ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР Российский патент 2022 года по МПК A61K35/17 A61K38/20 A61K39/395 A61P35/00 C12N15/63 C12N5/10 

[ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ]

[0001] Настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору, клетке, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, к вектору, содержащему последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор, и тому подобное.

Заявитель испрашивает приоритет заявки на патент Японии №2017-061461, поданной 27 марта 2017 г, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

[УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ]

[0002] Химерный антигенный рецептор (в настоящем документе также называемый «CAR») представляет собой искусственный химерный белок, в котором одноцепочечное антитело, которое распознает антиген клеточной поверхности злокачественной клетки, слит с областью передачи сигнала, которая индуцирует активацию Т-клеток. Например, путем введения гена, кодирующего CAR, в нормальные T-клетки периферической крови, не обладающие опухолевой активности (T-лимфоциты периферической крови), можно получить большое количество экспрессирующих CAR Т-клеток (в настоящем документе также называемых «CAR-Т-клетки»), способных экспрессировать CAR. Такие CAR-T-клетки обладают опухолевой активностью и, таким образом, могут обеспечивать разрушение злокачественных клеток без их взаимодействия с главным комплексом гистосовместимости (MHC).

[0003] Что касается противоопухолевой иммунотерапии, заключающейся во введении CAR-T-клеток, более конкретно, терапии, при которой у пациента собирают Т-клетки, в такие Т-клетки вводят ген, кодирующий CAR, и клетки с амлификацией гена возвращают пациенту, то в настоящее время во всем мире проводятся клинические испытания, результаты которых демонстрируют ее эффективность для гематопоэтических опухолей, таких как лейкоз и лимфома, и тому подобное.

[0004] Тем не менее, при противоопухолевой иммунотерапии с использованием CAR-T-клеток, ситуация в настоящее время такова, что эффективные результаты получены только для гематопоэтических опухолей, для солидных опухолей они не получены. Для создания эффективных CAR для солидных опухолей важен отбор целевых антигенов, и требуется поиск мишеневых антигенов, применимых к солидным опухолям.

[0005] Между тем, вероятными факторами, когда терапия CAR-T-клетками в отношении солидных опухолей не эффективна, являются низкий коэффициент выживаемости CAR-T-клеток in vivo, низкий уровень их накопления в местных опухолях, ингибирование их активности иммуносупрессивными факторами, секретируемыми опухолевыми клетками и тому подобное, и так далее. В качестве способа решения такой проблемы был описан способ, при котором нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор, стимулирующий иммунную функцию Т-клеток, вводили в Т-клетки вместе с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR (патентная литература 1).

[ПЕРЕЧЕНЬ ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ]

[ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА]

[0006] [Патентная литература 1]

Международная публикация PCT № WO 2016/056228

[СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ]

[ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА, РЕШАЕМАЯ ИЗОБРЕТЕНИЕМ]

[0007] Поскольку эффекты CAR-T-клеток, нацеленных на антиген, экспрессируемый в солидной опухоли человека, не были подтверждены в патентной литературе 1, то требуются CAR-T-клетки, проявляющие эффективность против такого антигена.

[0008] Задачей настоящего изобретения является создание нового CAR, который нацеливается на антиген солидной опухоли в качестве мишеневого антигена, и CAR-T-клеток, которые эффективны против солидных опухолей.

[РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ]

[0009] Настоящее изобретение включает в себя следующие аспекты.

(1) Химерный антигенный рецептор, содержащий связывающую мишеневый антиген область; трансмембранную область; и область передачи сигнала активации Т-клеток, в которой мишеневый антиген представляет собой ганглиозид GM2.

(2) Химерный антигенный рецептор согласно (1), в котором связывающая мишеневый антиген область содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой антитела против ганглиозида GM2.

(3) Химерный антигенный рецептор согласно (2), в котором антитело против ганглиозида GM2 представляет собой антитело, выбранное из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, и вариабельную области легкой цепи с CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2;

(b) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2; и

(c) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2.

(4) Химерный антигенный рецептор согласно (3), в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

(5) Химерный антигенный рецептор согласно (2)-(4), в котором антитело против ганглиозида GM2 представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).

(6) Химерный антигенный рецептор согласно (5), в котором scFv представляет собой полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, и который обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, и который обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2.

(7) Химерный антигенный рецептор согласно любому из (1)-(6), в котором трансмембранная область представляет собой трансмембранную область CD8.

(8) Химерный антигенный рецептор согласно (7), в котором трансмембранная область CD8 включает полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и который обладает трансмембранной способностью; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 20, и который обладает трансмембранной способностью.

(9) Химерный антигенный рецептор по любому из (1)-(8), в котором область передачи сигнала активации Т-клеток представляет собой область передачи сигнала активации Т-клеток CD3ζ.

(10) Химерный антигенный рецептор согласно (9), в котором область передачи сигнала активации Т-клетки CD3ζ включает полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 28, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки.

(11) Химерный антигенный рецептор согласно (9) или (10), в котором область передали сигнала активации Т-клетки дополнительно включает, по меньшей мере, одну из: область передачи сигнала активации Т-клетки CD28 и области передачи сигнала активации Т-клетки 4-1ВВ.

(12) Химерный антигенный рецептор согласно (11), в котором область передачи сигнала активации Т-клетки CD28ζ включает полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 24, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки.

(13) Химерный антигенный рецептор согласно (11), в котором область передачи сигнала активации Т-клетки 4-1ВВ включает полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 26, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки.

(14) Химерный антигенный рецептор согласно любому из (11)-(13), в котором область передачи сигнала активации Т-клетки включает области передачи сигнала активации Т-клетки CD28, 4-1ВВ и CD3ζ, и расположена в порядке CD28, 4-1BB и CD3ζ от N-конца.

(15) Клетка, которая экспрессирует химерный антигенный рецептор по любому из (1)-(14).

(16) Клетка согласно (15), которая дополнительно экспрессирует по меньшей мере один из: IL-7 или CCL19.

(17) Клетка согласно (16), которая экспрессирует и IL-7, и CCL19.

(18) Клетка согласно (16) или (17), в которой IL-7 включает полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, и который обладает стимулирующей активностью в отношении иммунной функции Т-клеток; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, и который обладает стимулирующей функцией в отношении иммунной функции Т-клеток.

(19) Клетка согласно (16)-(18), в которой CCL19 содержит полипептид, выбранный из группы, включающей следующие подпункты (а)-(с):

(а) полипептид, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61;

(b) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, и который обладает стимулирующей активностью в отношении иммунной функции Т-клеток; и

(c) полипептид с аминокислотной последовательностью, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, и который обладает стимулирующей функцией в отношении иммунной функции Т-клеток.

(20) Клетка согласно (15)-(19), которая является иммунной клеткой.

(21) Клетка согласно (20), где иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

(22) Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, которая кодирует химерный антигенный рецептор согласно любому из (1)-(14).

(23) Полинуклеотид согласно (22), дополнительно содержащий по меньшей мере одну из: последовательность оснований, которая кодирует IL-7, или последовательность, которая кодирует CCL19.

(24) Полинуклеотид согласно (23), содержащий и последовательность оснований, которая кодирует IL-7, и последовательность оснований, которая кодирует CCL19.

(25) Вектор, содержащий последовательность оснований, которая кодирует химерный антигенный рецептор согласно любому из (1)-(14).

(26) Вектор согласно (25), дополнительно содержащий по меньшей мере одну из: последовательность оснований, которая кодирует IL-7, или последовательность, которая кодирует CCL19.

(27) Вектор согласно (26), содержащий и последовательность оснований, которая кодирует IL-7, и последовательность оснований, которая кодирует CCL19.

(28) Способ получения клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, включающий введение в клетку полинуклеотида или вектора, который содержит последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор согласно любому из подпунктов (1)-(14).

(29) Способ получения клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор согласно (28), дополнительно включающий введение в клетку полинуклеотида или вектора, который содержит по меньшей мере одну из: последовательность оснований, кодирующую IL-7, или последовательности оснований, кодирующую CCL19.

(30) Способ получения клетки, экспрессирующей рецептор химерного антигена согласно (29), дополнительно включающий введение в клетку полинуклеотида или вектора, который содержит и последовательность оснований, кодирующую IL-7, и последовательность оснований, кодирующую CCL19.

(31) Фармацевтическая композиция, содержащая клетку согласно (15)-(20).

(32) Фармацевтическая композиция согласно (31), которая представляет собой фармацевтическую композицию для лечения или профилактики опухоли.

[ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ]

[0010] Согласно настоящему изобретению получен новый CAR, который нацеливается на антиген солидной опухоли, выступающий в качестве мишеневого антигена, и CAR-T-клетки, которые эффективны против солидных опухолей.

[КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ]

[0011]

На Фиг. 1А представлена схема, демонстрирующая конструкцию анти-GM2 CAR.

На Фиг. 1B представлена схема, демонстрирующая анти-GM2 CAR вектор, экспрессирующий IL-7/CCL19, и анти-GM2 CAR-Т-клетку, экспрессирующую IL-7/CCL19, в которую введен этот вектор.

На Фиг. 2 показаны результаты проверки уровня экспрессии CAR в анти-GM2 CAR-Т-клетках, экспрессирующих IL-7/CCL19, с помощью метода проточной цитометрии. Левый график показывает результаты для нетрансгенной Т-клетки, а правый график показывает результаты анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующей IL-7/CCL19.

На Фиг. 3 показаны результаты измерения концентраций IL-7 и CCL19 в культуральном супернатанте анти-GM2 CAR-Т-клеток с помощью ELISA. На графиках, обозначение «GM2 CAR» относится к анти-GM2 CAR-Т-клетке, экспрессирующей IL-7/CCL19, а обозначение «неинфицированная» относится к нетрансгенной Т-клетке (то же самое относится к последующим фигурам).

На Фиг. 4 показаны схемы анализа опухолевой цитотоксичности и анализа одновременного культивирования с использованием анти-GM2 CAR-Т-клеток, экспрессирующих IL-7/CCL19.

На Фиг. 5А показаны результаты анализа высвобождения хрома с использованием четырех типов анти-GM2-CAR-Т-клеток, экспрессирующих IL-7/CCL19. На Фиг. 5А показаны результаты анализа, в котором в качестве мишеневых клеток использовали линии злокачественных клеток мезотелиомы (Y-meso8A и MSTO211H). На графиках каждый «VL15VH», «VL25VH», «VH15VL» и «VH25VL» относится к результатам для анти-GM2 CAR-Т-клеток, экспрессирующих IL-7/CCL19, содержащих соответствующие последовательности в качестве scFv-последовательностей анти-GM2 CAR (то же самое относится к последующим фигурам).

На Фиг. 5В показаны результаты анализа высвобождения хрома с использованием четырех типов анти-GM2-CAR-Т-клеток, экспрессирующих IL-7/CCL19. На Фиг. 5В показаны результаты анализа, в котором в качестве мишеневых клеток использовали клеточные линии миеломы (KMS-11 и KMS-28PE).

На Фиг. 6А показаны результаты сравнения анализов высвобождения хрома анти-GM2-CAR-Т-клеткой, экспрессирующей IL-7/CCL19, и контрольной CAR-T-клеткой. На Фиг. 6А показаны результаты анализа, в котором в качестве мишеневой клетки использовали линию злокачественных клеток мезотелиомы (Y-meso8A). На графиках, «FITC CAR-T» обозначает анти-FITC CAR-T клетки, используемые в качестве отрицательного контроля (то же самое относится к последующим фигурам).

На Фиг. 6В показаны результаты сравнения анализов высвобождения хрома анти-GM2-CAR-Т-клеткой, экспрессирующей IL-7/CCL19, и контрольной CAR-T-клеткой. На Фиг. 6В показаны результаты анализа, в котором в качестве мишеневой клетки использовали линию клеток миеломы (КМS11).

На Фиг. 6С показаны результаты сравнения анализов высвобождения хрома анти-GM2-CAR-Т-клеткой, экспрессирующей IL-7/CCL19, и контрольной CAR-T-клеткой. На Фиг. 6С показаны результаты анализа, в котором в качестве мишеневых клеток использовали клеточную линию рака толстой кишки (SW480).

На Фиг. 7 показаны результаты совместного культивирования линии GM2-положительных злокачественных клеток мезотелиомы (Y-meso8A) с анти-GM2 CAR-Т-клетками, экспрессирующими IL-7/CCL19, или контрольными клетками. На фигуре, обозначение «только опухоль» относится к культивированию только опухолевых клеток (то же самое относится к последующим фигурам).

На Фиг. 8 показаны результаты анализа совместного культивирования линии GM2-положительных злокачественных клеток мезотелиомы (MSTO221H) с анти-GM2 CAR-Т-клетками, экспрессирующими IL-7/CCL19, или контрольными клетками.

На Фиг. 9 показаны результаты совместного культивирования линии GM2-негативных клеток рака толстой кишки (SW480) с анти-GM2 CAR-Т-клетками, экспрессирующими IL-7/CCL19, или контрольными клетками.

На Фиг. 10 показаны результаты измерения IFN-γ в культуральном супернатанте при анализе совместного культивирования каждой линии опухолевых клеток с анти-GM2 CAR-Т-клетками, экспрессирующими IL-7/CCL19, или контрольными клетками с помощью ELISA.

На Фиг. 11А показана динамика роста опухоли, когда иммунодефицитным мышам, которым интраторакально вводили люциферазу, экспрессирующую MSTO211H, вводят анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующие IL-7/CCL19, или нетрансгенные Т-клетки.

На Фиг. 11B показана динамика роста опухоли, когда иммунодефицитным мышам, которым внутрибрюшинно вводили люциферазу, экспрессирующую MSTO211H, вводят анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующие IL-7/CCL19, или нетрансгенные Т-клетки.

На Фиг. 12 показаны результаты анализа динамики роста опухоли, когда иммунодефицитным мышам, которым интраторакально вводили люциферазу, экспрессирующую MSTO211H, вводят анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующие IL-7/CCL19, или нетрансгенные Т-клетки.

На Фиг. 13 показаны результаты анализа динамика роста опухоли, когда иммунодефицитным мышам, которым интраторакально вводили люциферазу, экспрессирующую MSTO211H, вводят анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующие IL-7/CCL19, анти-GM2 CAR-экспрессирующие Т-клетки или нетрансгенные Т-клетки. На фигуре, «х» обозначает мертвую мышь.

На Фиг. 14 показаны результаты анализа эффекта на динамику роста опухоли, когда иммунодефицитным мышам, которым интратарокально вводили люциферазу, экспрессирующу MSTO211H, вводят анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующие IL-7/CCL19, анти-GM2 CAR-экспрессирующие Т-клетки или нетрансгенные Т-клетки.

На Фиг. 15 показаны результаты анализа эффекта на динамику роста опухоли, когда иммунодефицитным мышам, которым интраторакально вводили люциферазу, экспрессирующую MSTO211H, вводят анти-GM2 CAR-Т-клетки, экспрессирующие IL-7/CCL19, анти-GM2 CAR-экспрессирующие Т-клетки или нетрансгенные Т-клетки.

[ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ]

[0012] Полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки по настоящему изобретению могут быть находиться в выделенном состоянии. Другими словами, полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки, описанные в настоящем описании, могут быть выделенными полипептидами, выделенными полинуклеотидами, выделенными векторами и выделенными клетками.

[0013]

[ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР (АНТИ-GM2 CAR)]

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору, содержащему связывающую мишеневый антиген область; трансмембранную область; и область передачи сигнала активации Т-клеток, в которой мишеневый антиген представляет собой ганглиозид GM2.

[0014] В настоящем описании термин «химерный антигенный рецептор (CAR)» означает химерный белок, содержащий связывающую мишеневый антиген область, трансмембранную область и область передачи сигнала активации Т-клеток. Химерный белок означает белок, содержащий последовательность, полученную из двух или более видов гетерологичных белков. CAR не ограничен CAR, включающими только три вышеуказанные области, и включает CAR, включающие другие области.

[0015]

<Связывающая мишеневый антиген область>

CAR по настоящему варианту осуществления включает связывающую мишеневый антиген область, в котором мишеневый антиген представляет собой ганглиозид GM2 (в настоящем описании также обозначен как «GM2»).

[0016] Термин «связывающая мишеневый антиген область» означает внеклеточную область, которая связывается с мишеневым антигеном вне клетки, когда CAR экспрессируется в Т-клетке. CAR, экспрессируемый в CAR-T-клетке, переносится на клеточную мембрану и находится в состоянии, при котором связывающая мишеневые антиген область расположена вне клетки и область передачи сигнала активации Т-клетки, расположенный внутри клетки, соединены посредством трансмембранной области, которая проходит сквозь клеточную мембрану. Если CAR-T-клетка вступает в контакт с клеткой, которая имеет в качестве мембранного антигена мишеневый антиген, то связывающая мишеневый антиген область связывается с мишеневым антигеном после чего сигнал активации T-клетки передается из области передачи сигнала активации T-клетки внутрь Т-клетки, активируя Т-клетку.

[0017] В CAR по настоящему варианту осуществления мишеневый антиген, с которым связывается связывающая мишеневый антиген область, представляет собой GM2.

GM2 представляет собой тип ганглиозида, который представляет собой гликолипид с сиаловой кислотой. Ганглиозид представляет собой молекулу, которая составляет клеточную мембрану животного и состоит из сахарной цепи, которая представляет собой гидрофильную боковую цепь, и сфингозина и жирной кислоты, которые являются гидрофобными боковыми цепями. Ганглиозиды классифицируют по типу связывания и количеству связей с сиаловой кислотой, а также по наличию или отсутствию связывания с N-ацетилгалактозамином (GalNAc) и галактозой (Gal), которые связываются с невосстанавливающим концом. GM2 представляет собой один из ганглиозидов со структурой сахарной цепи: GalNAcβ1-4 (SAα2-3) Galβ1-4Glcβ1-1 церамид.

[0018] Тип и уровень экспрессии ганглиозидов изменяться в зависимости от типа клетки, типа органа, типа животного и тому подобного. Известно, что экспрессия ганглиозидов изменяется количественно и качественно в процессе перерождения клетки в злокачественную (Cancer Res 45: 2405-14 (1985)). Сообщалось, что едва ли любой GM2 может считаться экспрессируемым в нормальных клетках, но может экспрессироваться в опухолях, таких как рак легких, нейробластома, глиома, меланома, злокачественная мезотелиома и миелома (Cancer Res 45: 2405-14 (1985); Cancer Res 50: 7444-9 (1990); Cancer Sci vol. 102 no. 12: 2157-2163; Cancer Sci vol. 106 no. 1: 102-107 (2015)).

[0019] Связывающая мишеневый антиген область конкретно не ограничена, при условии, что она может специфически связываться с GM2, но предпочтительно включает антиген-связывающую область моноклонального антитела (в настоящем описании также называемого «анти-GM2-антитело»), способного специфически связываться с GM2. «Антиген-связывающая область» антитела относится к области, участвующей в связывании с антигеном в антителе, и конкретно относится к области, включающей определяющую комплементарность область (CDR). Антигенсвязывающая область антитела включает по меньшей мере одну CDR антитела. В предпочтительном варианте осуществления антиген-связывающая область антитела включает все шесть CDR антитела. CDR могут быть определены любым способом, известным для определения CDR, и можно использовать, например, определение по Kabat, Chothia, AbM, cotact и тому подобное. Предпочтительные примеры CDR включают CDR, определенные по Kabat.

