологических нарушений); (14) измененный режим сна (например, рабочий ночной смены); (15) лечение лекарственными средствами, удлиняющими интервал QTc; (16) сопутствующее тяжелое заболевание(я), при котором противопоказано применение ИКС (например, активный или неактивный туберкулез легких) или БАДД (например, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, гипертония, гипертиреоз, тиреотоксикоз и т.д.); (17) применение инъекционных глюкокортикостероидов или пероральных системных глюкокортикостероидов в течение 2 месяцев до скрининга или больше чем 3 курса в течение 6 месяцев до скрининга; (18) предварительное лечение переменными дозами ИКС, отдельно или в комбинации с нестероидным препаратом базисной терапии (кроме комбинированной терапии флутиказоном/салметеролом, комбинированной терапии будесонидом/формотеролом или комбинированной терапии мометазоном/формотеролом); (19) прием запрещенных сопутствующих лекарственных препаратов (перечисленных ниже); (20) известная аллергия на доксициклин или родственные соединения; (21) беременность или планируемая беременность в течение исследования, кормление грудью или нежелание использовать эффективный метод контрацепции; и (22) недавний случай паразитарной инфекции или путешествие в эндемическую область распространения паразитов в течение 6 месяцев до скрининга.

Пациенты оставались на постоянной дозе базисной терапии астмы в течение первых четырех недель исследования, после чего дозу базисной терапии постепенно понижали. Сначала в неделю 4 отменили бета-агонист длительного действия - компонент базисной терапии, а затем дозу ингаляционного кортикостероида понижали наполовину каждые 2 недели до недели 12. Пациенты продолжали лечение в исследовании до конца исследования или пока они не выбывали вследствие обострения астмы или по какой-либо другой причине.

B. Лечение в исследовании

Исследуемый продукт: Стерильный раствор mAb1 150 мг/мл для п/к инъекций, в стеклянном флаконе объемом 5 мл. Каждый флакон содержал отбираемый объем 2 мл. Дозу 300 мг вводили подкожно в исследовательском центре, раз в неделю, утром, в течение 12 недель.

Плацебо: Стерильное плацебо для п/к инъекций было предоставлено в одинаково подобранном стеклянном флаконе объемом 5 мл. Каждый флакон содержал отбираемый объем 2 мл. Плацебо вводили подкожно в исследовательском центре, раз в неделю, утром, в течение 12 недель.

В течение всего исследования не разрешался прием следующих сопутствующих лекарственных препаратов: любой другой ингаляционный стероид кроме комбинированной терапии флутиказоном/салметеролом или флутиказона, который вводят в протоколе (или будесонид/формотерол, или мометазон/формотерол в течение периода скрининга); системные или глазные стероиды; другие БАДД кроме салметерола, компонента комбинированной терапии флутиказоном/салметеролом, которую вводят в протоколе; любые другие комбинированные продукты ИКС/БАДД кроме приведенных выше; любые ингаляционные антихолинергические средства (например, бромид ипратропия или тиотропий); метилксантины (теофиллин, аминофиллины); кромоны; анти-IgE терапия; ингибиторы липоксигеназы; и антагонисты рецепторов лейкотриенов или ингибиторы синтеза лейкотриенов.

C. Эффективность лечения

Основным конечным показателем данного исследования являлось возникновение обострения астмы, определяемое любым из следующего: (1) 30%-ое или большее уменьшение относительно базового уровня пиковой скорости выдоха утром (ПСВ) за два последовательных дня; или (2) шесть или более дополнительных вдохов аэрозоля альбутерола или левалбутерола для облегчения дыхания в течение 24 часов (по сравнению с базовым уровнем) за 2 последовательных дня; или (3) ухудшение астмы, определяемое исследователем, требующее: (a) системной (пероральной и/или парентеральной) терапии стероидами, или (b) увеличения последней дозы ИКС, полученной до прекращения участия в исследовании, в ≥4 раза, или (c) госпитализации.

Дополнительные конечные показатели исследования включали средние изменения относительно базового уровня следующих параметров: (1) Объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) в литрах, измеряемый при каждом посещении; (2) Пиковая скорость выдоха утром и вечером (ПСВу и ПСВв) в литрах/минуту, измеряемые ежедневно; (3) Ежедневное использование альбутерола/левалбутерола в ингаляциях/день; (4) Оценка по Опроснику контроля над астмой, из пяти пунктов (ACQ5), при каждом посещении; (5) Пробуждения в ночное время (раз за ночь), измеряемые ежедневно; и (6) Оценка в Тесте на исход болезней носа и околоносовых пазух, из 22 пунктов (SNOT-22), на базовом уровне и в конце лечения (в Неделю 12), для оценки симптомов в верхних дыхательных путях. Дополнительные конечные показатели также включали процент больных со смешанным случаем астмы, определяемым по 30% или большему снижению относительно базового уровня ПСВ утром за два последовательных дня в сочетании с ≥6 дополнительными вдохами аэрозоля альбутерола или левалбутерола для облегчения дыхания в течение 24-часового периода по сравнению с базовым уровнем за 2 последовательных дня. ПСВ, ACQ5, оценки симптомов астмы, пробуждения ночью и использование препаратов для облегчения дыхания фиксировали в электронном ежедневнике. Среднее количество пробуждений в ночное время, в пределах от 0-10, усредняли за предыдущие 7 дней. Утренние и вечерние оценки симптомов астмы состояли из неподтверждаемого, сообщаемого пациентом результата, оцениваемого по лайкертовской шкале из 5 пунктов, где более высокая оценка соответствовала более плохому исходу (Таблица 2). Пациенты регистрировали общие оценки симптомов два раза в день до измерения ПСВ. Данные описаны как среднее значение за 7 дней до указанного момента (см., например, Фигуры 26A и 26B).

Таблица 2
Оценка симптомов астмы A) Утренняя оценка симптомов: 0 = Отсутствие симптомов астмы, сон в течение ночи 1 = Хороший сон, но некоторые жалобы утром. Ночью не было пробуждений 2 = Одно пробуждение из-за астмы (включая раннее пробуждение) 3 = Несколько пробуждений из-за астмы (включая раннее пробуждение) 4 = Плохая ночь, пробуждения большую часть ночи из-за астмы B) Вечерняя оценка симптомов: 0 = Очень хорошо, никаких симптомов астмы 1 = Один случай хрипа, кашля или одышки 2 = Более одного случая хрипа, кашля или одышки без нарушения повседневной деятельности 3 = Хрипы, кашель или одышка большую часть дня с некоторым нарушением повседневной деятельности 4 = Астма очень тяжелая. Неспособность выполнять повседневные действия как обычно

D. Контроль нежелательных явлений

Безопасность в ходе исследования оценивали посредством мониторинга Нежелательных явлений и Тяжелых нежелательных явлений.

Нежелательное явление (AE) представляет собой любой нежелательный медицинский случай у субъекта или субъекта клинического исследования, которому ввели фармацевтический продукт. Таким образом AE может быть любым нежелательным и непредусмотренным признаком (включая отклоняющиеся от нормы данные лабораторного анализа), симптомом или заболеванием, связанными по времени с применением лекарственного средства, независимо от того, считают ли его связанным с лекарственным (исследуемым) средством. AE также включают: любое ухудшение (то есть любое клинически значимое изменение частоты и/или интенсивности) существовавшего ранее состояния, которое связано по времени с применением исследуемого препарата; отклоняющиеся от нормы данные лабораторного анализа, которые исследователь считает клинически значимыми; и любое нежелательный медицинский случай.

Тяжелое нежелательное явление (SAE) представляет собой любое нежелательный медицинский случай, который при любой дозе приводит к смерти; является опасным для жизни; требует госпитализации в стационаре или продления текущей госпитализации; приводит к постоянной или существенной потере дееспособности или к инвалидности; является врожденной аномалией/врожденным пороком; или является важным медицинским явлением.

E. Статистические методы

Для первичного анализа доли пациентов, испытывающих обострение астмы, модель логистической регрессии использовали для сравнения группы SAR с плацебо. Модель включала сроки лечения и фактор стратификации (предыдущая доза комбинированной терапии ИКС/БАДД). Первичный анализ проводили на основе модифицированной группы с назначенным лечением (mITT), которая включала всех рандомизированных пациентов, которые получали по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства (ИЛС). Стратифицированный критерий хи-квадрат также использовали для подтверждения первичного анализа.

Что касается дополнительных конечных критериев эффективности, за исключением SNOT-22, изменение относительно базового уровня анализировали при использовании модели смешанного эффекта с методом многократных измерений (MMRM). Модель включала изменение относительно базовых значений до недели 12 в качестве переменных реакции, а также факторы (фиксированные эффекты) лечения, фактор стратификации, посещения, зависимость лечения от посещения, базовое значение и зависимость базового значение от посещения. Статистические выводы при сравнении лечения по изменению относительно базового уровня в неделю 12 были получены из модели смешанного эффекта. Изменение в SNOT-22 относительно базового уровня анализировали при использовании ковариационного анализа (ANCOVA), с использованием измерений в конце лечения для замены недостающих данных. Фармакодинамические эффекты оценивали, используя модель MMRM в апостериорном методе. Поправки на множественность не вводили, поскольку присутствовал только один основной конечный параметр и анализ. Переменные безопасности, включая AE, лабораторные показатели, жизненные признаки, кардиограмму, клинические лабораторные наблюдения и объективное обследование обобщали при использовании описательной статистики.

Демографические и клинические показатели обобщали, используя описательные характеристики. Диаграммы дополнительных и фармакодинамических переменных представлены как среднее изменение относительно базовых значений с течением времени со стандартной ошибкой. Сравнение эффектов лечения из MMRM анализа основано на среднем изменении наименьших квадратов (95% доверительный интервал [CI]) относительно базового уровня в Неделю 12.

