Область техники

Настоящее изобретение относится к области клеточной иммунотерапии и, точнее, к новым сконструированным иммунным клеткам, экспрессирующим два CAR, направленных против двух разных мишеней и применимым для лечения рака.

Предшествующий уровень техники

Примерно каждые три минуты у одного человека в Соединенных Штатах Америки диагностируют рак крови. По ранее сделанным прогнозам в 2020 году новые случаи лейкоза, лимфомы и миеломы должны были составить 178520 человек. Согласно ожиданиям в США в 2020 г. новые случаи лейкоза, лимфомы и миеломы должны были составить 9,9% от ожидаемых 1806590 новых диагностированных случаев рака (Cancer Facts & Figures, 2020. American Cancer Society).

Разработка терапии гематологических злокачественных новообразований Т-клетками с химерными антигенными рецепторами (CAR - chimeric antigen receptor) представляет собой одно из самых значительных терапевтических достижений за последнее десятилетие (Holstein с соавт., Clin. Pharmacol. Ther., 2020, 107(1): 112-122). Действительно, как быстро развивающаяся область онкологии, адоптивный перенос CAR-T-клеток показал поразительную эффективность в лечении гематологических злокачественных новообразований, о чем сообщалось в ряде клинических испытаний.

Иммунные клетки, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы (CAR), представляют собой клетки, которые генетически сконструированы для экспрессии CAR и обычно предназначены для распознавания специфических опухолевых антигенов и уничтожения раковых клеток, экспрессирующих эти опухолевые антигены. Не исключено, что иммунные клетки с CAR могут активировать иммунную систему для элиминации опухолей. Обычно это Т-клетки, экспрессирующие рецепторы CAR («CAR-T-клетки»), или натуральные клетки-киллеры (NK), экспрессирующие CAR («CAR-NK-клетки»), или макрофаги, экспрессирующие CAR.

CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из нацеливающего фрагмента, который связан с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. Как правило, связывающая часть CAR состоит из антигенсвязывающего домена, полученного из моноклонального антитела, состоящего из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), который содержит легкие и тяжелые вариабельные фрагменты моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. Также успешно применяют связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения CAR происходят из цитоплазматической области CD3дзета или гамма-цепей рецептора Fc. Было показано, что CAR первого поколения успешно перенаправляют цитотоксичность Т-клеток, однако они не могут обеспечить пролонгированное распространение и противоопухолевую активность in vivo. Сигнальные домены из ко-стимулирующих молекул, включая CD28, ОХ-40 (CD134), ICOS и 4-1ВВ (CD137), были добавлены отдельно (второе поколение) или в комбинации (третье поколение) для повышения выживаемости и увеличения пролиферации CAR-модифицированных Т-клеток. CAR успешно позволяют Т-клеткам перенаправляться против антигенов, экспрессируемых на поверхности опухолевых клеток различных злокачественных новообразований, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti с соавт., Blood, 2010, 116(7): 1035-1044).

Адоптивная иммунотерапия, которая включает перенос аутологичных или аллогенных антиген-специфических Т-клеток, полученных ex vivo, является многообещающей стратегией лечения вирусных инфекций и рака, что подтверждается увеличением числа CAR-T-клеток, одобренных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA - Food and Drug Administration) (например, aHTH-CD19 CAR-T тизагенлеклеуцел (Kymriah™) фирмы Novartis для лечения острого лимфобластного лейкоза из предшественников В-клеток, анти-С019 CAR-T аксикабтаген цилолеуцел (Yescarta™) фирмы Kite Pharma для лечения некоторых типов В-крупноклеточной лимфомы у взрослых пациентов).

Несмотря на прогресс в исследованиях и разработках CAR-T-клеточной терапии, все еще остается потребность в улучшенных CAR-T-клетках, которые могли бы воздействовать на более широкий спектр раковых заболеваний, а также на рецидивирующие виды рака и/или виды рака, для которых распространение связанных с раком антигенов весьма вариабельно и со временем, во время или после лечения эволюционирует.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении разработаны новые CAR-T-клетки, нацеленные на антигены CD20 и CD22, которые могут быть активированы опухолевыми клетками, экспрессирующими CD20 и CD22 на различных уровнях, и являются улучшенными по сравнению с CAR-T-клетками предшествующего уровня техники.

Первый объект относится к генетически сконструированным иммунным клеткам, экспрессирующим на своей клеточной поверхности химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный к CD22 (CAR22), и химерный антигенный рецептор, специфичный к CD20 (CAR20):

а) где указанный CAR22 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета; и

б) где указанный CAR20 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 15 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 16, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

В одном из объектов указанные генетически сконструированные иммунные клетки представляют собой TCR-отрицательные Т-клетки.

Другой объект настоящего изобретения касается фармацевтической композиции,

содержащей указанные сконструированные иммунные клетки или популяцию клеток,

содержащую указанные сконструированные иммунные клетки и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Еще один объект относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему: а) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, содержащую: i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета; а также

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, содержащую:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 15 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 16, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

Другие объекты относятся к вектору, содержащему указанные полинуклеотиды, а также к клетке-хозяину, содержащей указанные полинуклеотиды или вектор.

Еще один объект относится к способу получения указанных сконструированных иммунных клеток.

Другие объекты относятся к указанным сконструированным иммунным клеткам или популяциям клеток для применения в качестве лекарственного средства.

Другой объект относится к указанным сконструированным иммунным клеткам для применения при лечении рака или воспалительного заболевания, в частности рака или воспалительного заболевания, связанного с экспрессией CD20 и/или CD22.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Обнаружение CD20×CD22 или CD22×CD20 CAR. Анализ методом жидкостной цитометрии, показывающий обнаружение CD20 CAR или CD22 CAR в нетрансдуцированных (НТ) Т-клетках или клетках, трансдуцированных конструкциями CD22, CD22×CD20 или CD20×CD22 CAR, с использованием протокола, описанного в примере.

Фигура 2. Анализ методом жидкостной цитометрии различных клеток Раджи, полученных после обработки CD20 и CD22 TALEN® и сортировки клеток.

Фигура 3. Процент лизиса CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клеток от 2 разных доноров относительно клеток Раджи, экспрессирующих или не экспрессирующих антигены CD20 и/или CD22.

Фигура 4. С течением времени процент лизиса CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клеток относительно клеток Раджи, экспрессирующих CD20 и CD22 (А), экспрессирующих только CD22 (Б) или экспрессирующих только CD20 (В).

Фигура 5. Дозозависимый контроль in vivo опухолевой массы при лечении указанной дозой CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клеток, измеренный с помощью биолюминесценции.

Фигура 6. Кривая выживаемости животных, получавших указанные дозы CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клеток в диссеминированной модели В-клеточной лимфомы.

Фигура 7. Кривая выживаемости животных, получавших указанные дозы CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клеток, в подкожной модели В-клеточной лимфомы.

Фигура 8. Высвобождение гамма-интерферона CD20×CD22, CD22×CD20, CD20 и CD22 CAR-T-клетками на клетках Дауди.

Соответствующие обозначения, используемые в описании и примерах: Анти-CD20 CAR=CAR20=CD20CAR Анти-CD22 CAR=CAR22=CD22CAR

Анти-CD20 CAR/aHTH-CD22 CAR=CAR20x22 или CAR22×20=CD20×CD22CAR или CD22×CD20CAR.

Подробное описание изобретения

Если в настоящем описании не указано иное значение, все используемые технические и научные термины имеют те же значения, которые известны специалистам в области генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.

Все способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем изобретении, могут быть использованы при практическом применении или тестировании настоящего изобретения с соответствующими способами и материалами, описанными в настоящем изобретении. Сущность всех публикаций, патентных заявок, патентов и других источников, упомянутых в настоящем изобретении, в полной мере включена в настоящее описание в качестве ссылок. В случае конфликта настоящее описание, включающее определения, имеет преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры приводятся только в качестве иллюстраций и не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения, если специально не указано иное.

В практика настоящего изобретения используют обычные методы клеточной биологии, клеточной культуры, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, если не указано иное, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области. Такие методы в полной мере описаны в литературе. См., например, кн.: «Сштепг Protocols in Molecular Biology», Frederick M. AUSUBEL, 2000, изд-во Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Sambrook с соавт.кн.: «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3-е изд., 2001, изд-во Cold Spring Harbor, Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press); кн.: Oligonucleotide Synthesis», под ред. M. J. Gait, 1984; US 4683195; кн.: «Nucleic Acid Hybridization)) под ред. В. D. Harries и S. J. Higgins, 1984; кн.: «Transcription And Translation)) под ред. В. D. Hames и S. J. Higgins, 1984; кн.: «Culture Of Animal Cells», R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987; кн.: «Lnmobilized Cells And Enzymes», IRL Press, 1986; B. Perbal, «A Practical Guide To Molecular Cloning)), 1984; серии «Methods In ENZYMOLOGY», главные редакторы J. Abelson и M. Simon, Academic Press, Inc., Нью-Йорк, особенно тома 154 и 155 (под ред. Wu с соавт.) и том 185 «Gene Expression Technology)) под ред. D. Goeddel; кн.: «Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)), ред. J. H. Miller и M. P. Calos, 1987, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory; кн.: «Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology» под ред. Mayer и Walker, изд-во Academic Press, Лондон, 1987; кн.: «Handbook Of Experimental Immunology)), тома I-IV, под ред. D. M. Weir и С.С.Blackwell, 1986; кн.: «Manipulatingthe Mouse Embryo», изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1986.

Определения

Используемый в настоящем изобретении термин «антиген, связанный с болезненным состоянием» относится к антигену, присутствующему или сверхэкспрессированному при данном заболевании. В случае, когда антиген представляет собой CD20 или CD22, понятия «СD20-ассоциированное заболевание» или «CD22-ассоциированное заболевание» относятся к заболеванию, подобному раку или воспалительному заболеванию, при котором антиген CD20 или CD22 обычно присутствует в опухолевых клетках или клетках, провоцирующих воспалительную реакцию (в частности, в В-клетках). Антиген, связанный с болезненным состоянием, которое представляет собой рак, т.е. «антиген, ассоциированный с раком», может быть опухолевым антигеном, как описано в настоящем изобретении.

Используемый в настоящем изобретении термин «CD20» относится к антигенной детерминанте, которая, как известно, обнаруживается на В-клетках. CD20 человека также называют трансмембранными 4-доменами, подсемейство А, представитель 1 (MS4A1 - membrane-spanning 4-domains). Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот человека и мыши можно найти в общедоступных базах данных, таких как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, можно ознакомиться с аминокислотной последовательностью CD20 человека под регистрационными номерами NP 690605.1 и NP 068769.2, а последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей варианты транскрипта 1 и 3 CD20 человека, можно найти под, регистрационными номерами NM 152866.2 и NM 021950.3 соответственно. В одном из объектов антигеневязывающая часть CAR распознает и связывает антиген во внеклеточном домене белка CD20. В другом объекте белок CD20 экспрессируется на раковой клетке. Используемый в настоящем изобретении термин «CD20» включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и варианты сплайсинга полноразмерной последовательности CD20 дикого типа.