[0020] Анти-GM2 антитело, которое можно использовать в качестве антиген-связывающей области, конкретно не ограничивается и может быть известным антителом или впервые полученным антителом. В случае впервые полученного анти-GM2 антитела, получение анти-GM2 антитела может быть осуществлено известным способом. Например, можно использовать способ иммунизации животного антигеном GM2 с получением гибридомы, способ фагового дисплея или тому подобное.

[0021] Организм, из которого получено анти-GM2 антитело, конкретно не ограничено, но антитело человека является предпочтительным. Примеры анти-GM2 антитела человека включают антитело с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 в качестве вариабельной области тяжелой цепи (VH), и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 в качестве вариабельной области легкой цепи (VL) и тому подобное. Согласно определению по Kabat, аминокислотные последовательности CDR 1-3 области VH, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 показаны как SEQ ID NO: 63-65, соответственно. Кроме того, согласно определению по Kabat аминокислотные последовательности CDR 1-3 области VL, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 показаны как SEQ ID NO: 66-68, соответственно.

[0022] В предпочтительном варианте осуществления связывающая мишеневый антиген область может включать область VH и область VL анти-GM2 антитела. Например, полипептид, включающий одноцепочечное антитело (scFv) с областью VH и областью VL анти-GM2 антитела, является подходящим примером связывающей мишеневый антиген области. ScFv представляет собой полипептид, в котором область VH и область VL антитела связаны посредством пептидного линкера, и обычно используется в качестве связывающей мишеневый антиген области CAR.

[0023] В случае использования scFv, пептидный линкер для связывания области VH и области VL конкретно не ограничен, и можно использовать пептидные линкеры, обычно используемые для scFv. Примеры пептидных линкеров включают линкер 15 (SEQ ID NO: 6), линкер 25 (SEQ ID NO: 8) и тому подобное, но примеры не ограничиваются ими.

[0024] Область VH и область VL анти-GM2 антитела могут использоваться как область VH и область VL, используемые для scFv. Предпочтительные примеры анти-GM2 антител описаны выше. Кроме того, часть последовательности может быть модифицирована в области VH и области VL, используемой для scFv, при этом сохраняя ее способность связываться с GM2. Например, в качестве scFv предпочтительно использовать следующие примеры.

(а) scFv, который включает область VH, включающую CDR 1-3 области VH, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и область VL, включающую CDR 1-3 области VL, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и который обладает способностью связываться с GM2.

(1b) scFv, который включает область VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и область VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и который обладает способностью связываться с GM2.

(1с) scFv, который включает область VH, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и область VL, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и который обладает способностью связываться с GM2.

(c) scFv, который включает область VH, состоящую из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и область VL, состоящую из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и который обладает способностью связываться с GM2.

[0025] В приведенном выше (1а) в качестве последовательностей (каркасных последовательностей), отличных от CDR, предпочтительно использовать каркасные последовательности известных антител человека. Например, можно выбрать последовательности из аминокислотных последовательностей каркасных последовательностей антител человека, зарегистрированных в известных базах данных последовательностей, таких как GenBank, из аминокислотных последовательностей, выбранных из консенсусных последовательностей, полученных из каждой подгруппы антител человека (Human Most Homologous Consensus Sequence; Sequences of Proteins of Immunological Interest by Kabat, E. A. et al., US Dept. Health and Human Services, 1991) и тому подобное.

[0026] В приведенном выше (1c) термин «несколько» может означать, например, от 2 до 30, предпочтительно, означать от 2 до 20, более предпочтительно, означать от 2 до 10 и, еще более предпочтительно, означать от 2 до 5. Кроме того, термин «мутированный» может относиться к любому из: делеция, замена, добавление и вставка или их комбинация. Кроме того, мутация предпочтительно располагается в области, отличная от CDR 1-3 (то есть в каркасной области).

[0027] В приведенном выше (1d) идентичность последовательности конкретно не ограничена, если она составляет 70% или более, но предпочтительно составляет 80% или более, более предпочтительно 85% или более, еще более предпочтительно 90% или более еще более предпочтительно 95% или более и особенно предпочтительно 6% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более. Идентичность по последовательности (или гомология) аминокислотных последовательностей получают как пропорцию совпадений аминокислот ко всей аминокислотной последовательности, исключая пробелы в полученном выравнивании при сопоставления двух аминокислотных последовательностей с одновременным вводом пробелов в частях, соответствующих вставкам и делециям для максимального совпадения соответствующих аминокислот. Идентичность по последовательности аминокислотных последовательностей может быть получена с помощью различных типов программ поиска гомологии, известных в данной области. Например, значение идентичности последовательности аминокислотных последовательностей может быть получено путем расчета на основе выравнивания, полученного с помощью известного программного обеспечения поиска гомологии BLASTP.

[0028] Конкретные примеры scFv включают, например, полипептид, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16; полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16; полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, и который обладает способностью связываться с GM2; полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, и которая обладает способностью связываться с GM2; и тому подобное. Что касается термина «несколько» и термина «мутированный», к ним относится то же, что описано выше. Кроме того, для термина «идентичность по последовательности» применяется то же, что описано выше.

[0029]

<ТРАНСМЕМБРАННАЯ ОБЛАСТЬ>

Термин «трансмембранная область» означает область, которая присутствует при пересечении клеточной мембраны и связана с внеклеточной областью и внутриклеточной областью, когда CAR экспрессируется в Т-клетке. Трансмембранная область конкретно не ограничена, если она представляет собой полипептид, обладающий функцией пересекать клеточную мембрану. Трансмембранная область может быть получена из природного белка или может быть создана искусственно. Трансмембранная область, полученная из природного белка, может быть получена из любого мембрано-связывающего белка или трансмембранного белка. В предпочтительном варианте осуществления трансмембранная область может передавать сигнал активации в область передачи сигнала активации Т-клетки в ответ на связывание мишеневого антигена со связывающей мишеневый антиген областью.

[0030] Примеры трансмембранных областей включают трансмембранные области α-цепи и β-цепи рецептора Т-клеток, CD3ζ, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR и тому подобное. Предпочтительные примеры включают трансмембранную область CD8. Организм, из которого получены эти белки, конкретно не ограничен, но предпочтительно им является человек. Аминокислотные последовательности этих белков доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Примеры аминокислотных последовательностей CD8 человека включают аминокислотную последовательность, зарегистрированную как GenBank NO: NM_001768.6, и тому подобное, и примеры аминокислотных последовательностей трансмембранной области включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

[0031] Кроме того, трансмембранная область может быть мутантным вариантом вышеуказанной трансмембранной области, полученной из природного белка. Примеры мутантных вариантов трансмембранной области, полученных из природного белка, включают следующие.

(2a) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 20) трансмембранной области, полученной из природного белка, и который обладает трансмембранной способностью.

(2b) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 20) трансмембранной области, полученной из природного белка, и который обладает трансмембранной способностью.

[0032] В приведенном выше (2а) идентичность последовательности конкретно не ограничена, если она составляет 70% или более, но предпочтительно составляет 80% или более, более предпочтительно 85% или более, и особенно предпочтительно 90% или более, и конкретно, 95% или более.

[0033] В приведенном выше (2b) термин «несколько» может означать, например, от 2 до 10, предпочтительно, означать от 2 до 5, более предпочтительно, означать от 2 до 4 и, еще более предпочтительно, означать от 2 до 3. Кроме того, термин «мутированный» может относиться к любому из: делеция, замена, добавление и вставка или их комбинация.

[0034]

<ОБЛАСТЬ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА АКТИВАЦИИ T-КЛЕТКИ>

Термин «область передачи сигнала активации Т-клетки» означает область, которая расположена внутри клетки и передает сигнал активации Т-клетки внутрь Т-клетки, когда CAR экспрессируется в Т-клетке. В Т-клетке, если комплекс МНС-пептид связывается с Т-клеточным рецептором (TCR), то сигнал активации Т-клетки передается внутрь клетки через комплекс TCR-CD3, и запускаются различные сигналы фосфорилирования (первичный сигнал трансдукции). Кроме того, известно, что костимулирующие молекулы, экспрессируемые на поверхности Т-клетки, передают костимуляторные сигналы внутрь клетки и поддерживают активацию Т-клетки путем связывания каждой костимулирующей молекулы, экспрессируемой на поверхности антиген-презентирующей клетки, с конкретным лигандом (вторичная сигнальная трансдукция).

В настоящем описании термин «передача сигнала активации Т-клетки» включает как первичную передачу сигнала, так и вторичную передачу сигнала, как указано выше. Термин «область передачи сигнала активации Т-клетки» означает внутриклеточную область, участвующую в передаче сигнала от белка, участвующего в первичной передаче сигнала и вторичной передаче сигнала.

[0035] Область передачи сигнала активации Т-клетки конкретно не ограничена, при условии, что она является областью передачи сигнала активации Т-клетки от белка, участвующего в передачи сигнала активации Т-клетки. Например, известно, что иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) участвует в первичной передаче сигнала. Соответственно, примеры областей передачи сигнала активации Т-клетки включают область передачи сигнала активации Т-клетки от белка с ITAM. Примеры белков с ITAM включают CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d и тому подобное. Область передачи сигнала активации T-клетки, включающая ITAM этих белков, является предпочтительным примером области передачи сигнала активации T-клетки, используемой для CAR. Более предпочтительные примеры включают область передачи сигнала активации Т-клетrb CD3ζ или тому подобное.

[0036] Кроме того, костимулирующие молекулы участвуют во вторичной передаче сигнала, как описано выше. Соответственно, примеры областей передачи сигнала активации Т-клетки также включают область передачи сигнала костимулирующих молекул. Примеры костимулирующих молекул включают CD2, CD4, CD5, CD8, CD27, CD28, OXO40 (CD134), 4-1BB (CD137), ICOS, CD154, HVEM, GITR, γ-цепь, связанную с Fc-рецептором, и тому подобное. Область передачи сигнала активации T-клетки этих белков также является предпочтительным примером области передачи сигнала активации T-клетки, используемой для CAR. Более предпочтительные примеры включают область передачи сигнала активации Т-клетки CD28, 4-1ВВ или тому подобное.

[0037] Организм, из которого получены вышеуказанные белки, конкретно не ограничен, но предпочтительно им является человек. Аминокислотные последовательности этих белков доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Примеры аминокислотных последовательностей CD3ζ человека включают аминокислотную последовательность, зарегистрированную как GenBank NO: NM_000734.3, и тому подобное, и примеры аминокислотных последовательностей области передачи сигнала активации Т-клетки включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. Кроме того, примеры аминокислотных последовательностей CD28 человека включают аминокислотную последовательность, зарегистрированную как GenBank NO: NM_006139.2, и тому подобное, и примеры аминокислотных последовательностей области передачи сигнала активации T-клетки включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. Кроме того, примеры аминокислотных последовательностей 4-1BB человека включают аминокислотную последовательность, зарегистрированную как GenBank NO: NM_001561.5, и тому подобное, и примеры аминокислотных последовательностей области передачи сигнала активации T-клеток включают набор аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26.

[0038] Кроме того, область передачи сигнала активации T-клетки может быть мутантным вариантом области передачи сигнала активации T-клетки, полученной из природного белка, как описано выше. Примеры мутантных вариантов области передачи сигнала активации, полученных из природного белка, включают следующее.

(3a) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 24, 26 или 28) области передачи сигнала активации Т-клетки, полученной из природного белка, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки.

(3b) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 24, 26 или 28) области передачи сигнала активации Т-клетки, полученной из природного белка, и который обладает способностью передавать сигнал активации Т-клетки.

[0039] В приведенном выше (3а) идентичность последовательности конкретно не ограничена, если она составляет 70% или более, но предпочтительно составляет 80% или более, более предпочтительно 85% или более, и особенно предпочтительно 90% или более, и конкретно, 95% или более.

[0040] В приведенном выше (3c), в случае использования области белка, участвующего в первичной передаче сигнала, термин «несколько» может означать, например, от 2 до 30, предпочтительно, означать от 2 до 20, более предпочтительно, означать от 2 до 10 и, еще более предпочтительно, означать от 2 до 5. Кроме того, в случае использования области костимулирующей молекулы, термин «несколько» может означать, например, от 2 до 15, предпочтительно означать от 2 до 10, более предпочтительно, означать от 2 до 5 и, еще более предпочтительно, означать 2 или 3. Кроме того, термин «мутированный» может относиться к любому из: делеция, замена, добавление и вставка или их комбинация.

[0041] Число областей передачи сигнала активации T-клетки, входящих в состав CAR по настоящему изобретению, не ограничивается одной, и могут быть множеством областей передачи сигнала активации T-клетки. В этом случае множество областей передачи сигнала активации Т-соты могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. В предпочтительном варианте осуществления CAR включает в себя две или более областей передачи сигнала активации T-клетки. В этом случае области передачи сигнала активации T-клетки, входящие в состав CAR, предпочтительно представляют собой комбинацию области передачи сигнала активации T-клетки, участвующей в первичной передаче сигнала, и области передачи сигнала активации T-клетки, участвующей во вторичной передаче сигнала. Конкретные примеры включают комбинацию областей передачи сигнала активации T-клетки CD3ζ и CD28, комбинацию областей передачи сигнала активации T-клетки CD3ζ и 4-1BB, комбинацию областей передачи сигнала активации T-клетки CD3ζ, CD28 и 4-1BB и тому подобное.

[0042] В случае объединения области передачи сигнала активации T-клетки, участвующей в первичной передаче сигнала, с областью передачи сигнала активации T-клетки, участвующей во вторичной передаче сигнала, область передачи сигнала активации T-клетки, участвующая в первичной передаче сигнала, предпочтительно находится на C-конце. В вышеуказанных конкретных примерах предпочтительно, область передачи сигнала активации T-клетки CD3 находится на С-конце области передачи сигнала активации T-клетки CD28 или 4-1BB. В случае, если используются и CD28, и 4-1BB, то области могут быть расположены в любом порядке, но примеры расположения включают расположение в порядке CD28 и 4-1BB на N-конце.

[0043] В случае, если используется только одна область передачи сигнала активации T-клетки, предпочтительно использовать область передачи сигнала активации T-клетки, участвующую в первичной передаче сигнала, и более предпочтительно использовать область передачи сигнала активации T-клетки CD3ζ.

[0044]

<ДРУГИЕ ОБЛАСТИ>

CAR настоящего варианта осуществления может включать другие области, кроме указанных выше областей. Примеры других областей включают внеклеточную шарнирную область, цитоплазматическую область, спейсерную область, сигнальный пептид и тому подобное.

[0045]

(ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ШАРНИРНАЯ ОБЛАСТЬ)

Термин «внеклеточная шарнирная область» означает область, связывающую внеклеточную связывающую мишеневый антиген область и трансмембранную область. В предпочтительном варианте осуществления CAR по настоящему варианту осуществления содержит внеклеточную шарнирную область.

Внеклеточная шарнирная область конкретно не ограничена, при условии, что она может связывать связывающий мишеневый антиген участок и трансмембранную область. Внеклеточная шарнирная область может быть получена из природного белка или может быть создана искусственно. Внеклеточная шарнирная область может состоять, например, из приблизительно 1-100 аминокислот и, предпочтительно, из приблизительно 10-70 аминокислот. Внеклеточная шарнирная область предпочтительно представляет собой область, которая не влияет на способность связывания с GM2 связывающей мишеневый антиген области и не препятствует передаче сигнала областью передачи сигнала активации Т-клеток.

[0046] Примеры внеклеточных шарнирных областей включают внеклеточные шарнирные области CD8, CD28, CD4 и тому подобное. Кроме того, можно использовать шарнирную область иммуноглобулина (например, IgG4 и тому подобное). Предпочтительные примеры включают внеклеточную шарнирную область CD8.

[0047] Организм, из которого получены вышеуказанные белки, конкретно не ограничен, но предпочтительно им является человек. Аминокислотные последовательности этих белков доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Примеры аминокислотных последовательностей CD8 человека включают аминокислотные последовательности, описанные выше, и примеры аминокислотных последовательностей внеклеточной шарнирной области включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

[0048] Кроме того, внеклеточная шарнирная область может быть мутантным вариантом вышеуказанной внеклеточной шарнирной области, полученной из природного белка. Примеры мутантных вариантов внеклеточной шарнирной области, полученные из природного белка, включают следующие.

(4a) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 18) внеклеточной шарнирной области, полученной из природного белка.

(4b) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 18) внеклеточной шарнирной области, полученной из природного белка.

[0049] В приведенном выше (4а) идентичность последовательности конкретно не ограничена, если она составляет 70% или более, но предпочтительно составляет 80% или более, более предпочтительно 85% или более, и особенно предпочтительно 90% или более, и конкретно, 95% или более.

[0050] В приведенном выше (4b) термин «несколько» может означать, например, от 2 до 20, предпочтительно, означать от 2 до 15, более предпочтительно, означать от 2 до 10 и, еще более предпочтительно, означать от 2 до 5. Кроме того, термин «мутированный» может относиться к любому из: делеция, замена, добавление и вставка или их комбинация.

[0051]

(ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ)

«Цитоплазматическая область» представляет собой область, смежную с цитоплазматическим концом трансмембранной области в трансмембранном белке, и представляет собой область, состоящую из примерно 3-50 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления CAR по настоящему варианту осуществления включает цитоплазматическую область. Цитоплазматическая область конкретно не ограничена, при условии, что она является областью, смежной с цитоплазматической частью трансмембранной области трансмембранного белка. За счет связывания трансмембранной области с областью передачи сигнала активации Т-клетки через цитоплазматическую область, можно стабилизировать структуру трансмембранной области. Цитоплазматическая область может быть получена из природного белка или может быть получена синтезирована. Цитоплазматическая область может состоять, например, из примерно 3-50 аминокислот, предпочтительно из примерно 4-20 аминокислот и, более предпочтительно, из примерно 5-10 аминокислот. Цитоплазматическая область предпочтительно представляет собой область из того же белка, что и трансмембранная область. При использовании цитоплазматической области из того же белка, что и трансмембранная область, структура трансмембранной области может быть более стабильной.

[0052] Примеры цитоплазматических областей включают цитоплазматическую область белков, указанных для трансмембранной области, описанной выше. Предпочтительные примеры включают цитоплазматическую область CD8. Организм, из которого получены эти белки, конкретно не ограничен, но предпочтительно им является человек. Примеры аминокислотных последовательностей цитоплазматической области включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

[0053] Кроме того, цитоплазматическая область может быть мутантным вариантом вышеуказанной цитоплазматической области, полученной из природного белка. Примеры мутантных вариантов цитоплазматической области, полученных из природного белка, включают следующие.

(5a) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 22) цитоплазматической области, полученной из природного белка, и который обладает способностью стабилизировать трансмембранную область.

(5b) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 22) цитоплазматической области, полученной из природного белка, и который обладает способность стабилизировать трансмембранную область.

[0054] В приведенном выше (5а) идентичность последовательности конкретно не ограничена, если она составляет 70% или более, но предпочтительно составляет 80% или более, более предпочтительно 85% или более, и особенно предпочтительно 90% или более, и конкретно, 95% или более.

[0055] В приведенном выше (5b) термин «несколько» может означать, например, от 2 до 10, предпочтительно, означать от 2 до 4 и, более предпочтительно, означать 2 или 3. Кроме того, термин «мутированный» может относиться к любому из: делеция, замена, добавление и вставка или их комбинация.