F. Результаты

Результаты, наблюдаемые у всех 104 рандомизированных пациентов (из 491, прошедших скрининг), которые завершили или досрочно приостановили фазу лечения в исследовании, представлены ниже. Все рандомизированные пациенты проходили лечение в исследовании и были включены в группу mITT. Базовые показатели были аналогичными между группами. Демографические и клинические показатели также были аналогичными между этими двумя группами (Таблица 3). Как отмечено выше, пациенты проходили лечение либо mAb1, 300 мг подкожно, один раз в неделю, либо получали плацебо. Период лечения в исследовании был завершен на 86,5% и 67,3% у пациентов, получавших mAb1 и плацебо, соответственно (Фигура 25). Наиболее распространенной причиной досрочного прекращения являлась недостаточная эффективность, что было более частым в случае плацебо (21,2%), нежели mAb1 (1,9%).

Таблица 3
Базовые демографические и клинические показатели групп лечения* Переменная Плацебо
(N=52) mAb1 300 мг
(N=52) Возраст (лет) 41,6±13,1 37,8±13,2 Мужской пол, кол-во (%) 26 (50,0) 26 (50,0) Раса или этническая группа Белые 38 (73,1) 45 (86,5) Черные или афроамериканцы 9 (17,3) 5 (9,6) Азиаты 3 (5,8) 1 (1,9) Прочие 2 (3,8) 1 (1,9) Индекс массы тела Средний (кг/м²) 31,6±7,0 31,3±8,0 ≥30, кол-во (%) 25 (48,1) 24 (46,2) Продолжительность астмы (лет) 26,9±14,8 24,2±12,6 Кол-во обострений астмы за посл. 2 года 1,4±1,3 1,4±1,0 Предыдущая доза комбинированной терапии ИКС/БАДД, кол-во (%) Высокая доза 41 (78,8) 42 (80,8) Низкая доза 11 (21,2) 10 (19,2) Эозинофилы крови (×10^-9/л) 0,47±0,21 0,55±0,19 ОФВ₁ (л) 2,54±0,66 2,47±0,65 ОФВ₁ (% от расчетного объема) 72,0±12,7 72,0±12,6 ПСВ (л/мин) Утром 406,9±110,7 393,0±101,1 Вечером 416,6±116,8 414,6±102,3 Оценка ACQ5 2,1±0,5 2,1±0,5 Оценка симптомов астмы Утром 0,73±0,63 0,75±0,81 Вечером 1,12±0,73 0,92±0,71 Пробуждения в ночное время за сутки 0,21±0,50 0,44±0,80 SNOT-22 26,2±15,6 30,9±14,8 Кол-во вдохов аэрозоля альбутерола или левалбутерола за 24-часовой период 2,0±1,8 2,2±2,4 ФВОА (млрд.д.) 35,0±27,1 37,6±28,1 TARC (пг/мл) 470,5±204,7 496,1±342,4 Эотаксин-3 (пг/мл) 117,3±349,2 75,4±44,0 IgE (МЕ/мл) 694,7±1837,8 657,7±1482,3 *Плюс-минус значения - средние ± SD, за исключением случаев, когда указано иное. ACQ5 обозначает Опросник контроля над астмой (вариант с 5 вопросами), ФВОА - фракция выдыхаемого оксида азота, ОФВ₁ - объем форсированного выдоха за 1 секунду, IgE - иммуноглобулин E, ПСВ - пиковая скорость выдоха, SNOT-22 - Тест на исход болезней носа и околоносовых пазух из 22 пунктов, и TARC - тимусом и активацией регулируемый хемокин.

(i) Основной конечный критерий эффективности

Частота обострений астмы в группах лечения плацебо и mAb1 представлена в Таблице 4.

Таблица 4
Частота обострений астмы в группе mITT Плацебо (N=52) mAb1 (N=52) Пациенты, не имевшие обострений астмы 29 (55,8%) 49 (94,2%) Пациенты, имевшие обострения астмы 23 (44,2%) 3 (5,8%) Отношение несогласия с плацебо (95% CI) - 0,077 (0,021, 0,279)

В течение периода лечения было в общей сложности 26 обострений астмы, при этом ни одного пациента по поводу обострений астмы не госпитализировали. В группе плацебо обострение астмы было у 23 пациентов (44,2%), тогда как в группе лечения mAb1 обострение астмы испытали только 3 пациента (5,8%). Отношение несогласия составило 0,077 (p<0,0001), и относительное снижение риска - приблизительно 87%.

Из 26 обострений астмы, которые пациенты испытали в ходе данного исследования, 9 считались тяжелыми, что проявлялось в потребности немедленного вмешательства в форме лечения либо системными кортикостероидами, либо ингаляционными кортикостероидами в 4 или больше раз более высокой дозе, чем принимали до последнего случая. Сводка частоты тяжелых обострений астмы представлена в Таблице 5.

Таблица 5
Частота тяжелых обострений астмы в группе mITT Плацебо (N=52) mAb1 (N=52) Пациенты, не имевшие обострений астмы 29 (55,8%) 49 (94,2%) Пациенты, имевшие тяжелые обострения астмы 8 (15,4%) 1 (1,9%) Пациенты, имевшие нетяжелые обострения астмы 15 (28,8%) 2 (3,8%)

Как показано в Таблице 5, восемь тяжелых обострений астмы наблюдали в группе плацебо, и только 1 тяжелое обострение астмы наблюдали в группе лечения mAb1. Остальные 15 обострений астмы в группе плацебо и 2 в группе mAb1 соответствовали определению протокола обострения, основанного на пониженном ПСВ утром и/или повышенном применении альбутерола/левалбутерола. Как показано в Таблице 6, в группы активного лечения длительное улучшение в сравнении с базовым уровнем в ходе исследования наблюдали по всем параметрам, несмотря на отмену стероидов.

Таблица 6
Случаи обострений Исход Плацебо
(N=52) mAb1
(N=52) ≥30% снижения ПСВу относительно базового уровня в течение 24-часового периода за 2 последовательных дня 10* (19,2) 1 (1,9) ≥6 дополнительных ингаляций альбутерола/левалбутерола в течение 24-часового периода за 2 последовательных дня 10 (19,2) 1 (1,9) Лечение системными стероидами 5 (9,6) 1 (1,9) ≥4-кратное увеличение приема ИКС по сравнению с предыдущей дозой 3 (5,8) 0 Госпитализация 0 0 *4 пациента, получавших плацебо, соответствовали критериям ПСВ и лечения системными стероидами, и 1 пациент, получавший плацебо, соответствовал критериям ПСВ и увеличения применения альбутерола/левалбутерола.

В случае mAb1, период времени до обострения был более продолжительным (Фигура 1), причем риск обострения был ниже по сравнению с плацебо (отношение опасности 0,10; 95% CI 0,03, 0,34; P<0,001). Анализ времени до обострения астмы с помощью графика Каплана-Мейера показал, что эффект от лечения mAb1 сохранялся в течение длительного времени, в том числе через 8 недель, когда пациенты были подвержены более высокому риску развития обострений вследствие отмены стероидов (Фигура 1).

Лишь 1 пациент из группы плацебо имел смешанный случай астмы. Смешанный случай астмы определен как 30% или большее снижение относительно базового уровня ПСВ утром за 2 последовательных дня в сочетании с ≥6 дополнительными вдохами аэрозоля альбутерола или левалбутерола в течение 24-часового периода (по сравнению с базовым уровнем) за 2 последовательных дня.

(ii) Другие конечные критерии эффективности

Параметры функции легких (ОФВ1, ПСВу и ПСВв), основанные на симптомах астмы конечные показатели (оценка ACQ, пробуждения ночью) и применение альбутерола оценивали у каждого пациента при каждом посещении. Результаты, наблюдаемые для этих параметров (еженедельно изменение относительно базового уровня), представлены на Фигурах 2-7, соответственно. Кроме того, оценку SNOT-22 получали на базовом уровне и в конце лечения. Для всех параметров, средние базовые значения и средние значения в неделю 12 (LOCF), а также среднее различие между группами лечения (модель ANOVA для SNOT-22) приведены в Таблице 7. В Таблице 7 колонка, обозначенная "Различие с плацебо", отражает скорректированное по плацебо значение относительно базового уровня, которое учитывает изменения, которые наблюдали в отношении значения параметра, в сравнении с изменениями, которые наблюдали для того же параметра в группе, получавшей плацебо.

Таблица 7
Дополнительные параметры функции легких и оценки симптомов N Среднее базовое значение (SD) Среднеквадра-тическое изменение
(SD) Различие с плацебо p-значение ОФВ1 (л) Плацебо 52 2,54 (0,66) -0,22 (0,06) - mAb1 52 2,47 (0,65) 0,05 (0,06) 0,27 (0,11, 0,42) 0,0009 ПСВу (л/мин) Плацебо 52 406,9 (110,7) -20,7 (9,1) - mAb1 51 393,0 (101,1) 13,9 (8,8)† 34,6 (10,6, 58,5) 0,0051 ПСВв (л/мин) Плацебо 51 416,6 (116,8) -18,4 (8,9)† - mAb1 52 414,6 (102,3) 4,3 (8,5) 22,7 (-0,7, 46,0) 0,0567 Применение альбутерола (доз аэрозоля в день) Плацебо 52 2,0 (1,8) 0,7 (0,3) - mAb1 50 2,2 (2,4) -1,3 (0,3)‡ -2,0 (-2,9, -1,2) <0,0001 Оценка ACQ Плацебо 52 2,08 (0,52) -0,27 (0,16) - mAb1 52 2,09 (0,46) -1,00 (0,16) -0,73 (-1,15, -0,30) 0,0011 Пробуждений в ночное время (раз за ночь) Плацебо 52 0,2 (0,5) 0,1 (0,1) - mAb1 52 0,4 (0,8) -0,2 (0,1) -0,2 (-0,5, -0,0) 0,0518 Средний балл SNOT22 Плацебо 51 26,24 (15,62) 0,23 (2,15)† - mAb1 50 30,92 (14,77) -8,26 (2,20)‡ -8,49 (-13,96, -3,03) 0,0027 † 51 пациент по меньшей мере с 1 оценкой после базового уровня.
‡ 50 пациентов по меньшей мере с 1 оценкой после базового уровня.