Используемый в настоящем изобретении термин «CD22» относится к антигенной детерминанте, которая, как известно, обнаруживается на клетках-предшественниках лейкоза. Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот человека и мыши можно найти в общедоступных базах данных, таких как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотные последовательности изоформ 1-5 CD22 человека можно найти под регистрационными номерами NP 001762.2, NP 001172028.1, NP 001172029.1, NP 001172030.1 и NP 001265346.1, соответственно, а последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты 1-5 CD22 человека можно найти под регистрационными номерами NM 001771.3, NM 001185099.1, NM 001185100.1, NM 001185101.1 и NM 001278417.1, соответственно. В одном из объектов антигенсвязывающая часть CAR распознает и связывает антиген во внеклеточном домене белка CD22. В из объектов белок CD22 экспрессируется на раковой клетке. Используемый в настоящем изобретении термин «CD22» включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и варианты сплайсинга полноразмерного CD22 дикого типа.

Термин «опухолевой антиген» охватывает «опухолеспецифический антиген» и «опухолеассоциированный антиген». Опухолеспецифические антигены (TS А - Tumor-Specific Antigens) обычно присутствуют только на опухолевых клетках, а не на каких-либо других клетках, в то время как опухолеассоциированные антигены (ТАА Tumor-Associated Antigens) присутствуют не только на некоторых опухолевых клетках, но также на некоторых нормальных клетках. Опухолевой антиген по настоящему изобретению также относится к мутантным формам белка, которые появляются только в опухолях подобных форм, в то время как немутированная форма наблюдается в неопухолевых тканях.

Термин «внеклеточный антигенсвязывающий домен», используемый в настоящем изобретении, относится к олиго- или полипептиду, способному связывать специфический антиген. Предпочтительно домен может взаимодействовать с молекулой на клеточной поверхности. Например, внеклеточный антигенсвязывающий домен может быть выбран для распознавания антигена, который действует как маркер клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с конкретным болезненным состоянием. В конкретном случае указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), содержащий легкий (Vl) и тяжелый (Vh) вариабельный фрагмент моноклонального антитела, специфичного к целевому антигену, которые соединены гибким линкером. Антигенсвязывающий домен CAR, экспрессируемый на клеточной поверхности сконструированных иммунных клеток, описанных в настоящем изобретении, может быть любым доменом, который связывается с антигеном-мишенью и который происходит, например, из моноклонального антитела, рекомбинантного антитела, антитела человека, гуманизированного антитела и его функционального фрагмента.

Под «химерным антигенным рецептором» или «CAR - chimeric antigen receptor» обычно подразумевают синтетический рецептор, содержащий нацеливающийся фрагмент, который связывается с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. Согласно настоящему изобретению термин «химерный антигенный рецептор» охватывает как одноцепочечные CAR, так и многоцепочечные CAR. Как правило, связывающая часть CAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), включающего легкий и вариабельный фрагменты моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. Связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда также успешно используются. Сигнальные домены для CAR первого поколения происходят из цитоплазматической области CD8дзета или гамма-цепей рецептора Fc. Было показано, что CAR первого поколения успешно перенаправляют цитотоксичность Т-клеток. Однако они не могут обеспечить пролонгированную экспансию и противоопухолевую активность in vivo. Сигнальные домены из костимулирующих молекул, включая CD28, ОХ-40 (CD 134) и 4-1ВВ (CD 137), были добавлены отдельно (второе поколение) или в комбинации (третье поколение) для повышения выживаемости и увеличения пролиферации CAR-модифицированных Т-клеток. CAR не обязательно представляют собой только одноцепочечные полипептиды, также возможны многоцепочечные CAR. В соответствии с многоцепочечной архитектурой CAR, например, описанной в WO 2014039523, сигнальные домены и ко стимулирующие домены расположены на разных полипептидных цепях. Такие многоцепочечные CAR могут быть получены из FcsRI путем замены высокоаффинного IgE-связывающего домена альфа-цепи FcsRI на внеклеточный лиганд-связывающий домен, такой как scFv, тогда как N- и/или С-концевые хвосты FcsRI бета и/или гамма-цепи сливаются с передающими сигнал доменами и костимулирующими доменами, соответственно. Внеклеточный лиганд-связывающий домен играет роль в перенаправлении специфичности Т-клеток к клеткам-мишеням, в то время как домены, передающие сигнал, активируют ответ иммунных клеток.

Под «иммунной клеткой» подразумевают клетку, происходящую от кроветворной клетки, функционально участвующую в инициации и/или осуществлении врожденного и/или адоптивного иммунного ответа, обычно CD45, CD3 или С04-положительные клетки. Описанная в настоящем изобретении иммунная клетка может быть дендритной клеткой, дендритной клеткой-киллером, тучной клеткой, макрофагом, природной клеткой-киллером (NK-клеткой), цитокин-индуцированной клеткой-киллером (CIK-клеткой), В-клеткой или Т-клеткой, выбранной из группы, состоящей из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов, гамма-дельта Т-клеток, Т-клеток-природных киллеров (NKT-клеток).

Под «аллогенными» подразумевают клетки, происходящие от донора или продуцируемые и/или дифференцируемые из стволовых клеток с учетом введения пациентам, имеющим другой гаплотип.Такие иммунные клетки обычно конструируют таким образом, чтобы они были менее аллоре активны ми и/или становились более стойкими по отношению к своему пациенту-хозяину. Более конкретно, способ конструирования аллогенных иммунных клеток может включать стадию снижения или инактивации экспрессии TCR в Т-клетках или в стволовых клетках, которые должны быть трансформированы в Т-клетки. Это может быть достигнуто с помощью различных реагентов, специфичных по последовательности, такими методами, как сайленсинг генов или редактирование генов (нуклеаза, редактирование оснований, кшРНК, РНКи…).

Понятие «происходящие от донора» означает, что Т-клетки не обязательно поступают непосредственно от донора в виде новых клеток, но могут происходить из стволовых клеток или клеточных линий, полученных от исходных доноров, которые не являются пациентами, подвергавшимися лечению (т.е. имеют разные гаплотипы).

Под «первичной клеткой» или «первичными клетками» подразумевают клетки, взятые непосредственно из живой ткани (например, материала биопсии) и предназначенные для роста in vitro в течение ограниченного периода времени, что означает, что они могут подвергаться ограниченному числу удвоений популяции. Первичные клетки противопоставляются непрерывным канцерогенным или искусственно иммортализованным клеточным линиям. Неограничивающими примерами таких клеточных линий являются клетки СНО-K1; клетки НЕК293; клетки Сасо2; клетки U2-OS; клетки NIH 3Т3; клетки НСО; клетки SP2; клетки CHO-S; клетки DG44; клетки К-562, клетки U-937; клетки MRC5; клетки IMR90; клетки Jurkat; клетки HepG2; клетки HeLa; клетки НТ-1080; клетки НСТ-116; клетки Hu-h7; клетки Huvec; клетки MOLT-4.

Первичные иммунные клетки могут быть получены из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки, и от опухолей, таких как опухоли, инфильтруемые лимфоцитами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанные иммунные клетки могут быть производными от здорового донора, от пациента, у которого диагностирован рак, или от пациента, у которого диагностирована инфекция. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная клетка является частью смешанной популяции иммунных клеток, обладающих различными фенотипическими характеристиками, например, состоящими из положительных по CD4, CD8 и CD56 клеток. Первичные иммунные клетки получают от доноров или пациентов с помощью различных методов, известных в данной области, например, с помощью методов лейкафереза, описанного в обзоре Schwartz J. с соавт., J ClinApher., 2013, 28(3): 145-284.

Иммунные клетки, полученные из стволовых клеток, также считают первичными иммунными клетками согласно настоящему изобретению, в частности клетки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS induced pluripotent stem cells) [Yamanaka, К. с соавт., Science, 2008, 322(5903): 949-953]. Лентивирусную экспрессию факторов перепрограммирования используют для индукции мультипотентных клеток из клеток периферической крови человека [Staerk J. с соавт., Cell stem cell, 20107, (1): 20-24] [Loh Y.H. с соавт., Cell stem cell, 2010, 7 (1): 15-19].

Иммунные клетки могут быть получены из эмбриональных стволовых клеток человека методами, хорошо известными в данной области, которые не предусматривают разрушение человеческих эмбрионов [Chung с соавт., Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117].

Под понятием «генная инженерия» подразумевают любые методы, направленные на введение, модификацию и/или изъятие генетического материала из клетки. Под «редактированием генов» подразумевают генную инженерию, позволяющую добавлять, удалять или изменять генетический материал в определенных местах (локусах) генома, включая точечные мутации. Редактирование генов обычно включает реагенты, специфичные для последовательности.

Под «идентичностью» подразумевают идентичность последовательностей двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов. Идентичность можно определить путем сравнения положения в каждой последовательности, которая может быть выровнена для сравнения. Если определенное положение в сравниваемой последовательности занято одним и тем же основанием, то молекулы в этом положении идентичны. Степень сходства или идентичности между последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот зависит от количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в положениях, общих для последовательностей нуклеиновых кислот. Для вычисления идентичности между двумя последовательностями можно использовать различные алгоритмы и/или программы выравнивания, включая FASTA или BLAST, которые доступны как часть пакета анализа последовательностей GCG (Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин), и могут использоваться, например, с настройкой по умолчанию. Например, полипептиды по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны конкретным полипептидам, описанным в настоящем изобретении, и предпочтительно обладают практически такими же функциями, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды. Если не указано иное, настоящее изобретение охватывает полипептиды и полинуклеотиды, которые имеют одинаковую функцию и идентичны по меньшей мере на 80%, обычно по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% с описанными в настоящем изобретении последовательностями.

Термины «пациент», «субъект» или «донор» в настоящем изобретении подразумевают всех представителей царства животных, включая приматов, в том числе людей.

Настоящее изобретение основано на неожиданном наблюдении, согласно которому опухолевая клетка, экспрессирующая низкие уровни антигена CD20 и низкие уровни антигена CD22, несмотря на то, что не способна эффективно активировать нацеливание CAR-T-клетки либо на CD20, либо на CD22, может активировать CAR-T-клетки с двумя CAR, экспрессирующими как CAR, нацеленный на CD20, так и CAR, нацеленный на CD22.

В этих условиях, без опоры на теорию, общее количество молекул антигена CD20 и молекул антигена CD22 на участок опухоли представляет собой порог, выше которого активируются CAR-T-клетки с двумя CAR в отличие от CAR-T-клеток с одним CAR.

Это можно представить следующим образом:

X=плотность молекул антигена CD20 на поверхности опухоли, которые распознаются анти-CD20 CAR (CAR20);

Y=плотность молекул антигена CD22 на поверхности опухоли, которые распознаются анти-CD22 CAR (CAR22);

X+Y=Z=плотность молекул антигена CD20 и молекул антигена CD22 на поверхности опухоли;

Т=плотность молекул антигена, связанных с Т-клеткой, которая запускает указанную активацию Т-клетки=порогу, необходимому для активации Т-клетки;

Если Z>Т, то происходит активация Т-клеток.

Таким образом, одно из преимуществ Т-клеток по настоящему изобретению, экспрессирующих как CAR20, так и CAR22 (клетки с двумя рецепторами «CAR20×22-Т-клетка» или «CAR22×20-T-ioieTKa»), заключается в том, что их можно использовать в иммунотерапии для нацеливания на разросшуюся популяцию опухолевых клеток, имеющих различные уровни экспрессии антигенов CD20 и/или CD22. Таким образом, не только опухолевые клетки, имеющие низкий уровень экспрессии антигена CD20 и высокий уровень экспрессии антигена CD22, а также имеющие высокий уровень экспрессии антигена CD20 и низкий уровень экспрессии антигена CD22, будут мишенью (и, таким образом, будут уничтожены) для клеток с двумя рецепторами CAR22×20-T-клетками по настоящему изобретению, но, что удивительно, клетки, имеющие низкие уровни экспрессии антигенов CD20 и CD22, будут мишенью и, таким образом, будут уничтожены.