[0056]

(СПЕЙСЕРНАЯ ОБЛАСТЬ)

«Спейсерная область» представляет собой короткий пептид, который связывает две функциональные области (домены) белка. В одном из аспектов в CAR по настоящему варианту осуществления каждая область связывания мишеневого антигена, трансмембранная область, область передачи сигнала активации Т-клетки и тому подобное, описанные выше, могут быть связаны посредством спейсерной области. Спейсерная область конкретно не ограничена, и ее обычно используют для получения химерного белка. Длина спейсерной области может составлять от 1 до 100 аминокислот и предпочтительно от 10 до 50 аминокислот. Примеры спейсерных областей включают глицин-сериновые непрерывные последовательности и тому подобное.

[0057]

(СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД)

«Сигнальный пептид» представляет собой пептид, который управляет локализацией мембранного белка или секретируемого белка. В одном аспекте, CAR по настоящему варианту осуществления может включать сигнальный пептид. Сигнальный пептид, как правило, представляет собой пептид, состоящий из примерно 5-60 аминокислот, присутствующих на N-конце мембранного белка, и удаляется из зрелого белка, который окончательно локализован.

[0058] Сигнальный пептид, используемый для CAR по настоящему варианту осуществления, предпочтительно представляет собой сигнальный пептид, который управляет локализацией белка на клеточной мембране, и предпочтительно представляет собой сигнальный пептид мембранного белка. Примеры сигнальных пептидов включают сигнальные пептиды α-цепи и β-цепи рецептора Т-клеток, CD3ζ, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь иммуноглобулина и тому подобное. Конкретные примеры аминокислотных последовательностей сигнального пептида включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57.

[0059] В CAR по настоящему варианту осуществления каждая из вышеупомянутых областей может быть расположена в следующем порядке от N-конца: область связывания мишеневого антигена, трансмембранная область и область передачи сигнала активации T-клетки. Каждая из этих областей может быть непосредственно связана друг с другом или может быть связана с помощью другой области, последовательности спейсера или тому подобное.

[0060] В случае, когда CAR по настоящему варианту осуществления включает внеклеточную шарнирную область, внеклеточная шарнирная область располагается между областью, связывающей мишеневый антиген, и трансмембранной областью. Кроме того, в случае, когда CAR по настоящему варианту осуществления включает цитоплазматическую область, цитоплазматическая область располагается между трансмембранной областью и областью передачи сигнала активации Т-клетки.

Кроме того, в случае, когда CAR по настоящему варианту осуществления включает сигнальный пептид, сигнальный пептид располагается на N-конце CAR.

[0061] Конкретные примеры CAR по настоящему варианту осуществления включают CAR, включающий область связывания мишеневого антигена, содержащую scFv анти-GM2 антитела, трансмембранную область CD8 (или его мутантный вариант), область передачи сигнала активации T-клетки CD28 (или его мутантный вариант), область передачи сигнала активации T-клетки 4-1BB (или его мутантный вариант) и область передачи сигнала активации T-клетки CD3ζ (или его мутантный вариант). Более предпочтительные примеры включают CAR, содержащий область, связывающую мишеневый антиген, содержащую scFv анти-GM2-антитела, внеклеточную шарнирную область CD8 (или ее мутантный вариант), трансмембранную область CD8 (или ее мутантный вариант), цитоплазматическую область область CD8 (или ее мутантный вариант), область передачи сигнала активации T-клеток CD28 (или ее мутантный вариант), область передачи сигнала активации T-клетки 4-1BB (или ее мутантный вариант) и область передачи сигнала активации T-клетки CD3ζ (или его мутантный вариант).

[0062] Примеры такого CAR включают CAR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 42, 44 и 46. В аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 40, 42, 44 и 46, последовательности в положениях с 1 по 19 соответствуют сигнальным пептидам. Соответственно, каждый зрелый CAR в вышеупомянутых примерах включает аминокислотную последовательность в положениях с 20 по 874 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, аминокислотную последовательность в положениях с 20 по 884 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, аминокислотную последовательность в положениях 20-874 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44, или аминокислотную последовательность в положениях 20-884 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46.

В предпочтительном варианте осуществления CAR по настоящему варианту осуществления состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 42, 44 и 46. Кроме того, зрелый CAR состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-874 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, аминокислотной последовательности в положениях 20-884 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, аминокислотной последовательности в положениях 20-874 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44, и аминокислотной последовательности в положениях 20-884 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46.

[0063]

[КЛЕТКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ АНТИ-GM2 CAR (АНТИ-GM2 CAR-ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ КЛЕТКА)]

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет клетку, которая экспрессирует CAR вышеупомянутых вариантов осуществления.

[0064] Клетка по настоящему варианту осуществления экспрессирует CAR по вышеупомянутому варианту осуществления (также называемый «анти-GM2 CAR») и имеет CAR на клеточной поверхности. В клетках, экспрессирующих GM2, GM2 в изобилии присутствует на клеточной поверхности. Если клетка по настоящему варианту осуществления вступает в контакт с клеткой, экспрессирующей GM2, то клетка связывается с GM2 на поверхности клетки, экспрессирующей GM2, посредством области, связывающей мишеневый антиген, анти-GM2 CAR. Соответственно, клетка по настоящему варианту осуществления активируется, и, таким образом, происходит высвобождение цитолитических гранул и продукция цитокинов. Эти цитолитические гранулы и цитокины разрушают клетку, экспрессирующую GM2.

[0065] Клетка по настоящему варианту осуществления предпочтительно представляет собой клетку млекопитающего и может быть, например, клеткой человека или клеткой млекопитающего, отличного от человека, такого как мышь, крыса, крупный рогатый скот, овцы, лошади, собаки, свиньи и обезьяны, и более предпочтительно, является клеткой человека. Тип клеток конкретно не ограничен, и примеры включают клетки, собранные из крови, жидкости костного мозга, селезенки, тимуса, лимфатических узлов и тому подобное; иммунные клетки, инфильтрирующие злокачественные ткани, такие как первичные опухоли, метастатические опухоли и раковый асцит; и тому подобное. Их предпочтительные примеры включают иммунные клетки и мононуклеарные клетки периферической крови, отделенные от периферической крови, и тому подобное. Среди клеток, содержащихся в мононуклеарных клетках периферической крови, эффекторные клетки являются предпочтительными, а Т-клетки и их клетки-предшественники являются особенно предпочтительными клетками. Тип T-клеток конкретно не ограничен, и T-клетки могут быть любыми T-клетками среди αβ-клеток, γδ-T-клеток, CD8-позитивных T-клеток, цитотоксических T-клеток, CD4-позитивных T-клеток, вспомогательных T-клеток, T-клеток памяти, наивных Т-клеток, инфильтрирующих опухоль Т-клеток, природных Т-киллеров и тому подобное. Среди них CD8-позитивные Т-клетки или цитотоксические Т-клетки являются более предпочтительными.

[0066] Предпочтительно, кроме анти-GM2CAR, клетка по настоящему варианту осуществления дополнительно экспрессирует, по меньшей мере, один из: интерлейкин (IL)-7 или лиганд хемокина (CC мотив) 19 (CCL 19). В предпочтительном варианте осуществления клетка по настоящему варианту осуществления представляет собой клетку, которая экспрессирует: (i) анти-GM2 CAR и (ii) по меньшей мере один из IL-7 или CCL19. Более предпочтительно, клетка по настоящему варианту осуществления представляет собой клетку, которая экспрессирует анти-GM2 CAR, IL-7 и CCL19.

[0067] IL-7 является цитокином, необходимым для выживания Т-клеток, и продуцируется негематопоэтическими клетками, такими как стромальные клетки костного мозга, тимуса и лимфоидных органов и тканей, но его продукция Т-клетками практически не отмечается.

[0068] Между тем, CCL19 в основном продуцируется дендритными клетками и макрофагами в лимфатических узлах и способен вызывать миграцию Т-клеток и В-клеток, а также зрелых дендритных клеток посредством своего рецептора, который представляет собой рецептор CC-хемокина 7 (рецептор хемокина (C-C мотив) 7: CCR7).

[0069] Организм, из которого получены IL-7 и CCL19, конкретно не ограничен, но предпочтительно представляет собой человека. Аминокислотные последовательности этих белков доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Например, примеры аминокислотных последовательностей IL-7 человека включают аминокислотную последовательность, зарегистрированную как GenBank NO: NM_000880.3 (SEQ ID NO: 59), и тому подобное. Кроме того, примеры аминокислотных последовательностей CCL19 человека включают аминокислотную последовательность, зарегистрированную как GenBank NO: NM_006274.2 (SEQ ID NO: 61), и тому подобное. IL-7 и CCL19 имеют сигнальный пептид, и сигнальный пептид удаляется из зрелых белков. Например, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59 IL-7 человека, последовательность в положениях с 1 по 25 соответствует сигнальному пептиду. Кроме того, например, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61 CCL19 человека, последовательность в положениях с 1 по 21 соответствует сигнальному пептиду.

[0070] Кроме того, IL-7 и CCL19 могут быть мутантными вариантами природных белков, описанных выше. Примеры мутантных вариантов IL-7 включают следующие.

(6a) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности природного IL-7 (например, SEQ ID NO: 59), и который обладает функцией стимуляции иммунитета T-клетки.

(6b) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности природного IL-7 (например, SEQ ID NO: 59), и который обладает функцией стимуляции иммунитета Т-клетки.

[0071] Кроме того, примеры мутантных вариантов CCL19 включают следующее.

(7a) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 70% или более идентична (гомологична) аминокислотной последовательности природного CCL19 (например, SEQ ID NO: 61), и который обладает функцией стимуляции иммунитета T-клетки.

(7b) Полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой мутирована одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности природного CCL19 (например, SEQ ID NO: 61), и который обладает функцией стимуляции иммунитета Т-клетки.

[0072] Термин «функция стимуляции иммунитета Т-клетки» означает функцию поддержания или стимулирования выживания, роста, цитотоксической активности, миграционной активности, инфильтрационной активности злокачественной ткани и тому подобное Т-клеток.

В приведенных выше (6а) и (7а)идентичность последовательности конкретно не ограничена, если она составляет 70% или более, но предпочтительно составляет 80% или более, более предпочтительно 85% или более, и особенно предпочтительно 90% или более, и конкретно, 95% или более.

Кроме того, в приведенных выше (6b) и (7b), термин «несколько» может означать, например, от 2 до 30, предпочтительно, означать от 2 до 20, более предпочтительно, означать от 2 до 10 и, еще более предпочтительно, означать от 2 до 5. Кроме того, термин «мутированный» может относиться к любому из: делеция, замена, добавление и вставка или их комбинация.

[0073] Кроме того, мутантные варианты IL-7 и CCL19 могут быть мутантными вариантами, у которых сигнальный пептид заменен другим сигнальным пептидом, или могут быть мутантными вариантами, у которых удален сигнальный пептид. Предпочтительно, мутантные варианты IL-7 и CCL19 имеют сигнальный пептид секретируемых белков и секретируются внеклеточно.

[0074] В случае, когда клетка по настоящему варианту осуществления представляет собой выделенную Т-клетку, экспрессия по меньшей мере одного из IL-7 или CCL19 вместе с анти-GM2 CAR усиливает иммунную функцию Т-клетки, и, таким образом, Т-клетка приобретает превосходную цитотоксическую активность против GM2-экспрессирующих клеток, инвазивную функцию в опухолевую ткань и способна выживать в микроокружении опухоли.

[0075] Кроме того, клетка по настоящему варианту осуществления может экспрессировать "суицидный" ген, кроме анти-GM2 CAR. Экспрессия "суицидального" гена в клетке по настоящему варианту осуществления позволяет индуцировать апоптоз в клетке по настоящему варианту осуществления, если необходимо. "Суицидный" ген конкретно не ограничен, и можно использовать известный "суицидный" ген. Примеры "суицидальных" генов включают ген тимидинкиназы (HSV-TK) вируса простого герпеса, индуцибельный ген каспазы 9 и тому подобное. Клетки, экспрессирующие HSV-TK, могут вызывать гибель клеток при сосуществовании с ганцикловиром. Кроме того, клетки, экспрессирующие индуцибельную каспазу 9, могут вызывать гибель клеток при сосуществовании с химической индукцией димеризации (CID), такой как AP1903. Аминокислотные последовательности "суицидальных" генов доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Кроме того, также можно использовать последовательности коммерчески доступных векторов, включая "суицидный" ген и тому подобное.

[0076] Также можно сказать, что клетка по настоящему варианту осуществления представляет собой клетку (предпочтительно Т-клетку), содержащую анти-GM2 CAR. Можно сказать, что предпочтительными примерами клетки по настоящему варианту осуществления являются клетки (предпочтительно Т-клетки), содержащие анти-GM2 CAR и, по меньшей мере, один из IL-7 или CCL19. Можно сказать, что более предпочтительными примерами клетки по настоящему варианту являются клетки (предпочтительно Т-клетки), содержащие анти-GM2 CAR, IL-7 и CCL19. Можно сказать, что еще более предпочтительными примерами клетки по настоящему варианту осуществления являются клетки (предпочтительно Т-клетки), содержащие анти-GM2 CAR, IL-7, CCL19 и "суицидный" ген.

[0077] Клетка по настоящему варианту осуществления может быть получена путем введения полинуклеотида или вектора, содержащего основную последовательность, кодирующую анти-GM2 CAR, которая будет описана позже, в клетку.

[0078]

[ПОЛИНУКЛЕОТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ОСНОВНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ АНТИ-GM2 CAR]

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему основную последовательность, которая кодирует анти-GM2 CAR.

[0079] Полинуклеотид по настоящему варианту осуществления конкретно не ограничен при условии, что он содержит последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR. Анти-GM2 CAR, как описано выше в разделе [Химерный антигенный рецептор (анти-GM2 CAR)]. Полинуклеотид по настоящему варианту осуществления предпочтительно содержит последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность CAR анти-GM2, приведенную в качестве примера в разделе [Химерный антигенный рецептор (анти-GM2 CAR)], описанном выше.

[0080] Пример последовательностей оснований, кодирующих область, связывающую мишеневый антиген, включает последовательность оснований, кодирующую scFv анти-GM2 антитела. Более конкретно, в качестве примера можно указать полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В качестве последовательности оснований, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, можно указать последовательность оснований SEQ ID NO: 1, 49, 51 или 53. Кроме того, в качестве последовательности оснований, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, можно указать последовательность оснований SEQ ID NO: 3, 50, 52 или 54.

Эти базовые последовательности предпочтительно связаны базовой последовательностью, кодирующей линкер. Линкер такой же, как описано в разделе «Химерный антигенный рецептор», описанном выше. Например, в качестве последовательности оснований, кодирующей линкер 15, описанный выше, в качестве примера можно привести последовательность оснований SEQ ID NO: 5 или 55. Кроме того, в качестве последовательности оснований, кодирующей линкер 25, можно привести последовательность оснований SEQ ID NO: 7 или 56.

Конкретные примеры последовательностей оснований, кодирующих scFv анти-GM2 антитела, включают последовательность оснований SEQ ID NO: 9, 11, 13 или 15, и тому подобное.

Последовательность оснований, кодирующая область, связывающую мишеневый антиген, предпочтительно представляет собой оптимизированную по кодонам последовательность оснований в соответствии с видами вводимых клеток, и в случае введения в клетки человека предпочтительна оптимизированная по кодонам последовательность человека.

[0081] Кроме того, последовательности оснований, кодирующие трансмембранную область и область передачи сигнала активации Т-клетки, доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Кроме того, в случае, когда GM2 CAR содержит другие области, такие как внеклеточная шарнирная область, последовательности оснований, кодирующие другие области, также доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank.

Например, в случае, когда трансмембранная область CD8 человека используется в качестве трансмембранной области, примеры последовательностей оснований, кодирующих CD8 человека, включают последовательность оснований, зарегистрированную как GenBank NO: NM_001768.6, и тому подобное. В качестве последовательностей оснований, кодирующих трансмембранную область, можно привести последовательность оснований SEQ ID NO: 19.

Кроме того, например, в случае, когда область передачи сигнала активации T-клетки человека CD3ζ, CD28 человека или 4-1BB человека используется в качестве области передачи сигнала активации T-клетки, примеры последовательностей оснований, кодирующих CD3ζ человека, CD28 человека, и 4-1BB человека, соответственно, включают последовательности оснований, зарегистрированные как номера GenBank: NM_000734.3, NM_006139.2 и NM_001561.5 и тому подобное. В качестве соответствующих последовательностей оснований, кодирующих области передачи сигнала активации Т-клеток CD3ζ человека, CD28 человека и 4-1BB человека, можно привести последовательности оснований, изложенные в SEQ ID NO: 27, 23 и 25.

Кроме того, например, в случае, когда внеклеточная шарнирная область CD8 человека используется в качестве внеклеточной шарнирной области, последовательность оснований SEQ ID NO: 17, может быть проиллюстрирована в качестве последовательности оснований, кодирующей внеклеточную шарнирную область.

Кроме того, например, в случае, когда цитоплазматическая область CD8 человека используется в качестве цитоплазматической области, в качестве примера последовательности оснований, кодирующих цитоплазматическую область, можно привести SEQ ID NO: 21.

[0082] Последовательность оснований, кодирующая каждую вышеуказанную область, не ограничена известными последовательностями оснований, и может использоваться любая последовательность, если она является последовательностью оснований, кодирующей каждую из вышеуказанных областей. Из-за вырожденности генетического кода присутствует множество кодонов, соответствующих одной аминокислоте. Соответственно, присутствует много последовательностей оснований, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность. Последовательность оснований, кодирующая каждую вышеуказанную областей, может быть любой из множества последовательностей оснований, полученных путем вырожденности генетического кода, при условии, что она является последовательностью оснований, кодирующей эти области.

Последовательность оснований, кодирующая каждую вышеуказанную область, связывающую мишеневый антиген, предпочтительно представляет собой оптимизированную по кодонам последовательность оснований в соответствии с видами вводимых клеток, и в случае введения в клетки человека предпочтительна оптимизированная по кодонам последовательность человека.

Кроме того, последовательность оснований, кодирующая каждую вышеуказанную область, может представлять собой последовательность оснований, кодирующую мутантный вариант каждой области, полученной из природного белка. Мутантные варианты каждой области описаны выше в разделе [Химерный антигенный рецептор (анти-GM2 CAR)].

[0083] Соответствующая последовательность оснований, кодирующая каждую область анти-GM2-CAR, предпочтительно расположена в следующем порядке от 5'-конца: область связывания мишеневого антигена, трансмембранная области и области передачи сигнала активации Т-клетки. В случае использования сигнального пептида, внеклеточной шарнирной области или тому подобного, предпочтительно, чтобы сигнальный пептид был расположен на 5 'конце области, связывающей мишеневый антиген, а внеклеточная шарнирная область была расположена между область, связывающей мишеневый антиген и трансмембранную область. Последовательности оснований, кодирующие эти области, могут быть непосредственно связаны или могут быть связаны через последовательность оснований, кодирующую спейсерную область. Спейсерная область представляет собой область, описанную выше в разделе [Химерный антигенный антигена (анти-GM2 CAR)].

[0084] Конкретные примеры последовательностей оснований, кодирующих CAR против GM2, включают последовательность оснований, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, 41, 43 и 45 и тому подобное.