Лечение mAb1 привело к существенному изменению относительно базового уровня значений ОФВ1 в Неделю 1, который сохранялся в течение Недели 12 (Фигура 2) несмотря на отмену БАДД и ИКС, с небольшим уменьшением ОФВ1 в Неделю 5, совпавшим с отменой БАДД. Подобные улучшения наблюдали в отношении ПСВу и, но уже в меньшей степени, ПСВв (Фигуры 3 и 4). Среднеквадратическое (LS) изменение относительно базового уровня до недели 12 значения ОФВ1 составило -0,22 л для плацебо и 0,05 л для группы mAb1. (p=0,0009).

Оценка ACQ5 улучшилась в обеих группах лечения в Неделю 1 (Фигура 6). Однако, несмотря на большее улучшение ACQ5 в группе mAb1 между Неделями 1 и 4, эффект плацебо стабилизировался с сохранением различия вплоть до Недели 12.

Утренние оценки симптомов увеличивались относительно базового уровня до Недели 12 в группе плацебо. В случае mAb1, наблюдали первоначальное уменьшение, которое оставалось ниже базового уровня вплоть до Недели 12 (Фигура 26A). Подобный профиль (с большей вариабельностью) наблюдали в отношении вечерних оценок симптомов астмы (Фигура 26B).

Пробуждения ночью были стабильными в группе плацебо в течение Недели 6, затем возрастали с Недели 6 до 12. Напротив, пробуждения ночью уменьшались в группе mAb1 с Недели 1 и оставались улучшенными относительно базового уровня в течение Недели 12 (Фигура 7).

Изменения в использовании альбутерола/левалбутерола (Фигура 5) соответствовали другим дополнительным конечным показателям: начальное уменьшение с последующим возвращением на базовый уровень с плацебо. В случае mAb1 начальное уменьшение сохранялось с течением времени.

Наблюдалось незначительное различие на базовом уровне между значениями SNOT-22, со средней оценкой для плацебо 26,24 и средней оценкой для mAb1 39,02. В неделю 12, среднее LS изменение было небольшим увеличением в 0,23 пунктов для группы плацебо и средним уменьшением (улучшением) в 8,26 пунктов для группы mAb1. Это соответствовало величине улучшения в 8,49 пунктов для группы mAb1 (p=0,0027).

Таблица 8
Дополнительные конечные показатели Исход Плацебо
(N=52) mAb1
(N=52) Различие с плацебо
(95% CI)** P-значение Оценка Каплана-Мейера на 12 недель 46,0
(31,8, 60,2) 5,8
(0,0, 2,1) 0,10
(0,03 - 0,34) <0,001 Изменение оценок симптомов астмы утром, с базового уровня до недели 12 0,3±0,1 -0,4 ± 0,1 -0,7
(-0,9 - -0,4) <0,001 Изменение оценок симптомов астмы вечером, с базового уровня до недели 12 0,1±0,1 -0,6 ± 0,1 -0,7
(-0,9 - -0,4) <0,001

Таблица 9
Изменение Относительно базового уровня в Неделю 12 оценки SNOT-22, соответствующей заболеванию верхних дыхательных путей Подшкала SNOT-22 Среднеквадратическое изменение ± стандартная ошибка Различие с плацебо (95% CI) P-значение Плацебо
(N=52) mAb1
(N=52) Потребность высморкаться -0,25±0,17* 0,95±0,17† -0,70 (-1,13, -0,26) 0,002 Заложенность носа -0,20±0,19* -0,94±0,19† 0,75 (-1,22, -0,28) 0,002 Пониженная чувствительность запаха/вкуса 0,04±0,18* -1,13±0,18† -1,16 (-1,62, -0,71) <0,001 *51 и †50 пациентов с по меньшей мере 1 оценкой после базового уровня, соответственно

В отношении всех дополнительных конечных показателей, измерения на Неделе 12 говорили в пользу лечения mAb1 и были значимыми, за исключением ПСВ вечером и пробуждений ночью (Таблица 7 и 8). Существенные улучшения с mAb1 также наблюдали для трех пунктов SNOT-22, соответствующих заболеванию верхних дыхательных путей (Таблица 9).

(iii) Безопасность

В целом mAb1 было безопасным и хорошо переносилось. О нежелательных явлениях, возникших в процессе лечения (TEAE), сообщили так же 40 (76,9%) пациентов, получавших плацебо, и 42 (80,8%) пациента, проходящих лечение mAb1 (Таблица 10). Явления TEAE были неспецифическими, обычно от слабой до умеренной интенсивности, при этом в большинстве они проявлялись в конце исследования. Увеличение сообщений последующих TEAE наблюдали для mAb1 по сравнению с плацебо: о реакциях на участке инъекции сообщали 15 (28,8%) пациентов mAb1 и 5 пациентов плацебо (9,6%); о назофарингите сообщали 7 (13,5%) пациентов mAb1 и 2 пациента плацебо (3,8%); о головной боли сообщали 6 (11,5%) пациентов mAb1 и 3 (5,85%) пациента плацебо, и о тошноте сообщали 4 (7,7%) пациента mAb1 и 1 (1,9%) пациент плацебо.

Таблица 10
Нежелательные явления Нежелательное явление Плацебо (N=52) mAb1 (N=52) Кол-во пациентов (%) Любое нежелательное явление 40 (76,9) 42 (80,8) Любое тяжелое нежелательное явление 3 (5,8) 1 (1,9) Досрочное прекращение участия в исследовании вследствие возникшего нежелательного явления 3 (5,8) 3 (5,8) Смерть 0 0 Наиболее частые НЯ* Реакции на участке инъекции† 5 (9,6) 15 (28,8) Назофарингит 2 (3,8) 7 (13,5) Инфекция верхних дыхательных путей 9 (17,3) 7 (13,5) Головная боль 3 (5,8) 6 (11,5) Тошнота 1 (1,9) 4 (7,7) Реакции, напоминающие укусы членистоногих 0 3 (5,8) Мышечные спазмы 0 3 (5,8) Заложенность носа 1 (1,9) 3 (5,8) Сыпь 1 (1,9) 3 (5,8) Крапивница 0 3 (5,8) Вирусная инфекция верхних дыхательных путей 0 3 (5,8) * ≥3 пациентов в любой группе лечения по термину предпочтительного употребления
† реакция на участке инъекции включает следующие явления: боль на участке инъекции, реакция на участке инъекции, покраснение на участке инъекции, сыпь на участке инъекции, гематома на участке инъекции, крапивница на участке инъекции, дерматит на участке инъекции, воспаление на участке инъекции, узелок на участке инъекции, зуд на участке инъекции и припухлость участка инъекции.

В течение исследования не было зарегистрировано ни одного смертельного случая. Из 4 сообщенных тяжелых нежелательных явлений, возникших в процессе лечения (SAE): 1 пациент mAb1 страдал биполярным расстройством, и 3 пациента плацебо испытывали явления SAE, типичные для астмы, вследствие пневмонии, огнестрельного ранения с левосторонним пневмотораксом и перелома правой лодыжки. Ни один из этих SAE не считали связанными с IMP и все, кроме недавнего перелома лодыжки, выздоровели к концу исследования. Не было ни одного смертельного случая.

В общей сложности 6 пациентов прервали участие в исследовании из-за TEAE: 3 пациента в группе mAb1 (биполярное расстройство, астма с хрипами и ангионевротический отек) и 3 пациента в группе плацебо (инфекция верхних дыхательных путей, псориаз и астма). TEAE ангионевротический отек возник у 42-летней афроамериканки после девятой дозы лечения в исследовании и проявился в виде зудящей, папулезной сыпи, наблюдаемой на участке инъекции и на некотором удалении от него. Отек сохранялся в течение одной недели и прошел после прекращения лечения в исследовании и терапии преднизоном и дифенгидрамином. Это явление посчитали связанным с лечением. Это НЯ возникало после появления легкой сыпи на участке инъекции после первой и шестой доз лечения в исследовании.

Среди наиболее частых НЯ, наблюдаемых у ≥3 пациентов в любой группе лечения (Таблица 10), реакции на участке инъекции, назофарингит, тошнота и головная боль возникали чаще в случае mAb1, чем плацебо. Ни о каких клинически значимых изменениях показателей жизненно важных функций, объективного осмотра, данных клинических лабораторных анализов или ЭКГ не сообщали ни в одной группе.

G. Заключение

Наблюдали существенные улучшения функции легких и других параметров контроля астмы. Эффективность наблюдалась с ранних этапов и сохранялась, несмотря на отмену базисной терапии. Относительное снижение приблизительно на 87% (p<0,0001) по основному конечному показателю частоты возникновения обострений астмы у пациентов с персистирующей, умеренной - тяжелой астмой с эозинофилией наблюдали после 12-недельного лечения 300 мг mAb1 раз в неделю (5,8%) по сравнению с плацебо (44,2%). Как показано в Таблице 7, клинически и статистически значимые (без поправки на множественность) улучшения при лечении по сравнению с плацебо наблюдали в отношении показателей функции легких (ОФВ1, ПСВу), оценок симптомов астмы (ACQ) и применения альбутерола. Положительные тенденции наблюдали для ПСВв (p=0,0567) и пробуждений в ночное время (p=0,0518). Статистически значимое (без поправки на множественность) улучшение также наблюдали для оценки SNOT-22. В основной группе лечения длительное улучшение относительно базового уровня в течение исследования наблюдали для всех показателей, несмотря на отмену ИКС и БАДД. В целом mAb1 было безопасным и хорошо переносилось.

