Способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов Российский патент 2023 года по МПК G01N33/00 G01N25/00 A61B5/01 

Изобретение относится к медицине, к способам доклинического исследования безопасности обезболивающих средств из класса агонистов κ-опиоидных рецепторов с использованием в качестве подопытных крыс и может быть использовано при разработке новых обезболивающих препаратов.

Агонисты κ-опиоидных рецепторов получают синтетическим путем, а их обезболивающая активность при введении человеку и животным обусловлена избирательной стимуляцией κ-опиоидных рецепторов. Соединения этого класса обладают меньшим аддиктивным потенциалом и угнетающим влиянием на дыхание по сравнению с агонистами μ-опиоидных рецепторов, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных лекарственных средств [1, 2]. Вместе с тем, широкому использованию агонистов κ-опиоидных рецепторов в клинической практике препятствуют побочные эффекты такие как выраженная седация, дисфория, повышение тревожности и нарушение процессов восприятия по типу галлюцинаций [3, 4]. В связи с этим, в настоящее время продолжается изучение новых агонистов κ-опиоидных рецепторов, не вызывающих вышеперечисленных симптомов [2, 5], и разрабатываются алгоритмы изучения безопасности соединений этого класса в доклинических исследованиях.

Анализ фармакодинамики агонистов κ-опиоидных рецепторов свидетельствует, что их анальгетическое действие связано с активацией G-белок зависимых калиевых каналов через аденилатциклазный механизм, блокированием кальциевых каналов и, как следствие, деполяризацией цитолеммы [6]. Тогда как побочные эффекты агонистов κ-опиоидных рецепторов обусловлены активацией аррестинового пути в ГАМК-ергических нейронах прилегающего ядра, коры головного мозга и гиппокампа [7], а также в дофаминергических нейронах вентральной покрышки [8].

На сегодняшний день скрининговая оценка безопасности вновь синтезированных агонистов κ-опиоидных рецепторов на доклиническом этапе исследования предполагает анализ их активирующего потенциала в отношении G-белка ингибитора аденилатциклазы и аррестинового пути in vitro с использованием культур клеток, полученных методами генной инженерии [9]. Исследование выполняют на эмбриональных клетках почек человека. Для регистрации функциональной активности G-белка, клетки трансфицируют генетически сконструированным цАМФ-биосенсором на основе люциферазы светлячка (GloSensor; Promega, Madison, WI) и κ-опиоидного рецептора в отношении 1:1.

Полученные указанным способом клетки инкубируют в течение 20-30 мин в среде с различными концентрациями исследуемого агониста κ-опиоидного рецептора, после чего добавляют люцефирин и регистрируют интенсивность люминесценции.

Активацию аррестинового пути оценивают с использованием биосенсора Танго (Tango), получаемого за счет связывания С-конца κ-опиоидного рецептора с транскрипционным фактором через линкерную последовательность, содержащую сайт отщепления протеазы вируса гравировки табака. К культуре клеток с биосенсором добавляют растворы с различным содержанием исследуемого соединения и инкубируют на плашках в течение 20-30 мин. Активацию аррестинового пути регистрируют по интенсивности люминесценции, которую используют для построения зависимости величины люминесценции от концентрации агониста κ-опиоидных рецепторов. Полученные данные применяют для расчета средних эффективных концентраций исследуемого вещества по способности активировать G- и аррестин-зависимые пути, а отношение этих величин рассматривают в качестве интегрального показателя безопасности агониста κ-опиоидных рецепторов.

Однако реализация указанного метода возможна только в условиях специально оснащенной лаборатории с повышенными требованиями к чистоте помещения и не может быть применена в условиях in vivo. К тому же, рассматриваемый метод является дорогостоящим. Отмеченные недостатки препятствуют внедрению метода в широкую практику. Кроме того, результаты in vitro, полученные с использованием данного подхода, невозможно экстраполировать на организм человека.

Другим методом оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов на доклиническом этапе разработки лекарственных средств является их исследование в экспериментах на мелких лабораторных животных [10, 11]. Указанный метод позволяет выявить профиль целевой активности, токсикологический симптомокомплекс и определить безопасные дозы исследуемого агониста κ-опиоидных рецепторов, а также обосновать выбор его оптимальных доз для клинических исследований.

В качестве способа-прототипа принят способ исследования безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов в экспериментах на мелких лабораторных животных (мышах) с использованием батареи тестов первичного наблюдения, включающих тесты «Открытое поле», «Рота-род», «Горячая пластина» и регистрацию следующих признаков: наличие тремора, наличие судорог, наличие реакции Штраубе, сохранность слухового рефлекса, сохранность роговичного рефлекса, сохранность сгибательного рефлекса, повышение или снижение температуры тела, гиперсаливация, пилоэрекция, птоз, экзофтальм, кровенаполнение кожных покровов [10].

В соответствии со способом прототипом безопасность агонистов κ-опиоидных рецепторов оценивают по общей (неспецифической) нейропсихотропной активности в экспериментах на 144 белых беспородных мышах-самцах массой 20-25 г, содержащихся в лабораторных условиях инвертированного светового цикла (12 ч день /12 ч ночь), при температуре 18-24°С, относительной влажности 40-80%. Посторонний шум и воздействие прочих раздражителей сводится к минимуму. Перед началом эксперимента животных приручают в течение 1 месяца. Исследуемый агонист κ-опиоидных рецепторов вводят внутрибрюшинно в шести дозах. Контролем служит группа животных, которым аналогичным образом вводят растворитель.

Тестирование животных осуществляют через 1 ч после введения исследуемых агонистов κ-опиоидных рецепторов. Влияние веществ на поведение животных оценивают в тесте «Открытое поле», представляющем собой круглую арену с полом, разделенным линиями на сектора для регистрации двигательной активности, и отверстиями диаметром 1,5 см, для оценки норковой активности мышей. Для каждого подопытного животного регистрируют показатели двигательной активности по количеству пересеченных линий секторов и заглядываний в норки, а также эмоциональной активности по количеству эпизодов груминга продолжительностью более 6-8 секунд, проходов через центр, спонтанных вокализаций и амбивалентных вытягиваний. После завершения каждого тренировочного сеанса установку протирают ветошью с дезинфицирующим раствором для исключения ольфакторных сигналов, которые могли бы отвлекать и влиять на поведение следующего подопытного животного. Статистически значимое изменение показателей «Открытого поля» у животных опытных групп по сравнению с контролем считают нарушением ориентировочно-исследовательского поведения животных под действием исследуемых агонистов κ-опиоидных рецепторов.