[0085] Полинуклеотид по настоящему варианту осуществления может быть получен путем связывания полинуклеотидов, состоящих из последовательности оснований, кодирующих каждую область анти-GM2 CAR, непосредственно или через спейсерную последовательность. Полинуклеотиды, кодирующие каждую область анти-GM2 CAR, могут быть получены химическим синтезом с помощью известного метода на основе последовательности оснований каждой области. Кроме того, с помощью ПЦР, изотермической амплификации и тому подобного с использованием ДНК, выделенной из Т-клеток или тому подобного, и кДНК, полученной обратной транскрипцией РНК, выделенной из Т-клеток или тому подобного в качестве матрицы, можно амплифицировать и получить полинуклеотиды, кодирующие каждую область. Полинуклеотиды, кодирующие каждую полученную таким образом область, могут быть модифицированы, например, путем замены, делеции, добавления и вставки в пределах соответствующей области, без потери функции каждой области после трансляции.

[0086] Полинуклеотид по настоящему варианту осуществления может включать, кроме последовательности оснований, кодирующей анти-GM2 CAR, регуляторные последовательности, такие как промотор, энхансер, сигнал добавления поли А и терминатор, последовательности оснований, кодирующие другие белки, и тому подобное.

[0087] Примеры других белков включают IL-7 и CCL19. Последовательности оснований, кодирующие эти белки доступны из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Например, в случае, когда используется IL-7 человека, примеры последовательностей оснований, кодирующих IL-7 человека, включают последовательность оснований, зарегистрированную как GenBank NO: NM_002190.2 (SEQ ID NO: 58), и тому подобное. Кроме того, в случае, когда используется CCL19 человека, примеры последовательностей оснований, кодирующих CCL19 человека, включают в себя последовательность оснований, зарегистрированную как GenBank NO: NM_006274.2 (SEQ ID NO: 60), и тому подобное.

Кроме того, последовательности оснований, кодирующие эти белки, не ограничиваются известными последовательностями оснований, и могут использоваться любые последовательности, если они являются последовательностями оснований, кодирующими эти белки, и может использоваться любая из множества последовательностей оснований, полученная посредством вырожденности генетического кода. Последовательности оснований, кодирующие эти белки, предпочтительно представляют собой оптимизированную по кодонам последовательность оснований в соответствии с видом вводимых клеток, и в случае введения в клетки человека предпочтительна оптимизированная по кодонам и последовательность человека.

Кроме того, последовательности оснований, кодирующие эти белки, могут кодировать мутантные варианты природного IL-7 и природного CCL19. Эти мутантные варианты описаны выше в разделе [Клетка, экспрессирующая анти-GM2 CAR (анти-GM2 CAR-экспрессирующая клетка)].

[0088] Примеры других белков включают "суицидный" ген. "Суицидный" ген описан выше в разделе [Клетка, экспрессирующая анти-GM2 CAR (анти-GM2 CAR-экспрессирующая клетка)]. Последовательность оснований, кодирующая "суицидный" ген, доступна из известных баз данных последовательностей, таких как GenBank. Кроме того, также можно использовать последовательности коммерчески доступных векторов, содержащих "суицидный" ген.

[0089] В случае, когда полинуклеотид по настоящему варианту осуществления включает последовательность оснований, кодирующую другой белок, последовательность оснований, кодирующую пептид саморасщепляющегося типа, такой как пептид 2A, последовательность внутреннего сайта проникновения рибозима (IRES) и тому подобное, может быть встроена между последовательностью оснований, кодирующей анти-GM2 CAR, и последовательностью оснований, кодирующей другой белок. Кроме того, в случае, когда присутствуют два или более других белка, между другими белками могут быть встроен пептид самоотщепляющегося типа, IRES и тому подобное. Встраивая эти последовательности, множественные белки могут экспрессироваться независимо от одного промотора.

[0090] Примеры 2A-пептидов включают 2A-пептиды пикорнавируса, ротавируса, вируса насекомого, афтовируса, вируса трипаносомы и тому подобное. В качестве конкретного примера, можно привести аминокислотную последовательность 2А пептида (F2A) пикорнавируса SEQ ID NO: 62. Последовательность оснований, кодирующая пептид 2A, предпочтительно представляет собой оптимизированную по кодонам последовательность оснований в соответствии с видами вводимых клеток, и в случае введения в клетки человека предпочтительна оптимизированная по кодонам последовательность человека.

[0091] Кроме того, полинуклеотид по настоящему варианту осуществления может быть полинуклеотидом, имеющим регуляторные последовательности, такие как промотор, энхансер, сигнал добавления поли А и терминатор для каждой из кодирующих белок последовательности оснований, кодирующей анти-GM2 CAR, и последовательности оснований, кодирующей другие белки. Кроме того, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, в котором некоторые кодирующие белок последовательности независимо имеют регуляторные последовательности, а последовательности, кодирующие другие белки, связанные через пептид 2A, IRES или тому подобное, имеют общие регуляторные последовательности.

[0092]

[ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ОСНОВАНИЙ, КОДИРУЮЩУЮ АНТИ-GM2 CAR]

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору, содержащему последовательность оснований, которая кодирует анти-GM2 CAR.

[0093] Полинуклеотид по варианту осуществления может быть в форме вектора. Тип вектора конкретно не ограничен, и можно использовать обычно используемые векторы экспрессии и тому подобное. Вектор может быть линейным или кольцевым и может представлять собой невирусный вектор, такой как плазмида, может представлять собой вирусный вектор или может представлять собой транспозонный вектор. Примеры векторов включают вирусные векторы, плазмидные векторы, эписомальные векторы, векторы с искусственной хромосомой и тому подобное.

[0094] Примеры вирусных векторов включают векторы вируса Сендай, векторы ретровируса (включая лентивирус), векторы аденовируса, векторы аденоассоциированных вирусов, векторы вируса герпеса, векторы вируса коровьей оспы, векторы вируса оспы, векторы вируса полиомиелита, векторы вируса синдрома, вирусы рабдовируса, векторы парамиксовируса ортомиксовирусные векторы и тому подобное.

[0095] Примеры плазмидных векторов включают плазмидные векторы для экспрессии в клетках животных, такие как pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV и pcDNAI/Neo.

[0096] Эписомальный вектор представляет собой вектор, способный к внехромосомной автономной репликации. Примеры эписомальных векторов включают векторы, содержащие последовательности, которые необходимы для автономной репликации и получены из EBV, SV40 и тому подобного в качестве векторных элементов. Конкретные примеры векторных элементов, необходимых для автономной репликации, включают начальную точку репликации и ген, кодирующий белок, который связывается с вектором в начальной точке репликации для контроля репликации. Их примеры включают oriP, который является начальной точкой репликации, и ген EBNA-1 в случае EBV, и ori, который является начальной точкой репликации, и ген SV40LT в случае SV40.

[0097] Примеры векторов искусственной хромосомы включают векторы дрожжевой искусственной хромосомы (YAC), векторы бактериальной искусственной хромосомы (BAC), векторы на основе P1 искусственной хромосомы (PAC) и тому подобное.

[0098] Предпочтительные примеры вектора по настоящему варианту осуществления включают вирусные векторы, и его более предпочтительные примеры включают ретровирусные векторы. Примеры ретровирусных векторов включают вектор pMSGV1 (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2012)) и вектор pMSCV (производства Takara Bio Inc.). Используя ретровирусный вектор, ген в векторе встраивается в геном клетки-хозяина, и, таким образом, ген может стабильно экспрессироваться в клетке-хозяине в течение длительного времени.

[0099] Кроме последовательностей оснований, описанных выше в разделе [Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR], вектор по настоящему варианту осуществления может включать начальную точку репликации; последовательность оснований, кодирующая белок, который связывается с вектором в начальной точке репликации для контроля репликации; последовательность оснований, кодирующая маркерный ген, такой как ген лекарственной устойчивости и репортерный ген; и тому подобное.

[0100] Последовательность оснований, кодирующая анти-GM2-CAR, предпочтительно расположена внутри вектора, и экспрессируется под контролем соответствующего промотора. Кроме того, в случае, когда встроены последовательности оснований, кодирующие другие белки, эти последовательности оснований предпочтительно расположены внутри вектора, и экспрессируются под контролем соответствующего промотора. Примеры промоторов включают промотор SRα, промотор ранней стадии SV40, LTR ретровируса, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK), EF1α промотор, металлотионеиновый промотор, промотор теплового шока и тому подобное. Кроме того, энхансер гена IE CMV человека может использоваться вместе с промотором. В качестве примера можно указать промотор CAG (включая энхансер цитомегаловируса, промотор β-актина курицы и сигнальный сайт поли-А гена β-глобина) и тому подобное. Кроме того, как описано выше в разделе [Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR], его транскрипция могут быть осуществляться под контролем общего промотора путем определения местоположения последовательности оснований, кодирующей пептид саморасщепляющегося типа или IRES между каждой из кодирующей белок последовательностью.

[0101] В предпочтительном варианте осуществления кроме последовательности оснований, кодирующей анти-GM2 CAR, вектор по настоящему варианту осуществления дополнительно включает по меньшей мере одну последовательность оснований, кодирующую IL-7, и последовательность оснований, кодирующую CCL19. В более предпочтительном варианте осуществления кроме последовательности оснований, кодирующей анти-GM2 CAR, вектор по настоящему варианту осуществления дополнительно включает последовательность оснований, кодирующую IL-7, и последовательность оснований, кодирующую CCL19.

Вектор по настоящему варианту осуществления предпочтительно включает последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR, функционально связанную с соответствующим промотором. Более предпочтительно, вектор по настоящему варианту осуществления включает последовательность оснований, в которой последовательность оснований, кодирующая анти-GM2 CAR, последовательность оснований, кодирующая IL-7, и последовательность оснований, кодирующая CCL19, связаны через последовательность оснований, кодирующую пептид саморасщепляющегося типа или IRES. Последовательность оснований функционально связана с соответствующим промотором. Фраза «функционально связана с промотором» означает, что последовательность оснований связана ниже промотора и экспрессируется под контролем промотора. В вышеприведенном примере порядок расположения последовательности оснований, кодирующей анти-GM2 CAR, последовательности оснований, кодирующей IL-7, и последовательности оснований, кодирующей CCL19, конкретно не ограничен и может быть любым.

[0102]

[СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ АНТИ-GM2 CAR]

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения клетки, экспрессирующей анти-GM2 CAR, при этом способ включает введение полинуклеотида или вектора, содержащего последовательность нуклеотидов, кодирующую анти-GM2 CAR, в клетку.

[0103] Клетка, экспрессирующая анти-GM2 CAR по вышеуказанному варианту осуществления (также называется «клеткой, экспрессирующей анти-GM2 CAR»), может быть получена путем введения полинуклеотида или вектора, содержащего последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR из варианта осуществления выше в клетку. Полинуклеотид или вектор, введенный в клетку, сохраняется в клетке в состоянии, способном к экспрессии анти-GM2 CAR. Фраза «состояние, способное к экспрессии» означает состояние, в котором последовательность оснований, кодирующая анти-GM2 CAR, может транскрибироваться и транслироваться.

[0104] Способ введения полинуклеотида или вектора в клетку конкретно не ограничен, и можно использовать известные способы. Их примеры включают способ вирусной инфекции, способ липофекции, способ микроинъекции, способ на основании фосфата кальция, способ на основе DEAE-декстрана, способ электропорации, способ с использованием транспозона, способ с применением пушки для частиц и тому подобное.

[0105] Кроме того, в случае, когда вектор представляет собой ретровирусный вектор, подходящие упаковочные клетки могут быть выбраны на основе последовательностей LTR и сигнальных последовательностей упаковки, включенных в вектор, и частицы ретровируса могут быть получены с их использованием. Примеры упаковочных клеток включают PG13, PA317, GP+E-86, GP+envAm-12, Psi-Crip и тому подобное. Кроме того, клетки 293 или клетки 293T с высокой эффективностью трансфекции могут быть использованы в качестве упаковочных клеток. Поскольку различные ретровирусные векторы и упаковочные клетки, которые можно использовать для упаковки вектора, широко коммерчески доступны, можно использовать эти коммерчески доступные продукты. Например, можно использовать клетки GP2-293 (производства Takara Bio Inc.), клетки Plat-GP (производства Cosmo Bio Co., Ltd.), клетки PG13 (CRL-10686 производства ATCC), клетки PA317. (CRL-9078, производимый ATCC) и тому подобное, и коммерчески доступный набор, такой как Retrovirus packagin Kit Eco (производства Takara Bio Inc.).

[0106] В случае, когда в клетках, экспрессирующих анти-GM2 CAR, экспрессируются другие чужеродные белки, такие как IL-7, CCL19, и "суицидный" ген, последовательности оснований, кодирующие эти другие белки, могут быть встроены в вектор, содержащий последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR, или может быть встроен в другой вектор. В случае, когда последовательности оснований, кодирующие другие белки, включены в другой вектор, вектор может быть встроен в клетку одновременно или отдельно с вектором, содержащим последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR.

[0107] Кроме того, клетка, экспрессирующая анти-GM2 CAR, может быть получена путем введения полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR, в геном клетки, так что полинуклеотид может экспрессироваться под контролем соответствующего промотора, используя известные методы редактирования генов и тому подобное. Примеры методов редактирования генов включают методы с использованием эндонуклеаз, таких как нуклеаза цинкового пальца, активирующая транскрипцию эффекторная нуклеаза (TALEN), кластерная система с регулярным перемежающимся коротким палиндромным повторением (CRISPR) -Cas и пентатрикопептидный повтор (PPR). В случае, когда другие чужеродные белки экспрессируются в клетке, экспрессирующей анти-GM2 CAR, аналогично, полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую другой чужеродный белок, может быть встроен в геном клетки, так что полинуклеотид может быть экспрессирован под контролем соответствующего промотора, используя способы редактирования генов и тому подобное. Например, в качестве примера можно привести способ введения полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR (или другие белки), функционально связанную с соответствующим промотором, в некодирующую область и тому подобное в геноме клетки; способ введения полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR (или другие белки), ниже эндогенного промотора в геноме клетки; и тому подобное. Примеры эндогенных промоторов включают промоторы TCRα и TCRβ и тому подобное.

[0108] После введения в клетку полинуклеотида или вектора, содержащего последовательность оснований, кодирующую анти-GM2 CAR, экспрессия анти-GM2 CAR в клетке может быть подтверждена известным методом, таким как проточная цитометрия, RT-PCR, Нозерн-блоттинг, Вестерн-блоттинг, ИФА и флуоресцентное иммуноокрашивание. Кроме того, экспрессия других чужеродных белков, таких как IL-7 и CCL19, также может быть аналогичным образом подтверждена известными способами.

[0109]

[ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ КЛЕТКУ, ЭКСПРЕССИРУЮЩУЮ АНТИ-GM2 CAR]

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку, экспрессирующую анти-GM2 CAR.

[0110] Клетка, экспрессирующая анти-GM2 CAR, проявляет специфическую цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих GM2. Соответственно, клетка, экспрессирующая анти-GM2 CAR, может быть использована для лечения или профилактики заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими GM2. Поскольку GM2 экспрессируется в широком диапазоне опухолевых клеток, включая рак легких, нейробластому, глиому, меланому, злокачественную мезотелиому, миелому и тому подобное, фармацевтическая композиция, содержащая клетку, экспрессирующую анти-GM2 CAR, может использоваться в качестве фармацевтической композиции для лечения или профилактики опухолей. Опухоль может быть опухолью любой костной ткани, хрящевой ткани, жировой ткани, мышечной ткани, сосудистой ткани и кроветворной ткани. Примеры опухолей включают злокачественную опухоль, такую как глиома, меланома, злокачественная мезотелиома, рак легких, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак печени, рак матки, рак мочевого пузыря, рак желчных путей, рак пищевода, опухоль яичка, рак щитовидной железы, рак головного мозга, рак простаты, рак толстой кишки, рак почки, рак яичников, рак молочной железы, аденокарциному, плоскоклеточный рак, аденосквамозно-клеточный рак, анапластический рак, крупноклеточный рак, мелкоклеточный рак, рак кожи, рак влагалища, рак шеи, рак селезенки, рак трахеи, рак бронхов, рак тонкой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря и рак яичка; саркому, такую как остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная гемангиоэндотелиома, злокачественная шваннома и саркома мягких тканей; бластому, такую как нейробластома, гепатобластома, медуллобластома, нефробластома, панкреатобластома, плевропульмональная бластома и ретинобластома; опухоль зародышевой клетки; злокачественную опухоль крови, такую как лимфома, лейкоз и миелома; и тому подобное, но примеры не ограничиваются этим. В частности, фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления подходит в качестве фармацевтической композиции для лечения или профилактики опухолей, экспрессирующих GM2. Примеры опухолей, экспрессирующих GM2, включают рак легкого, нейробластому, глиому, меланому, злокачественную мезотелиому, миелому и тому подобное, но примеры не ограничиваются этим. Экспрессирует опухоль GM2 или нет, можно подтвердить, например, известным способом, используя анти-GM2 антитело или тому подобное. Примеры известных способов включают проточную цитометрию, ELISA, иммуноокрашивание, флуоресцентное иммуноокрашивание и тому подобное. Клетки (предпочтительно Т-клетки), которые экспрессируют любой из IL-7 и CCL19, один или оба, в дополнение к CAR против GM2, проявляют сильную цитотоксическую активность против даже солидных опухолей, если опухоль экспрессирует GM2. По этой причине фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления, содержащая клетки (предпочтительно Т-клетки), экспрессирующие CAR против GM2, и любой IL-7 и CCL19, один или оба, могут быть особенно предпочтительно использованы в случае солидных опухолей, экспрессирующих GM2. Таким образом, фармацевтическая композиция для лечения или профилактики солидных опухолей, которая содержит клетку (предпочтительно Т-клетку), экспрессирующую анти-GM2 CAR, и любой IL-7 и CCL19, один или оба, является предпочтительным примером фармацевтической композиции на настоящему варианту осуществления. Термин «солидная опухоль» означает опухоль, отличную от злокачественной опухоли крови, возникающую из кроветворных тканей, и включает рак эпителиальных клеток и рак неэпителиальных клеток.

[0111] Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления может содержать другие компоненты, такие как фармацевтически приемлемый носитель, кроме клетки, экспрессирующей анти-GM2 CAR. Примеры других компонентов включают, в дополнение к фармацевтически приемлемому носителю, активирующий Т-клетки фактор, такой как цитокины, иммуностимулятор, ингибитор иммунной контрольной точки, клетки, экспрессирующие другие CAR, противовоспалительный агент и тому подобное, но примеры этим не ограничены. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают среду для культивирования клеток, физиологический солевой раствор, фосфатный буферный раствор, цитратный буферный раствор и тому подобное.

[0112] Фармацевтическую композицию по настоящему варианту осуществления можно вводить известным способом, но предпочтительно ее можно вводить пациенту путем инъекции или инфузии. Способ введения предпочтительно представляет собой внутривенное введение, но не ограничивается этим, и введение может быть осуществлено путем инъекции в опухоль или тому подобное.

[0113] Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления может включать терапевтически эффективное количество клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR. Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество агента, эффективного для лечения или профилактики заболевания. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от болезни, возраста, пола, массы тела и тому подобное индивида для введения. В фармацевтической композиции по настоящему изобретению вышеуказанное терапевтически эффективное количество клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, может быть, например, количеством, которое позволяет клеткам, экспрессирующим анти-GM2 CAR, подавлять рост опухолей.