Другое преимущество CAR-T-клеток с двумя рецепторами по настоящему изобретению заключается в их применимости в иммунотерапии для лечения опухоли, которая развивается путем экспрессии большего или меньшего количества антигенов CD20 и CD22, в том числе во время лечения.

Другое преимущество двойных CAR-T-клеток с двумя рецепторами по настоящему изобретению заключается в их применимости в иммунотерапии для лечения рака, характеризующегося низкой экспрессией антигенов CD20 и CD22.

Еще одно преимущество двойных CAR-T-клеток с двумя рецепторами по настоящему изобретению связано с синергетическим эффектом двух CAR, возможно, за счет благоприятствования и усиления иммунного синапса между Т-клетками и их опухолевыми клетками-мишенями, что, возможно, обеспечивает более высокий уровень выработки эффекторных цитокинов.

Помимо вышеупомянутых преимуществ, CAR-T-клетки с двумя рецепторами по настоящему изобретению также полезны для предотвращения рецидива рака, связанного с CD20 и CD22, и/или ускользания антигена.

То, что было обнаружено и описано в настоящем изобретении, вероятно, можно обобщить таким образом, что CAR-T-клетки с двумя рецепторами, нацеленные на два разных антигена, ассоциированных с опухолью, могут быть полезны в иммунотерапии для нацеливания на расширенную популяцию опухолевых клеток, имеющих разные уровни экспрессии антигенов, ассоциированных с опухолью, таких как подробно описано выше.

Еще один неожиданный эффект одного из объектов, раскрытых в настоящему изобретении, связан с наблюдением, согласно которому иммунная клетка, экспрессирующая CAR20 и CAR22 на своей клеточной поверхности и имеющая интегрированную в геном клетки экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую в направлении от 5' до 3':

(i) промотор,

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20,

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующая саморасщепляющийся пептид;

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR22,

причем один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22;

демонстрирует более значимое уменьшение опухоли in vivo по сравнению с иммунной клеткой, экспрессирующей CAR20 и CAR22 на своей клеточной поверхности и имеющей интегрированную в клеточный геном экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую в направлении от 5' до 3':

(i) промотор,

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR22,

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующая саморасщепляющийся пептид;

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20. Иммунные клетки, экспрессирующие анти-СР20 CAR и анти-СР22 CAR Иммунные клетки по настоящему изобретению наделены двумя синтетическими химерными антигенными рецепторами (CAR), нацеленными на антиген CD20 и антиген CD22, соответственно.

Анти-СР22 CAR (CAR22) и анти-СР20 CAR (CAR20)

Описанные в настоящем изобретении иммунные клетки наделены двумя синтетическими CAR, что придает им более высокую специфичность по отношению к клеткам, таким как клетки опухоли, экспрессирующие антиген CD20 и/или CD22, или к воспалительным клеткам, экспрессирующим антиген СР20 и/или СР22.

Рекомбинантный химерный антигенный рецептор обычно кодируется экзогенным полинуклеотидом, который вводят в клетку с использованием вирусных векторов в соответствии с одной из стадий трансдукции, также приводимой в настоящем описании. Рекомбинантный рецептор, кодируемый экзогенным полинуклеотидом, также может быть введен в клетку в виде плазмиды или продукта ПЦР.

Как правило, полипептиды CAR содержат внеклеточный антигенсвязывающий домен, транс мембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, причем указанный антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, ассоциированным с болезненным состоянием.

Хотя анти-СР20 и анти-СР22 CAR, описанные в настоящем изобретении, не ограничиваются конкретной структурой CAR, нуклеиновая кислота, которую можно использовать для генной инженерии иммунных клеток, обычно кодирует CAR, содержащий: внеклеточный антигенсвязывающий домен, который связывается с антигеном, ассоциированным с болезненным состоянием, шарнир, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен. Обычно внеклеточный антигенсвязывающий домен представляет собой scFv, содержащий тяжелую вариабельную цепь (VH) и легкую вариабельную цепь (VL) антитела, связывающегося со специфическим антигеном (например, с опухолевым антигеном), соединенным через линкер. Транс мембранный домен может представлять собой, например, трансмембранный домен СВ8α или транс мембранный домен 4-1ВВ. Стимулирующим доменом может быть, например, стимулирующий домен 4-1ВВ. Первичный сигнальный домен может представлять собой, например, сигнальный домен CD3ξ.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения во избежание какой-либо рекомбинации в конструкции, содержащей полинуклеотиды, кодирующие два CAR с идентичными доменами последовательности нуклеотидов, используемые для кодирования одних и тех же аминокислотных последовательностей, присутствуют в конструкции дважды (например, один и тот же трансмембранный домен, один и тот же стимулирующий домен) оптимизируют с использованием кодонов и учитывают вырожденность кода, так что нуклеотидные последовательности различаются.

В одном объекте настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), связанные линкером, где указанная цепь VH содержит H-CDR SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и указанная цепь VL содержит L-CDR SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52.

Например, антигенсвязывающий домен, специфичный для CD20, содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), связанные линкером (образующим scFv SEQ ID NO: 17), где указанные цепи VH и VL содержат H-CDR SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 и L-CDR SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52.

Анти-CD20 CAR, описанный в настоящем изобретении, может содержать:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), включающую аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% SEQ ID NO: 15, содержащей H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% SEQ ID NO: 16, содержащей L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

В одном из объектов настоящего изобретения CAR, нацеленный на присутствующий на опухолевых клетках антиген CD20, экспрессируется генетически сконструированными иммунными клетками, описанными в настоящем изобретении, соответствует описанному в табл. 3 и 4.

В одном из объектов настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), связанные линкером, где указанная цепь VH содержит H-CDR SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, и указанная цепь VL содержит L-CDR SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46.

Например, антигенсвязывающий домен, специфичный для CD22, содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), связанные линкером (образующим scFv SEQ ID NO: 13), где указанные цепи VH и VL содержат H-CDR SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, а также L-CDR SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46.

Анти-CD22 CAR по настоящему изобретению может содержать:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), включающую аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% SEQ ID NO: 11, содержащей H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% SEQ ID NO: 16, содержащей L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

В одном из объектов настоящего изобретения CAR, нацеленный на присутствующий на опухолевых клетках антиген CD22, экспрессируется генетически сконструированными иммунными клетками, описанными в настоящем изобретении, соответствует описанному в табл. 5 и 6 и ниже в разделе Примеры.

Иммунные клетки, экспрессирующие CAR20 и CAR22

Описанные в настоящем изобретении сконструированные иммунные клетки снабжены двумя синтетическими химерными антигенными рецепторами (CAR), нацеленными на антиген CD20 и антиген CD22, соответственно, согласно описанию.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные иммунные клетки не экспрессируют никакого другого CAR, нацеленного на другой антиген, отличный от CD20 или CD22. Более конкретно, указанные иммунные клетки не экспрессируют другие CAR, кроме описанных здесь CAR22 и CAR20.

Иммунная клетка может быть, например, дендритной клеткой, дендритной клеткой-киллером, тучной клеткой, макрофагом, NK-клеткой, цитокин-индуцированной клеткой-киллером (CIK cytokine-induced Killer), В-клеткой или Т-клеткой, выбранными из группы, состоящей из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов, гамма-дельта Т-клеток, NKT-клеток и инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILL tumor infiltrating lymphocytes).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммунная клетка, сконструированная для экспрессии двух CAR, выбрана из группы, состоящей из Т-клетки, NK-клетки и макрофага.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммунная клетка, экспрессирующая два CAR, представляет собой Т-клетку, например, цитотоксическую Т-клетку.

В общем случае указанная иммунная клетка состоит из популяции клеток, такой как популяция иммунных клеток, в частности, популяция Т-клеток, популяция NK-клеток и/или популяция макрофагов.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку для применения в иммунотерапии в качестве готового препарата.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку, которая является TCR-отрицательной (не экспрессирует TCR-альфа на своей клеточной поверхности).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная сконструированная Т-клетка экспрессирует короткую шпилечную РНК (кшРНК) или малую интерферирующую РНК (миРНК), направленную против полинуклеотид ной последовательности, кодирующей компонент TCR.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная сконструированная Т-клетка несет мутации в альфа-аллелях TCR и/или бета-аллелях TCR.

В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная сконструированная Т-клетка может иметь по меньшей мере один аллель, кодирующий TCR альфа, TCR бета и/или CD3, который инактивирован мутацией.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная сконструированная Т-клетка имеет по меньшей мере один аллель, выбранный из β2m, PD1, CTLA4, dCK, CD52 и/или GR, который был инактивирован.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения сконструированная иммунная клетка не экспрессирует специфичный для ритуксимаба мимотоп SEQ ID NO: 22.

Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения касается генетически сконструированных Т-клеток, экспрессирующих CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, где указанный CAR22 содержит VH SEQ ID NO: 11 и VL SEQ ID NO: 12, а указанный CAR20 содержит VH SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16.

Еще более конкретно в настоящем изобретении предусматривают генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и где указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

Конкретный объект настоящего изобретения касается генетически сконструированных Т-клеток, экспрессирующих CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, причем указанный CAR22 содержит VH из SEQ ID NO: 11 и VL из SEQ ID NO: 12, указанный CAR20 содержит VH из SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16, и указанная сконструированная Т-клетка имеет по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который инактивирован мутацией.

Конкретный объект настоящего изобретения касается генетически сконструированных Т-клеток, экспрессирующих CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, причем указанный CAR22 содержит VH из SEQ ID NO: 11 и VL из SEQ ID NO: 12, указанный CAR20 содержит VH из SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16, и указанная сконструированная Т-клетка имеет по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией и имеет по крайней мере один выбранный аллель из CD52 и р2 т, которые были инактивированы, в частности, где указанная сконструированная Т-клетка имеет ТСRальфа и/или TCRбета и CD52, которые были инактивированы мутацией.

Еще более конкретно, в настоящем изобретении предусматривают генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, причем указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и указанная сконструированная Т-клетка имеет по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией.

Еще более конкретно, в настоящем изобретении предусматривают генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, причем указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и указанная сконструированная Т-клетка имеет по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией, и имеет по меньшей мере один аллель, выбранный из CD52 и β2m, который был инактивирован, в частности, где указанная сконструированная Т-клетка имеет ТСRальфа и/или TCRбета и CD52, которые были инактивированы мутацией.