Влияние агонистов κ-опиоидных рецепторов на моторно-координационную функцию животных исследуют в тесте «Рота-род» по способности животного удерживать равновесие на цилиндре диаметром 6 см, вращающемся со скоростью 10 об/мин. Согласно современному руководству [12], данный тест выполняют в три этапа, при этом второй и третий этапы отделены от первого двадцатичетырехчасовым интервалом.

Целью первого этапа является привыкание животных к оборудованию и обучение их удерживать равновесие на вращающемся цилиндре. Животных трижды помещают на установку, после чего фиксируют время, которое они смогут удержаться на нем. Во время тренировочных сеансов производят отбор мышей со сходной обучаемостью и способностью удерживаться на цилиндре более 180 с. По результатам первого тестирования отбраковывают около 10% мышей.

На втором этапе проводят оценку исходного уровня моторной активности мышей, и из выборки животных, выполнивших тест, формируют группы по 4-6 мышей в каждой.

На третьем этапе оценивают влияние агонистов κ-опиоидных рецепторов на моторно-координационную функцию животных через 30, 60, 120 и 180 мин после внутрибрюшинного введения агониста κ-опиоидных рецепторов.

В ходе теста «Рота-род» регистрируют следующие показатели:

- время нахождения животного на вращающемся цилиндре;

- количество животных, не выполнивших тест, в группе.

Критерием нарушения моторно-координационной функции животных считают время удержания на цилиндре менее 180 сек. Каждое животное тестируют трехкратно. Статистически значимое снижение времени удержания на вращающемся цилиндре у мышей опытных групп по сравнению с контролем считают нарушением моторно-координационной функции.

В дополнение к тестам «Открытое поле» и «Рота-род» в отдельном эксперименте оценивают влияние агонистов κ-опиоидных рецепторов на нейромышечную возбудимость и мышечный тонус по способности провоцировать у подопытных животных развитие тремора, судорог и реакции Штраубе, исследуют сохранность слухового, роговичного и сгибательного рефлексов, а также фиксируют вегетативные проявления (повышение или снижение температуры тела, гиперсаливация, пилоэрекция, птоз, экзофтальм и кровенаполнение кожных покровов).

Анальгетическую активность агонистов κ-опиоидных рецепторов исследуют в тесте «Горячая пластина», в ходе выполнения которого мышей помещают на металлическую пластину, нагретую до 55°С и регистрируют латентное время появления болевой реакции - облизывание задней лапы. Статистически значимое увеличение латентного времени болевой реакции у мышей опытных групп по сравнению с контролем считают анальгетическим эффектом исследуемых агонистов κ-опиоидных рецепторов. Сравнение среднегрупповых показателей опытных и контрольных групп проводят с использованием однофакторного дисперсионного анализа с множественными сравнениями по критерию Тьюки или, если распределение экспериментальной выборочной совокупности отличается от нормального, с использованием метода Краскала-Уоллеса и множественными сравнениями по критерию Данна.

Согласно способу-прототипу, по результатам тестирования строят кривую зависимости снижения двигательной активности в открытом поле (побочный эффект) от дозы, на основании этой кривой, посредством интерполяции, находят дозу, вызывающую 50% эффект, обозначаемую как средняя токсическая доза (ТД₅₀). Вместе с этим строят кривую зависимости увеличения латентного времени появления болевой реакции на горячей пластине от дозы и, также посредством интерполяции, находят дозу, вызывающую 50% эффект от максимально возможного. Эту дозу считают средней эффективной дозой (ЕД₅₀) по анальгезии.

Интегральным показателем безопасности исследуемых агонистов κ-опиоидных рецепторов при реализации способа-прототипа служит гиполокомоторный индекс, который рассчитывается как частное от деления ТД₅₀ на ЕД₅₀, что обычно обозначается как широта терапевтического действия [13]. Безопасными считают агонисты κ-опиоидных рецепторов со значением широты терапевтического действия больше, чем у препарата сравнения - буторфанола, наиболее эффективного и безопасного агониста κ-опиоидных рецепторов.

Существенными недостатком способа-прототипа является то, что его реализация основана на принципах оценки общей нейротоксичности химических соединений, то есть способ-прототип, кроме побочных симптомов, специфично возникающих при активации κ-опиоидных рецепторов, учитывает ряд симптомов, не связанных с действием агонистов κ-опиоидных рецепторов, в частности наличие тремора, судорог, сохранность слухового, роговичного и сгибательного рефлексов, гиперсаливация, пилоэрекция, птоз, экзофтальм, кровенаполнение кожных покровов. В свою очередь, это порождает такие недостатки способа-прототипа как:

- трудоемкость и длительность - реализация способа-прототипа предполагает оценку широкого перечня обязательных к учету показателей, изменение которых вызывает множество других классов веществ;

- низкая информативность - реализация способа-прототипа не учитывает полный перечень симптомов побочного действия агонистов κ-опиоидных рецепторов;

- необходимость использования в эксперименте большого количества (минимум 144 особи) подопытных животных, тогда как современные правила гуманного отношения к животным требуют снижения их числа;

- низкая чувствительность методики оценки эффективности агонистов κ-опиоидных рецепторов на горячей пластине, так при температуре 55°С не обнаруживается анальгетическая активность некоторых агонистов κ-опиоидных рецепторов.

- необходимость использования для регистрации побочных симптомов специального оборудования, а именно, установок «Открытое поле» и «Рота-род».