[0114] Доза и интервал введения фармацевтической композиции по настоящему варианту осуществления могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от возраста, пола, массы тела и тому подобное индивида, который получает введение; типа, степени прогрессирования, симптомов и тому подобного заболевания; способа введения; и тому подобное. В качестве дозы можно вводить терапевтически эффективное количество, и примеры включают от 1×10⁴ до 1×10¹⁰ клеток, предпочтительно, от 1×10⁵ до 1×10⁹ клеток, и, более предпочтительно, от 5×10⁶ до 5×10⁸ клеток в качестве числа клеток для введения на введение.

[0115] Интервал введения фармацевтической композиции по настоящему варианту осуществления может составлять, например, каждую неделю, каждые 10-30 дней, каждый месяц, каждые 3-6 месяцев, каждый год или тому подобное. Кроме того, поскольку клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, могут автономно пролиферировать в организме индивида, получающего введение, их можно вводить только один раз. Альтернативно, количество клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, в организме может контролироваться после введения, и период введения может определяться в зависимости от результата.

[0116] Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления может быть использована в сочетании с другими противоопухолевыми средствами. Примеры других противоопухолевых средств включают алкилирующие лекарственные средства, такие как циклофосфамид, антиметаболиты, такие как пентостатин, молекулярно нацеленные лекарственные средства, такие как ритуксимаб, ингибиторы киназы, такие как иматиниб, ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб, ингибиторы кальциневрина, такие как циклоспорин, противораковые антибиотики, такие как идар растительные алкалоиды, такие как иринотекан, препараты платины, такие как цисплатин, препараты гормональной терапии, такие как тамоксифен, иммунорегуляторные препараты, такие как ниволумаб и пембролизумаб, и тому подобное, но примеры не ограничиваются этим.

[0117] Кроме того, в других аспектах настоящее изобретение относится 1) к применению клетки, экспрессирующей анти-GM2 CAR, для получения фармацевтической композиции для лечения или профилактики опухоли; 2) к способу лечения или профилактики опухоли, экспрессирующей GM2, причем указанный способ включает введение клетки, экспрессирующей анти-GM2 CAR, индивиду (например, пациенту, страдающему опухолью, экспрессирующей GM2, пациенту, который подвергся хирургическому удалению опухоли и тому подобное); 3) к клетке, экспрессирующей анти-GM2 CAR, для применения в лечении или профилактике опухоли; и 4) к применению клетке, экспрессирующей анти-GM2 CAR, для лечения или профилактики опухоли.

Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для получения клетке, экспрессирующей анти-GM2 CAR, причем набор включает вектор вышеописанного варианта осуществления. Набор конкретно не ограничен, при условии, что он содержит вектор вышеописанного варианта осуществления, и набор может включать инструкцию для получения клетки, экспрессирующей анти-GM2 CAR, реагента, используемого для введения вектора в клетку, и тому подобное.

[ПРИМЕРЫ]

[0118] Далее настоящее изобретение будет описано с помощью примеров, но настоящее изобретение не ограничено следующими примерами.

[0119]

[Пример 1] Получение клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, экспрессирующих IL-7 и CCL 19 (отбор фактора, стимулирующего иммунную функцию Т-клеток)

В живом организме присутствуют по меньшей мере сотни молекул, способных контролировать функцию Т-клеток. Авторы настоящего изобретения выбрали IL-7 и CCL19 среди огромного числа комбинаций в качестве фактора, стимулирующего иммунную функцию, для усиления противоопухолевого эффекта в клетках CAR-T.

[0120] Вышеупомянутый IL-7 является цитокином, необходимым для выживания Т-клеток, и продуцируется негематопоэтическими клетками, такими как стромальные клетки костного мозга, тимус, лимфатические органы и ткани и тому подобное. Между тем, способность продуцировать IL-7 едва ли обнаруживается в Т-клетках.

[0121] Кроме того, вышеупомянутый CCL19 в основном продуцируется дендритными клетками и макрофагами лимфатических узлов и обладает способностью вызывать миграцию Т-клеток и В-клеток, а также зрелых дендритных клеток посредством рецептора, CCR7.

[0122]

(ScFv последовательности анти-GM2 CAR)

Последовательности scFv анти-GM2 были созданы на основе последовательностей известных анти-GM2 антител. Чтобы сравнить VL и VH и типы линкеров, синтезировали каждый фрагмент ДНК VL-линкера 15-VH (SEQ ID NO: 9: VL15VH), VL-линкера 25-VH (SEQ ID NO: 11: VL25VH), VH-линкера 15-VL (SEQ ID NO: 13: VH15VL) и VH-линкера 25-VL (SEQ ID NO: 15: VH 25VL). В следующих примерах VL15 VH использовали в качестве последовательности scFv против GM2, если не указано иное.

[0123]

(Получение вектора, эксперссирующего анти-GM2 CAR, IL-7 и CCL19)

Сначала осуществляли химический синтез фрагмента ДНК IL-7-F2A-CCL19 (SEQ ID NO: 33: IL-7-F2A-CCL19), кодирующего IL-7 человека (без стоп-кодона), а затем F2A и CCL19 человека. Затем, используя существующий вектор анти-CD20 CAR-IL-7/CCL19, полученный путем введения конструкции, состоящей из мышиного анти-CD20 scFv, мышиного CD8 трансмембранной области, мышиного CD28-4-1BB-CD3ζ внутриклеточного сигнального мотива, и мышиного IL-7-F2A-мышиного CCL19, в вектор экспрессии ретровируса pMSGV1 (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2012)), область мышиного IL-7-F2A-CCL19 в векторе меняли на синтезированный фрагмент ДНК человеческого IL-7-F2A-CCL19 (SEQ ID NO: 33) путем обработки и лигирования рестриктазой (NsiI и SalI). Кроме того, химический синтез выполняли на фрагменте ДНК человеческого анти-CD20 CAR (SEQ ID NO: 37: анти-CD20 CAR), состоящем из scFv анти-CD20 человека, трансмембранной области CD8 человека и внутриклеточного сигнального мотива человека CD28-4-1BB-CD3ζ и область анти-CD20 CAR мыши в векторе была заменена этим фрагментом ДНК путем обработки и лигирования рестриктазой (NcoI и EcoI). Наконец, фрагменты ДНК (SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 15), кодирующие человеческий анти-GM2 scFv, были химически синтезированы, и анти-CD20 scFv в векторе был заменен этим фрагментом ДНК путем обработки и лигирования рестриктазой (NcoI и NotI). Конструкция фрагмента ДНК анти-GM2 CAR показана на Фиг. 1А, а схема расположения полученного вектора показана на Фиг. 1В.

[0124]

(Получение вектора, экспрессирующего анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19 и HSV-tk)

В клеточной терапии CAR-T сильный иммунный ответ на целевой антиген может вызывать системные побочные эффекты, такие как синдром высвобождения цитокинов. Чтобы предотвратить эту проблему, была получена конструкция CAR, в которой ген тимидинкиназы, полученный из вируса герпеса, HSV-tk, был введен в качестве "суицидального" гена. Когда эта конструкция была трансфицирована и HSV-tk экспрессировался в клетках CAR-T, добавление ганцикловира, который является препаратом для терапии цитомегаловируса, индуцирует апоптоз клеток CAR-T и их уничтожение, и введение ганцикловира позволяет контролировать CAR-T клетки в организме.

Сначала химически синтезировали фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-F2A-HSV-tk (SEQ ID NO: 35: IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk). Затем, область IL-7-F2A-CCL19 в векторе, экспрессирующем анти-GM2 CAR (SEQ ID NO: 39), экспрессирующем IL-7 и CCL19, заменяли на синтезированный фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk (SEQ ID NO: 35) путем обработки и лигирования рестриктазой (NsiI и SalI) и, таким образом, получали вектор экспрессии анти-GM2 CAR (SEQ ID NO: 47), экспрессирующий IL-7/CCL19 и HSV-tk.

[0125]

(Получение ретровируса, в который был введен вектор, экспрессирующий анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19)

Ретровирус получали для трансфекции генов в Т-клетки. Используя Lipofectamine 3000 (производство Life Technology Inc.), вышеупомянутый вектор, экспрессирующий анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, и плазмида p-Ampho (производство Takara Bio Inc.) трансфицировали в упаковочную клетку линии GP2-293 (производство Takara Bio Inc.) и, таким образом, получали вектор, экспрессирующий анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, в который введен ретровирус. Супернатант, содержащий ретровирус, извлекали через 48 часов после трансфекции.

[0126] В качестве культурального раствора для клеток GP2-293 использовали DMEM, в которую добавляли 10% FCS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Кроме того, в качестве культурального раствора для Т-клеток, используемых в Примерах, которые будут описаны позже, использовали GT-T 551, содержащий 2,0% сыворотки AB-типа человека (производство Sigma), 1% пенициллин-стрептомицин (производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). и 2,5 мкг/мл амфотерицина В (производство Bristol-Myers Squibb).

[0127]

(Генетическая трансдукция Т-клеток)

Мононуклеарные клетки периферической крови собирали из крови здоровых доноров и культивировали с 2×10⁶ IL-2 (200 Ед/мл: производство Peprotech) в 5% CO₂ инкубаторе при 37°C в течение 3 дней на планшете со слоем моноклонального анти-CD3 антитела (5 мкг/мл) и RetroNectin (зарегестрированный товарный знак: производство Takara Bio Inc., 25 мкг/мл) на активированных Т-клетках. На второй день после начала культивирования добавляли 500 мкл/лунка супернатанта, содержащего ретровирус, в который был введен вектор, экспрессирующий анти-GM2-CAR, IL-7/CCL19, полученный выше, в необработанный 24-луночный планшет, на который был заранее нанесен 25 мкг/мл RetroNectin (производство Takara Bio Inc.) и, таким образом, получали планшет с заранее нанесенным ретровирусом путем центрифугирования при 2000 g в течение 2 часов. Всего было получено две чашки, и после завершения центрифугирования чашки промывали 1,5% BSA/PBS и хранили при 4°C до использования. На третий день культивирования активированные клетки извлекали из планшета и добавляли к клеточной суспензии (1×10⁵ клеток/мл). Первую ретровирусную инфекцию осуществляли путем добавления 1 мл на лунку этой клеточной суспензии в планшет с предварительно помещенным ретровирусом и культивирования в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 24 часов в присутствии IL-2 (конечная концентрация 200 Ед/мл). На следующий день (день культивирования 4) осуществляли вторую ретровирусную инфекцию, перенося раствор клеток из каждой лунки в хранящийся второй планшет с предварительно помещенным на него вирус, центрифугируя при 500 g в течение 1 минуты и культивируя при 37°C в течение 4 часов. Через 4 часа культивирования при 37°С 1 мл мутного раствора клеток из каждой лунки переносили в новый 12-луночный планшет для культивирования клеток, разведенный в 4 раза свежим культуральным раствором (GT-T551), содержащим IL-2 (200 Ед/мл) и культивировали при 37°С в 5% CO₂-инкубаторе. Культивирование проводили до 7-го дня с начала дня культивирования мононуклеарных клеток периферической крови, таким образом, получали Т-клетки (Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19), в которые вводили вектор, экспрессирующий IL-7/CCL19, анти-GM2 CAR, (Фиг. 1B). Кроме того, в то же время в качестве CAR-негативного клеточного контроля получали нетрансгенные клетки, которые представляют собой активированные мононуклеарные клетки периферической крови того же здорового донора, но не инфицированные ретровирусом.

[0128]

[Пример 2] Измерение экспрессии CAR методом проточной цитометрии (проточный цитометрический анализ)

Анализ уровня экспрессии CAR, который распознает GM2 в качестве антигена, проводили двухцветным проточным цитометрическим анализом. Полученные клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, взаимодействовали с биотинилированным белком L (производство GenScript), меченным аллофикоцианином (APC) стрептавидином (производство Affymetrix) и меченным APC моноклональным анти-CD8 антителом (производство Affymetrix) и осуществляли окрашивание. EC800 (производство Sony) использовали для проточной цитометрии, а программное обеспечение FlowJo (производства Tree Star) использовали для анализа данных.

[0129] Результаты показаны на Фиг. 2. На левом графике показаны результаты клеток, в которые не были трансфицированы геном CAR, а на правом графике показаны результаты Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19. Числовые значения на графиках представляют проценты соответствующих популяций. Как показано на Фиг. 2, примерно 68% экспрессии CAR было подтверждено в Т-клетках, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19.

[0130]

[Пример 3] Получение IL-7 и CCL19

(Измерение концентраций IL-7 и CCL19 в культуральном супернатанте клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19)

Выделяли культуральный супернатант Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, или нетрансгенных клеток на 7-й день культивирования, как описано выше, и полученные Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR IL-7 и CCL19, исследовали с использованием коммерчески доступного набора ELISA (производство Peprotech и R & D systems, соответственно).

[0131]

[Результаты]

Результаты показаны на Фиг. 3. Как показано на Фиг. 3, в супернатанте культуры Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2-CAR, IL-7/CCL19 (GM-CAR), было обнаружено 300 пг/мл или более IL-7 и 2000 пг /мл или более CCL19. На основании этих результатов было подтверждено, что клетки, экспрессирующие Т-клетки, анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, и экспрессирующие IL-7 и CCL19, секретируются внеклеточно. С другой стороны, в культуральном супернатанте (без инфицирования) контрольных нетрансгенных Т-клеток количества как IL-7, так и CCL19 было ниже предела обнаружения (не обнаружено).

[0132]

[Пример 4] Экспрессия GM2 в каждой опухолевой клетке

(Проточный цитометрический анализ)

Клеточные линии злокачественной мезотелиомы Y-meso8A и MSTO211H, клеточная линия миеломы KMS-11 и клеточная линия рака толстой кишки SW480 были окрашены анти-GM2 антителом и контрольным анти-DNP антителом, которые были мечены Alexa 488, и экспрессию GM2 в каждой опухолевой клетки измеряли методом проточной цитометрии. Как для анти-GM2-антитела, меченного Alex 488, так и для анти-DNP-антитела, меченного Alex 488, проводили окрашивание в концентрации 10 мкг/образец.

[0133] Экспрессия GM2 не наблюдалась в клеточной линии рака толстой кишки SW480, но экспрессия GM2 была подтверждена в клеточных линиях злокачественной мезотелиомы Y-meso8A и MSTO211H, а также в клеточных линиях миеломы KMS-11 и KMS-28 PE.

[0134]

[Пример 5] Анализ цитотоксичности

(Анализ высвобождения ⁵¹Cr 1 Т-клетками, экспрессирующими анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19)

На Фиг. 4 показаны графики исследований получения Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, анализа цитотоксичности опухоли и анализа совместного культивирования. Как показано на Фиг. 4, Т-клетки, экспрессирующие CAR, IL-7/CCL19, выделяли на 8-й день, и цитотоксическую активность Т-клеток, экспрессирующих CAR, IL-7/CCL19, против опухолевых клеток оценивали с использованием стандартного 4-часового анализа высвобождения 51^Cr.

Различные опухолевые клетки, экспрессирующие GM2 человека, использовали в качестве клеток-мишеней. Линию опухолевых клеток культивировали при 37°C в течение 1 часа в присутствии 100 μCi Na₂ ⁵¹CrO₄, и затем 3 раза промывали, и в 96-луночную V-донный планшет добавляли 5×10³ клеток на лунку (производство Nunc). После этого в качестве эффекторных Т-клеток добавляли четыре типа Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2-CAR, IL-7/CCL19, с различными комбинациями VH и VL, и линкер в scFv CAR-анти-GM2 или нетрансгенные Т-клетки и проводили совместное культивирование с клетками-мишенями при 37°С в течение 4 часов. Соотношение эффектор/мишень (отношение E/T) доводили до 2,5, 5, 10, 20 и 40. Максимальное высвобождение и спонтанное высвобождение клеток-мишеней измеряли путем культивирования клеток-мишеней в 10%-ном Тритоне-Х (производство Sigma-Aldrich), содержащем культуральный раствор, или только в культуральном растворе. Высвобождение ⁵¹Cr супернатанта измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика TopCount (производство PerkinElmer). Процент цитотоксической активности рассчитывали по формуле: цитотоксическая активность (%) = [(анализ высвобождения - спонтанное высвобождение)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение)]×100.

[0135]

[Результаты]

Результаты показаны на Фиг. 5А и 5В. На Фиг. 5А показаны результаты, в которых в качестве клеток-мишеней использовали линии клеток злокачественной мезотелиомы (Y-meso8A и MSTO211H), а на Фиг. 5В показаны результаты, в качестве клеток-мишеней использовали линии клеток миеломы (KMS-11 и KMS-28PE). На графиках каждый «VL15VH», «VL25VH», «VH15VL» и «VH25VL» относится к результатам для анти-GM2 CAR-Т-клеток, экспрессирующих IL-7/CCL19, содержащих соответствующие последовательности в качестве scFv-последовательностей анти-GM2 CAR. Как показано на Фиг. 5А и В, Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2-CAR, IL-7/CCL19, проявляли цитотоксичность в отношении линий опухолевых клеток при любой комбинации VH, VL и линкера. С другой стороны, контрольные нетрансгенные Т-клетки (без инфекции) почти не проявляли цитотоксической активности в отношении линий опухолевых клеток. На Фиг. 5А и 5В боковая ось графиков представляет отношение эффектора (Т-клетки) к мишени (опухолевая клетка) в соотношении E/T, а вертикальная ось представляет цитотоксическую активность (%).

[0136]

(Анализ высвобождения ⁵¹Cr 2 Т-клетками, экспрессирующими анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19)

Для изучения GM2-специфичности цитотоксической активности с помощью анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток, используя Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, анти-FITC CAR-T-клетки, которые распознают FITC в качестве контроля CAR-T-клеток, и нетрансгенные T-клетки, сравнивали и исследовали цитотоксическую активность каждой клетки в отношении GM2-позитивной опухолевой клеточной линии и GM2-негативной опухолевой клеточной линии. Для Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, использовали Т-клетки, содержащие VL15VH в качестве последовательности scFv.

[0137]

[Результаты]

Результаты показаны на Фиг. 6А-6С. На Фиг. 6А показаны результаты, в которых в качестве клеток-мишеней использовали линию клеток злокачественной мезотелиомы (Y-MESO8A), на Фиг. 6В показаны результаты, в которых в качестве клетки-мишени использовали линию клеток миеломы (KMS11), а на Фиг. 6C показаны результаты, в которых в качестве клеток-мишеней использовали линию клеток рака толстой кишки (SW480). Как показано на Фиг. 6A-6C, значительная цитотоксическая активность анти-FITC CAR-T-клеток (FITC CAR-T) не обнаруживалась в отношении любых клеток-мишеней и была почти такой же, как и у нетрансгенных T-клеток (без инфекции). С другой стороны, Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19 (GM2 CAR-T) проявляли цитотоксичность в отношении GM2-экспрессирующих клеток (Y-MESO8A и KMS11), но не проявляли цитотоксичность в отношении клеток, не экспрессирующих GM2. (SW480). На основании описания выше, было подтверждено, что Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2-CAR-IL-7/CCL19, индуцируют цитотоксическую активность специфически в отношении GM2. На рис. На Фиг. 6А-6С боковая ось графиков представляет отношение эффектора (Т-клетки) к мишени (опухолевая клетка) в соотношении E/T, а вертикальная ось представляет цитотоксическую активность (%).