Пример 3: Биомаркерные исследования

Биомаркерный анализ проводили на пробах, полученных от субъектов, которые участвовали в клинических испытаниях mAb1 (см. Пример 2, выше). В частности, биомаркеры сыворотки/плазмы, связанные с TH2 воспалением, такие как тимусом и активацией регулируемый хемокин (TARC; CCL17), иммуноглобулин E (IgE), эотаксин-3, периостин, раково-эмбриональный антиген (РЭА), YKL-40 и эозинофилы крови, измеряли в пробах пациентов на базовом уровне и в различные точки времени после начала лечения в исследовании. Базовые уровни этих биомаркеров оценивали по потенциальному прогностическому значению для реакции на лечение. Кроме того, фракцию выдыхаемого NO (ФВОА) и эозинофилы и нейтрофилы в индуцированной мокроте измеряли в качестве биомаркерой бронхиального воспаления. Оценку выдыхаемого оксида азота проводили до спирометрии и после воздержания от приема пищи в течение по меньшей мере 1 часа, используя прибор NIOX (Aerocrine AB, Solna, Sweden). Биомаркеры анализировали, используя смешанную модель, ниже приведены средние значения, полученные методом наименьших квадратов на основе данной модели.

Субъектам с астмой (N=104) подкожно вводили либо mAb1 (300 мг), либо плацебо, в дни 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 и 78 исследования (то есть 12 еженедельных доз) (см. Пример 2). Пробы для биомаркерного анализа забирали у субъектов, получавших антитело и плацебо, в неделю 0, 1, 4, 8 и 12. Антигенспецифичный IgE детектировали, используя тест Phadiatop^®.

TARC, эотаксин-3 и IgE оставались неизменными в ответ на плацебо (Фигуры 8, 9 и 10). Напротив, быстрое снижение TARC (среднее % изменение -22,7% в сравнении с +0,3%; p=0,0003) (Фигура 8) и эотаксина-3 (среднее % изменение -39,62% в сравнении с 12,69%; p<0,0001) (Фигура 9) наблюдалось в течение одной недели у пациентов, получавших mAb1, и сохранялось до недели 12: TARC: -26,0% в сравнении с +7,6% плацебо (p=0,0005); Эотаксин-3: -45,67% в сравнении с +5,13% плацебо (p<0,0001).

Уровни TARC изменялись в течение недели в ответ на воздействие mAb1, которое вводили подкожно в дозе 300 мг. Уровни TARC выходили на плато приблизительно при 50% от базового уровня у получавших mAb1 субъектов, несмотря на отмену ИКС. Данные позволяют предположить, что экспрессия TARC более непосредственно связана с сигнализацией IL-4R, нежели с изменениями ОФВ1 (который понижается параллельно с отменой ИКС [после Недели 4]), и что блокирование IL-4R вызывает изменение сигнатуры TH1, как наблюдали, например, при введении ИФН-гамма. Можно было бы титровать дозу mAb1, используя TARC (и, например, CXCL10), в особенности у пациентов, требующих длительного лечения и подверженных риску развития иммунных заболеваний TH1-типа.

Общий IgE сыворотки также снизился после лечения mAb1. Ответ общего IgE сыворотки был более гетерогенным и отсроченным по сравнению с ответом TARC. Средние (SD) базовые уровни IgE составляли 694,68 МЕ/л (1837,82) для группы плацебо (n=52) и 657,66 (1482,25) для группы mAb1 (n=52), тогда как медианное значение составляло 169,95 для группы плацебо и 206,15 для группы mAb1. Несмотря на такую гетерогенность, наблюдали тенденцию к уменьшению IgE у пациентов, получавших mAb1, по сравнению с плацебо, однако только начиная с недели 4. IgE сыворотки значительно снизился в группе mAb1 по сравнению с плацебо (среднее % изменение -10,1% в сравнении с +13,5%; p=0,0325), начиная с недели 4, и продолжал снижаться до недели 12 (среднее % изменение -36,8% для REGN668/SAR231893 в сравнении с -5,5% для плацебо; p<0,0001) (Фигура 10).

Все изменения относительно базового уровня и плацебо в Неделю 12 для ФВОА, TARC, эотаксин-3 и IgE говорили в пользу mAb1 (все P<0,001) (Таблица 11). Никакие различия относительно базового уровня или между группами лечения не наблюдали для YKL-40 или РЭА.

Таблица 11
Процентное изменение относительно базового уровня в Неделю 12 по фармакодинамическим конечным показателям Исход Среднеквадратическое процентное изменение ± стандартная ошибка P-значение Плацебо
(N=52) mAb1
(N=52) ФВОА 35,0±10,8 28,7±11,2 <0,001 TARC 7,6±6,9 -26,0±6,9 <0,001 Эотаксин-3 5,1±4,7 -45,7±4,7 <0,001 IgE 5,5±3,6 -36,8±3,6 <0,001 Эозинофилы крови 2,7±15,8 41,6±15,7 0,078

Наблюдалось транзиентное уменьшение уровней периостина, сопровождаемое повышением при отмене БАДД/ИКС (Фигура 11). Введение mAb1 задерживало повышение, но не предотвращало повышение выше базового уровня. Никакого согласуемого эффекта лечения не наблюдали в случае РЭА (Фигура 12) и YKL-40 (Фигура 13). Содержание эозинофилов в крови оставалось неизменным в течение Недели 6, но затем повышалось в Недели 8 и 12 (Фигура 14). Содержание эозинофилов в периферической крови не изменялось на плацебо в течение всего лечения. Различие между лечением не было значимым, с пограничным увеличением, которое было вызвано более существенным повышением эозинофилов в крови лишь у нескольких пациентов, получавших mAb1. У большинства пациентов наблюдали слабое повышение или же таковое отсутствовало (Таблица 12).

Таблица 12
Процент пациентов, достигших пороговых значений изменений уровней эозинофилов в крови Изменение эозинофилов Количество (%) пациентов Плацебо (n=52) mAb1 (n=52) >15% увеличение 13 (30,2) 21 (47,7) 15% увеличение - 0% изменения 7 (16,3) 6 (16,6) 0% - 15% увеличение 8 (18,6) 4 (9,1) 15% - 100% увеличение 13 (30,2) 6 (13,6) 100% - 200% увеличение 2 (4,7) 3 (6,8) >200% увеличение 0 4 (9,1)

Поскольку только 3 пациента mAb1 испытывали обострение астмы в ходе исследования, невозможно сделать вывод относительно связи между базовыми уровнями биомаркеров и обострениями астмы.

Лечение mAb1 также было связано с существенным уменьшением относительно базового уровня значений ФВОА в Неделю 4, при этом ФВОА оставался ниже базового уровня вплоть до Недели 12, независимо от отмены ИКС (среднее % изменение в неделю 12: -28,7 для mAb1 и 35,0 для плацебо; p<0,0001) (Фигура 15). Напротив, значения ФВОА в группе плацебо оставались стабильными до Недели 8, с последовавшим увеличением в Неделю 12, совпавший с отменой ИКС.

Улучшение объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) значимо коррелировало со снижением ФВОА (r=-0,408, p=0,009) в неделю 12 (Фигура 16). Аналогично улучшения ПСВу и ПСВв коррелировали со снижением ФВОА (Фигуры 17 и 18). Другие корреляции с ФВОА не были значимыми. См. Таблицу 13.

Таблица 13
Корреляция между ОФВ1 и PD конечными показателями Исход Корреляция P-значение ФВОА -0,408 <0,009 TARC -0,248 0,10 Эотаксин-3 -0,146 0,34 IgE -0,279 0,06 Эозинофилы крови 0,165 0,28

Анализ диаграммы рассеяния базовых уровней эозинофилов в сравнении с изменением ОФВ1 относительно базового уровня в неделю 12, как оказалось, не позволил связать базовые уровни эозинофилов и эффект лечения, измеряемый по изменению ОФВ1 относительно базового уровня в неделю 12 в группе исследования (базовый уровень эозинофилов ≥0,3×10⁹/л) (Фигура 19). Базовый уровень эозинофилов коррелировал с уменьшением ACQ (Фигура 20) и уменьшением применения альбутерола/левалбутерола (Фигура 21). Периостин и YKL-40 на базовом уровне коррелировали с уменьшением ACQ (Фигуры 22 и 23).

Изменение ОФВ1 относительно базового уровня в неделю 12 сочеталось с отменой ИКС (начиная с недели 4). Подобные исследования не позволили связать базовые уровни TARC или IgE и изменение ОФВ1 относительно базового уровня в неделю 12 в группе исследования (базовый уровень эозинофилов ≥0,3×10⁹/л).

Выводы

Эти результаты показывают, что mAb1 вызывало значительное уменьшение биомаркеров сыворотки, связанных с Th2 воспалением (TARC, эотаксин-3 и IgE) и бронхиальным воспалением (ФВОА) у взрослых пациентов с астмой. Корреляция между снижением ФВОА и улучшением ОФВ1 указывает на взаимосвязь между IL-4/IL-13 опосредованной противовоспалительной активностью и улучшением легочной функции при умеренной - тяжелой, неконтролируемой астме.