В настоящем изобретении также предусматривают генетически сконструированную иммунную клетку, экспрессирующую CAR20 и CAR22 на своей клеточной поверхности согласно вышеописанному, причем указанные CAR кодируются экзогенной нуклеиновой кислотой, встроенной в геном указанной иммунной клетки, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит в направлении от 5' до 3':

(i) промотор, (например, промотор EF1 альфа),

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20,

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19),

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR22,

причем один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

В частности, также предусматривают генетически сконструированную иммунную клетку, экспрессирующую CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности согласно вышеописанному, где указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит в направлении от 5' к 3':

(i) промотор (такой как промотор ЕР1альфа), который контролирует экспрессию указанного CAR20;

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20, содержащую сигнальный пептид SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 17, шарнир CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен 4-1BB SEQ ID NO: 8 и сигнальный домен CD8дзета SEQ ID NO: 9;

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19);

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR22, содержащую сигнальный пептид SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 13, шарнир CDS-альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен 4-IBB SEQ ID NO: 8 и сигнальный домен CD8дзета SEQ ID NO: 9;

причем один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения также представлена генетически сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности согласно описанному выше, причем указанные CAR кодируются экзогенной нуклеиновой кислотой, включенной в геном указанной иммунной клетки, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит в направлении от 5' к 3':

(i) промотор (такой как промотор ЕР1альфа),

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR22,

(iii) нуклеиновую кислота, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19),

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20,

при этом один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

В частности, также предложена генетически сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая CAR22 и CAR20 на своей клеточной поверхности, как описано выше, где указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит в направлении от 5' к 3':

(i) промотор (такой как промотор ЕР1альфа), который контролирует экспрессию указанного CAR22,

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный CAR22, содержащий сигнальный пептид SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 13, шарнир CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен 4-IBB SEQ ID NO: 8 и сигнальный домен CD8дзета SEQ ID NO: 9),

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19),

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20, содержащую сигнальный пептид SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 17, шарнир CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8 льфа SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен 4-IBB SEQ ID NO: 8 и сигнальный домен CD8дзета SEQ ID NO: 9.

Способы получения генетически сконструированных иммунных клеток Иммунные клетки, которые должны быть генетически сконструированы для экспрессии CAR20 и CAR22 согласно описанию настоящего изобретения, могут быть получены путем введения одного или нескольких экзогенных полинуклеотидов, кодирующих указанные CAR. Указанный полинуклеотид можно ввести в клетку с помощью вирусных векторов методом трансдукции. Указанный полинуклеотид также может быть введен в клетку в виде плазмиды или продукта ПЦР.

Стабильная экспрессия CAR, в частности CAR20 и CAR22, описанных в настоящем документе, в описанных выше иммунных клетках может быть достигнута с использованием, например, вирусных векторов (например, лентивирусных векторов, ретровирусных векторов, векторов аденоассоциированного вируса (AAV)) или путем интеграции транспозонов/систем транспозаз, или плазмид, или продуктов ПЦР. Другие подходы включают прямую электропорацию мРНК.

Для одновременной доставки обоих CAR в клетку полинуклеотид (полинуклеотиды), кодирующие анти-CD22 CAR (CAR22) и анти-СD20 CAR (CAR20), описанные в настоящем изобретении, могут иметь различные структуры, такие как:

(а) полицистронная структура, в которой обе две единицы транскрипции контролируются уникальным промотором, имеют одинаковое направление транскрипции и разделены «саморасщепляющимся» пептидом, таким как пептид 2 А (например, Р2А, Т2А, Е2А, F2A),

(б) двунаправленное расположение, при котором каждая из 2 единиц транскрипции контролируется независимым промотором в конфигурации «голова к голове» и которые транскрибируются в противоположных направлениях, и

(в) моноцистронная компоновка с обоими транскриптами scFV, разделенными геномным спейсером.

Используемый в настоящем изобретении термин «полицистронная» мРНК относится к одной матричной РНК, которая содержит две или более кодирующие последовательности (т.е. цистроны) и кодирует более одного белка. Полицистронная мРНК может содержать любой известный в данной области элемент, обеспечивающий трансляцию двух или более генов из одной и той же молекулы мРНК, включая, но им не ограничиваясь, саморасщепляющийся пептид, такой как элемент Р2А, элемент Т2А, элемент Е2А и элемент F2A или элемент IRES.

Саморасщепляющийся пептид, который должен быть включен в полинуклеотиды по настоящему изобретению, может быть выбран из пептида 2А, 2А-подобного пептида, пептида Р2А, пептида Е2А, пептида F2A, пептида Т2А, в частности, пептида 2А, более конкретно пептида Р2А SEQ ID NO: 19, пептида Т2А SEQ ID NO: 38, пептида Е2А SEQ ID NO: 39 или пептида F2A с SEQ ID NO: 40, еще точнее пептида Р2А SEQ ID NO: 19.

Аббревиатура IRES (Internal ribosome entry site) означает «внутренний сайт посадки рибосомы», причем по настоящему изобретению можно использовать любой IRES, который допускает транскрипцию, а затем трансляцию кодирующей последовательности, инсертированной в ген. Например, IRES, входящий в состав описанных в настоящем изобретении полинуклеотидов, может иметь SEQ ID NO: 37.

Как описано в настоящем изобретении, CAR20 и CAR22 могут кодироваться двумя нуклеиновыми кислотами, где:

1) одна нуклеиновая кислота кодирует CAR20, содержащий:

1) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 15 и содержит H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 16 и содержит L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 и необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета; и

2) другая нуклеиновая кислота кодирует CAR22, содержащий: i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 11 и содержит H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 12 и содержит L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46 и необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

В одном варианте CAR22 и CAR20 кодируются двумя независимыми нуклеиновыми кислотами а) и б), где:

(1) нуклеиновая кислота а) кодирует CAR22, содержащий:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета; и

(2) нуклеиновая кислота б) кодирует CAR20, содержащий:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 15 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 16, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают выделенный полинуклеотид, содержащий:

а) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, содержащую: i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета, и

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, содержащую:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 15 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 16, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

В другом варианте нуклеиновые кислоты а) и б) находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, а выделенный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А, Т2А, Е2А, F2A), расположенную между нуклеиновыми кислотами а) и б).

Таким образом, основным объектом в настоящем изобретении является полинуклеотид, содержащий в направлении от 5' к 3':

(i) промотор (такой как промотор ЕР1альфа)

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, как описано в настоящем изобретении,

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19);

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, как описано в настоящем изобретении,

причем один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

В настоящем описании также предусматривают полинуклеотид, содержащий в направлении от 5' к 3':

(i) промотор (такой как промотор ЕР1альфа)

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, как описано в настоящем изобретении,

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19);

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, как описано в настоящем изобретении,

причем один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид, описанный в настоящем изобретении, не содержит нуклеиновой кислоты, кодирующей другой CAR, отличный от CAR22 и CAR20.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид, описанный в настоящем изобретении, не содержит нуклеиновой кислоты, кодирующей специфичный для ритуксимаба мимотоп SEQ ID NO: 22.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, содержит:

а) промотор (такой как промотор ЕЕ1альфа), который контролирует экспрессию указанного CAR20, за которым следует нуклеиновая кислота, кодирующая указанный CAR20, где указанный CAR20 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 15 и содержит H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 16 и содержит L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD3дзета; и

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, содержащую:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 11 и содержит H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 12 и содержит L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета;

причем указанные нуклеиновые кислоты а) и б) находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А, Т2А, Е2А или F2A), расположена между указанными нуклеиновыми кислотами а) и б).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22 по настоящему изобретению, содержит:

а) промотор (такой как промотор ЕЕ1альфа), который контролирует экспрессию указанного CAR22, за которым следует нуклеиновая кислота, кодирующая указанный CAR22, при этом указанный CAR22 состоит из:

i) по меньшей мере одного внеклеточного домена, содержащего:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 11 и содержит H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 12 и содержит L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета; и

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, содержащую:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 15 и содержит H-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 16 и содержит L-CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета;

причем указанные нуклеиновые кислоты а) и б) находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А, Т2А, Е2А или F2A), расположена между указанными нуклеиновыми кислотами а) и б).

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, содержит:

а) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, которая содержит промотор (такой как промотор EF1 альфа), контролирующий экспрессию указанного CAR22, состоящего из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 13, шарнира CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранного домена CDS-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-1BB SEQ ID NO: 8 и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9;

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, состоящую из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 17, шарнира CDS-альфа SEQ ID NO: 4, транс мембранного домена CDS-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-IBB SEQ ID NO: 8 и дзета-сигнализирующий домен CD3 SEQ ID NO: 9; и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9; и

в) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19), помещенную между нуклеиновой кислотой а) и нуклеиновой кислотой б), допуская одновременную экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, содержит:

а) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, которая содержит промотор (такой как промотор EF1 альфа), контролирующий экспрессию указанного CAR20, состоящего из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 17, шарнира CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранного домена CD8-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-1BB SEQ ID NO: 8 и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9;

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, состоящую из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 13, шарнира CDS-альфа SEQ ID NO: 4, транс мембранного домена CD8-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-IBB SEQ ID NO: 8 и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9; и

в) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19), помещенную между нуклеиновой кислотой а) и нуклеиновой кислотой б), допуская одновременную экспрессию указанных CAR22 и CAR20.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31 (конструкция CAR22×CAR20).

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 32 (конструкция CAR20×CAR22).

Также в настоящем изобретении предусматривают вектор, содержащий любой из выделенных полинуклеотидов по настоящему изобретению.

Также в настоящем изобретении предусматривают клетку-хозяина, содержащую вектор по настоящему изобретению.

Популяцию иммунных клеток, которые необходимо сконструировать, обычно выделяют из крови пациента или здорового донора путем афереза и дополнительно конструируют для экспрессии химерного антигенного рецептора на их поверхности. В качестве альтернативы, популяция иммунных клеток, которую необходимо сконструировать, может происходить из клеток пуповинной крови или из стволовых клеток, которые дополнительно сконструированы для экспрессии химерного антигенного рецептора на их поверхности.

Указанные иммунные клетки, экспрессирующие CAR, могут происходить из иммунных клеток пациента или совместимого донора, которые были сконструированы для экспрессии на своей поверхности специфического CAR.

Указанные иммунные клетки, экспрессирующие CAR, могут также происходить из стволовых клеток, таких как iPS-клетки, происходящие от данного пациента или от совместимого донора, или из лимфоцитов, инфильтрирующихся в опухоль (TILL tumor infiltrating lymphocytes).

В других объектах указанные иммунные клетки, экспрессирующие CAR, представляют собой так называемые «готовые» составы иммунных клеток, в которых иммунные клетки, не принадлежащие конкретно пациенту, подлежащему лечению, были сконструированы для экспрессии CAR и стали пригодными для аллогенного терапевтического лечения.

Понятие «аллогенный» означает, что клетки происходят от донора или продуцируются и/или дифференцируются из стволовых клеток с учетом введения пациентам, имеющим другой гаплотип.

Такие иммунные клетки обычно конструируют так, чтобы они были менее аллореактивными и/или становились более стойкими по отношению к своему пациенту-хозяину. Более конкретно, способ конструирования аллогенных иммунных клеток может включать стадию снижения или инактивации экспрессии TCR в Т-клетках или в стволовых клетках, которые должны быть трансформированы в Т-клетки. Этого можно добиться с помощью различных реагентов, специфичных для последовательности, такими методами как сайленсинг генов или редактирование генов (нуклеаза, редактирование оснований, РНКи…).

Ранее были предоставлены надежные протоколы и стратегии редактирования генов для получения аллогенных Т-клеток терапевтического класса из МКПК, особенно с помощью в высокой степени безопасных и специфических эндонуклеазных реагентов в форме TALE-нуклеаз (TALEN®). Получение так называемых «универсальных 1-клеток», которые являются [TCR]^{отрицательными} Т-клетками, от доноров достигнуто и успешно введено пациентам с пониженной реакцией «трансплантат против хозяина» (GVhD - Graft versus Host Disease) (Poirot с соавт., Cancer. Res. 2015, 75 (18): 3853-3864; Qasim с соавт., Science Translational 2017, 9(374)). Между тем, инактивация компонентов TCR или β2m в первичных Т-клетках может сочетаться с инактивацией дополнительных генов, кодирующих белки-ингибиторы контрольных точек, как описано, например, в WO 2014184744.