Недостатком способа-прототипа также служит игнорирование расчета терапевтического индекса - частного от деления дозы, вызывающей токсический эффект у небольшой части животных в группе (пороговая токсическая доза, в качестве которой принимают ТД₅, ТД₁₀, ТД₁₆, ТД₂₅), к дозе, вызывающей анальгетический эффект у большинства особей (так называемая абсолютноэффективная доза по анальгезии, в качестве которой может быть принята ЕД₈₄, ЕД₉₀, ЕД₉₅, ЕД₉₉).

Из уровня техники известно, что для оценки безопасности лекарственных средств находит применение методики расчета терапевтического индекса по формулам ТИ=ТД₂₅/ЕД₇₅ [25], ТИ-ТД₁₀/ЕД₉₀ [25, 26], ТИ=ТД₅/ЕД₉₅ [26], ТИ=ТД₁₆/ЕД₈₄ [27]. Подобные показатели, не зависимо от методики расчета, характеризуют наличие у препарата диапазона дозировок, в которых он обладает выраженным обезболивающим действием и при этом не проявляет явных признаков токсического действия. Учет этих показателей особенно необходим в случае выраженного отличия углов наклона кривой зависимости «доза-обезболивающее действие» и кривой зависимости «доза-токсический эффект», когда интерпретация данных о безопасности разрабатываемых фармакологических препаратов на основании расчета широты терапевтического действия является ложной [14].

В связи с вышеперечисленными недостатками, изыскание способа скрининговой оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов, отличающегося высокой информативностью и специфичностью, простотой и относительно высокой скоростью проведения, не требующего использования специального оборудования, является весьма актуальным.

Цель изобретения - создание способа экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов на доклиническом этапе их разработки с использованием в качестве подопытных животных крыс, не требующего наличия специального оборудования для оценки симптомов побочного действия и отличающегося специфичностью в отношении агонистов κ-опиоидных рецепторов.

Поставленная цель достигается тем, что предложен способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов, включающий введение исследуемых веществ грызунам, наблюдение за симптомами побочного действия: вокализацией, гипотермией и гиполокомоцией, проведение теста первичного наблюдения «Горячая пластина», регистрацию выявленных симптомов, расчет анальгетической и токсической дозы, расчет широты терапевтического действия как частное от деления средней токсической дозы на среднюю анальгетическую дозу, сравнение полученных результатов расчетов с аналогичными результатами расчетов препарата сравнения - буторфанола, в котором в качестве лабораторных животных используют белых беспородных половозрелых крыс-самцов, агонисты к-опиоидных рецепторов вводят в 5-ти дозах, по шесть животных на каждую, дополнительно наблюдают наличие/отсутствие полиурии, распластывания, пячения и каталепсии, при условии регистрации манифестации в комплексе шести специфичных симптомов побочного действия, а именно гиполокомоции, распластывания, пячения, вокализации, полиурии, гипотермии, а также анальгетического действия на горячей пластине одновременно с отсутствием двух симптомов: реакции Штраубе и каталепсии делают вывод о принадлежности вещества исключительно к классу κ-опиоидных антагонистов, причем анальгетическое действие на горячей пластине исследуют при температуре пластины 50°С, расчет токсической дозы проводят по симптому побочного действия с наименьшим значением дозы, дополнительно рассчитывают терапевтический индекс как частное от деления токсической дозы, вызывающей проявления симптома у 25% животных, на анальгетическую дозу, вызывающую эффект у 75% животных, безопасными считают агонисты κ-опиоидных рецепторов со значениями широты терапевтического действия и терапевтического индекса большими, чем у препарата сравнения.

В отличие от способа-прототипа заявляемый способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов предполагает:

- регистрацию совокупности шести симптомов побочного действия, специфичного для агонистов κ-опиоидных рецепторов: гиполокомоция, распластывание, пячение, вокализации, гипотермия, полиурия и двух симптомов, специфичных для агонистов μ-опиоидных рецепторов (реакция Штраубе, каталепсия) вместо двадцати трех общих симптомов нейротоксичности, заявленных в способе-прототипе;

- физикальную экспресс-оценку манифестации симптомов побочного действия у животных без использования специального оборудования (установок «Открытое поле» и «Рота-род»);

- использование минимального количества подопытных животных 36 беспородных половозрелых крыс-самцов вместо 144 мышей, как требуется для реализации способа-прототипа;

- оценку анальгетической активности (эффективности) на пластине, нагретой до температуры 50°С, вместо 55°С, согласно требованиям способа прототипа;

- приручение животных в течение 3-х дней перед тестированием вместо 1 месяца, как требует способ прототип;

- расчет широты терапевтического действия для симптома с минимальным значением средней токсической дозы, что позволяет учесть весь спектр токсического действия исследуемого агониста κ-опиоидных рецепторов;

- расчет терапевтического индекса, что дает более полную информацию о безопасности исследуемого вещества.

Возможность достижения цели, поставленной при разработке заявляемого способа экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов, на современном этапе развития уровня техники обосновывается открытием веществ с избирательным действием на κ-опиоидные рецепторы и синтезом новых соединений на их основе [2, 5], для которых в случае использования заявляемого способа (на этапе скрининговой оценки) исключается необходимость оценки широкого спектра неспецифических симптомов, характерных для ряда существующих фармакологических средств аналогичного назначения.

В качестве объекта исследования заявляемый способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов требует использования крыс, так как, по сравнению с мышами, они легче приучаются к тестовой обстановке, что позволяет сократить период подготовки животных к эксперименту. При этом, авторы способа-прототипа [10] не обнаружили спонтанных вокализаций при введении агонистов κ-опиоидных рецепторов мышам, в отличие от экспериментов, проведенных на крысах, то есть предложенный в заявляемом способе симптомокомплекс из шести симптомов, специфично возникающих при активации агонистов κ-опиоидных рецепторов, в большей мере характерен для крыс, чем для мышей.

Принципиальным для реализации заявляемого способа экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов является использование животных мужского пола, так как из уровня техники известно, что самцы более чувствительны к токсическим эффектам κ-опиоидных рецепторов по сравнению с самками [15, 16].