Объем настоящего изобретения не должен ограничиваться конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящей заявке. Более того, различные модификации, в дополнение к описанным в настоящей заявке, станут очевидны специалистам в данной области из предыдущего описания и сопровождающих фигур. Такие модификации должны быть включены в объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 4: Блокада сигнального пути IL-4/IL-13 ингибирует выработку IgE и ремоделирование дыхательных путей в модели на мышах эозинофильной астмы, индуцированной аллергенами пылевых клещей

ВВЕДЕНИЕ

Было показано, что аллерген пылевого клеща (HDM) вызывает Th2 иммунный ответ, включая приток Th2-клеток в легкие, и IL-4-индуцированную транс-эндотелиальную миграцию эозинофилов в легкие. Эозинофилы, или эозинофильные гранулоциты, являются основными эффекторными клетками в аллергических реакциях, при этом высвобождение содержимого гранул (содержащих IL-4) из эозинофилов способствует развитию воспаления. У астматиков, Th2-регулируемая выработка IL-4 способствует миграции эозинофилов из крови в легкие при посредстве эотаксина, мощного хемоатрактанта эозинофилов (Mochizuki et al., J. Immunol., 1998, 160(1):60-68). Кроме того, при локализации на участке воспаления, эозинофилы вырабатывают и секретируют IL-4, способствуя, таким образом, продолжению Th2-регулируемого воспаления (Bjerke et al., Respir. Med., 1996, 90(5):271-277). У пациентов с аллергической астмой индукция HDM повышала уровень IgE и цитокинов Th2 в сыворотке в течение 5 недель после индукции аллергеном (van de Pol et al., Allergy, 2012, 67(7):67-73).

В данном Примере модель HDM-индуцированной хронической астмы использовали для оценки фармакодинамических эффектов антител против IL-4R в отношении маркеров воспаления дыхательных путей у мышей. Кроме того, в этой модели оценивали влияние антител против IL-4R на отложение коллагена в дыхательных путях, так как отложение коллагена коррелирует со степенью ремоделирования дыхательных путей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

в экспериментах данного Примера использовали два различных антитела против IL-4Rα: "mAb1", полностью человеческое моноклональное антитело, специфичное к человеческому IL-4Rα (то есть антитело против IL-4R, используемое в других рабочих примерах, представленных в настоящей заявке); и "anti-mIL-4Rα", мышиное моноклональное антитело, специфичное к мышиному белку IL-4Rα. mAb1 не обладает перекрестной реактивностью с мышиным IL-4Rα; поэтому mAb1 оценивали в гуманизированных мышах, в которых ввели сконструированный человеческий IL-4 и эктодомен IL-4Rα с целью замены ими соответствующих мышиных последовательностей у мышей (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu). Мышиное антитело против мышиного IL-4Rα "anti-mIL-4Rα", с другой стороны, тестировали на мышах дикого типа (Balb/c). Также в этих экспериментах тестировали мышиный IL-13Rα2-mFc слитый белок, который действует как рецептор-ловушка, блокируя сигнализацию IL-13 в результате выключения цитокина IL-13.

В отношении модели HDM-индуцированной астмы, мышей сенсибилизировали посредством ежедневной интраназальной аппликации HDM (50 мкг на мышь в 20 мкл PBS) в течение 10 дней, с последующим перерывом (период разрешения 2 недели). Аллерген с вводили путем интраназальной аппликации HDM (50 мкг на мышь в 20 мкл PBS) три раза в неделю в течение 8 недель. Для каждого введения HDM, в течение периода сенсибилизации или провокации, мышам делали легкую анестезию изофлураном.

Мышей оставляли для акклиматизации в экспериментальной лаборатории минимум в течение 5 дней перед началом экспериментальной процедуры. В течение всей продолжительности эксперимента животные оставались в экспериментальной лаборатории в стандартных условиях при 12-часовом цикле дня/ночи со свободным доступом к корму и воде. Число мышей в клетке было ограничено максимум 5 мышами.

В общей сложности в двух экспериментах использовали 48 гуманизированных мышей, в которых человеческий IL-4 лиганд и человеческий эктодомен IL-4Rα были генно-инженерно введены с целью замены ими соответствующих мышиных последовательностей (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu). Мыши IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu имели смешанный фон C57BI/6NTac(75%)/129S6SvEvTac(25%). Кроме того, в одном из трех экспериментов использовали 20 однопометных мышей дикого типа с идентичным смешанным фоном. В каждом эксперименте мышей сенсибилизировали HDM (или PBS в контрольной группе) ежедневно, в течение десяти дней, с последующим периодом разрешения со дня 11 до дня 29. Со дня 30, животных стимулировали HDM три раза в неделю, в течение 8 недель, до дня 81, а затем усыпляли в день 85 для анализа. Мышей делили на шесть экспериментальных групп следующим образом:

(1) Несенсибилизированные, не подвергавшиеся лечению: PBS вводили интраназально в течение периодов сенсибилизации и провокации. Мышам не вводили антитела (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мыши n=9, однопометные особи дикого типа n=5).

(2) HDM-сенсибилизированные, не подвергавшиеся лечению: HDM вводили интраназально в течение периодов сенсибилизации и провокации. Мышам не вводили антитела (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мыши n=7; однопометные особи дикого типа n=5);

(3) HDM-сенсибилизированные, подвергнутые лечению anti-mIL-4Rα: HDM вводили интраназально в течение периодов сенсибилизации и провокации. Мышам в/б вводили anti-mIL-4Rα в дозе 50 мг/кг, два раза в неделю, с недели 7 до недели 12, в общей сложности в количестве 12 доз, в течение периода 6 недель (однопометные особи дикого типа n=5);

(4) HDM-сенсибилизированные, подвергнутые лечению антителом mAb1 против IL-4R человека: HDM вводили интраназально в течение периодов сенсибилизации и провокации. Мышам в/б вводили mAb1 в дозе 50 мг/кг, два раза в неделю, с недели 7 до недели 12, в общей сложности в количестве 12 доз, в течение периода 6 недель (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мыши n=12).

(5) HDM-сенсибилизированные, подвергнутые лечению мышиным IL-13Rα2-mFc слитым белком: HDM вводили интраназально в течение периодов сенсибилизации и провокации. Мышам в/б вводили IL-13Rα2-mFc в дозе 25 мг/кг, два раза в неделю, с недели 7 до недели 12, в общем количестве 12 доз, в течение периода 6 недель (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мыши n=7; однопометные особи дикого типа n=5);

(6) HDM-сенсибилизированные, подвергнутые введению антитела контрольного изотипа: HDM вводили интраназально в течение периодов сенсибилизации и провокации. Мышам в/б вводили изотипическое контрольное АТ в дозе 50 мг/кг, два раза в неделю, с недели 7 до недели 12, в общем количестве 12 доз в течение периода 6 недель (IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мыши n=7).

Мышей усыпляли в день 85, забирали кровь для анализа уровня иммуноглобулина сыворотки, после чего легкое (одну долю) использовали для получения одного из следующего: i) жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL), ii) ферментативно обработанного образца суспензии отдельных клеток для проточного цитометрического анализа, iii) фиксированного формалином образца для окрашивания и гистологического анализа, или iv) образца для анализа с использованием набора для анализа коллагена Sircol™ с целью определения количества коллагена, содержащегося в доле легкого.

Жидкость BAL получали из усыпленных животных, открыв сначала трахею и введя 23G лаважную трубку через небольшой разрез в стенке трахеи. Затем в легкое вводили стерильный PBS (1 мл) и отбирали жидкость BAL через лаважную трубку, используя шприц. 100 мкл BAL наносили на колонку Cytospin, которую центрифугировали в течение 5 минут при 500 об/мин для выделения клеток и их нанесения на предметные стекла. Препараты сушили и окрашивали гематоксилин-эозином (ГЭ) для визуализации эозинофилов.

Уровень IgE сыворотки определяли количественно, используя коммерческий набор ELISA. Коротко, последовательно разведенные образцы сыворотки инкубировали с захватывающим антителом против IgE в 96-луночных планшетах и детектировали IgE биотинилированным вторичным антителом против мышиного IgE. Очищенный мышиный IgE, меченный HRP, использовали в качестве стандарта.

Уровни HDM-специфичного IgG1 в сыворотке количественно определяли с помощью ELISA. Коротко, покрытые HDM планшеты инкубировали с последовательно разведенными образцами сыворотки, после чего инкубировали с HRP-конъюгированным антителом против мышиного IgG1. Относительные уровни IgG1 в сыворотке были представлены как единицы титра (OD450 умножали на коэффициент разведения, требуемый для достижения OD450≤0,5). Забранные доли легкого мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до стадии выделения. Для выделения коллагена, легкое гомогенизировали в охлаждаемом льдом растворе NaCl/NaHCO₃ и центрифугировали при 9000×g в течение 10 мин. Эту стадию повторяли три раза, после чего полученный осадок обрабатывали пепсином в уксусной кислоте в течение 18 часов при 4°C.

Образцы центрифугировали, супернатант отбирали и смешивали с реактивом Sircol Dye Reagent для окрашивания содержащегося в образцах коллагена. Образцы промывали реактивом Acid-Salt Wash для удаления несвязанного красителя Sircol Dye, а затем смешивали с реактивом Alkali. 200 мкл каждого образца переносили в 96-луночный планшет и измеряли OD при 555 нм. Коллагеновый стандарт использовали для конечного количественного определения коллагена, содержащегося в каждом образце.

Легкие забирали у усыпленных мышей и выдерживали в полной среде DMEM на льду до обработки смесью коллагеназы и ДНКазы в буфере HBSS в течение 20 минут при 37°C. Коллагеназную активность нейтрализовали добавлением 0,5М ЭДТА, образцы центрифугировали и эритроциты лизировали буфером ACK. Суспензии клеток, полученные для каждого образца, разделяли на три отдельных пула и окрашивали смесью антител 1 (anti-CD11c-APC, anti-SiglecF-PE, anti-F4/80-FITC, anti-CD45-PerCp-Cy5.5) или смесью антител 2 (anti-CD11c-APC, anti-CD11b-PerCp-Cy5.5, anti-CD103-FITC, anti-MHCII-PE), или смесью антител 3 (anti-CD19-PE, anti-Ly6G-APC, anti-CD3-FITC, anti-CD11b-PerCp-Cy5.5) в течение 25 минут при 4°C. Окрашенные клетки фиксировали в растворе Cytofix/Cytoperm в течение 30 минут при 4°C и хранили в PBS до проточного цитометрического анализа на FACSCanto (BD Biosciences).