В других случаях сконструированная иммунная клетка может быть дополнительно модифицирована для придания устойчивости по меньшей мере к одному иммуносупрессивному лекарственному средству, например, путем инактивации CD52, который является мишенью анти-СD52-антитела (например, алемтузумаба), как описано, например, в WO 2013176915.

В других случаях сконструированная иммунная клетка может быть дополнительно модифицирована для придания устойчивости к химиотерапевтическому средству, в частности к препарату-аналогу пурина, например, путем инактивации DCK как описано в WO 201575195.

В других случаях сконструированная иммунная клетка может быть дополнительно модифицирована для улучшения ее персистенции или продолжительности жизни в организме пациента, в частности путем инактивации гена, кодирующего компонент (компоненты) MHC-I, такие как HLA или β2m, как описано в WO 2015136001 или в публикации Liu с соавт. (Cell Res 2017, 27:154-157).

В других случаях сконструированную иммунную клетку мутируют для улучшения ее CAR-зависимой иммунной активации, в частности, для снижения или подавления экспрессии белков контрольных точек иммунного ответа и/или их рецепторов, таких как PD1 или CTLA4, как описано в WO 2014184744.

Фармацевтические составы

Один объект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный к CD22 (CAR22), и химерный антигенный рецептор, специфичный к CD20 (CAR20), согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая популяцию иммунных клеток, включающую генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный в отношении CD22 (CAR22), и химерный антигенный рецептор, специфичный в отношении CD20 (CAR20), описанные в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Конкретный объект по настоящему изобретению касается фармацевтической композиции, содержащей генетически сконструированные Т-клетки по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Еще один конкретный объект по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию Т-клеток, включающую генетически сконструированные Т-клетки по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Другой конкретный объект по настоящему изобретению касается фармацевтической композиции, содержащей генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20 и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит VH SEQ ID NO: 11 и VL SEQ ID NO: 12, и указанный CAR20 содержит VH SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16.

Еще более конкретно предусматривают фармацевтическую композицию, содержащую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и где указанный CAR20 содержит аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 18.

Еще один конкретный объект по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию Т-клеток, включающую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит VH SEQ ID NO: 11 и VL SEQ ID NO: 12, а указанный CAR20 содержит VH SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16.

Еще один конкретный объект по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию Т-клеток, включающую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, а указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

Другой конкретный объект по настоящему изобретению касается фармацевтической композиции, содержащей генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит VH SEQ ID NO: 11 и VL SEQ ID NO: 12, и указанный CAR20 содержит VH SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16, и где указанные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией, и/или где указанные сконструированные Т-клетки имеют по меньшей мере один инактивированный аллель, выбранный из (32 т и CD52.

Еще более конкретно, предусматривают фармацевтическую композицию, содержащую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, где указанный CAR20 содержит аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 18, и где указанные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который инактивирован мутацией.

Еще более конкретно, предусматривают фармацевтическую композицию, содержащую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, где указанный CAR20 содержит аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 18, и где указанные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией, и/или где указанные сконструированные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, выбранный из β2m и CD52, который был инактивирован.

Еще один конкретный объект по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию Т-клеток, включающую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит VH SEQ ID NO: 11 и VL SEQ ID NO: 12, указанный CAR20 содержит VH SEQ ID NO: 15 и VL SEQ ID NO: 16, и где указанные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, кодирующий TCRaльфa, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован путем мутации, и/или где указанные сконструированные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, выбранный из β2m и CD52, который был инактивирован.

Еще один конкретный объект по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию Т-клеток, включающую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, где указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и где указанные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией.

Еще один конкретный объект по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию Т-клеток, включающую генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности CAR22 и CAR20, и фармацевтический эксципиент, где указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, где указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и где указанные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, кодирующий ТСRальфа, TCRбета и/или CD3, который был инактивирован мутацией, и/или где указанные сконструированные Т-клетки имеют по меньшей мере один аллель, выбранный из (32 т и CD52, который был инактивирован.

В настоящем изобретении также представлены генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR20 и CAR22 согласно описанию настоящего изобретения, для применения в качестве лекарственного средства.

Также в настоящем изобретении предусмотрена популяция иммунных клеток, включающая генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR20 и CAR22 согласно описанию настоящего изобретения, для применения в качестве лекарственного средства.

Способы лечения

Другой объект относится к способам лечения рака и/или воспалительного заболевания, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, генетически сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении.

Аналогичный объект касается генетически сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, для применения в способе лечения рака и/или воспалительного заболевания.

Аналогичный объект относится к популяции иммунных клеток, включающей генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, для применения в способе лечения рака и/или воспалительного заболевания.

Аналогичные объекты касаются применения генетически сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, или популяции иммунных клеток, включающей генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, для приготовления лекарственного средства.

Аналогичный объект касается применения генетически сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, или популяции иммунных клеток, включающей генетически сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR20 и CAR22, как описано в настоящем изобретении, для приготовления лекарственного средства для лечения рака и/или воспалительного заболевания.

Лечение может быть предназначено для лечения рака, включая гематологический рак, такой как гематологический рак, выбранный из лимфомы, лимфомы Ходжкина (ЛХ), неходжкинской лимфомы (НХЛ), лейкоза, множественной миеломы (ММ), В-хронического лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) (также известного как острый лимфобластный лейкоз), острого лимфоцитарного рака, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), в частности, CD22- и/или CD20-ассоциированного гематологического рака, более конкретно рефрактерного к рецидивам CD22- и/или CD20-ассоциированного гематологического рака, еще более конкретно агрессивной формы указанного CD22-и/или СВ20-ассоциированного гематологического рака.

Лечение может быть связано с предотвращением или ослаблением воспалительного заболевания, связанного с CD20 и/или CD22.

В конкретном объекте лечение предназначено для лечения пациентов с рефрактерной к рецидивам НХЛ.

В еще одном конкретном объекте лечение предназначено для лечения пациентов, больных раком, у которых экспрессия антигенов CD20 и CD22 является низкой.

В конкретном объекте лечение предназначено для лечения пациентов, которых ранее лечили ритуксимабом (антитело к CD20, которое является стандартом лечения НХЛ).

«Неходжкинская лимфома (НХЛ)» - это термин для группы разнообразных видов рака крови, которые имеют одну общую характеристику: все они возникают из лимфоцитов. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) идентифицировала более 60 конкретных подтипов НХЛ, которым были присвоены названия как «диагностические обозначения».

В частности, термин «неходжкинская лимфома (НХЛ)» включает следующие диагностические обозначения для неходжкинской лимфомы (НХЛ):

1. Зрелые В-клеточные лимфомы (около 85-90% случаев НХЛ):

- Агрессивная: диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДКВКЛ) (31%), лимфома мантийных клеток (ЛМК) (может проявляться как агрессивная или индолентная) (6%), лимфобластная лимфома (2%), лимфома Беркитта (БЛ) (2%). %), первичная медиастинальная (тимусная) крупноклеточная В-клеточная лимфома (ПМКВКЛ) (2%), трансформированная фолликулярная и трансформированная лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистой оболочкой (MALT - mucosa-associated lymphoid tissue), В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности с двойным или тройным поражением (HBL - High-grade B-cell lymphoma), первичная кожная ДКВКЛ (ножной тип), первичная ДКВКЛ центральной нервной системы, первичная лимфома центральной нервной системы (ЦНС), лимфома, ассоциированная с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД)

Индолентные: фолликулярная лимфома (ФЛ) (22%), лимфома маргинальной зоны (МЗЛ) (8%), хронический лимфолейкоз/мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (ХЛЛ/МЛЛ) (6%), лимфома лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка (ЛТСОЖ) (5%), лимфоплазмоцитарная лимфома (1%), макроглобулинемия Вальденстрема (MB), узловая лимфома маргинальной зоны (УЛМЗ) (1%), лимфома маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС),

2. Зрелые Т-клеточные лимфомы и лимфомы природных клеток-киллеров (NK) около 10-15% случаев НХЛ)

- Агрессивные: периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛ), не определенная иначе (6%), системная анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ) (2%), лимфобластная лимфома (2%), гепатолиенальная гамма/дельта Т-клеточная лимфома, подкожная панникулитоподобная Т-клеточная лимфома (ПППТКЛ), кишечная Т-клеточная лимфома энтеропатического типа, первичная кожная анапластическая крупноклеточная лимфома

- Индолентная: кожная Т-клеточная лимфома (КТКЛ) (4%), грибовидный микоз (ГМ), синдром Сезари (СС), ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых, экстранодальная NK/T- клеточная лимфома (3NK/TKJI), назальный тип.

Вышеизложенное описание настоящего изобретения предусматривает способ и процесс его реализации и использования таким образом, что любой специалист в данной области техники может сделать и использовать его, причем эта возможность предусмотрена, в частности, в сути прилагаемой формулы изобретения, которая составляет часть исходного описания.

Там, где в настоящем описании указан числовой предел или диапазон, включены конечные точки. Кроме того, все значения и поддиапазоны в пределах числового предела или диапазона специально включены таким образом, как если бы они были явно обозначены.

После общего описания настоящего изобретения его дальнейшее понимание может быть представлено путем отсылки на некоторые конкретные примеры, которые представлены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема заявляемого изобретения.

Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения

1. Генетически сконструированная Т-клетка, экспрессирующая на своей клеточной поверхности химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный к CD22 (CAR22), и химерный антигенный рецептор, специфичный к CD20 (CAR20),

а) где указанный CAR22 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD3дзета; и

б) где указанный CAR20 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 15 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 16, необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета; и

в) где указанная сконструированная Т-клетка является TCR-отрицатель ной.

2. Генетически сконструированная Т-клетка по варианту осуществления настоящего изобретения по п. 1, причем указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

3. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1 и 2, причем ни один из внеклеточных доменов указанных CAR20 и CAR22 не содержит ритуксимаб-специфического мимотопа SEQ ID NO: 22.

4. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-3, причем указанная сконструированная Т-клетка экспрессирует короткую шпилечную РНК (кшРНК) или малую интерферирующую РНК (миРНК), направленную против полинуклеотидной последовательности, кодирующей компонент TCR.

5. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-3, причем в указанной сконструированной Т-клетке аллель ТСRальфа и/или TCRбета мутирован.

6. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-3 и 5, причем в указанной сконструированной Т-клетке по меньшей мере один аллель, кодирующий TCR альфа, TCR бета и/или CD3, инактивирован мутацией.

7. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-6, причем указанная сконструированная Т-клетка имеет инактивированный аллель CD52.

8. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-7, причем указанная сконструированная Т-клетка имеет инактивированный аллель β2m.

9. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-8, причем указанная сконструированная Т-клетка имеет инактивированный аллель PD1.

10. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-9, причем указанная сконструированная Т-клетка имеет инактивированный аллель CTLA4.

11. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-10, причем указанная сконструированная Т-клетка имеет инактивированный аллель dCK.

12. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-11, причем указанная сконструированная Т-клетка имеет инактивированный аллель GR.

13. Генетически сконструированная Т-клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-12, причем указанная сконструированная иммунная клетка представляет собой цитотоксическую Т-клетку.

14. Генетически сконструированная Т-клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-13, причем указанная сконструированная Т-клетка входит в состав популяции Т-клеток.

15. Генетически сконструированная Т-клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-14, причем указанная сконструированная Т-клетка является первичной клеткой.