[0138]

(Анализ совместного культивирования)

Как показано на Фиг. 4, Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, выделяли на 7-й день и в 24-луночном планшете для культивирования клеток совместно культивировали с GM2-позитивной негативной линией опухолевых клеток или линией GM2-негативных опухолевых клеток в инкубаторе с температурой 37°C после корректировки соотношения эффектор:опухолевые клетки от 1:1 до 1:3. Цитотоксическая активность наблюдалась под микроскопом через 2 или 3 дня после начала совместного культивирования, и IFN-γ, продуцируемый в культуральном супернатанте, измеряли с использованием коммерчески доступного набора ELISA для IFN-γ (производства BioLegend). В качестве контроля Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, использовали Т-клетки, экспрессирующие анти-FITC CAR, и нетрансгенные Т-клетки.

[0139]

[Результаты]

Результаты, показаны на Фиг. 7-9. Фиг. 7 и 8 показаны результаты, в которых в качестве клетки-мишени использовали линию клеток злокачественной мезотелиомы (Y-meso8A, MSTO221H), а на Фиг. 9 показаны результаты, в которых в качестве клетки-мишени использовали линию клеток рака толстой кишки (SW480). Как показано на Фиг. 7-9, при совместном культивировании контрольных Т-клеток, экспрессирующих анти-FITC-CAR (FITC CAR-T) или нетрансгенных Т-клеток (неинфицированных) с опухолевыми клетками-мишенями все опухолевые клетки-мишени наблюдали за ростом тот же уровень, что и в лунках только для опухоли.

[0140] С другой стороны, в Т-клетках, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19 (GM2 CAR-T) наблюдали различия в росте опухоли в зависимости от типа опухолевой клетки-мишени. При совместном культивировании с GM2-негативными клетками-мишенями (SW 480: Фиг. 9) опухолевые клетки-мишени росли на том же уровне, что и в лунках, содержащих только опухоли. С другой стороны, при совместном культивировании с GM2-позитивными опухолевыми клетками (Y-meso8A: Фиг. 7 и MSTO221H: Фиг. 8) количество опухолевых клеток явно уменьшалось по сравнению с лунками только для опухолей и лунками, культивируемыми вместе с контрольными клетками.

[0141] На основании этих результатов было подтверждено, что Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, повреждают опухолевые клетки антиген-специфическим образом, как в анализе высвобождения ⁵¹Cr. Кроме того, как показано на Фиг. 10, в ELISA IFN-γ с использованием супернатанта после совместного культивирования, продукция IFN-γ была подтверждена только в супернатанте совместного культивирования Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, и GM2-позитивных клетках-мишенях (MSTO221H и Y-meso8A).

[0142]

[Пример 6] Терапевтический эффект на модели опухоли

(Введение Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR-IL-7/CCL19, облученным рентгеном мышам)

Мышей NOD/SCID/IL2rgKO (NSG), которые являются иммунодефицитными мышами, облучали рентгеновским излучением 2 Гр, а затем инокулировали с 1×10⁴ экспрессирующими люциферазу MSTO211H, внутрибрюшинно или интраторакально. Через один день вводили 2,5×10⁷ внутривенно вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19 (1×10⁷ клеток на клетки, в которых была подтверждена экспрессия CAR) или такое же количество нетрансгенных Т-клеток в качестве контроля, внутривенно этой модельной группе внутрибрюшинных опухолей (n=2) или интраторакальных опухолей (n=3). День введения клетки считали днем 0, а объем опухоли (= интенсивность свечения, обусловленного активностью люциферазы) оценивали во времени, используя систему визуализации IVIS (производства Perkin Elmer).

[0143]

[Результаты]

Результаты изменения объема опухоли у мышей показаны на Фиг. 11А и 11В. На Фиг. 11А показан результат на интраторакальной модели опухоли, а на Фиг. 11В показан результат на внутрибрюшинной модели опухоли. Как показано на Фиг. 11А, на интраторакальной модели опухоли рост опухоли был подтвержден в группе (без инфекции), которой вводили нетрансгенные Т-клетки, но в группе (GM2 CAR-T), которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2-CAR, IL-7/CCL19, не было отмечено роста опухоли. Кроме того, как показано на Фиг. 11B, на внитрибрюшинной модели опухоли рост опухоли отмечали вплоть до 3-го дня в группе (GM2 CAR-T), в которую вводили T-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, но опухоль постепенно уменьшалась со следующего дня. На основании этих результатов очевидно, Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, обладают превосходной противоопухолевой активностью, как на внутрибрюшинной модели опухоли, так и на интреторокальной модели опухоли.

[0144]

(Введение Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR-IL-7/CCL19, необлученным рентгеном мышам)

Затем был исследован противоопухолевый эффект на модели, при которой мышам NSG проводили интраторакальную инокуляцию опухоли без предварительной обработки рентгеновским излучением. В грудную полость инокулировали 1×10⁴ клеток, экспрессирующих люциферазу MSTO211H, и на следующий день 1,6×10⁷ Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19 (1×10⁷ клеток в случае CAR-экспрессирующих клеток) или такое же количество нетрансгенных Т-клеток в качестве контроля вводили внутривенно (группа, которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19: n=6, и группа, которой вводили нетрансгенные Т-клетки: n= 5). День введения клеток считался днем 0, а рост опухоли оценивался во времени с использованием системы визуализации IVIS, как описано выше.

[0145]

[Результаты]

Результаты изменения объема опухоли у мышей показаны на Фиг. 12. Как показано на Фиг. 12, в группе (без инфекции), которой вводили нетрансгенные Т-клетки, опухоль постепенно увеличивалась. С другой стороны, в группе (GM2 CAR-T), которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, опухоли демонстрировали тенденцию к росту до 9 дня, но со следующего дня опухоли не росли, кроме одной мыши, и исчезли. Было подтверждено, что Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, индуцируют превосходный противоопухолевый эффект, как в вышеупомянутой модели, подвергнутой предварительной обработке облучением рентгеновскими лучами.

[0146]

[Пример 7] Терапевтический эффект на модели опухоли

(Получение Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR)

Вектор, экспрессирующий анти-GM2 CAR, получали с той же конфигурацией, что и вектор, экспрессирующий анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, за исключением того, что фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 не содержался. Этот вектор, экспрессирующий анти-GM2 CAR, трансдуцировали в Т-клетки таким же образом, как в примере 1, и, таким образом, получали Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR.

[0147]

(Введение Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, или Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR, мышам)

Мышам NOD/SCID/IL2rgKO (NSG), которые являются иммунодефицитными мышами, инокулировали 1×10⁴ клеток, экспрессирующих люциферазу MSTO211H, интраторакально. Через день, этой группе с интраторакальным введением опухолевых клеток внутривенно вводили 2,2×10⁶ Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19 (1×10⁶ клетки в случае клеток, к которых подтверждена экспрессия CAR), такое же число Т-клеток, экспрессирующих анти-GM2 CAR (1×106 клеток, в случае клеток, для которых подтверждена экспрессия CAR), или такое же число нетрансгенных Т-клеток в качестве контроля. День введения клетки считали днем 1, а объем опухоли (= интенсивность свечения, обусловленного активностью люциферазы) оценивали во времени, используя систему визуализации IVIS (производства Perkin Elmer).

[0148]

[Результаты]

Результаты изменения объема опухоли у мышей показаны на Фиг. 13. На Фиг. 13 «х» означает, что мышь умерла. Как показано на Фиг. 13, на интраторакальной модели опухоли рост опухоли был подтвержден с течением времени в группе (без инфекции), которой вводили нетрансгенные Т-клетки, и ни одна мышь не выжила на 57 день. Даже в группе (GM2 CAR-T(-) IL-7/CCL19), в которую вводили Т-клетки, эксперссирующие анти-GM2 CAR, со временем опухоли росли, но наблюдалось подавление роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили нетрансгенные Т-клетки. С другой стороны, в группе (GM2 CAR-T(+) IL-7/CCL19), в которую вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, рост опухоли был подавлен по сравнению с другими группами и мыши выживали даже через 70 дней.

[0149] Фиг. 14 представляет собой график, показывающий изменения интенсивности люминесценции на Фиг. 13. На графике Фиг. 14 боковая ось указывает количество дней, прошедших с момента интраторакальной инокуляции опухолевых клеток мыши, а вертикальная ось указывает интенсивность свечения (×10⁶ фотонов/сек) от опухолевых клеток. В группе (без инфекции), которой вводили нетрансгенные Т-клетки, и в группе (GM2 CAR-T (-) IL-7/CCL19), в которую вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, не было мышей выживших на 57-й день, и не было последующих отражений на графике. На Фиг. 14, можно подтвердить, что рост опухоли слегка подавлялся в группе (GM2 CAR-T(-) IL-7/CCL19), которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, по сравнению с группой (без инфекции), которым вводили нетрансгенные Т-клетки. С другой стороны, в группе (GM2 CAR-T(+) IL-7/CCL19), в которую вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, рост опухоли подавлялся в практически постоянных пределах.

[0150] Кроме того, Фиг. 15 представляет собой график, который показывает переход в отношении выживаемости мышей. На Фиг. 15 боковая ось указывает количество дней, прошедших с момента интраторакальной инокуляции опухолевых клеток мыши, а вертикальная ось указывает коэффициент выживаемости (%) мышей. Как показано на Фиг. 15, было подтверждено, что в группе (GM2 CAR-T(-) IL-7/CCL19), которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, период выживания имел тенденцию незначительно увеличиваться по сравнению с группой (без инфекции), которой вводили нетрансгенные Т-клетки. С другой стороны, было подтверждено, что в группе (GM2 CAR-T(+) IL-7/CCL19), которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, коэффициент выживаемости был улучшен (эффект увеличения времени выживания) по сравнению с группой, которой вводили нетрансгенные Т-клетки, и группой, которой вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR.

На основании этих результатов очевидно, Т-клетки, экспрессирующие анти-GM2 CAR, IL-7/CCL19, обладают превосходной противоопухолевой активностью.

[Промышленная применимость]

[0151] Согласно настоящему изобретению получен новый CAR, который нацеливается на антиген солидной опухоли, выступающий в качестве мишеневого антигена, и CAR-T-клетки, которые эффективны против солидных опухолей. Клетки CAR-T по настоящему изобретению можно использовать для лечения или профилактики солидных опухолей, экспрессирующих GM2, таких как рак легких, нейробластома, глиома, меланома, злокачественная мезотелиома и миелома.

[0152] Настоящее изобретение основано на заявке на патент Японии №2017-61461, поданной 27 марта 2017 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НОЙЛ-ИММЬЮН БАЙОТЕК, ИНК.

<120> ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР

<130> PC25381

<150> JP2017-061461

<151> 2017-03-27

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VH анти-GM2 антитела VL15VH

<400> 1

gaagtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtcaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta tacattcacc gactataaca tggactgggt gaagcagagc 120

cccggccagg gactggagtg gatgggctac atctacccca ataacggcgg caccggctac 180

aaccagaagt tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 240

atggaactgc acagcctcag aagcgaagac accgctgtgt actactgcgc cacctacggc 300

cactactacg gctacatgtt cgcctactgg ggacagggca ccctggtgac cgtcagcagc 360

<210> 2

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VH анти-GM2 антитела

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VL анти-GM2 антитела VL15VH

<400> 3

gacatccagc tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgcta gccccggaga cagagtgacc 60

atcacctgtt ccgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120

aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg cttccggcgt gcctgccaga 180

ttttccggct ccggcagcgg cacaagctac tccctgacca tcagcagact gcagcccgaa 240

gacatcgcca cctactactg tcagcagagg agcagctacc cctacacctt cggcggcggc 300

accaaggtgg agatcaag 318

<210> 4

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VL анти-GM2 антитела

<400> 4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 15 для VL15VH

<400> 5

ggcggcggcg gaagcggagg cggcggcagc ggcggaggcg gaagc 45

<210> 6

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 15

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 25 для VL25VH

<400> 7

agctccgctg acgacgctaa gaaggacgct gccaagaagg acgacgccaa gaaggatgac 60

gccaaaaaag acggc 75

<210> 8

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 25

<400> 8

Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala

1 5 10 15

Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly

20 25

<210> 9

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VL15VH)

<400> 9

gacatccagc tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgcta gccccggaga cagagtgacc 60

atcacctgtt ccgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120

aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg cttccggcgt gcctgccaga 180

ttttccggct ccggcagcgg cacaagctac tccctgacca tcagcagact gcagcccgaa 240

gacatcgcca cctactactg tcagcagagg agcagctacc cctacacctt cggcggcggc 300

accaaggtgg agatcaaggg cggcggcgga agcggaggcg gcggcagcgg cggaggcgga 360

agcgaagtgc agctggtgca gtccggagcc gaggtgaaaa agcctggcgc ctccgtcaag 420

gtgagctgca aggccagcgg ctatacattc accgactata acatggactg ggtgaagcag 480

agccccggcc agggactgga gtggatgggc tacatctacc ccaataacgg cggcaccggc 540

tacaaccaga agttcaagtc caaggtgacc atcaccgtgg acaccagcac cagcaccgcc 600

tacatggaac tgcacagcct cagaagcgaa gacaccgctg tgtactactg cgccacctac 660

ggccactact acggctacat gttcgcctac tggggacagg gcaccctggt gaccgtcagc 720

agc 723

<210> 10

<211> 241

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VL15VH)

<400> 10

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser

115 120 125

Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys

130 135 140

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln

145 150 155 160

Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn

165 170 175

Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr

180 185 190

Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg

195 200 205

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr

210 215 220

Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 11

<211> 753

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VL25VH)

<400> 11

gatatccaac tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt cccccggaga cagggtgaca 60

attacctgca gcgccagctc ctccgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120

aaggccccca agctgtggat ctactccaca agcaacctgg cctccggcgt gcctgccaga 180

tttagcggaa gcggcagcgg cacatcctac agcctgacca tctccaggct gcagcccgag 240

gacatcgcca catactactg ccagcagagg tccagctacc cttacacatt cggaggcggc 300

accaaggtgg agatcaagag ctccgctgac gacgctaaga aggacgctgc caagaaggac 360

gacgccaaga aggatgacgc caaaaaagac ggcgaagtcc agctggtgca gagcggcgct 420

gaggtgaaga agcctggcgc cagcgtcaag gtgagctgta aggcctccgg ctacaccttc 480

accgactaca acatggattg ggtgaagcag agccccggac agggcctgga gtggatgggc 540

tacatctacc ccaacaacgg cggcaccggc tacaaccaga aattcaagtc caaggtgacc 600

atcaccgtgg acaccagcac atccaccgcc tacatggaac tgcacagcct gaggtccgag 660

gacacagccg tgtactactg cgctacctac ggccactact acggctacat gttcgcttac 720

tggggacagg gcaccctggt gaccgtgagc tcc 753

<210> 12

<211> 251

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VL25VH)

<400> 12

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Asp Asp Ala

100 105 110

Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys

115 120 125

Lys Asp Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

130 135 140

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn

180 185 190

Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 13

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VH15VL)

<400> 13

gaggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt caagcagagc 120

cctggccagg gcctggagtg gatgggctat atctacccca acaacggcgg caccggctac 180

aaccagaagt tcaagagcaa ggtcaccatc accgtggaca cctccacctc cacagcctac 240

atggagctgc acagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actactgcgc tacctacggc 300

cattactacg gatacatgtt cgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtgtcctcc 360

ggaggaggag gaagcggagg cggcggctcc ggcggaggcg gatccgacat ccagctgaca 420

caatccccca gcagcctgag cgctagcccc ggcgataggg tgacaattac ctgcagcgcc 480

tccagctccg tgtcctacat gcactggttt cagcaaaagc ccggcaaggc ccctaagctg 540

tggatctaca gcaccagcaa cctggccagc ggagtgcctg ccagatttag cggcagcggc 600

agcggcacca gctacagcct gaccatcagc agactgcagc ccgaggatat cgccacctac 660

tactgccagc agaggagctc ctacccctac acattcggcg gcggaaccaa ggtggagatc 720

aag 723

<210> 14

<211> 241

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VH15VL)

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 15

<211> 753

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VH25VL)

<400> 15

gaagtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtc 60

agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120

cccggccaag gcctcgagtg gatgggatac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180

aaccagaagt tcaagagcaa ggtgaccatc accgtggaca catccacaag caccgcctat 240

atggagctcc acagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cacctacggc 300

cactactacg gctatatgtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

tccagcgccg atgatgccaa gaaggatgcc gccaaaaagg acgacgctaa gaaggatgac 420

gccaagaagg acggcgatat ccagctgaca cagagcccta gctccctgag cgctagccct 480

ggcgacagag tgaccatcac ctgcagcgcc agctccagcg tgagctacat gcactggttc 540

cagcagaaac ccggcaaggc ccccaagctg tggatctaca gcaccagcaa tctggctagc 600

ggcgtgcctg ccaggtttag cggatccggc agcggcacct cctactccct gacaatctcc 660

agactgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccaac agaggtcctc ctacccctac 720

accttcggcg gcggcaccaa agtggagatc aag 753

<210> 16

<211> 251

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2scFv (VH25VL)

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys

115 120 125

Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp

130 135 140

Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro

145 150 155 160

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

165 170 175

Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile

180 185 190

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro

210 215 220

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245 250

<210> 17

<211> 165

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 17

ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat 165

<210> 18

<211> 55

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

50 55

<210> 19

<211> 63

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 19

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 20

<211> 21

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 21

ctttactgca accacaggaa c 21

<210> 22

<211> 7

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 22

Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn

1 5

<210> 23

<211> 123

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 23

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 24

<211> 41

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 24

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 25

<211> 138

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 25

cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60

atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120

gaagaaggag gatgtgaa 138

<210> 26

<211> 46

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 26

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40 45

<210> 27

<211> 339

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 27

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 28

<211> 113

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 28

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 29

<211> 849

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD8 (шарнир)_CD8 (трансмембранная область)_CD28 (сигнальная

область)_4-1BB (сигнальная область)_CD3z (сигнальная область)

<400> 29

ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 180

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 240

cacaggaaca ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 300

cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 360

gcctatcgct cccgtttctc tgttgttaaa cggggcagaa agaagctcct gtatatattc 420

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 480

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 540

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 600

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 660

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 720

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 780

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 840

ccccctcgc 849

<210> 30

<211> 283

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD8 (шарнир)_CD8 (трансмембранная область)_CD28 (сигнальная

область)_4-1BB (сигнальная область)_CD3z (сигнальная область)