В модели HDM-индуцированной хронической эозинофильной астмы (ЭА), левые доли легкого забирали у 4 мышей из каждой группы для микроматричного анализа экспрессии генов с использованием технологии GeneChip^®. Уровни экспрессии генов у мышей, которых сенсибилизировали и провоцировали HDM, а затем обрабатывали АТ контрольного изотипа, сравнивали с уровнями экспрессии генов у мышей, которых ложно (PBS) сенсибилизировали и провоцировали, и не подвергали обработке антителом. Порог изменения экспрессии генов устанавливали >1,5-кратного. Выборку генов, идентифицированных как дифференциально экспрессируемые у мышей, которых сенсибилизировали и провоцировали HDM, затем также анализировали в группе, в которой вводили anti-IL-4Rα, в сравнении с группой, в которой вводили изотипический контроль. Порог изменения экспрессии генов в группе, обработанной anti-IL-4Rα, в сравнении с группой, в которой вводили изотипический контроль, устанавливали >2-кратного.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сенсибилизация и провокация HDM привели к повышению уровней IgE и HDM-специфичного IgG1. Повышение IgE было полностью заблокировано обоими АТ против IL-4Rα, но не обработкой IL-13Rα2-Fc (Фигуры 27A и 27B); на уровни HDM-специфичного IgG1 не повлияла ни одна обработка (данные не показаны).

Сенсибилизация и провокация HDM также вызвали увеличение коллагена, содержащегося в легких мышей. Содержание коллагена в легких мышей, которым вводили АТ к IL-4Rα и белок IL-13Rα2-Fc, снижалось до уровней, наблюдаемых у ложно сенсибилизированных и провоцированных мышей (Фигуры 28A и 28B).

Кроме того, обработка mAb1 предотвращала приток эозинофилов, нейтрофилов и воспалительных дендритных клеток в легкое (Фигура 29, панели A и B).

Микроматричный анализ мРНК, выделенной из ткани легкого HDM-индуцированных IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мышей, которым вводили антитело контрольного изотипа, выявил дифференциальную экспрессию 1468 генов (826 генов апрегулированы и 642 - даунрегулированы) по сравнению с ложно сенсибилизированными и провоцированными мышами. Обработка mAb1 HDM-индуцированных IL-4^hu/huIL-4Rα^hu/hu мышей привела к изменениям экспрессии только 521 гена (по сравнению с ложно сенсибилизированными/провоцированными мышами), обеспечивая эффективное блокирование приблизительно 65% генов, затронутых HDM сенсибилизацией/провокацией (>1,5-кратное изменение, p<0,05). Особый интерес представляет тот факт, что mAb1 опосредовало даунрегуляцию экспрессии генов нескольких представителей семейства цитокина IL-1, в частности IL-1α (2,9-кратную), IL-33 (2,6-кратную) и IL-18 связывающего белка (1,5-кратную). Экспрессия гена IL-1β не была увеличена в HDM-индуцированной группе, обработанной контрольным изотипом (по сравнению с ложно сенсибилизированными/провоцированными мышами), но была уменьшена (1,5-кратно) в группе, обработанной mAb1. Экспрессия гена Th1 воспалительных цитокинов, IL-12β и IFN-γ, была также даунрегулирована при введении mAb1 по сравнению с группой, обработанной контрольным изотипом. В частности, восемь генов, кодирующих хемокины-лиганды, вовлеченные в хоуминг и направленную миграцию клеток, были даунрегулированы в группе, обработанной mAb1, по сравнению с группой, обработанной контрольным изотипом: Ccl11 (~9-кратное снижение), Ccl8 и Cxcl2 (оба ~5-кратное снижение), Cxcl1, Ccl7, Ccl6 (все ~3-кратное снижение), Ccl2 и Ccl9 (примерно 2-кратное снижение).

ВЫВОДЫ

В данном Примере показано, что блокада IL-4 сигнализации через рецепторы I типа и II типа антителами против IL-4Rα подавляет воспалительные и фиброзные изменения в легких HDM-провоцированных мышей, а также изменения сигнатуры генов, которые вызывает HDM.

Другие варианты осуществления представлены в формуле изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Marius Ardeleanu

Namita Gandhi

Neil Graham

Stephane C. Kirkesseli

Sudeep Kundu

Allen Radin

Ross E. Rocklin

Steven Weinstein

Jennifer Davidson Hamilton

Jeffrey Ming

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ АСТМЫ ПОСРЕДСТВОМ ВВЕДЕНИЯ

АНТАГОНИСТА IL-4R

<130> US2012/080-WO-PCT

<140> To be assigned

<141> Filed herewith

<150> US 61/691,625

US 61/758,097

US 61/761,279

US 61/783,796

US 61/805,797

FR 1356994

<151> 2012-08-21

2013-01-29

2013-02-06

2013-03-14

2013-03-27

2013-07-16

<160> 275

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 1

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttccgc tcttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcggtc atatcatatg atggaagtaa taaatattat 180

atagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgaat 240

ctgcaaatga acagcctgag acttgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagagggg 300

agggggggat ttgactactg gggccaggga atcccggtca ccgtctcctc a 351

<210> 2

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Pro

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 3

ggattcacct tccgctctta tggc 24

<210> 4

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly

1 5

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

atatcatatg atggaagtaa taaa 24

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

gcgaaagagg ggaggggggg atttgactac 30

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

Ala Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggtcataaac aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagtcc ctaagtccct gatccatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtc acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acga 324

<210> 10

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

caggtcataa acaattat 18

<210> 12

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

Gln Val Ile Asn Asn Tyr

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

gctgcatcc 9

<210> 14

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

Ala Ala Ser

1

<210> 15

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

caacagtata atagtcaccc gtggacg 27

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Trp Thr

1 5

<210> 17

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttccgc tcttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcggtc atatcatatg atggaagtaa taaatattat 180

atagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgaat 240

ctgcaaatga acagcctgag acttgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagagggg 300

agggggggat ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 18

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 19

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggtcataaac aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagtcc ctaagtccct gatccatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtc acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 20

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttccgc tcttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagagggg 300

agggggggat ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 22

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggtcataaac aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtc acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa ac 322

<210> 24

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 25

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcaga agctatggca tacactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgat aactgaggac acggctgtgt attattgtgt gaaagagggg 300

aggggggggt ttgactactg gggccaggga accacggtca ccgtctcctc a 351

<210> 26

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ile Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 27

ggattcacct tcagaagcta tggc 24

<210> 28

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 28

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly

1 5

<210> 29

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 29

atatcatatg atggaagtaa taaa 24

<210> 30

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 30

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 31

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 31

gtgaaagagg ggaggggggg gtttgactac 30

<210> 32

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 32

Val Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 33

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 33

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggtcattaat aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagtcc ctaagtccct gatccatgct gcatccagtt tgcaaagagg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acga 324

<210> 34

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 35

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 35

caggtcatta ataattat 18

<210> 36

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 36

Gln Val Ile Asn Asn Tyr

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 37

gctgcatcc 9

<210> 38

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 38

Ala Ala Ser

1

<210> 39

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 39

caacaatata atagttaccc gtggacg 27

<210> 40

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 40

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 41

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 41

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcaga agctatggca tacactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgat aactgaggac acggctgtgt attattgtgt gaaagagggg 300

aggggggggt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 42

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ile Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 43

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggtcattaat aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagtcc ctaagtccct gatccatgct gcatccagtt tgcaaagagg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 44

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 45

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcaga agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gaaagagggg 300

aggggggggt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 46

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Glu Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 47

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggtcattaat aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa ac 322

<210> 48

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 49

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cgggggggtc cttgagactc 60

tcctgtgcag gctctggatt cacgtttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcg attagtggtt ccggtggtaa cacatacttc 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggtccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 50

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 51

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 51

ggattcacgt ttagagacta tgcc 24

<210> 52

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 52

Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Ala

1 5

<210> 53

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 53

attagtggtt ccggtggtaa caca 24

<210> 54

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 54

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 55

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 55

gcgaaagatc gactctctat aacaattcgc ccacgctatt atggtttgga cgtc 54

<210> 56

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 56

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

1 5 10 15

Asp Val

<210> 57

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 57

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggccattaac aatcatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctttgct gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acga 324

<210> 58

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asn Asn His

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 59

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 59

caggccatta acaatcat 18

<210> 60

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 60

Gln Ala Ile Asn Asn His

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 61

gctgtatcc 9

<210> 62

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 62

Ala Val Ser

1

<210> 63

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 63

caacagtata atagttaccc gtggacg 27

<210> 64

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 64

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 65

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 65

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cgggggggtc cttgagactc 60

tcctgtgcag gctctggatt cacgtttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcg attagtggtt ccggtggtaa cacatacttc 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cc 372

<210> 66

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 67

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 67

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggccattaac aatcatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctttgct gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 68

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asn Asn His

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 69

<211> 373

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 69

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacgtttaga gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtt ccggtggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cct 373

<210> 70

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 71

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 71

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggccattaac aatcatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa ac 322

<210> 72

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asn Asn His

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 73

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 73

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cgggggggtc cttgagactc 60

tcctgtgcag gctctggatt cacgtttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcg attagtggtt ccggtggtaa cacatacttc 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggtccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 74

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 75

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 75

ggattcacgt ttagagacta tgcc 24

<210> 76

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 76

Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Ala

1 5

<210> 77

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 77

attagtggtt ccggtggtaa caca 24

<210> 78

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 78

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 79

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 79

gcgaaagatc gactctctat aacaattcgc ccacgctatt atggtttgga cgtc 54

<210> 80

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 80

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

1 5 10 15

Asp Val

<210> 81

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 81

gaaatagtgt tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtattg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agtcagggca gtctccacag ctccttatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttgggttt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gcccggggac caagctggag atcaaacga 339