При реализации заявляемого способа исследуемый агонист κ-опиоидных рецепторов вводят минимум в 5-ти дозах, по шесть животных на каждую дозу, что является необходимым условием для построения зависимости доза-эффект в фармакологическом эксперименте [13]. Такой подход позволяет снизить минимальное количество подопытных животных до 36 голов с учетом шести животных контрольной группы, которым вводят растворитель агониста κ-опиоидных рецепторов.

Эффективность исследуемых агонистов κ-опиоидных рецепторов оценивают на горячей пластине с температурой 50°С, что является более чувствительным способом выявления анальгетического действия агонистов κ-опиоидных рецепторов [17, 18], чем использование пластины, нагретой до 55°С, при этом критерием анальгетического действия считают отсутствие болевой реакции (облизывание задней лапы, подпрыгивание) в течение 80 секунд.

Наличие или отсутствие симптомов побочного действия и болевой чувствительности учитывают в виде альтернативных качественных признаков. Подсчитывают количество животных в каждой группе с наличием или отсутствием вышеперечисленных симптомов, после чего определяют средние токсические дозы по симптомам побочного действия и снижению болевой чувствительности методом пробит-анализа. Из перечня регистрируемых симптомов побочного действия выбирают один наиболее выраженный симптом, то есть симптом с наименьшей средней токсической дозой (ТД₅₀) дополнительно, рассчитывают ТД₂₅ по этому симптому. Безопасность агониста κ-опиоидных рецепторов оценивают по значению широты терапевтического действия, которая рассчитывается как частное от деления ТД₅₀ наиболее выраженного побочного симптома на среднюю эффективную (терапевтическую) дозу (ЕД₅₀) по эффекту анальгезии, а также по терапевтическому индексу - частному от деления ТД₂₅ на ЕД₇₅ по эффекту анальгезии. Значение первого показателя указывает во сколько раз сильнее проявляется терапевтическое действие исследуемого вещества по сравнению с токсическим. Значение второго показателя позволяет судить о том, будет ли проявляться токсичность вещества при его терапевтическом действии. Чем больше значение обоих индексов, тем безопаснее исследуемый агонист κ-опиоидных рецепторов.

Для того, чтобы быть рекомендованным к клиническим испытаниям, исследуемое вещество должно иметь значение широты терапевтического действия и/или значение терапевтического индекса больше, чем у препарата сравнения - буторфанола.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается результатами проведенных исследований, представленными в следующих примерах.

Пример 1. Порядок реализации заявляемого способа экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов.

При реализации заявляемого способа оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов в качестве подопытных животных используют белых беспородных крыс-самцов массой 180-250 г, прошедших карантин в течение 14 суток. Животных содержат в стандартных условиях, соответствующих действующим нормативным документам, регламентирующим правила надлежащей лабораторной практики и охрану животных, используемых в научных целях.

За три дня до тестирования проводят приручение и ознакомление животных с комнатой, где будут проводить тестирование. Для этого в клетке на тележке животных ежедневно привозят в комнату и оставляют в ней не менее чем на 1 ч. В течение этого времени каждое животное берут в руки, имитируют захват и манипуляции, которые будут осуществлять в ходе тестирования.

В день тестирования определяют массу тела животных с точностью до 1 г.

После этого животным вводят исследуемый агонист κ-опиоидных рецепторов или его растворитель (животным контрольной группы) и фиксируют появление комплекса симптомов, специфично возникающих при активации κ-опиоидных рецепторов.

До снятия крышки с клетки регистрируют наличие:

- распластывания - характерной позы, когда животное лежит на животе, передние лапы расставлены в стороны, задние подобраны под себя;

- пячения - животное перемещается в горизонтальной плоскости задом наперед;

- вокализаций - испускание звуков в слышимом диапазоне;

-наличие или отсутствие реакции Штраубе - характерного подъема хвоста, обусловленного повышением тонуса мышц.

После снятия крышки клетки регистрируют наличие или отсутствие:

- гиполокомоции - визуального снижения общей двигательной активности животных по сравнению с контрольной группой;

-каталепсии - сохранения позы животным более 30 сек при постановке его передними лапами вертикально к стенке клетки;

- полиурии - обильного мочевыделения, наблюдающегося в виде намокания шерсти нижней половины туловища (область передней брюшной стенки и задние лапы), а иногда всего живота.

По окончании наблюдения у всех подопытных животных цифровым термометром с точностью до 0,1°С измеряют ректальную температуру. Снижение ректальной температуры ниже двух стандартных отклонений от среднего в контрольной группе считают гипотермией.

После этого оценивают болевую реакцию животного на пластине, нагретой до 50°С. Отсутствие болевой реакции (облизывания задней лапы или подпрыгивания) у животного в течение 80 секунд считают анальгетическим эффектом исследуемого агониста κ-опиоидных рецепторов.

Растворитель и способ его введения выбирают в соответствии с физико-химическими свойствами исследуемого агониста κ-опиоидных рецепторов и предполагаемым целевым путем поступления в организм человека.

По результатам исследования, методом пробит-анализа по Финни [19] рассчитывают ТД₅₀ по регистрируемым симптомам побочного действия и ЕД₅₀ и ЕД₇₅ по анальгезии. Определяют наиболее выраженный токсический симптом, характеризующийся наименьшим значением ТД₅₀. Рассчитывают ТД₂₅ по этому симптому. Рассчитывают широту терапевтического действия и терапевтический индекс. Делают вывод о безопасности исследуемого агониста κ-опиоидных рецепторов, сравнивая с препаратом сравнения.

Пример 2. Специфичность комплекса из шести симптомов, характерных для активации агониста κ-опиоидных рецепторов

В эксперименте с использованием в качестве подопытных животных половозрелых белых беспородных крыс-самцов исследовали специфичность комплекса из шести симптомов, характерных для активации κ-опиоидных рецепторов.

Для исследования были выбраны вещества, представляющие различные классы обезболивающих средств: агонисты κ-опиоидных рецепторов - GR 89696 и BRL 52537, агонист μ-опиоидных рецепторов - морфин, агонист δ-опиоидных рецепторов - SCN-80, агонист каннабиноидных рецепторов - Δ⁸-тетрагидроканабинол, нестероидное противовоспалительное средство - ибупрофен.