<400> 30

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

50 55 60

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn

65 70 75 80

His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

85 90 95

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

100 105 110

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val

115 120 125

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

130 135 140

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

145 150 155 160

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

165 170 175

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

180 185 190

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

195 200 205

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

210 215 220

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

225 230 235 240

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

245 250 255

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

260 265 270

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

275 280

<210> 31

<211> 86

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EcoRI_F2A-NsiI

<400> 31

gaattcggaa gcggagtgaa acagactttg aattttgacc ttctcaagtt ggcgggagac 60

gtggagtcca accctggacc atgcat 86

<210> 32

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EcoRI_F2A-NsiI

<400> 32

Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys

20 25

<210> 33

<211> 909

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_SalI

<400> 33

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300

gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360

gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420

aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480

caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca cggaagcgga 540

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct 600

ggacctatgg ccctgctact ggccctcagc ctgctggttc tctggacttc cccagcccca 660

actctgagtg gcaccaatga tgctgaagac tgctgcctgt ctgtgaccca gaaacccatc 720

cctgggtaca tcgtgaggaa cttccactac cttctcatca aggatggctg cagggtgcct 780

gctgtagtgt tcaccacact gaggggccgc cagctctgtg cacccccaga ccagccctgg 840

gtagaacgca tcatccagag actgcagagg acctcagcca agatgaagcg ccgcagcagt 900

taagtcgac 909

<210> 34

<211> 300

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_SalI

<400> 34

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu

180 185 190

Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala

195 200 205

Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly

210 215 220

Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile

225 230 235 240

Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly

245 250 255

Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu

260 265 270

Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu

275 280 285

Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser

290 295 300

<210> 35

<211> 2112

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_HSVtK_SalI

<400> 35

atgttccatg tgagcttcag gtacatcttc ggactgcctc ctctcatcct ggtcctcctc 60

cccgtggcca gctccgactg tgacatcgaa ggaaaggatg gcaagcagta cgaaagcgtg 120

ctgatggtga gcatcgatca gctcctggat tccatgaagg aaatcggctc caactgcctc 180

aacaatgagt tcaacttttt taagaggcat atctgcgacg ccaacaagga gggcatgttt 240

ctgttcaggg ccgccaggaa gctgagacag ttcctcaaga tgaatagcac cggcgacttc 300

gacctccatc tgctgaaggt gtccgaggga accaccatcc tgctgaactg caccggccaa 360

gtgaagggaa gaaaacctgc tgccctgggc gaggctcagc ctaccaagag cctcgaggag 420

aacaaaagcc tgaaggagca gaagaagctg aacgacctgt gcttcctcaa gaggctcctg 480

caggagatta agacctgttg gaacaagatc ctgatgggca caaaggagca cggatccggc 540

gtgaagcaga ccctgaactt tgacctgctc aaactggccg gcgacgtcga gtccaatcct 600

ggacctatgg ctctgctgct cgccctgagc ctgctcgtcc tctggacctc ccctgctcct 660

accctgagcg gcaccaatga cgctgaagac tgctgcctgt ccgtgaccca gaagcctatc 720

cccggatata tcgtgaggaa ttttcattac ctcctgatca aggacggctg tagagtgccc 780

gccgtcgtgt tcacaacact cagaggcagg cagctgtgtg ctccccccga ccagccttgg 840

gtggagagaa tcattcagag actgcaaagg acctccgcta agatgaagag gaggtccagc 900

ggcagcggag tgaagcagac actgaatttc gacctgctca agctggccgg cgatgtggag 960

agcaaccctg gacctatggc ttcctacccc ggacatcagc acgcttccgc cttcgaccag 1020

gccgctagaa gcagaggaca ctccaataga aggacagccc tgaggcctag gagacagcag 1080

gaggccaccg aggtgaggcc cgagcagaaa atgcccaccc tgctgagagt gtatattgat 1140

ggaccccacg gcatgggaaa aaccaccaca acccagctgc tggtggctct gggaagcagg 1200

gatgatattg tgtacgtccc cgaacctatg acatattgga gggtcctcgg cgcctccgag 1260

accatcgcca acatttacac cacccagcac aggctggatc agggagagat ctccgccggc 1320

gatgctgccg tggtgatgac cagcgcccag atcactatgg gtatgcctta tgccgtgacc 1380

gacgctgtgc tggctcctca cattggcggc gaagccggat cctcccatgc tccccctcct 1440

gccctcacac tgatctttga cagacatcct atcgccgctc tgctgtgcta ccccgccgct 1500

aggtacctga tgggcagcat gacccctcag gccgtgctgg cttttgtggc cctcattccc 1560

cccacactgc ctggcacaaa tatcgtgctc ggcgccctgc ctgaggacag gcacatcgat 1620

aggctggcta agagacagag acccggagag aggctggatc tcgctatgct ggccgccatc 1680

aggagggtgt acggcctgct ggccaacacc gtgagatatc tccagtgtgg cggatcctgg 1740

agggaagact ggggccaact gagcggcaca gctgtgcctc ctcaaggcgc tgagccccag 1800

agcaacgctg gacccagacc tcacatcggc gataccctgt tcaccctgtt tagagcccct 1860

gagctcctgg cccctaacgg cgacctgtac aatgtgttcg cttgggccct ggatgtgctc 1920

gccaagagac tcaggagcat gcacgtcttc attctggact acgaccagtc ccccgctggc 1980

tgcagagatg ccctgctcca gctgacctcc ggcatggtgc agacccacgt gaccacccct 2040

ggaagcatcc ccacaatctg cgacctggcc aggacctttg ccagagaaat gggagaagcc 2100

aactgagtcg ac 2112

<210> 36

<211> 701

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_HSVtK_SalI

<400> 36

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu

180 185 190

Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala

195 200 205

Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly

210 215 220

Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile

225 230 235 240

Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly

245 250 255

Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu

260 265 270

Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu

275 280 285

Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ser Gly Val

290 295 300

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

305 310 315 320

Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser

325 330 335

Ala Phe Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr

340 345 350

Ala Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu

355 360 365

Gln Lys Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly

370 375 380

Met Gly Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg

385 390 395 400

Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu

405 410 415

Gly Ala Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu

420 425 430

Asp Gln Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser

435 440 445

Ala Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu

450 455 460

Ala Pro His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro

465 470 475 480

Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys

485 490 495

Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val

500 505 510

Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile

515 520 525

Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys

530 535 540

Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile

545 550 555 560

Arg Arg Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys

565 570 575

Gly Gly Ser Trp Arg Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val

580 585 590

Pro Pro Gln Gly Ala Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His

595 600 605

Ile Gly Asp Thr Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala

610 615 620

Pro Asn Gly Asp Leu Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu

625 630 635 640

Ala Lys Arg Leu Arg Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln

645 650 655

Ser Pro Ala Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met

660 665 670

Val Gln Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp

675 680 685

Leu Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn

690 695 700

<210> 37

<211> 1641

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-hCD20 CAR

<400> 37

atggattgga cctggaggat cctgtttctg gtggctgccg ccaccggagc ccattcccag 60

atcgtgctga gccagagccc tgccattctg agcgccagcc ccggcgaaaa ggtgaccatg 120

acctgcaggg ccagcagcag cgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcccggctcc 180

agccccaaac cctggatcta cgccaccagc aatctggcca gcggcgtgcc tgtgagattc 240

tccggcagcg gcagcggcac aagctatagc ctgaccatct ccagagtgga ggccgaggat 300

gccgccacct actactgcca gcagtggacc agcaaccccc ccacattcgg aggcggcacc 360

aagctggaga tcaaaggcgg aggcggcagc ggcggaggcg gcagcggagg cggaggaagc 420

caagtgcagc tgcagcagcc tggagctgag ctggtgaagc ctggcgcctc cgtcaagatg 480

agctgcaagg ccagcggcta cacattcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 540

cccggaagag gcctggagtg gatcggagcc atctaccccg gcaacggcga taccagctat 600

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctc accgccgaca agagcagcag caccgcctac 660

atgcagctga gcagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actactgcgc caggtccacc 720

tactatggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggcgccg gaacaaccgt gaccgtgagc 780

gccgcggccg cattcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840

cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900

tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960

tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020

ctttactgca accacaggaa caggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1080

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1140

cgcgacttcg cagcctatcg ctcccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaagctc 1200

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1260

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1320

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1380

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1440

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1500

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1560

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1620

atgcaggccc tgccccctcg c 1641

<210> 38

<211> 547

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-hCD20 CAR

<400> 38

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro

50 55 60

Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val

85 90 95

Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn

100 105 110

Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu

130 135 140

Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

145 150 155 160

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

165 170 175

Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

180 185 190

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

195 200 205

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

210 215 220

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

245 250 255

Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala

260 265 270

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

275 280 285

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

290 295 300

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

305 310 315 320

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

325 330 335

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser

340 345 350

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

355 360 365

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

370 375 380

Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

385 390 395 400

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

405 410 415

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

420 425 430

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

435 440 445

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

450 455 460

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

465 470 475 480

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

485 490 495

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

500 505 510

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

515 520 525

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

530 535 540

Pro Pro Arg

545

<210> 39

<211> 2625

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VL15VH)

<400> 39

atggattgga cctggaggat tctgttcctg gtggctgctg ccacaggcgc ccattccgac 60

atccagctga cccagtcccc tagcagcctg tccgctagcc ccggagacag agtgaccatc 120

acctgttccg ccagctccag cgtgagctac atgcactggt tccagcagaa gcccggcaag 180

gcccccaagc tgtggatcta cagcaccagc aacctggctt ccggcgtgcc tgccagattt 240

tccggctccg gcagcggcac aagctactcc ctgaccatca gcagactgca gcccgaagac 300

atcgccacct actactgtca gcagaggagc agctacccct acaccttcgg cggcggcacc 360

aaggtggaga tcaagggcgg cggcggaagc ggaggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc 420

gaagtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtcaaggtg 480

agctgcaagg ccagcggcta tacattcacc gactataaca tggactgggt gaagcagagc 540

cccggccagg gactggagtg gatgggctac atctacccca ataacggcgg caccggctac 600

aaccagaagt tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 660

atggaactgc acagcctcag aagcgaagac accgctgtgt actactgcgc cacctacggc 720

cactactacg gctacatgtt cgcctactgg ggacagggca ccctggtgac cgtcagcagc 780

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020

tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 1080

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1140

gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1200

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1260

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1320

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1380

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1440

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1500

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1560

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1620

caggccctgc cccctcgcga attcggaagc ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt 1680

ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac cctggaccat gcatgttcca tgtttctttt 1740

aggtatatct ttggacttcc tcccctgatc cttgttctgt tgccagtagc atcatctgat 1800

tgtgatattg aaggtaaaga tggcaaacaa tatgagagtg ttctaatggt cagcatcgat 1860

caattattgg acagcatgaa agaaattggt agcaattgcc tgaataatga atttaacttt 1920

tttaaaagac atatctgtga tgctaataag gaaggtatgt ttttattccg tgctgctcgc 1980

aagttgaggc aatttcttaa aatgaatagc actggtgatt ttgatctcca cttattaaaa 2040

gtttcagaag gcacaacaat actgttgaac tgcactggcc aggttaaagg aagaaaacca 2100

gctgccctgg gtgaagccca accaacaaag agtttggaag aaaataaatc tttaaaggaa 2160

cagaaaaaac tgaatgactt gtgtttccta aagagactat tacaagagat aaaaacttgt 2220

tggaataaaa ttttgatggg cactaaagaa cacggaagcg gagtgaaaca gactttgaat 2280

tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg gagtccaacc ctggacctat ggccctgcta 2340

ctggccctca gcctgctggt tctctggact tccccagccc caactctgag tggcaccaat 2400

gatgctgaag actgctgcct gtctgtgacc cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg 2460

aacttccact accttctcat caaggatggc tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca 2520

ctgaggggcc gccagctctg tgcaccccca gaccagccct gggtagaacg catcatccag 2580

agactgcaga ggacctcagc caagatgaag cgccgcagca gttaa 2625

<210> 40

<211> 874

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VL15VH)

<400> 40

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu

85 90 95

Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr

100 105 110

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

130 135 140

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val

145 150 155 160

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp

165 170 175

Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr

180 185 190

Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val

195 200 205

Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His

210 215 220

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly

225 230 235 240

His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys

260 265 270

Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

275 280 285

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

290 295 300

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

325 330 335

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg

340 345 350

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

355 360 365

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

370 375 380

Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

385 390 395 400

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

405 410 415

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

420 425 430

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

435 440 445

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

450 455 460

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

465 470 475 480

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

485 490 495

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

500 505 510

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

515 520 525

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

530 535 540

Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu

545 550 555 560

Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe

565 570 575

His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val

580 585 590

Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly

595 600 605

Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp

610 615 620

Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe

625 630 635 640

Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe

645 650 655

Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly

660 665 670

Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu

675 680 685

Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly

690 695 700

Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu

705 710 715 720

Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu

725 730 735

Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly

740 745 750

Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

755 760 765

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser

770 775 780

Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn

785 790 795 800

Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly

805 810 815

Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg

820 825 830

Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala

835 840 845

Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg

850 855 860

Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser

865 870

<210> 41

<211> 2655

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VL25VH)

<400> 41

atggactgga cctggaggat cctctttctg gtggccgccg ctaccggcgc tcacagcgat 60

atccaactga cccagtcccc ttccagcctg agcgcttccc ccggagacag ggtgacaatt 120

acctgcagcg ccagctcctc cgtgagctac atgcactggt tccagcagaa gcccggcaag 180

gcccccaagc tgtggatcta ctccacaagc aacctggcct ccggcgtgcc tgccagattt 240

agcggaagcg gcagcggcac atcctacagc ctgaccatct ccaggctgca gcccgaggac 300

atcgccacat actactgcca gcagaggtcc agctaccctt acacattcgg aggcggcacc 360

aaggtggaga tcaagagctc cgctgacgac gctaagaagg acgctgccaa gaaggacgac 420

gccaagaagg atgacgccaa aaaagacggc gaagtccagc tggtgcagag cggcgctgag 480

gtgaagaagc ctggcgccag cgtcaaggtg agctgtaagg cctccggcta caccttcacc 540

gactacaaca tggattgggt gaagcagagc cccggacagg gcctggagtg gatgggctac 600

atctacccca acaacggcgg caccggctac aaccagaaat tcaagtccaa ggtgaccatc 660

accgtggaca ccagcacatc caccgcctac atggaactgc acagcctgag gtccgaggac 720

acagccgtgt actactgcgc tacctacggc cactactacg gctacatgtt cgcttactgg 780

ggacagggca ccctggtgac cgtgagctcc gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca 840

gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg 1080

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1140

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct 1200

gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1260

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1320

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1380

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1440

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1500

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1560

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1620

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcga attcggaagc 1680

ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac 1740

cctggaccat gcatgttcca tgtttctttt aggtatatct ttggacttcc tcccctgatc 1800

cttgttctgt tgccagtagc atcatctgat tgtgatattg aaggtaaaga tggcaaacaa 1860

tatgagagtg ttctaatggt cagcatcgat caattattgg acagcatgaa agaaattggt 1920

agcaattgcc tgaataatga atttaacttt tttaaaagac atatctgtga tgctaataag 1980

gaaggtatgt ttttattccg tgctgctcgc aagttgaggc aatttcttaa aatgaatagc 2040

actggtgatt ttgatctcca cttattaaaa gtttcagaag gcacaacaat actgttgaac 2100

tgcactggcc aggttaaagg aagaaaacca gctgccctgg gtgaagccca accaacaaag 2160

agtttggaag aaaataaatc tttaaaggaa cagaaaaaac tgaatgactt gtgtttccta 2220

aagagactat tacaagagat aaaaacttgt tggaataaaa ttttgatggg cactaaagaa 2280

cacggaagcg gagtgaaaca gactttgaat tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg 2340

gagtccaacc ctggacctat ggccctgcta ctggccctca gcctgctggt tctctggact 2400

tccccagccc caactctgag tggcaccaat gatgctgaag actgctgcct gtctgtgacc 2460

cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg aacttccact accttctcat caaggatggc 2520

tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca ctgaggggcc gccagctctg tgcaccccca 2580

gaccagccct gggtagaacg catcatccag agactgcaga ggacctcagc caagatgaag 2640

cgccgcagca gttaa 2655

<210> 42

<211> 884

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VL25VH)

<400> 42

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu

85 90 95

Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr

100 105 110

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala

115 120 125

Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp

130 135 140

Asp Ala Lys Lys Asp Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

145 150 155 160

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly

180 185 190

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met

245 250 255

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

260 265 270

Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

305 310 315 320

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

325 330 335

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

340 345 350

Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr

355 360 365

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

370 375 380

Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser

385 390 395 400

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

405 410 415

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

420 425 430

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

435 440 445

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

450 455 460

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

465 470 475 480

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

485 490 495

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

500 505 510

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

515 520 525

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

530 535 540

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Ser

545 550 555 560

Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

565 570 575

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr

580 585 590

Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser

595 600 605

Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val

610 615 620

Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly

625 630 635 640

Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys

645 650 655

Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu

660 665 670

Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu

675 680 685

Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln

690 695 700

Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys

705 710 715 720

Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp

725 730 735

Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn

740 745 750

Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr

755 760 765

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

770 775 780

Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr

785 790 795 800

Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys

805 810 815

Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe

820 825 830

His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe

835 840 845

Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp

850 855 860

Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys

865 870 875 880

Arg Arg Ser Ser

<210> 43

<211> 2625

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VH15VL)

<400> 43

atggactgga cctggaggat cctcttcctg gtggctgctg ccacaggcgc ccattccgag 60

gtgcagctgg tgcagtccgg agccgaggtg aagaagcctg gcgccagcgt gaaggtgagc 120

tgtaaggcct ccggctacac cttcaccgac tacaacatgg actgggtcaa gcagagccct 180

ggccagggcc tggagtggat gggctatatc taccccaaca acggcggcac cggctacaac 240

cagaagttca agagcaaggt caccatcacc gtggacacct ccacctccac agcctacatg 300

gagctgcaca gcctgaggag cgaggatacc gccgtgtact actgcgctac ctacggccat 360

tactacggat acatgttcgc ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt gtcctccgga 420

ggaggaggaa gcggaggcgg cggctccggc ggaggcggat ccgacatcca gctgacacaa 480

tcccccagca gcctgagcgc tagccccggc gatagggtga caattacctg cagcgcctcc 540

agctccgtgt cctacatgca ctggtttcag caaaagcccg gcaaggcccc taagctgtgg 600

atctacagca ccagcaacct ggccagcgga gtgcctgcca gatttagcgg cagcggcagc 660

ggcaccagct acagcctgac catcagcaga ctgcagcccg aggatatcgc cacctactac 720

tgccagcaga ggagctccta cccctacaca ttcggcggcg gaaccaaggt ggagatcaag 780

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020

tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 1080

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1140

gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1200

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1260

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1320

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1380

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1440

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1500

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1560

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1620

caggccctgc cccctcgcga attcggaagc ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt 1680

ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac cctggaccat gcatgttcca tgtttctttt 1740

aggtatatct ttggacttcc tcccctgatc cttgttctgt tgccagtagc atcatctgat 1800

tgtgatattg aaggtaaaga tggcaaacaa tatgagagtg ttctaatggt cagcatcgat 1860

caattattgg acagcatgaa agaaattggt agcaattgcc tgaataatga atttaacttt 1920

tttaaaagac atatctgtga tgctaataag gaaggtatgt ttttattccg tgctgctcgc 1980

aagttgaggc aatttcttaa aatgaatagc actggtgatt ttgatctcca cttattaaaa 2040

gtttcagaag gcacaacaat actgttgaac tgcactggcc aggttaaagg aagaaaacca 2100

gctgccctgg gtgaagccca accaacaaag agtttggaag aaaataaatc tttaaaggaa 2160

cagaaaaaac tgaatgactt gtgtttccta aagagactat tacaagagat aaaaacttgt 2220

tggaataaaa ttttgatggg cactaaagaa cacggaagcg gagtgaaaca gactttgaat 2280

tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg gagtccaacc ctggacctat ggccctgcta 2340

ctggccctca gcctgctggt tctctggact tccccagccc caactctgag tggcaccaat 2400

gatgctgaag actgctgcct gtctgtgacc cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg 2460

aacttccact accttctcat caaggatggc tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca 2520

ctgaggggcc gccagctctg tgcaccccca gaccagccct gggtagaacg catcatccag 2580

agactgcaga ggacctcagc caagatgaag cgccgcagca gttaa 2625

<210> 44

<211> 874

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VH15VL)