16. Генетически сконструированная Т-клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-15, причем указанная сконструированная Т-клетка является клеткой млекопитающего, предпочтительно клеткой человека.

17. Генетически сконструированная Т-клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-16, причем указанная сконструированная Т-клетка не экспрессирует другого CAR помимо указанных CAR22 и CAR20.

18. Популяция Т-клеток, содержащая сконструированные Т-клетки в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-7.

19. Фармацевтическая композиция, содержащая сконструированные Т-клетки по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-17 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

20. Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию Т-клеток по варианту осуществления настоящего изобретения по п. 18 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

21. Выделенный полинуклеотид, содержащий:

а) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, содержащую:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную легкую цепь (VL) SEQ ID NO: 12, необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и

сигнальный домен CD8дзета; и

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR20, содержащую:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH) SEQ ID NO: 15 и вариабельную легкую цепь (VL)

SEQ ID NO: 16, необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD8дзета.

22. Полинуклеотид по варианту осуществления настоящего изобретения по п. 21, в котором нуклеиновые кислоты а) и б) находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, причем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А, Т2А, Е2А или F2A), расположена между нуклеиновыми кислотами а) и б).

23. Полинуклеотид по вариантам осуществления настоящего изобретения по п.п. 21 или 22, где указанный отдельный полинуклеотид не содержит нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, отличный от указанных CAR22 и CAR20.

24. Полинуклеотид по вариантам осуществления настоящего изобретения по п.п. 21-23, где указанный отдельный полинуклеотид не содержит нуклеиновой кислоты, кодирующей специфический для ритуксимаба мимотоп SEQ ID NO: 22.

25. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 21-24, где нуклеиновая кислота а) содержит промотор (такой как промотор EF1 альфа), который контролирует экспрессию указанного CAR22, состоящего из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 13, шарнира CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранного домена CD8-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-1BB SEQ ID NO: 8 и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9;

где нуклеиновая кислота б) кодирует указанный CAR20, состоящий из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 17, шарнира CD8-альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранного домена CDS-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-IBB SEQ ID NO: 8 и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9; 20 причем нуклеиновая кислота, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19), находится между нуклеиновой кислотой а) и нуклеиновой кислотой б), обеспечивая одновременную экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

26. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 21-24, где нуклеиновая кислота б) содержит промотор (такой как промотор EF1 альфа), который контролирует экспрессию указанного CAR20,

состоящего из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 17, шарнира CD8альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранного домена CD8-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-1BB SEQ ID NO: 8 и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9;

где нуклеиновая кислота а) кодирует указанный CAR22, состоящий из сигнального пептида SEQ ID NO: 1, scFv SEQ ID NO: 13, шарнира CD8-альфа SEQ ID NO: 4, трансмембранного домена CDS-альфа SEQ ID NO: 6, костимулирующего домена 4-IBB SEQ ID NO: 8, сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9; причем нуклеиновая кислота, кодирующая саморасщепляющийся пептид (такой как Р2А SEQ ID NO: 19), находится между нуклеиновой кислотой а) и нуклеиновой кислотой б), обеспечивая одновременную экспрессию указанных CAR22 и CAR20.

27. Выделенный полинуклеотид согласно варианту осуществления настоящего изобретения по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31 (конструкция CAR22×CAR20).

28. Выделенный полинуклеотид согласно варианту осуществления настоящего изобретения по п. 26, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 32 (конструкция CAR20×CAR22).

29. Вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 21-28.

30. Клетка-хозяин, содержащая вектор согласно варианту осуществления настоящего изобретения по п. 29.

31. Способ получения сконструированных Т-клеток в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-17, включающий введение в иммунную клетку полинуклеотида в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 21-28 или вектора в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения по п. 29.

32. Сконструированные Т-клетки согласно любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-17 для применения в качестве лекарственного средства.

33. Сконструированные Т-клетки согласно любому из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-17 для применения при лечении рака, связанного с экспрессией CD20 и/или CD22.

34. Сконструированные Т-клетки в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-17 для применения при лечении гематологического рака, в частности, CD22- и/или CD20-ассоциированного гематологического рака, более конкретно рецидивирующего рефрактерного CD22-и/или CD20-ассоциированный гематологический рака, еще более конкретно агрессивную форму указанного CD22- и/или CD20-ассоциированного гематологического рака.

35. Сконструированные Т-клетки для применения в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения по п.п. 33 или 34, где указанный рак выбран из группы, состоящей из лимфомы, лимфомы Ходжкина (ЛХ), неходжкинской лимфомы (НХЛ), лейкоза, множественной миеломы (ММ), В-хронического лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ), острого лимфолейкоза (ОЛЛ), острого лимфоцитарного рака, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).

36. Сконструированные Т-клетки для применения в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения по п. 35, где указанный рак представляет собой неходжкинскую лимфому или острый лимфоцитарный лейкоз.

37. Сконструированные Т-клетки для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 33-36, где указанный рак связан с низкой экспрессией CD20 и/или CD22.

38. Сконструированные Т-клетки для применения в соответствии с любым из 10 вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 33-37, где указанный рак представляет собой рецидивирующую неходжкинскую лимфому.

39. Способ лечения пациента, больного раком, связанного с экспрессией CD20 и/или CD22, включающий введение указанному пациенту эффективного количества сконструированных Т-клеток в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 1-17 или популяции Т-клеток по п. 18.

40. Способ лечения согласно варианту осуществления настоящего изобретения по п. 39, где указанный рак выбран из группы, состоящей из лимфомы, лимфомы Ходжкина (ЛХ), неходжкинской лимфомы (НХЛ), лейкоза, множественной миеломы (ММ), В-хронического лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ), острого лимфолейкоза (ОЛЛ), острого лимфоцитарного рака, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).

41. Способ лечения согласно варианту осуществления настоящего изобретения по п.п. 39 или 40, причем указанный рак представляет собой неходжкинскую лимфому или острый лимфоцитарный лейкоз.

42. Способ лечения в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 39-41, причем указанный рак связан с низкой экспрессией CD20 и/или CD22.

43. Способ лечения в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения по п.п. 39-42, причем указанный рак представляет собой 30 рецидивирующую неходжкинскую лимфому.

Примеры

Приведенные в настоящем описании примеры показывают, как создавать двойные CAR-T-клетки, нацеленные на антигены CD20 и CD22 («CD20×CD22» или «CD20×CD22» CAR-T-клетки), и демонстрируют их способность лизировать опухолевые клетки с рецепторами CD22 и/или CD20 с низкой экспрессией или без экспрессии.

Пример 1. Генерация двойных конструкций CD20 и CD22 CAR и их контроль Две ориентации двойного CAR разрабатывают и конструируют в виде рекомбинантного лентивирусного вектора для сравнения экспрессии, активности и эффективности. Первая двойная конструкция (CD22×CD20) содержит промотор EF1альфа, который управляет экспрессией первого CD22 CAR, состоящего из сигнального пептида (SEQ ID NO: 1), scFv SEQ ID NO: 13, шарнира CD8альфа (SEQ ID NO: 4) и домена TM (SEQ ID NO: 6), костимулирующего домена 4-IBB (SEQ ID NO: 8) и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9. За данным первым CAR следует саморасщепляющийся пептид Р2А (SEQ ID NO: 19), обеспечивающий экспрессию второго CD20 CAR, состоящего из сигнального пептида (SEQ ID NO: 1), анти-CD20 scFv SEQ ID NO: 17, шарнира CD8альфа (SEQ ID NO: 4) и домена TM (SEQ ID NO: 6), костимулирующего домен 4-IBB (SEQ ID NO: 8) и сигнального домена CD8дзета SEQ ID NO: 9. Чтобы избежать какой-либо рекомбинации в конструкции rLV нуклеотидные последовательности, используемые для кодирования одних и тех же аминокислотных последовательностей, дважды присутствующих в конструкции, оптимизируют с использованием кодонов и вырожденности кода таким образом, чтобы развести нуклеотидные последовательности. Вторая двойная конструкция (CD20×CD22) содержит точно такие же последовательности (нуклеотидов и аминокислот), но CD20 CAR расположен сразу после промотора EF1 альфа.

Для сравнения CD22 или CD20 CAR внедряют в рекомбинантный лентивирусный вектор. Эти конструкции содержат промотор ЕПальфа, управляющий экспрессией одного CAR, нацеленного на CD22 (SEQ ID NO: 14) или CD20 (SEQ ID NO: 18). Пример 2. Генерация двойных CD20×CD22 или CD22×CD20 CAR-T-клеток Используют криоконсервированные МКПК не менее чем от 3 разных доноров. МКПК оттаивают при 37°С, промывают и ресуспендируют в среде OpTmizer с добавлением рекомбинантного интерлейкина-2 человека (rhIL-2, 350 МЕ/мл) сыворотки человека АВ (5%) для инкубирования в течение ночи при 37°С в инкубаторе с 5% СO₂. Затем клетки активируют гранулами, покрытыми анти-CD3/CD28, в среде OpTmizer с добавлением сыворотки человека АВ (5%) (и дополнительно 5% CTS™ Immune Cell SR во время фазы роста) и рекомбинантного интерлейкина-2 человека (rhIL- 2, 350 МЕ/мл) в инкубаторе с атмосферой СО₂ в течение 3 дней. Затем амплифицированные Т-клетки трансдуцируют лентивирусными частицами, экспрессирующими CD20×CD22 или CD22×CD20 CAR (SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, соответственно) при множественности заражения 15 (MOI Multiplicity of Infection) в присутствии усилителя трансдукции Lentiboost (фирма Mayflower bioscience SB-P-LV-101-12). Амплифицированные Т-клетки также трансдуцируют лентивирусными частицами, экспрессирующими только CD20 CAR или CD22 CAR (SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 18) при MOI 5. Через два дня после трансдукции клетки подвергают электропорации с 4 мРНК, две из которых кодируют плечи TRAC T01 TALEN (SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24) и две кодируют плечи CD52 T01 TALEN (SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26) с использованием системы AgilePulse Max. Клетки ре суспендируют в культуральной среде, инкубируют на протяжении от 16 до 18 ч при 30°С и размножают при 37°С после добавления свежей культуральной среды, время от времени регулируя концентрацию клеток. В последний день культивирования (18 дней после размораживания) Т-клетки используют в различных анализах или замораживают в среде для замораживания (90% ФСБ, 10% ДМСО). Клетки хранят замороженными при -150°С до использования.

Пример 3. Обнаружение двойных CD20 и CD22 CAR-T клеток

Для обнаружения CD20 CAR используют рекомбинантный белок CD20, слитый с His-меткой (фирма Асго, номер в каталоге #CD0-H52H3, SEQ ID NO: 20), в сочетании с АРС-меченым aHTH-His-антителом (фирма BioLegend, номер в каталоге #362605). Для обнаружения CD22 CAR используют белок CD22-Fc (SEQ ID NO: 21) в сочетании с меткой СуЗ подкласса 1 анти-Fcgamma (фирма Jackson ImmunoResearch, номер в каталоге #115-165-205).

Различные CAR-T-клетки (нетрансдуцированные, CD20×CD22 CAR, CD22×CD20 CAR или CD22 CAR), полученные в примере 1, инкубируют со 100 нг белка CD22-Fc и 200 нг белка CD20-His, промывают и дополнительно инкубируют с анти-Fc гамма (50 нг) или анти-His (50 нг), затем фиксируют в 2% PFA. Затем клетки анализируют с помощью жидкостной цитометрии.