В ходе исследования формировали шесть групп животных, подвергавшихся введению выбранных веществ в эффективных дозах: 1 группа - GR 89696 в дозе 15 мкг/кг, 2 группа - BRL 52537 в дозе 500 мг/кг, 3 группа - морфин в дозе 8 мг/кг, 4 группа - SCN-80 в дозе 3,2 мг/кг, 5 группа - Δ⁹-тетрагидроканабинол в дозе 32 мг/кг, 6 группа - ибупрофен в дозе 480 мг/кг. Эффективные дозы веществ выбирали на основании данных литературы [20, 21, 22, 23]. Вещества, за исключением ибупрофена, вводили внутрибрюшинно в 0,9% водном растворе хлорида натрия. Наличие или отсутствие симптома регистрировали через 30 минут после введения анальгетиков. Ибупрофен вводили перорально, состояние животных оценивали через 60 минут после введения.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

По результатам проведенного исследования был расширен известный из уровня техники перечень симптомов побочного действия агонистов κ-опиоидных рецепторов. Кроме известных симптомов (гиполокомоция, гипотермия, полиурия) в эксперименте у крыс наблюдалось нарушение ортостатической активности (распластывание и/или ползание), пячение и увеличение частоты спонтанных вокализаций. Необходимо отметить, что распластывание, пячение и спонтанные вокализации при введении агонистов κ-опиоидных рецепторов по данным литературы не были отмечены у мышей [10], поэтому использование крыс в качестве объекта исследования при скрининговой оценке безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов является более предпочтительным.

Зарегистрированный перечень симптомов побочного действия агонистов κ-опиоидных рецепторов обнаруживается у человека в виде седации, дисфории, полиурии, дискоординации движений, а также ложных галлюцинаций, связанных с нарушением ощущения пропорций тела и искажением тактильной чувствительности [1-4], то есть является клинически значимым.

В эксперименте (таблица 1), также регистрировали манифестацию двух симптомов, характеризующих μ-опиоидную активность веществ (реакция Штраубе и каталепсия). Это было необходимо для дифференцирования физиологической активности агонистов κ-опиоидных рецепторов, так как некоторые современные анальгетики являются смешанными агонистами μ- и κ-опиоидных рецепторов, например, пентазоцин, бупренорфин.

Сопоставление перечней симптомов побочного действия существующих анальгетиков разных групп позволяет заключить, что предложенный в заявляемом способе экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов перечень симптомов побочного действия является специфичным, то есть возникающим при стимуляции κ-опиоидных рецепторов и характерным исключительно для этого класса анальгетиков (таблица 1).

Пример 3. Оценка широты терапевтического действия и терапевтического индекса препарата сравнения - буторфанола с использованием заявляемого способа.

В эксперименте с использованием в качестве подопытных животных половозрелых белых беспородных крыс-самцов исследовали эффективность и безопасность агониста κ-опиоидных рецепторов препарата сравнения - буторфанола. Буторфанол был выбран, как один из наиболее эффективных и безопасных агонистов κ-опиоидных рецепторов среди известных в настоящее время [24].

В ходе исследования формировали шесть групп: пять экспериментальных и одну контрольную, по 6 особей в каждой. Всего 36 животных.

Буторфанол вводили однократно в хвостовую вену в 0,9% водном растворе хлорида натрия из расчета 1 мл/кг.

Животным группы 1 буторфанол вводили в дозе 100 мкг/кг, группы 2 - буторфанол в дозе 300 мкг/кг, группы 3 - буторфанол в дозе 1000 мкг/кг, группы 4 - буторфанол в дозе 3000 мкг/кг, группы 5 - буторфанол в дозе 6000 мкг/кг. Животным контрольной группы (группа 6) вводили 0,9% физиологический раствор из расчета 1 мл/кг. Дозы буторфанола для исследования были выбраны на основании работ [10, 23].

Через 30 минут после введения буторфанола или физиологического раствора у животных регистрировали наличие или отсутствие распластывания, пячения, вокализаций, полиурии, реакции Штраубе, гиполокомоции и каталепсии, измеряли температуру тела и оценивали болевую чувствительность на горячей пластине.

В таблице 2 показано количество животных в группе с проявлением симптома. На фигуре 1 представлены кривые доза-эффект буторфанола по анальгезии и гиполокомоции.

Экспериментальные данные, представленные в таблице 2 и на фигуре 1, свидетельствуют о том, что буторфанол вызывал специфичные для активации κ-опиоидных рецепторов симптомы. Симптомы, характерные для активации μ-опиоидных рецепторов (каталепсия и реакция Штраубе) не наблюдались. Средняя эффективная доза буторфанола по анальгезии составила 207,4±58,4 мкг/кг, ЕД₇₅ - 323,3 мкг/кг.

Статистическую обработку полученных данных проводили методом пробит-анализа, по результатам которого рассчитывали токсические и эффективные дозы буторфанол по каждому симптому.

Из всех симптомов побочного действия наименьшая ТД₅₀ была определена по гиполокомоции 656,0±211,4 мкг/кг (фигура 1). ТД₂₅ составила 363,9 мкг/кг. Широта терапевтического действия буторфанола, была равна 3,2, терапевтический индекс - 1,1.

Найденные значения широты терапевтического действия и терапевтического индекса использовались в примерах 4 и 5 в качестве критериальных значений показателей.

Пример 4. Оценка безопасности агониста κ-опиоидных рецепторов BRL 52537 с использованием заявляемого способа.

В ходе исследования безопасности агониста κ-опиоидных рецепторов BRL 52537 формировали шесть групп половозрелых белых беспородных крыс-самцов: пять экспериментальных и одна контрольная, по 6 особей в каждой.

BRL 52537 вводили однократно в хвостовую вену в виде 0,9% водного раствора хлорида натрия из расчета 1 мл/кг.