<210> 82

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 82

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 83

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 83

cagagcctcc tgtatagtat tggatacaac tat 33

<210> 84

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 84

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 85

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 85

ttgggttct 9

<210> 86

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 86

Leu Gly Ser

1

<210> 87

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 87

atgcaagctc tacaaactcc gtacact 27

<210> 88

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 88

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 89

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 89

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cgggggggtc cttgagactc 60

tcctgtgcag gctctggatt cacgtttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcg attagtggtt ccggtggtaa cacatacttc 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cc 372

<210> 90

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 90

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 91

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 91

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtattg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agtcagggca gtctccacag ctccttatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttgggttt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gcccggggac caagctggag atcaaa 336

<210> 92

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 92

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 93

<211> 373

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 93

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacgtttaga gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtt ccggtggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cct 373

<210> 94

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 95

<211> 337

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 95

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtattg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaac 337

<210> 96

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 96

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 97

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 97

caggtgcagc tggtggagtc tgagggactc ttggaacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caactttaga gactttgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gtggtagtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaacca cacgctgtat 240

ctgcgaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtgt attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattac ggtctggacg tctggggcca agggtccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 98

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 98

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Leu Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Arg Asp Phe

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 99

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 99

ggattcaact ttagagactt tgcc 24

<210> 100

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 100

Gly Phe Asn Phe Arg Asp Phe Ala

1 5

<210> 101

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 101

attagtggta gtggtagtaa taca 24

<210> 102

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 102

Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 103

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 103

gcgaaagatc gactctctat aacaattcgc ccacgctatt acggtctgga cgtc 54

<210> 104

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 104

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

1 5 10 15

Asp Val

<210> 105

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 105

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattattttg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagttc ctaagctcct gatctttgct gcatccactt tgcatccagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattcgcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaaa tatgacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa acga 324

<210> 106

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 106

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ser Thr Leu His Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 107

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 107

caggacatta gcaattat 18

<210> 108

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 108

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 109

gctgcatcc 9

<210> 110

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 110

Ala Ala Ser

1

<210> 111

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 111

caaaaatatg acagtgcccc gtacact 27

<210> 112

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 112

Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 113

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 113

gaggtgcagc tggtggagtc tgagggactc ttggaacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caactttaga gactttgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gtggtagtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaacca cacgctgtat 240

ctgcgaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtgt attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattac ggtctggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cc 372

<210> 114

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 114

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Leu Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Arg Asp Phe

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 115

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 115

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattattttg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagttc ctaagctcct gatctttgct gcatccactt tgcatccagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattcgcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaaa tatgacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 116

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 116

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ser Thr Leu His Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 117

<211> 373

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 117

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caactttaga gactttgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtagtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattac ggtctggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cct 373

<210> 118

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 118

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Arg Asp Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 119

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 119

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaaa tatgacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa ac 322

<210> 120

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 120

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 121

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 121

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cttctggatt cacccttaac aactttgtca tgaactgggt ccgccaggtt 120

ccagggaagg gactggagtg ggtctctttt attagtgcta gtggtggtag tatatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca cttccaagaa cacattatat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggccgtct attactgtgc gaaatccccg 300

tataactgga acccctttga ctattggggc cagggaacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 122

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 122

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Val Met Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Asn Trp Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 123

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 123

ggattcaccc ttaacaactt tgtc 24

<210> 124

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 124

Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe Val

1 5

<210> 125

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 125

attagtgcta gtggtggtag tata 24

<210> 126

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 126

Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile

1 5

<210> 127

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 127

gcgaaatccc cgtataactg gaaccccttt gactat 36

<210> 128

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 128

Ala Lys Ser Pro Tyr Asn Trp Asn Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 129

<211> 327

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 129

gacatccagt tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga acgagccacc 60

ctctcctgca gggccagtct gagtgttagc agcaaattag cctggtacca gcagacacct 120

ggccaggctc ccagactcct catctatagt gcctccaccc gggccactgg tatcccagtc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cggtttatta ctgtcagcag tataatcatt ggcctccgta cacttttggc 300

caggggacca aggtggagat caaacga 327

<210> 130

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 130

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Ser Lys

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn His Trp Pro Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 131

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 131

ctgagtgtta gcagcaaa 18

<210> 132

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 132

Leu Ser Val Ser Ser Lys

1 5

<210> 133

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 133

agtgcctcc 9

<210> 134

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 134

Ser Ala Ser

1

<210> 135

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 135

cagcagtata atcattggcc tccgtacact 30

<210> 136

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 136

Gln Gln Tyr Asn His Trp Pro Pro Tyr Thr

1 5 10

<210> 137

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 137

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cttctggatt cacccttaac aactttgtca tgaactgggt ccgccaggtt 120

ccagggaagg gactggagtg ggtctctttt attagtgcta gtggtggtag tatatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca cttccaagaa cacattatat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggccgtct attactgtgc gaaatccccg 300

tataactgga acccctttga ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 138

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 138

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Val Met Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Asn Trp Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 139

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 139

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga acgagccacc 60

ctctcctgca gggccagtct gagtgttagc agcaaattag cctggtacca gcagacacct 120

ggccaggctc ccagactcct catctatagt gcctccaccc gggccactgg tatcccagtc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cggtttatta ctgtcagcag tataatcatt ggcctccgta cacttttggc 300

caggggacca agctggagat caaa 324

<210> 140

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 140

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Ser Lys

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn His Trp Pro Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 141

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 141

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacccttaac aactttgtca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgcta gtggtggtag tatatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatccccg 300

tataactgga acccctttga ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 142

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 142

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Asn Trp Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 143

<211> 325

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 143

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtct gagtgttagc agcaaattag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatagt gcctccacca gggccactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataatcatt ggcctccgta cacttttggc 300

caggggacca agctggagat caaac 325

<210> 144

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 144

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Ser Lys

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn His Trp Pro Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 145

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 145

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag gctctggatt cacctttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtctcatct attagtggtt ccggtggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggtccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 146

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 146

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 147

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 147

ggattcacct ttagagacta tgcc 24

<210> 148

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 148

Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Ala

1 5

<210> 149

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 149

attagtggtt ccggtggtaa caca 24

<210> 150

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 150

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 151

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 151

gcgaaagatc gactctctat aacaattcgc ccacgctatt atggtttgga cgtc 54

<210> 152

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 152

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

1 5 10 15

Asp Val

<210> 153

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 153

gacatcgtgt tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtattg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agtcagggca gtctccacag ctccttatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttgggttt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaacga 339

<210> 154

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 154

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 155

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 155

cagagcctcc tgtatagtat tggatacaac tat 33

<210> 156

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 156

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 157

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 157

ttgggttct 9

<210> 158

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 158

Leu Gly Ser

1

<210> 159

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 159

atgcaagctc tacaaactcc gtacact 27

<210> 160

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 160

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 161

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 161

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag gctctggatt cacctttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtctcatct attagtggtt ccggtggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cc 372

<210> 162

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 162

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 163

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 163

gacatcgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtattg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agtcagggca gtctccacag ctccttatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttgggttt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336

<210> 164

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 164

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 165

<211> 373

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 165

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttaga gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtt ccggtggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctctataa caattcgccc acgctattat ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cct 373

<210> 166

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 166

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 167

<211> 337

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 167

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtattg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaac 337

<210> 168

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 168

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 169

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 169

caggtgcagc tggtggagtc tgggggagtc ttggagcagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtacag cctctggatt cacctttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gtggtggtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca actccaacca cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctccataa caattcgccc acgctattac ggtttggacg tctggggcca agggtccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 170

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 170

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 171

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 171

ggattcacct ttagagacta tgcc 24

<210> 172

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 172

Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Ala

1 5

<210> 173

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 173

attagtggta gtggtggtaa taca 24

<210> 174

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 174

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 175

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 175

gcgaaagatc gactctccat aacaattcgc ccacgctatt acggtttgga cgtc 54

<210> 176

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 176

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

1 5 10 15

Asp Val

<210> 177

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 177

gatattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

attacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattattttg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagttc ctaaactcct gatctttgct gcatccactt tgcatccagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagtag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa acga 324

<210> 178

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 178

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ser Thr Leu His Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 179

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 179

caggacatta gcaattat 18

<210> 180

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 180

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

1 5

<210> 181

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 181

gctgcatcc 9

<210> 182

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 182

Ala Ala Ser

1

<210> 183

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 183

caaaagtata acagtgcccc gtacact 27

<210> 184

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 184

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 185

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 185

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagtc ttggagcagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtacag cctctggatt cacctttaga gactatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gtggtggtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca actccaacca cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctccataa caattcgccc acgctattac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cc 372

<210> 186

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 186

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 187

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 187

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

attacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattattttg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagttc ctaaactcct gatctttgct gcatccactt tgcatccagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagtag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 188

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 188

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ser Thr Leu His Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 189

<211> 373

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 189

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttaga gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

ctctccataa caattcgccc acgctattac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cct 373

<210> 190

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 190

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120

<210> 191

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 191

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa ac 322

<210> 192

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 192

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 193

<211> 355

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 193

gaagtgcacc tggtggaatc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgagg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccggggaagg gcctggaatg ggtctcaggt cttagtcgga caagtgtcag tataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctttat 240

ttggaaatga acagtctgag acctgaggac acggccttat attactgtgc aaaatggggg 300

acccgggggt attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355

<210> 194

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 194

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Leu Ser Arg Thr Ser Val Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Thr Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 195

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 195

ggattcacct ttgatgatta tgcc 24

<210> 196

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 196

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 197

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 197

cttagtcgga caagtgtcag tata 24

<210> 198

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 198

Leu Ser Arg Thr Ser Val Ser Ile

1 5

<210> 199

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 199

gcaaaatggg ggacccgggg gtattttgac tac 33

<210> 200

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 200

Ala Lys Trp Gly Thr Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 201

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 201

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggatattagt atttggttag cctggtatca gcagagtcca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatcaatgtt gcatcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag tctgcagcct 240

gaagattttg taacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggcgaccaa ac 322