<400> 44

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

210 215 220

Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

245 250 255

Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys

260 265 270

Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

275 280 285

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

290 295 300

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

325 330 335

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg

340 345 350

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

355 360 365

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

370 375 380

Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

385 390 395 400

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

405 410 415

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

420 425 430

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

435 440 445

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

450 455 460

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

465 470 475 480

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

485 490 495

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

500 505 510

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

515 520 525

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

530 535 540

Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu

545 550 555 560

Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe

565 570 575

His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val

580 585 590

Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly

595 600 605

Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp

610 615 620

Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe

625 630 635 640

Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe

645 650 655

Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly

660 665 670

Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu

675 680 685

Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly

690 695 700

Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu

705 710 715 720

Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu

725 730 735

Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly

740 745 750

Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

755 760 765

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser

770 775 780

Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn

785 790 795 800

Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly

805 810 815

Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg

820 825 830

Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala

835 840 845

Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg

850 855 860

Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser

865 870

<210> 45

<211> 2655

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VH25VL)

<400> 45

atggactgga cctggaggat cctgttcctg gtggctgctg ccaccggagc ccactccgaa 60

gtgcagctgg tgcagtccgg agctgaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaggtcagc 120

tgcaaagcca gcggctatac cttcaccgac tacaacatgg actgggtgaa gcagagcccc 180

ggccaaggcc tcgagtggat gggatacatc taccccaaca acggcggcac cggctacaac 240

cagaagttca agagcaaggt gaccatcacc gtggacacat ccacaagcac cgcctatatg 300

gagctccaca gcctgaggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccac ctacggccac 360

tactacggct atatgttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctcctcc 420

agcgccgatg atgccaagaa ggatgccgcc aaaaaggacg acgctaagaa ggatgacgcc 480

aagaaggacg gcgatatcca gctgacacag agccctagct ccctgagcgc tagccctggc 540

gacagagtga ccatcacctg cagcgccagc tccagcgtga gctacatgca ctggttccag 600

cagaaacccg gcaaggcccc caagctgtgg atctacagca ccagcaatct ggctagcggc 660

gtgcctgcca ggtttagcgg atccggcagc ggcacctcct actccctgac aatctccaga 720

ctgcagcccg aggacatcgc cacctactac tgccaacaga ggtcctccta cccctacacc 780

ttcggcggcg gcaccaaagt ggagatcaag gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca 840

gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg 1080

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1140

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct 1200

gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1260

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1320

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1380

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1440

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1500

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1560

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1620

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcga attcggaagc 1680

ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac 1740

cctggaccat gcatgttcca tgtttctttt aggtatatct ttggacttcc tcccctgatc 1800

cttgttctgt tgccagtagc atcatctgat tgtgatattg aaggtaaaga tggcaaacaa 1860

tatgagagtg ttctaatggt cagcatcgat caattattgg acagcatgaa agaaattggt 1920

agcaattgcc tgaataatga atttaacttt tttaaaagac atatctgtga tgctaataag 1980

gaaggtatgt ttttattccg tgctgctcgc aagttgaggc aatttcttaa aatgaatagc 2040

actggtgatt ttgatctcca cttattaaaa gtttcagaag gcacaacaat actgttgaac 2100

tgcactggcc aggttaaagg aagaaaacca gctgccctgg gtgaagccca accaacaaag 2160

agtttggaag aaaataaatc tttaaaggaa cagaaaaaac tgaatgactt gtgtttccta 2220

aagagactat tacaagagat aaaaacttgt tggaataaaa ttttgatggg cactaaagaa 2280

cacggaagcg gagtgaaaca gactttgaat tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg 2340

gagtccaacc ctggacctat ggccctgcta ctggccctca gcctgctggt tctctggact 2400

tccccagccc caactctgag tggcaccaat gatgctgaag actgctgcct gtctgtgacc 2460

cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg aacttccact accttctcat caaggatggc 2520

tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca ctgaggggcc gccagctctg tgcaccccca 2580

gaccagccct gggtagaacg catcatccag agactgcaga ggacctcagc caagatgaag 2640

cgccgcagca gttaa 2655

<210> 46

<211> 884

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VH25VL)

<400> 46

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ala Asp Asp

130 135 140

Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala

145 150 155 160

Lys Lys Asp Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

165 170 175

Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser

180 185 190

Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

195 200 205

Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

210 215 220

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg

225 230 235 240

Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser

245 250 255

Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala

260 265 270

Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

305 310 315 320

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

325 330 335

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

340 345 350

Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr

355 360 365

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

370 375 380

Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser

385 390 395 400

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

405 410 415

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

420 425 430

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

435 440 445

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

450 455 460

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

465 470 475 480

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

485 490 495

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

500 505 510

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

515 520 525

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

530 535 540

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Ser

545 550 555 560

Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

565 570 575

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr

580 585 590

Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser

595 600 605

Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val

610 615 620

Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly

625 630 635 640

Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys

645 650 655

Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu

660 665 670

Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu

675 680 685

Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln

690 695 700

Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys

705 710 715 720

Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp

725 730 735

Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn

740 745 750

Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr

755 760 765

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

770 775 780

Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr

785 790 795 800

Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys

805 810 815

Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe

820 825 830

His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe

835 840 845

Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp

850 855 860

Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys

865 870 875 880

Arg Arg Ser Ser

<210> 47

<211> 3825

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VL15VH)_HSV tk

<400> 47

atggattgga cctggaggat tctgttcctg gtggctgctg ccacaggcgc ccattccgac 60

atccagctga cccagtcccc tagcagcctg tccgctagcc ccggagacag agtgaccatc 120

acctgttccg ccagctccag cgtgagctac atgcactggt tccagcagaa gcccggcaag 180

gcccccaagc tgtggatcta cagcaccagc aacctggctt ccggcgtgcc tgccagattt 240

tccggctccg gcagcggcac aagctactcc ctgaccatca gcagactgca gcccgaagac 300

atcgccacct actactgtca gcagaggagc agctacccct acaccttcgg cggcggcacc 360

aaggtggaga tcaagggcgg cggcggaagc ggaggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc 420

gaagtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtcaaggtg 480

agctgcaagg ccagcggcta tacattcacc gactataaca tggactgggt gaagcagagc 540

cccggccagg gactggagtg gatgggctac atctacccca ataacggcgg caccggctac 600

aaccagaagt tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 660

atggaactgc acagcctcag aagcgaagac accgctgtgt actactgcgc cacctacggc 720

cactactacg gctacatgtt cgcctactgg ggacagggca ccctggtgac cgtcagcagc 780

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020

tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 1080

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1140

gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1200

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1260

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1320

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1380

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1440

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1500

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1560

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1620

caggccctgc cccctcgcga attcggaagc ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt 1680

ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac cctggaccat gcatgttcca tgtgagcttc 1740

aggtacatct tcggactgcc tcctctcatc ctggtcctcc tccccgtggc cagctccgac 1800

tgtgacatcg aaggaaagga tggcaagcag tacgaaagcg tgctgatggt gagcatcgat 1860

cagctcctgg attccatgaa ggaaatcggc tccaactgcc tcaacaatga gttcaacttt 1920

tttaagaggc atatctgcga cgccaacaag gagggcatgt ttctgttcag ggccgccagg 1980

aagctgagac agttcctcaa gatgaatagc accggcgact tcgacctcca tctgctgaag 2040

gtgtccgagg gaaccaccat cctgctgaac tgcaccggcc aagtgaaggg aagaaaacct 2100

gctgccctgg gcgaggctca gcctaccaag agcctcgagg agaacaaaag cctgaaggag 2160

cagaagaagc tgaacgacct gtgcttcctc aagaggctcc tgcaggagat taagacctgt 2220

tggaacaaga tcctgatggg cacaaaggag cacggatccg gcgtgaagca gaccctgaac 2280

tttgacctgc tcaaactggc cggcgacgtc gagtccaatc ctggacctat ggctctgctg 2340

ctcgccctga gcctgctcgt cctctggacc tcccctgctc ctaccctgag cggcaccaat 2400

gacgctgaag actgctgcct gtccgtgacc cagaagccta tccccggata tatcgtgagg 2460

aattttcatt acctcctgat caaggacggc tgtagagtgc ccgccgtcgt gttcacaaca 2520

ctcagaggca ggcagctgtg tgctcccccc gaccagcctt gggtggagag aatcattcag 2580

agactgcaaa ggacctccgc taagatgaag aggaggtcca gcggcagcgg agtgaagcag 2640

acactgaatt tcgacctgct caagctggcc ggcgatgtgg agagcaaccc tggacctatg 2700

gcttcctacc ccggacatca gcacgcttcc gccttcgacc aggccgctag aagcagagga 2760

cactccaata gaaggacagc cctgaggcct aggagacagc aggaggccac cgaggtgagg 2820

cccgagcaga aaatgcccac cctgctgaga gtgtatattg atggacccca cggcatggga 2880

aaaaccacca caacccagct gctggtggct ctgggaagca gggatgatat tgtgtacgtc 2940

cccgaaccta tgacatattg gagggtcctc ggcgcctccg agaccatcgc caacatttac 3000

accacccagc acaggctgga tcagggagag atctccgccg gcgatgctgc cgtggtgatg 3060

accagcgccc agatcactat gggtatgcct tatgccgtga ccgacgctgt gctggctcct 3120

cacattggcg gcgaagccgg atcctcccat gctccccctc ctgccctcac actgatcttt 3180

gacagacatc ctatcgccgc tctgctgtgc taccccgccg ctaggtacct gatgggcagc 3240

atgacccctc aggccgtgct ggcttttgtg gccctcattc cccccacact gcctggcaca 3300

aatatcgtgc tcggcgccct gcctgaggac aggcacatcg ataggctggc taagagacag 3360

agacccggag agaggctgga tctcgctatg ctggccgcca tcaggagggt gtacggcctg 3420

ctggccaaca ccgtgagata tctccagtgt ggcggatcct ggagggaaga ctggggccaa 3480

ctgagcggca cagctgtgcc tcctcaaggc gctgagcccc agagcaacgc tggacccaga 3540

cctcacatcg gcgataccct gttcaccctg tttagagccc ctgagctcct ggcccctaac 3600

ggcgacctgt acaatgtgtt cgcttgggcc ctggatgtgc tcgccaagag actcaggagc 3660

atgcacgtct tcattctgga ctacgaccag tcccccgctg gctgcagaga tgccctgctc 3720

cagctgacct ccggcatggt gcagacccac gtgaccaccc ctggaagcat ccccacaatc 3780

tgcgacctgg ccaggacctt tgccagagaa atgggagaag ccaac 3825

<210> 48

<211> 1275

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-GM2 CAR (VL15VH)_HSV tk

<400> 48

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu

85 90 95

Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr

100 105 110

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

130 135 140

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val

145 150 155 160

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp

165 170 175

Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr

180 185 190

Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val

195 200 205

Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His

210 215 220

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly

225 230 235 240

His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys

260 265 270

Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

275 280 285

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

290 295 300

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

325 330 335

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg

340 345 350

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

355 360 365

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

370 375 380

Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

385 390 395 400

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

405 410 415

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

420 425 430

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

435 440 445

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

450 455 460

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

465 470 475 480

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

485 490 495

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

500 505 510

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

515 520 525

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

530 535 540

Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu

545 550 555 560

Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe

565 570 575

His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val

580 585 590

Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly

595 600 605

Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp

610 615 620

Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe

625 630 635 640

Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe

645 650 655

Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly

660 665 670

Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu

675 680 685

Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly

690 695 700

Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu

705 710 715 720

Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu

725 730 735

Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly

740 745 750

Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

755 760 765

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser

770 775 780

Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn

785 790 795 800

Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly

805 810 815

Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg

820 825 830

Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala

835 840 845

Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg

850 855 860

Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ser Gly Val Lys Gln

865 870 875 880

Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

885 890 895

Pro Gly Pro Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe

900 905 910

Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu

915 920 925

Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys

930 935 940

Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly

945 950 955 960

Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp

965 970 975

Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala

980 985 990

Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln

995 1000 1005

Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala

1010 1015 1020

Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu

1025 1030 1035

Ala Pro His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro

1040 1045 1050

Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu

1055 1060 1065

Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro

1070 1075 1080

Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro

1085 1090 1095

Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile

1100 1105 1110

Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu

1115 1120 1125

Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn

1130 1135 1140

Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg Glu Asp Trp

1145 1150 1155

Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala Glu Pro

1160 1165 1170

Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu Phe

1175 1180 1185

Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu

1190 1195 1200

Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu

1205 1210 1215

Arg Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala

1220 1225 1230

Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln

1235 1240 1245

Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu

1250 1255 1260

Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn

1265 1270 1275

<210> 49

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VH анти-GM2 антитела VL25VH

<400> 49

gaagtccagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtcaaggtg 60

agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggattgggt gaagcagagc 120

cccggacagg gcctggagtg gatgggctac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180

aaccagaaat tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcacatc caccgcctac 240

atggaactgc acagcctgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc tacctacggc 300

cactactacg gctacatgtt cgcttactgg ggacagggca ccctggtgac cgtgagctcc 360

<210> 50

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VL анти-GM2 антитела VL25VH

<400> 50

gatatccaac tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt cccccggaga cagggtgaca 60

attacctgca gcgccagctc ctccgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120

aaggccccca agctgtggat ctactccaca agcaacctgg cctccggcgt gcctgccaga 180

tttagcggaa gcggcagcgg cacatcctac agcctgacca tctccaggct gcagcccgag 240

gacatcgcca catactactg ccagcagagg tccagctacc cttacacatt cggaggcggc 300

accaaggtgg agatcaag 318

<210> 51

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VH анти-GM2 антитела VH15VL

<400> 51

gaggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt caagcagagc 120

cctggccagg gcctggagtg gatgggctat atctacccca acaacggcgg caccggctac 180

aaccagaagt tcaagagcaa ggtcaccatc accgtggaca cctccacctc cacagcctac 240

atggagctgc acagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actactgcgc tacctacggc 300

cattactacg gatacatgtt cgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtgtcctcc 360

<210> 52

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VL анти-GM2 антитела VH15VL

<400> 52

gacatccagc tgacacaatc ccccagcagc ctgagcgcta gccccggcga tagggtgaca 60

attacctgca gcgcctccag ctccgtgtcc tacatgcact ggtttcagca aaagcccggc 120

aaggccccta agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg ccagcggagt gcctgccaga 180

tttagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagact gcagcccgag 240

gatatcgcca cctactactg ccagcagagg agctcctacc cctacacatt cggcggcgga 300

accaaggtgg agatcaag 318

<210> 53

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VH анти-GM2 антитела VH25VL

<400> 53

gaagtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtc 60

agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120

cccggccaag gcctcgagtg gatgggatac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180

aaccagaagt tcaagagcaa ggtgaccatc accgtggaca catccacaag caccgcctat 240

atggagctcc acagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cacctacggc 300

cactactacg gctatatgtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

<210> 54

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область VL анти-GM2 антитела VH25VL

<400> 54

gatatccagc tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcta gccctggcga cagagtgacc 60

atcacctgca gcgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaaacccggc 120

aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaatctgg ctagcggcgt gcctgccagg 180

tttagcggat ccggcagcgg cacctcctac tccctgacaa tctccagact gcagcccgag 240

gacatcgcca cctactactg ccaacagagg tcctcctacc cctacacctt cggcggcggc 300

accaaagtgg agatcaag 318

<210> 55

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер 15 для VH15VL

<400> 55

ggaggaggag gaagcggagg cggcggctcc ggcggaggcg gatcc 45

<210> 56

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер 25 для VH25VL

<400> 56

tccagcgccg atgatgccaa gaaggatgcc gccaaaaagg acgacgctaa gaaggatgac 60

gccaagaagg acggc 75

<210> 57

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид

<400> 57

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 58

<211> 531

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 58

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300

gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360

gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420

aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480

caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca c 531

<210> 59

<211> 177

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 59

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

<210> 60

<211> 294

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 60

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294

<210> 61

<211> 98

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 61

Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser

20 25 30

Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr

35 40 45

Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr

50 55 60

Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg

85 90 95

Ser Ser

<210> 62

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F2A

<400> 62

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 63

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 области VH анти-GM2 антитела

<400> 63

Asp Tyr Asn Met Asp

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 области VH анти-GM2 антитела

<400> 64

Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 65

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 области VH анти-GM2 антитела

<400> 65

Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 области VL анти-GM2 антитела

<400> 66

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 области VL анти-GM2 антитела

<400> 67

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 области VL анти-GM2 антитела

<400> 68

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

57

<---

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии и молекулярной биологии, в частности к клетке, которая экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR), IL-7 и CCL19, а также к вектору экспрессии, способу получения клетки и фармацевтической композиции для лечения или профилактики опухолей. Клетка содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор, полинуклеотид, включающую последовательность оснований, кодирующую IL-7, и полипептид, включающий последовательность оснований, кодирующую CCL19. При этом химерный антигенный рецептор содержит мишеневую антигенсвязывающую область, трансмембранную область и область передачи сигнала, которая индуцирует активацию Т–клеток. Мишеневая антигенсвязывающая область CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела против ганглиозида GM2. Изобретение позволяет повысить эффективность терапии солидных опухолей CAR Т-клетками. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 20 ил., 7 пр.

1. Клетка, которая экспрессирует химерный антигенный рецептор, IL-7 и CCL19 и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор, полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующую IL-7, и полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующую CCL19,

где химерный антигенный рецептор содержит:

мишеневую антигенсвязывающую область, трансмембранную область и область передачи сигнала, которая индуцирует активацию Т-клеток,

где мишеневая антигенсвязывающая область содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела против ганглиозида GM2,

где антитело против ганглиозида GM2 представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих (а)-(с):

(a) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2,

где CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи определены согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact;

(b) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой одна или 2-10 аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой одна или 2-10 аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact; и

(c) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact.

2. Клетка по п.1,

где CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:65 соответственно; и

CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:66, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:67 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:68 соответственно.

3. Клетка по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

4. Клетка по любому из пп.1-3, где антитело против ганглиозида GM2 представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).

5. Клетка по п.4, где scFv представляет собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из следующих (а)-(с):

(а) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16;

(b) полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16, и который способен связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16, локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact; и

(c) полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или 2-20 аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16, и который способен связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16, локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact.

6. Клетка по любому из пп.1-4, где клетка является иммунной клеткой.

7. Полинуклеотид, который кодирует химерный антигенный рецептор, IL-17 и CCL19, где полинуклеотид содержит последовательность оснований, которая кодирует химерный антигенный рецептор, последовательность оснований, которая кодирует IL7, и последовательность оснований, которая кодирует CCL19,

химерный антигенный рецептор, содержащий:

мишеневую антигенсвязывающую область, трансмембранную область и область передачи сигнала, которая индуцирует активацию Т–клеток,

где мишеневая антигенсвязывающая область содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела против ганглиозида GM2,

где антитело против ганглиозида GM2 представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих (а)-(с):

(a) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2,

где CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи определены согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact;

(b) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой одна или 2-10 аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой одна или 2-10 аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact; и

(c) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и которое обладает способностью связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact.

8. Полинуклеотид по п.7,

где CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:65 соответственно; и

CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:66, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:67 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:68 соответственно.

9. Полинуклеотид по п.8, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

10. Полинуклеотид по любому из пп.7-9, где антитело против ганглиозида GM2 представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).

11. Полинуклеотид по п.10, где scFv представляет собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из следующих (а)-(с):

(а) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16;

(b) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 12, 14 и 16, и который способен связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact; и

(c) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна или 2-20 аминокислот мутированы в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, и который способен связываться с ганглиозидом GM2,

где мутация в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 16, локализована в области, отличной от CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, определенных согласно нумерации Kabat, Chothia, AbM или cotact.

12. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп.7-11.

13. Способ получения клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, включающий введение полинуклеотида по любому из пп.7-11 или вектора по п.12 в клетку.

14. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики опухоли, где композиция содержит клетку по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.