Животным группы 1 вводили BRL 52537 в дозе 50 мкг/кг, группы 2 - BRL 52537 в дозе 100 мкг/кг, группы 3 - BRL 52537 в дозе 500 мкг/кг, группы 4 - BRL 52537 в дозе 1000 мкг/кг, группы 5 - BRL 52537 в дозе 3000 мкг/кг. Животным контрольной группы (группа 6) вводили 0,9% физиологический раствор из расчета 1 мл/кг.

После введения BRL 52537 или физиологического раствора у животных регистрировали наличие или отсутствие гиполокомоции, распластывания, пячения, вокализации, полиурии, реакции Штраубе и каталепсии, гипотермии и анальгезии на горячей пластине.

По результатам эксперимента методом пробит-анализа рассчитывали дозы BRL 52537, введение в которых вызывало эффект у 50% подопытных животных по регистрируемым симптомам через 30 минут, так как симптомы в этой временной точке были наиболее выражены.

В таблице 3 показано количество животных в группе с проявлением симптома. На фигуре 2 представлены кривые доза-эффект BRL 52537 по анальгезии и гиполокомоции.

Экспериментальные данные, представленные в таблице 3 и на фигуре 2, свидетельствуют о том, что побочное действие BRL 52537 проявлялось в виде симптомокомплекса, специфичного для активации κ-опиоидных рецепторов и включающего гиполокомоцию, распластывание, пячение, гипотермию, вокализации и полиурию. Симптомы, характерные для активации μ-опиоидных рецепторов (каталепсия и реакция Штраубе) не обнаруживались.

Средняя эффективная доза BRL 52537 по анальгезии составила 807,1±201,6 мкг/кг, ЕД₇₅ - 1276 мкг/кг.

Из всех симптомов побочного действия наименьшие ТД₅₀ были определены по гиполокомоции 568,6±208,2 мкг/кг (фигура 2), ТД₂₅ по гиполокомоции составила 255,8 мкг/кг. Широта терапевтического действия BRL 52537 была равна 0,70, терапевтический индекс - 0,20.

В связи с тем, что значения широты терапевтического действия и терапевтический индекс BRL 52537 меньше соответствующих значений буторфанола (3,2 и 1,1), соединение BRL 52537 не пригодно для использования в клинической практике в качестве анальгетика.

Пример 5. Оценка безопасности агониста κ-опиоидных рецепторов GR 89696 с использованием заявляемого способа.

В эксперименте с использованием в качестве подопытных животных половозрелых белых беспородных крыс-самцов исследовали эффективность и безопасность агониста κ-опиоидных рецепторов GR 89696. Соединение GR 89696 было выбрано, как наиболее активный представитель своего класса соединений [9], что позволяло ожидать присутствие в сипмтомокомплексе его токсического действия всех заявленных в формуле изобретения симптомов.

В ходе исследования формировали шесть групп: пять экспериментальных и одну контрольную, по 6 особей в каждой. Всего 36 животных.

GR 89696 вводили однократно в хвостовую вену в 0,9% водном растворе хлорида натрия из расчета 1 мл/кг.

Животным группы 1 GR 89696 вводили в дозе 0,5 мкг/кг, группы 2 - GR 89696 в дозе 1,6 мкг/кг, группы 3 - GR 89696 в дозе 5 мкг/кг, группы 4 - GR 89696 в дозе 10 мкг/кг, группы 5 - GR 89696 в дозе 22 мкг/кг. Животным контрольной группы (группа 6) вводили 0,9% физиологический раствор из расчета 1 мл/кг. Дозы GR 89696 для исследования были выбраны на основании работ [1, 11], согласно которым GR 89696 в дозах 1-50 мкг/кг снижал двигательную активность крыс в открытом поле и тесте принудительное плавание.

Через 30 минут после введения GR 89696 или физиологического раствора у животных регистрировали наличие или отсутствие распластывания, пячения, вокализаций, полиурии, реакции Штраубе, гиполокомоции и каталепсии, гипотермию и анальгезию на горячей пластине.

Статистическую обработку полученных данных проводили методом пробит-анализа, по результатам которого рассчитывали токсические и эффективные дозы GR 89696 по каждому симптому.

В таблице 4 показано количество животных в группе с проявлением симптома. На фигуре 3 представлены кривые доза-эффект GR 89696 по анальгезии и гиполокомоции/ распластыванию.

Экспериментальные данные, представленные в таблице 4 и на фигуре 3, свидетельствуют о том, что GR 89696 вызывал специфичные для активации κ-опиоидных рецепторов симптомы: гиполокомоцию, распластывание, пячение, гипотермию, вокализации и полиурию. Симптомы, характерные для активации μ-опиоидных рецепторов (каталепсия и реакция Штраубе) не наблюдались. Средняя эффективная доза по анальгезии составила 11,2±5,4 мкг/кг, ЕД₇₅ - 12,1 мкг/кг.

Из всех симптомов побочного действия наименьшая ТД₅₀ была определена для гиполокомоции и распластывания 4,8±1,7 мкг/кг (фигура 3). ТД₂₅ составила 4,4 мкг/кг. Широта терапевтического действия GR 89696, была равна 0,43, терапевтический индекс - 0,36.

В связи с тем, что значения широты терапевтического действия и терапевтический индекс GR 89696 меньше соответствующих значений буторфанола (3,2 и 1,1), соединение GR 89696 не пригодно для использования в клинической практике в качестве анальгетика.

Специфический симптомокомплекс соединения GR 89696, установленный в эксперименте, подтверждает его κ-опиоидную активность.

Таким образом, экспериментально зарегистрированный перечень клинически значимых симптомов известных агонистов κ-опиоидных рецепторов является необходимым и достаточным.