Результаты на фиг. 1 показывают, что трансдукция только CD22 CAR привела к 40% CD22 CAR положительных Т-клеток, тогда как трансдукция CD22×CD20 или CD20×CD22 CAR привела к 39% и 25% двойных положительных CAR-T-клеток, соответственно. Эти результаты воспроизводимы с использованием трех разных доноров. Интересно, что CD22×CD20 приводит к повышенной средней флуоресцентной интенсивности (MFI) окрашивания CD22 CAR, тогда как CD20×CD22 приводит к более высокому MFI окрашивания CD20 CAR.

Пример 4. Линии клеток, используемые для тестирования Т-клеток с двумя химерными антигенными рецепторами (двойных CD20 и CD22 CAR-T-клеток)

Линия клеток Раджи экспрессирует на высоком уровне CD20 и CD22. Эту клеточную линию модифицировали для экспрессии гена люциферазы и используют в качестве положительного контроля, т.е. для клеток-мишеней, экспрессирующих как CD20, так и CD22. Кроме того, клеточные линии Раджи обрабатывают CD22 и/или CD20 TALEN. Вкратце, клетки Раджи подвергают электропорации с мРНК, кодирующей плечи CD22 TALEN (SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28), и мРНК, кодирующими CD20 TALEN (SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30), с использованием системы AgilePulse Max. Клетки инкубируют при 30°С в течение 16-18 ч в среде RPMI1640 с 10% фетальной сыворотки быка (ФСБ) и 1% пенициллина/стрептавидина (культуральная среда), и выращивают в свежей культуральной среде при 37°С в инкубаторе с СО2 до стадии сортировки. Различные клеточные популяции очищают с использованием антибиотиновых микробусин и либо анти-CD20-биотина, либо анти-CD22-биотина, либо обоих (фирма Biolegend) для получения различных клеточных популяций, экспрессирующих i) CD20, но не CD22, ii) CD22, но не CD20, или iii) не экспрессирующие ни CD20, ни CD22. Фиг. 2 иллюстрирует фенотип таких отобранных популяций.

Пример 5. Цитотоксичность двойных CD20 и CD22 CAR-T-клеток CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клетки, полученные в примере 1 и полученные от трех разных доноров, тестируют по способности к цитотоксичности в отношении различных клеток Раджи, полученных в примере 4.

Т-клетки размораживают и подсчитывают количество жизнеспособных клеток с использованием устройства NucleoCounter® (фира Chemometec, модель NC-250). Различные CAR-T-клетки совместно культивировали в течение от 4 до 16 ч (при 37°С в инкубаторе с 5% С0₂) с различными клетками Раджи (CD20+CD22+, CD20+CD22-, CD22-CD20+и CD20-CD22-), экспрессирующими люциферазу, в 96-луночных планшетах при различном соотношении эффектор/мишень. В конце инкубационного периода высвобожденную люциферазу измеряют с помощью набора One-Glo® (фирма Promega, номер в каталоге #Е6110) в соответствии с протоколом поставщика. На фиг. 3 показано, что для всех используемых доноров CD22 CAR-T-клетки могут эффективно лизировать клоны CD20+CD22+и CD20-CD22+Раджи, тогда как CD22×CD20 или CD20×CD22 CAR-T-клетки обеспечивают тот же уровень лизиса, что и CD22 CAR, но также могут лизировать CD20 до того же уровня+CD22- клонов Раджи.

Способность к уничтожению CD20×CD22, CD22×CD20 и CD22 CAR-T-клеток, полученных в примере 1, также тестируют в анализе повторного заражения или серийного уничтожения. Различные CAR-T-клетки размораживают, подсчитывают и инкубируют с различными клетками Раджи при соотношении 1:1 CAR-положительные Т-клетки/клетки Раджи (CD20+CD22+, CD20-CD22+, CD20+CD22-). Через 3 дня инкубирования половину лунок используют для измерения высвобождения люциферазы с использованием набора One-Glo® (фирма Promega, номер в каталоге #Е6110), а другую половину переносят в новые планшеты, содержащие клетки Раджи, для дополнительного инкубирования. Измерение люциферазы повторяют через 7 дней, 10 дней, 14 дней и 17 дней.

На фиг. 4 показано, что CD22×CD20 или CD20×CD22 CAR-T-клетки способны эффективно убивать все протестированные клетки Раджи, тогда как CD22 CAR-T-клетки способны эффективно убивать только CD20+CD22+и CD20-CD22+клетки Раджи. Неожиданно было показано, что CD22 CAR-T-клетки проявляют низкую активность в отношении CD20+CD22- клеток Раджи, подтверждая, что экспрессия CD22 не полностью устранена в этом клоне. Это также свидетельствует о том, что двойные CAR могут эффективно убивать целевые опухолевые клетки с низкой экспрессией обоих антигенов-мишеней.

Пример 6. Контроль опухолевой нагрузки модели диссеминированной В-клеточной лимфомы in vivo

Клетки Дауди, экспрессирующие CD20 и CD22, модифицируют для экспрессии люциферазы и GFP. Клетки Дауди вводят внутривенно мышам с иммунодефицитом NSG (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtml Wjl/SzJ, фирма Jackson laboratories). Через семь дней после имплантации опухоли отдельным мышам внутривенно вводят CD20×CD22 (1 и 3 миллиона), CD22×CD20 (1 и 3 миллиона) и CD22 (10 миллионов) CAR-T-клеток. Сигнал биолюминесценции (ВЫ) после инъекции D-люциферина контролируют раз в две недели до 60-го дня после инъекции CAR-T-клеток; результаты представлены на фиг. 5. Для всех условий обработки тестируемыми С ART-клетками сигнал DLI был снижен по сравнению с контролем носителя или нетрансдуцированными Т-клетками. Неожиданно оказалось, что при низкой дозе в 1 миллион CAR+Т-клеток CD20×CD22 CAR Т-клетки проявляли сильную активность в качестве клеток-киллеров, которая была выше, чем у CD22×CD20 CAR-T-клеток.

Пример 7. Эффективность лечения в модели диссеминированной В-клеточной лимфомы in vivo

Животных, инъецированных клетками Дауди и впоследствии внутривенно инъецированных CAR-T-клетками из примера 6 CD20×CD22 (1 миллион), CD22×CD20 (1 миллион) и CD22 (10 миллионов), контролируют на выживаемость в течение 60 дней. Как показано на фиг. 6, животные, получавшие любую из протестированных CAR-T-клеток, выживают дольше, чем животные, получавшие либо носитель, либо нетрансдуцированные Т-клетки. Кроме того, что оказалось неожиданным, животные, получавшие CD20×CD22 CAR-T-клетки, жили дольше, чем животные, получавшие CD22×CD20 CAR-T-клетки.

Пример 8. Эффективность лечения в модели диссеминированной В-клеточной лимфомы in vivo

Линии клеток Раджи, описанные в примере 2, вводят подкожно мышам с иммунодефицитом NSG (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ, фирма Jackson Laboratories). Все три клеточные линии инъецируют одновременно каждому животному, в частности, клетки Раджи дикого типа (WT) инъецируют в один бок, клетки Раджи CD22- инъецируют в другой бок и клетки CD20- тоже в бок, но в другое место. Через неделю после инъекции опухоли внутривенно вводили CAR Т-клетки CD20×CD22 (3 и 8 миллионов), CD22×CD20 (3 и 8 миллионов) и CD22 (8 миллионов) и наблюдали за выживаемостью животных. Как показано на фиг. 7, животные, получавшие лечение CAR-T-клетками CD22, быстро погибали от заболевания, поскольку они несли опухолевые клетки CD22, на которые CAR-T-клетки CD22 не могли нацеливаться. Обработка тремя и восемью миллионами Т-клеток с двойным CAR показывает, что, хотя обе обработки эффективны, животные, получавшие CD20×CD22, неожиданно выживали в течение более длительного времени, чем животные, получавшие CD22×CD20.

Пример 9. Высвобождение интерферона гамма (IFN-гамма) CAR-T-клетками с двойными CD20 и CD22 CAR-T-клетками

Клетки Дауди, экспрессирующие CD20 и CD22, модифицируют для экспрессии гена люциферазы и GFP. Эти клетки Дауди инкубируют в течение ночи с CD20×CD22, CD22×CD20, CD22 или СВ20-положительными CAR-T-клетками в соотношении 1:1 (эффектор-мишень). На следующий день планшет центрифугируют и собирают супернатант.Уровни интерферона гамма, высвобождаемого при инкубации опухоли с CAR-T-клетками, количественно определяют с использованием набора ELISA для человеческого интерферона гамма Quantikine (фирма R&D systems, DIF50C) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве положительного контроля CAR-T-клетки инкубируют с ацетатом форболмиристата (РМА phorbol myristate acetate; фирма Sigma Aldrich, P8139) и иономицином (Sigma Aldrich, 10634). Окончательные значения высвобождения интерферона гамма нормализуют по таковым в положительном контроле. На фиг. 8 показано, что двойные CD20×CD22 CAR-T-клетки, а также CD22×CD20 CAR-T-клетки активируются при распознавании антигена на опухолевых клетках и высвобождают более высокие уровни IFN-гамма, чем одиночные CAR-T-клетки (CD20 или CD22). Это наблюдение указывает на синергетический эффект от использования двойных (CD20, CD22) CAR-T-клеток.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СЕЛЛЕКТИС С.А.

<120> Т-КЛЕТКИ С ДВУМЯ ХИМЕРНЫМИ АНТИГЕННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ CAR

<130> P242859PC00

<150> PA202070509

<151> 2020-07-31

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD8 alpha signal peptide

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Alternative signal peptide

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Fc gamma RIII alpha hinge

<400> 3

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

1 5 10 15

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD8 alpha hinge

<400> 4

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 5

<211> 231

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> IgG1 hinge

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD8 alpha transmembrane domain

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 4-1BB transmembrane domain

<400> 7

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 8

<211> 42

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 4-1BB stimulatory domain

<400> 8

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD3 zeta signalling domain

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Linker

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 VH

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 VL

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 246

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 scFv

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

180 185 190

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 14

<211> 490

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 full

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp

35 40 45

Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp

65 70 75 80

Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro

85 90 95

Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu

115 120 125

Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

165 170 175

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

180 185 190

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 15

<211> 122

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 VH

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 VL

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 244

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20scFv

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala

180 185 190

Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys

<210> 18

<211> 488

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 full

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr

115 120 125

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

165 170 175

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp

195 200 205

Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp

225 230 235 240

Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

325 330 335

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

340 345 350

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

370 375 380

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

385 390 395 400

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

405 410 415

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

420 425 430

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

435 440 445

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

450 455 460

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

465 470 475 480

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 19

<211> 22

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> P2A peptide

<400> 19

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 20

<211> 317

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD20-6His

<400> 20

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys

210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

290 295 300

Ser His His His His His His His His His His His His

305 310 315

<210> 21

<211> 916

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD22-Fc

<400> 21

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu

20 25 30

Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala

35 40 45

Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr

50 55 60

Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr

65 70 75 80

Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly

85 90 95

Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn

100 105 110

Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp

115 120 125

Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His

130 135 140

Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp

165 170 175

Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser

180 185 190

Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro

195 200 205

Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala

210 215 220

Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His

225 230 235 240

Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg

245 250 255

Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro

260 265 270

Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys

275 280 285

Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser

290 295 300

Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser

305 310 315 320

Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val

325 330 335

Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu

340 345 350

Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His

355 360 365

Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro

370 375 380

Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn

385 390 395 400

Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln

405 410 415

Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile

420 425 430

Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn

435 440 445

Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu

450 455 460

Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr

465 470 475 480

Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro

485 490 495

Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys

500 505 510

Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln

515 520 525

Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu

530 535 540

Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser

545 550 555 560

Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser

565 570 575

Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala

580 585 590

Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu

595 600 605

Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val

610 615 620

Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His

625 630 635 640

Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala

645 650 655

Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu

660 665 670

Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Gly

675 680 685

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val

690 695 700

Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val

705 710 715 720

Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile

725 730 735

Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val

740 745 750

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

755 760 765

Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu

770 775 780

Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala

785 790 795 800

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro

805 810 815

Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Asp Lys Val

820 825 830

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

835 840 845

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

850 855 860

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

865 870 875 880

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

885 890 895

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

900 905 910

Ser Pro Gly Lys

915

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> rituximab-specific epitope