<210> 202

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 202

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Val Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Ala Thr Lys

100 105

<210> 203

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 203

caggatatta gtatttgg 18

<210> 204

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 204

Gln Asp Ile Ser Ile Trp

1 5

<210> 205

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 205

gttgcatcc 9

<210> 206

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 206

Val Ala Ser

1

<210> 207

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 207

caacaggcta acagtttccc gatcacc 27

<210> 208

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 208

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr

1 5

<210> 209

<211> 355

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 209

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgagg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccggggaagg gcctggaatg ggtctcaggt cttagtcgga caagtgtcag tataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctttat 240

ttggaaatga acagtctgag acctgaggac acggccttat attactgtgc aaaatggggg 300

acccgggggt attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355

<210> 210

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 210

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Leu Ser Arg Thr Ser Val Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Thr Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 211

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 211

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggatattagt atttggttag cctggtatca gcagagtcca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatcaatgtt gcatcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag tctgcagcct 240

gaagattttg taacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa ac 322

<210> 212

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 212

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Val Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 213

<211> 355

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 213

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt cttagtcgga caagtgtcag tataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaatggggg 300

acccgggggt attttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355

<210> 214

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 214

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Leu Ser Arg Thr Ser Val Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Thr Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 215

<211> 322

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 215

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca ggatattagt atttggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgtt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa ac 322

<210> 216

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 216

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 217

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 217

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttgctacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaat cacctttagc acctatgcca tgagctgggt ccgtcaggct 120

ccagggaggg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatcctac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccagc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtcata 300

gcagctcgtc ctcactggaa cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 218

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 218

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ser Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ile Ala Ala Arg Pro His Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 219

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 219

ggaatcacct ttagcaccta tgcc 24

<210> 220

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 220

Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr Ala

1 5

<210> 221

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 221

attagtggta gtggtgatag caca 24

<210> 222

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 222

Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr

1 5

<210> 223

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 223

gcgaaagtca tagcagctcg tcctcactgg aacttcgatc tc 42

<210> 224

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 224

Ala Lys Val Ile Ala Ala Arg Pro His Trp Asn Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 225

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 225

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agatatttag cctggtatca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg gagtttatta ctgtcagcag cgtagtgact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgg 324

<210> 226

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 226

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 227

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 227

cagagtgtta gtagatat 18

<210> 228

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 228

Gln Ser Val Ser Arg Tyr

1 5

<210> 229

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 229

gatgcatcc 9

<210> 230

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 230

Asp Ala Ser

1

<210> 231

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 231

cagcagcgta gtgactggcc gctcact 27

<210> 232

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 232

Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 233

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 233

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttgctacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaat cacctttagc acctatgcca tgagctgggt ccgtcaggct 120

ccagggaggg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatcctac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccagc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtcata 300

gcagctcgtc ctcactggaa cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 234

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 234

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ser Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ile Ala Ala Arg Pro His Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 235

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 235

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agatatttag cctggtatca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg gagtttatta ctgtcagcag cgtagtgact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgg 324

<210> 236

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 236

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 237

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 237

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaat cacctttagc acctatgcca tgagctgggt ccgtcaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtcata 300

gcagctcgtc ctcactggaa cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 238

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 238

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ile Ala Ala Arg Pro His Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 239

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 239

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agatatttag cctggtatca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagtgact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgg 324

<210> 240

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 240

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 241

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 241

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

acctgtgcag cctctggatt caccttcagt agtaatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatt atatcatatg atggaaataa tcaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagca cacgctgtat 240

ctggaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac aaaagccatc 300

tctataagtg gaacttacaa ctggttcgat tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 242

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 242

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Ala Ile Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 243

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 243

ggattcacct tcagtagtaa tggc 24

<210> 244

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 244

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Gly

1 5

<210> 245

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 245

atatcatatg atggaaataa tcaa 24

<210> 246

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 246

Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Gln

1 5

<210> 247

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 247

acaaaagcca tctctataag tggaacttac aactggttcg attcc 45

<210> 248

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 248

Thr Lys Ala Ile Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Ser

1 5 10 15

<210> 249

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 249

gaaattgtat tgacacagtc tccagccatc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aggtacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgg 324

<210> 250

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 250

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 251

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 251

cagagtgtta gcaggtac 18

<210> 252

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 252

Gln Ser Val Ser Arg Tyr

1 5

<210> 253

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 253

gatgcatcc 9

<210> 254

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 254

Asp Ala Ser

1

<210> 255

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 255

caacagcgta gcaactggcc gctcact 27

<210> 256

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 256

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 257

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 257

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

acctgtgcag cctctggatt caccttcagt agtaatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatt atatcatatg atggaaataa tcaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagca cacgctgtat 240

ctggaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac aaaagccatc 300

tctataagtg gaacttacaa ctggttcgat tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 258

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 258

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys His Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Ala Ile Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 259

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 259

gaaattgtat tgacacagtc tccagccatc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aggtacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgg 324

<210> 260

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 260

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 261

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 261

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agtaatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaaataa tcaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac aaaagccatc 300

tctataagtg gaacttacaa ctggttcgat tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 262

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 262

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Ala Ile Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 263

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 263

gaaattgtat tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aggtacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgg 324

<210> 264

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 264

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 265

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(8)

<223> Xaa=Любая аминокислота

<400> 265

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 266

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(8)

<223> Xaa=Любая аминокислота

<400> 266

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 267

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(18)

<223> Xaa=Любая аминокислота

<400> 267

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa

<210> 268

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(11)

<223> Xaa=Любая аминокислота

<400> 268

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 269

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(3)

<223> Xaa=Любая аминокислота

<400> 269

Xaa Xaa Xaa

1

<210> 270

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(9)

<223> Xaa=Любая аминокислота

<400> 270

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 271

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 271

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 272

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 272

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 273

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 273

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 274

<211> 207

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 274

Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile

1 5 10 15

Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu

20 25 30

Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr

35 40 45

Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu

50 55 60

Met Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala

65 70 75 80

Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val

85 90 95

Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp

100 105 110

Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu

115 120 125

Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro

130 135 140

Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val

165 170 175

Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro

180 185 190

Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His

195 200 205

<210> 275

<211> 231

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fasicularis

<400> 275

Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Ser Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Gly Gly Pro Thr Asn Cys Ser Ala Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Gln Ser Ser Glu Thr His Thr Cys Val Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Val Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Met

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Val Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn Asp Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Tyr Ser Arg Ile His Asn

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Lys Pro Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln His Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp Tyr Asn Ser

210 215 220

Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln

225 230

<---

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу уменьшения частоты возникновения одного или более обострений астмы и к способу уменьшения частоты возникновения обострений астмы или улучшения одного или более связанных с астмой параметров. Способ уменьшения частоты возникновения одного или более обострений астмы у субъекта, страдающего умеренно-тяжелой эозинофильной астмой, включает введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с рецептором интерлейкина 4 (IL-4R), где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три последовательности областей, определяющих комплементарность, тяжелой цепи (НCDR), содержащие SEQ ID NOs: 148, 150 и 152, и три последовательности областей, определяющих комплементарность, легкой цепи (LCDR), содержащие SEQ ID NO: 156, 158 и 160, и где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой дополнительное поддерживающее лечение. Способ уменьшения частоты возникновения обострений астмы или улучшения одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, страдающего умеренно-тяжелой эозинофильной астмой, включает последовательное введение субъекту единичной начальной дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с рецептором интерлейкина 4 (IL-4R), с последующим введением одной или более вторичных доз указанных антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три последовательности областей, определяющих комплементарность, тяжелой цепи (НCDR), содержащие SEQ ID NOs: 148, 150 и 152, и три последовательности областей, определяющих комплементарность, легкой цепи (LCDR), содержащие SEQ ID NO: 156, 158 и 160, и где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой дополнительное поддерживающее лечение. Вышеуказанная группа изобретений обеспечивает способы направленной терапии для лечения или предотвращения астмы. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 31 ил., 13 табл., 4 пр.

1. Способ уменьшения частоты возникновения одного или более обострений астмы у субъекта, страдающего умеренно-тяжелой эозинофильной астмой, включающий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с рецептором интерлейкина 4 (IL-4R),

где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три последовательности областей, определяющих комплементарность, тяжелой цепи (НCDR), содержащие SEQ ID NOs: 148, 150 и 152, и три последовательности областей, определяющих комплементарность, легкой цепи (LCDR), содержащие SEQ ID NO: 156, 158 и 160, и

где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой дополнительное поддерживающее лечение.

2. Способ по п.1, где обострение астмы выбрано из группы, состоящей из следующего:

(a) 30%-ное или большее снижение относительно базового уровня пиковой скорости выдоха утром (ПСВ) за два последовательных дня;

(b) шесть или более дополнительных вдохов аэрозоля альбутерола или левалбутерола для облегчения дыхания в течение 24-часового периода по сравнению с базовым уровнем за два последовательных дня; и

(c) ухудшение астмы, требующее:

(i) системного лечения стероидами, или

(ii) увеличения применения ингаляционных кортикостероидов по меньшей мере в 4 раза по сравнению с последней дозой, принятой до приостановки лечения, или

(iii) госпитализации.

3. Способ уменьшения частоты возникновения обострений астмы или улучшения одного или более связанных с астмой параметров у субъекта, страдающего умеренно-тяжелой эозинофильной астмой, включающий последовательное введение субъекту единичной начальной дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с рецептором интерлейкина 4 (IL-4R), с последующим введением одной или более вторичных доз указанных антитела или его антигенсвязывающего фрагмента,

где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три последовательности областей, определяющих комплементарность, тяжелой цепи (НCDR), содержащие SEQ ID NOs: 148, 150 и 152, и три последовательности областей, определяющих комплементарность, легкой цепи (LCDR), содержащие SEQ ID NO: 156, 158 и 160, и

где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой дополнительное поддерживающее лечение.