Проведенные экспериментальные исследования доказывают возможность экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов на основе симптомокомплекса из шести клинически значимых симптомов побочного действия, специфично возникающих при активации κ-опиоидных рецепторов и двух симптомов, характерных для активации μ-опиоидных рецепторов. Практическая реализация заявляемого способа экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов является простой в исполнении, не требует длительной адаптации животных к экспериментальным условиям, использования специального дорогостоящего оборудования, а также позволяет существенно (в 4 раза) сократить минимальное количество используемых в эксперименте подопытных животных.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые предложен способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов, предусматривающий исследовать симптомокомплекс из шести клинически значимых симптомов побочного действия, специфично возникающих при активации κ-опиоидных рецепторов и двух симптомов, характерных для активации μ-опиоидных рецепторов, а оценку безопасности проводить по широте терапевтического действия и терапевтическому индексу, рассчитанным по наиболее выраженному побочному симптому, что является существенным отличительным признаком заявляемого способа.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», так как на современном этапе развития уровня техники не представлялась очевидной возможность экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов и подтверждения κ-опиоидной активности разрабатываемых анальгетиков по экспериментально установленному комплексу специфичных симптомов их побочного действия, включая 3 симптома, обнаруженных в эксперименте, и целесообразность использования в качестве подопытных животных крыс, то есть заявляемый способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов не вытекает для специалиста явным образом из уровня техники.

Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для промышленного применения» подтверждается приведенными примерами, свидетельствующими, что заявляемый способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов прост в исполнении, легко воспроизводим, не требует длительной адаптации животных к экспериментальным условиям, использования специального дорогостоящего оборудования, отличается специфичностью симптомов, возникающих при активации κ-опиоидных рецепторов и позволяет снизить количество подопытных животных, участвующих в эксперименте. Поэтому заявляемый способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов может быть успешно использован в научно-исследовательских учреждениях Российской Федерации и стран СНГ при разработке новых обезболивающих препаратов на основе агонистов κ-опиоидных рецепторов и скрининговой оценке их безопасности в ходе доклинических исследований.

Список литературы

1. Быков В.Н., Анохин А.Г., Чепур С.В., Иванов И.М., Покровская Л.А., Назаров Г.В., Галан С.Е., Мурадов М.М. Исследование психолептических эффектов κ-опиоидных агонистов // Токсикологический вестник, 2011. - №3. - С. 13-16.

2. Lovell K.М., Frankowski K.J., Stahl E.L., Slauson S.R., Yoo Ε., Prisinzano Т.Е., Bohn L.M. Structure activity relationship studies of functionally selective kappa opioid receptor (KOR) agonists that modulate ERK phosphorylation while preserving G protein over β-arrestin 2 signaling bias // ACS Chem. Neurosci., 2015. - doi: 10.1021 /acschemneuro.5b00092.

3. Lemos J.C., Chavkin C. Kappa opioid receptor function // The receptors 23. The opiate receptors. / Ed. G.W. Pasternak. - Springer Science+Business Media, - 2011. - P. 265-306.

4. Walsh S.L., Strain E.C., Abreu M.E. Bigelow G.E. Enadoline, a selective kappa opioid agonist: comparison with butorphanol and hydromorphone in humans // Psychopharmacology, 2001. - V. 157. -P. 151-162.

5. Dunn A.D., Reed В., Guariglia C, Dunn A.M., Hillman J.M., Kreek M.J. Structurally related kappa opioid receptor agonists with substantial differential signaling bias: neuroendocrine and behavioral effects in C57BL6 mice // International journal of neuropsychopharmacology, 2018. - V. 21. -N. 9. - P. 847-857.

6. Bruchas M.R., Chavkin C. Kinase cascades and ligand-directed signaling at the kappa opioid receptor // Psychopharmacology, 2010. - V. 210. - P. 137-147.

7. Bruchas M.R., Land B.B., Aita M., Xu M., Barot S.K., Li S., Chavkin C. Stress-induced p38 mitogen-activated protein kinase activation mediates opioid dependent dysphoria // The journal of neuroscience, 2007. - V. 27(43). - P. 11614-11623.

8. Ehrich J.M., Messinger D.I., Knakal C.R., Kuhar J.R., Schattauer S.S., Bruchas M.R., Zweifel L.S., Kieffer B.L., Phillips P.E.M., Chavkin C. Kappa opioid receptor-induced aversion requires p38 МАРК activation in VTA dopamine neurons // The journal of neuroscience, 2015. -V. 35. - N. 37. - P. 12917-12931.

9. White K.L., Alex P. Scopton, Marie-Laure Rives, Ruslan V. Bikbulatov, Prabhakar R. Polepally, Peter J. Brown, Terrance Kenakin, Jonathan A. Javitch, Jordan K. Zjawiony, and Bryan L. Roth identification of novel functionally selective k-opioid receptor scaffolds // Mol. Pharmacol, 2014. - V. 85. - P. 83-90.

10. Spasov Α.Α., Grechko O.Yu., Eliseeva N.V., Litvinov R.A., Shamshina D.D. Toxic effect of single treatment with kappa-opioid agonist ru-1205 compound, on the neurological status of wild type mice // J. Clin. Pharm., 2017. - V. 3. - Ν. 1. - P. 1014.

11. Быкова А.Ф., Галан С.Е., Малягин В.Ю., Субботина С.Н. Оценка безопасности производного арилацетамида GR 89,696, обладающего анальгетической активностью // Токсикологический вестник, 2019. - №4. - С. 32-37.

12. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под. ред. Миронова A.M. и др. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

13. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1963. - 161 с.

14. Gupta Р.K., 2016 Fundamentals of Toxicology. - Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo: Elsevier, 2016.-398 p.

15. Conway S.M., Puttick D., Russell S., Potter D., Roitman M.F., Chartoff E.H. Females are less sensitive than males to the motivational- and dopamine-suppressing effects of kappa opioid receptor activation // Neuropharmacology, 2019. -N. 146. - P. 231-241.

16. Laman-Maharg Α., Williams A.V., Zufelt M.D., Minie V.A., Ramos-Maciel S., Hao R., Sanchez E.O., Copeland Т., Silverman J.L., Leigh Α., Snyder R., Carroll F.I., Fennell T.R., Trainor B.C. Sex differences in the effects of a kappa opioid receptor antagonist in the forced swim test // Front. Pharmacol., 2018. - V. 9:93. - doi: 10.3389/fphar.2018.00093.

17. Craft R.M., Beraal S.A., Sex differences in opioid antinociception: к and ‘mixed action’agonists // Drug and alcohol dependence, 2001. - V. 63. - P. 215-228.

18. Smith M.A., Barrett A.C., Picker M.J. Antinociceptive effects of opioids following acute and chronic administration of butorphanol: influence of stimulus intensity and relative efficacy at the mu receptor // Psychopharmacology, 1999. - V. 143. - P. 261-269.

19. Lei C, Sun X. Comparing lethal dose ratios using probit regression with arbitrary slopes // BMC Pharmacology and Toxicology, 2018. - V. 19. - P. 61

20. Roux S., Sablre E., Porsolt R.D. Primary observation (Irwin) test in rodents for assessing acute toxicity of a test agent and its effects on behavior and physiological function // Current protocols in pharmacology, 2004. - P. 10.10.1-10.10.23.

21. Jutkiewicz E.M., Eller E.B., Folk J.E., Rice K.C., Traynor J.R., Woods J.H. - Opioid agonists: differential efficacy and potency of SNC80, its 3-OH (SNC86) and 3-desoxy (SNC162) derivatives in sprague-dawley rats // The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 2004.-V. 309.-P. 173-181.

22. Sofia R. D., Vassar H.B., Knobloch L.C. Comparative analgesic activity of various naturally occurring cannabinoids in mice and rats//Psychopharmacologia (Berl.), 1975. - V. 40.-P. 285-295.

23. Бузлама А.В., Николаевский В.Α., Чернов Ю.Н., Сливкин А.И. Доклинические исследования лекарственных веществ. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017.-384 с.

24. Heel R.C., Brogden R.N., Speight Т.М., Avery G.S. Butorphanol: A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy // Drugs, 1978. - V.16. - P. 473-505.

25. Dale's Pharmacology Condensed Ε-Book Clive P. Page, Simon Pitchford Elsevier Health Sciences, 25 дек. 2019 г. - Всего страниц: 176

26. Chou, Т.-С.(2006). Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies. Pharmacological Reviews, 58(3), 621-681. doi:10.1124/pr.58.3.10

27. Luszczki, J. J., & Czuczwar, S. J. (2003). Isobolographic and subthreshold methods in the detection of interactions between oxcarbazepine and conventional antiepileptics - a comparative study. Epilepsy Research, 56(1), 27-42. doi:10.1016/j.eplepsyres.2003.08.

Изобретение относится к способам доклинического исследования безопасности обезболивающих средств из класса агонистов κ-опиоидных рецепторов и может быть использовано при разработке новых обезболивающих препаратов. Способ включает введение исследуемых веществ белым половозрелым крысам-самцам в 5-ти дозах по шесть животных на каждую, наблюдение за восьмью симптомами побочного действия и проведение теста первичного наблюдения «Горячая пластина» при температуре пластины 50°С. При условии регистрации манифестации в комплексе шести специфичных симптомов побочного действия, а именно гиполокомоции, распластывания, пячения, вокализации, полиурии, гипотермии, а также анальгетического действия на горячей пластине одновременно с отсутствием двух симптомов: реакции Штраубе и каталепсии делают вывод о принадлежности вещества исключительно к классу κ-опиоидных антагонистов. Проводят расчет средней анальгетической дозы, а также расчет средней токсической дозы по симптому побочного действия с наименьшим значением дозы, расчет широты терапевтического действия как частного от деления средней токсической дозы на среднюю анальгетическую дозу. Также рассчитывают терапевтический индекс как частное от деления токсической дозы, вызывающей проявления симптома у 25% животных, на анальгетическую дозу, вызывающую эффект у 75% животных. Безопасными считают агонисты κ-опиоидных рецепторов со значениями широты терапевтического действия и терапевтического индекса большими, чем у препарата сравнения буторфанол. Способ позволяет быстро провести оценку безопасности по симптомам, отличающимся специфичностью в отношении агонистов κ-опиоидных рецепторов, прост в исполнении, легко воспроизводим, не требует длительной адаптации животных к экспериментальным условиям и использования специального дорогостоящего оборудования, позволяет снизить количество подопытных животных, участвующих в эксперименте. 3 ил., 4 табл., 5 пр.

Способ экспресс-оценки безопасности агонистов κ-опиоидных рецепторов, включающий введение исследуемых веществ грызунам, наблюдение за симптомами побочного действия: вокализацией, гипотермией, гиполокомоцией, реакцией Штраубе, проведение теста первичного наблюдения «Горячая пластина», регистрацию выявленных симптомов, расчет средней анальгетической дозы и средней токсической дозы, расчет широты терапевтического действия как частного от деления средней токсической дозы на среднюю анальгетическую дозу, сравнение полученных результатов расчетов с аналогичными результатами расчетов препарата сравнения, в качестве препарата сравнения используют буторфанол, отличающийся тем, что в качестве лабораторных животных используют белых беспородных половозрелых крыс-самцов, агонисты κ-опиоидных рецепторов вводят в 5-ти дозах, по шесть животных на каждую, дополнительно наблюдают наличие/отсутствие полиурии, распластывания, пячения и каталепсии, при условии регистрации манифестации в комплексе шести специфичных симптомов побочного действия, а именно гиполокомоции, распластывания, пячения, вокализации, полиурии, гипотермии, а также анальгетического действия на горячей пластине одновременно с отсутствием двух симптомов: реакции Штраубе и каталепсии делают вывод о принадлежности вещества к классу κ-опиоидных антагонистов, причем анальгетическое действие на горячей пластине исследуют при температуре пластины 50°С, расчет токсической дозы проводят по симптому побочного действия с наименьшим значением дозы, дополнительно рассчитывают терапевтический индекс как частное от деления токсической дозы, вызывающей проявления симптома у 25% животных, на анальгетическую дозу, вызывающую эффект у 75% животных, безопасными считают агонисты κ-опиоидных рецепторов со значениями широты терапевтического действия и терапевтического индекса большими, чем у препарата сравнения.