<400> 22

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

1 5

<210> 23

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> TRAC_T01-L

<400> 23

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 24

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> TRAC_T01-R

<400> 24

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 25

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD52_T01-L

<400> 25

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 26

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD52_T01-R

<400> 26

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 27

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD22_T01-L

<400> 27

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 28

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD22_T01-R

<400> 28

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 29

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD20_T01-L

<400> 29

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 30

<211> 925

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CD20_T01-R

<400> 30

Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu

1 5 10 15

Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys

20 25 30

Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly

35 40 45

Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

145 150 155 160

Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro

165 170 175

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

225 230 235 240

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

245 250 255

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

275 280 285

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

305 310 315 320

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln

325 330 335

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

340 345 350

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

355 360 365

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

370 375 380

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile

385 390 395 400

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu

405 410 415

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

420 425 430

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

435 440 445

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

450 455 460

Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

465 470 475 480

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

485 490 495

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

500 505 510

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

515 520 525

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

530 535 540

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

545 550 555 560

Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu

565 570 575

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

580 585 590

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln

595 600 605

Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

610 615 620

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly

625 630 635 640

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

645 650 655

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

660 665 670

Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro

675 680 685

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala

690 695 700

Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly

705 710 715 720

Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys

725 730 735

Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile

740 745 750

Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu

755 760 765

Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys

770 775 780

His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly

785 790 795 800

Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly

805 810 815

Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val

820 825 830

Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp

835 840 845

Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser

850 855 860

Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His

865 870 875 880

Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile

885 890 895

Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg

900 905 910

Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp

915 920 925

<210> 31

<211> 3003

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> nt seq CAR22xCAR20

<400> 31

atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcaaga 60

ccacaggtgc agctgcagca gagcggccct ggcctggtga agccaagcca gacactgtcc 120

ctgacctgcg ccatcagcgg cgattccgtg agctccaact ccgccgcctg gaattggatc 180

aggcagtccc cttctcgggg cctggagtgg ctgggaagga catactatcg gtctaagtgg 240

tacaacgatt atgccgtgtc tgtgaagagc agaatcacaa tcaaccctga cacctccaag 300

aatcagttct ctctgcagct gaatagcgtg acaccagagg acaccgccgt gtactattgc 360

gccagggagg tgaccggcga cctggaggat gcctttgaca tctggggcca gggcacaatg 420

gtgaccgtgt ctagcggagg aggaggatcc ggaggaggag gatctggcgg cggcggcagc 480

gatatccaga tgacacagtc cccatcctct ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgaca 540

atcacctgta gggcctccca gaccatctgg tcttacctga actggtatca gcagaggccc 600

ggcaaggccc ctaatctgct gatctacgca gcaagctccc tgcagagcgg agtgccatcc 660

agattctctg gcaggggctc cggcacagac ttcaccctga ccatctctag cctgcaggcc 720

gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag tcttatagca tcccccagac atttggccag 780

ggcaccaagc tggagatcaa gaccacaacc ccagcaccaa ggccacctac acctgcacca 840

accatcgcct ctcagcccct gagcctgaga cctgaggcat gtaggccagc agcaggagga 900

gcagtccata caaggggtct ggattttgca tgcgacatct acatctgggc acctctggca 960

ggaacatgtg gcgtgctcct gctcagcctg gtcatcaccc tgtactgcaa gagaggcagg 1020

aagaagctgc tgtatatctt caagcagccc ttcatgcgcc ccgtgcagac aacccaggag 1080

gaggatggct gctcctgtag gttcccagaa gaggaggagg gaggatgtga gctgcgcgtg 1140

aagttttccc ggtctgccga cgcacctgca taccagcagg gccagaacca gctgtataac 1200

gagctgaatc tgggccggag agaggagtac gatgtgctgg acaagaggcg cggcagagat 1260

ccagagatgg gcggcaagcc ccggagaaag aaccctcagg agggcctgta caatgagctg 1320

cagaaggata agatggccga ggcctattct gagatcggca tgaagggaga gaggcgccgg 1380

ggcaagggac acgacggact gtaccaggga ctgagcacag ccaccaagga tacctatgac 1440

gccctgcata tgcaggcact gcctccaagg ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 1500

aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg ctctgcctgt caccgctctg 1560

ctgctgcccc tggctctgct gctgcacgcc gcacgccccg aagtccagct ggtcgaatct 1620

gggggcgggc tggtgcagcc aggaagatca ctgaggctga gctgcgccgc ttccggcttc 1680

accttcaacg actatgccat gcactgggtg agacaggctc ccggaaaggg cctggagtgg 1740

gtctctacca tcagttggaa ttccgggtct attggatatg ccgacagcgt gaaaggccgc 1800

ttcacaatct ctcgagataa cgctaagaaa agtctgtacc tgcagatgaa ttcactgagg 1860

gcagaggaca ctgccctgta ctattgcgcc aaggatattc agtacggcaa ctactattac 1920

gggatggacg tctgggggca gggaaccaca gtgaccgtca gctccggagg aggaggatcc 1980

ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc gagatcgtgc tgacacagag cccagccact 2040

ctgagtctgt cacccggcga acgagctaca ctgtcctgtc gggcaagcca gtccgtctct 2100

agttatctgg cttggtacca gcagaagcca ggacaggcac cacgactgct gatctacgat 2160

gctagcaaca gagcaacagg gattcctgca aggttctctg gcagtgggtc aggaactgac 2220

tttacactga ctatctcaag cctggagcct gaagatttcg ccgtgtatta ctgccagcag 2280

cggtccaatt ggccaatcac ctttggccag gggacacgcc tggagatcaa gactaccaca 2340

cctgctccac gaccacctac tccagcacct accattgctt ctcagcccct gagtctgcgg 2400

cctgaagcat gtagaccagc agcaggagga gcagtgcata ccagaggact ggactttgcc 2460

tgcgatatct atatttgggc accactggct ggaacttgtg gagtgctgct gctgtctctg 2520

gtcatcaccc tgtattgcaa gcgaggccgg aagaaactgc tgtacatttt caaacagcct 2580

tttatgagac cagtgcagac tacccaggag gaagacggct gcagctgtag gttccccgag 2640

gaagaggaag ggggatgtga gctgagggtc aagtttagcc gctccgctga tgcacctgcc 2700

tatcagcagg ggcagaatca gctgtacaac gagctgaatc tgggacggag agaggaatac 2760

gacgtgctgg ataaaaggcg aggacgagat ccagaaatgg gagggaagcc ccgacggaaa 2820

aaccctcagg agggcctgta taatgaactg cagaaggaca aaatggctga ggcatactct 2880

gaaatcggaa tgaagggcga gagaaggcgc ggaaaaggcc acgatgggct gtatcaggga 2940

ctgagtaccg ccacaaagga cacctacgat gcactgcata tgcaggccct gccaccccgg 3000

tga 3003

<210> 32

<211> 3003

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> nt seq CAR20xCAR22

<400> 32

atggctctgc ctgtcaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcacgc 60

cccgaagtcc agctggtcga atctgggggc gggctggtgc agccaggaag atcactgagg 120

ctgagctgcg ccgcttccgg cttcaccttc aacgactatg ccatgcactg ggtgagacag 180

gctcccggaa agggcctgga gtgggtctct accatcagtt ggaattccgg gtctattgga 240

tatgccgaca gcgtgaaagg ccgcttcaca atctctcgag ataacgctaa gaaaagtctg 300

tacctgcaga tgaattcact gagggcagag gacactgccc tgtactattg cgccaaggat 360

attcagtacg gcaactacta ttacgggatg gacgtctggg ggcagggaac cacagtgacc 420

gtcagctccg gaggaggagg atccggagga ggaggaagcg gaggaggagg atccgagatc 480

gtgctgacac agagcccagc cactctgagt ctgtcacccg gcgaacgagc tacactgtcc 540

tgtcgggcaa gccagtccgt ctctagttat ctggcttggt accagcagaa gccaggacag 600

gcaccacgac tgctgatcta cgatgctagc aacagagcaa cagggattcc tgcaaggttc 660

tctggcagtg ggtcaggaac tgactttaca ctgactatct caagcctgga gcctgaagat 720

ttcgccgtgt attactgcca gcagcggtcc aattggccaa tcacctttgg ccaggggaca 780

cgcctggaga tcaagactac cacacctgct ccacgaccac ctactccagc acctaccatt 840

gcttctcagc ccctgagtct gcggcctgaa gcatgtagac cagcagcagg aggagcagtg 900

cataccagag gactggactt tgcctgcgat atctatattt gggcaccact ggctggaact 960

tgtggagtgc tgctgctgtc tctggtcatc accctgtatt gcaagcgagg ccggaagaaa 1020

ctgctgtaca ttttcaaaca gccttttatg agaccagtgc agactaccca ggaggaagac 1080

ggctgcagct gtaggttccc cgaggaagag gaagggggat gtgagctgag ggtcaagttt 1140

agccgctccg ctgatgcacc tgcctatcag caggggcaga atcagctgta caacgagctg 1200

aatctgggac ggagagagga atacgacgtg ctggataaaa ggcgaggacg agatccagaa 1260

atgggaggga agccccgacg gaaaaaccct caggagggcc tgtataatga actgcagaag 1320

gacaaaatgg ctgaggcata ctctgaaatc ggaatgaagg gcgagagaag gcgcggaaaa 1380

ggccacgatg ggctgtatca gggactgagt accgccacaa aggacaccta cgatgcactg 1440

catatgcagg ccctgccacc ccgaggaagc ggagctacta acttcagcct gctgaagcag 1500

gctggagacg tggaggagaa ccctggacct atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg 1560

ccactggccc tgctgctgca cgcagcaaga ccacaggtgc agctgcagca gagcggccct 1620

ggcctggtga agccaagcca gacactgtcc ctgacctgcg ccatcagcgg cgattccgtg 1680

agctccaact ccgccgcctg gaattggatc aggcagtccc cttctcgggg cctggagtgg 1740

ctgggaagga catactatcg gtctaagtgg tacaacgatt atgccgtgtc tgtgaagagc 1800

agaatcacaa tcaaccctga cacctccaag aatcagttct ctctgcagct gaatagcgtg 1860

acaccagagg acaccgccgt gtactattgc gccagggagg tgaccggcga cctggaggat 1920

gcctttgaca tctggggcca gggcacaatg gtgaccgtgt ctagcggagg aggaggatcc 1980

ggaggaggag gatctggcgg cggcggcagc gatatccaga tgacacagtc cccatcctct 2040

ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgaca atcacctgta gggcctccca gaccatctgg 2100

tcttacctga actggtatca gcagaggccc ggcaaggccc ctaatctgct gatctacgca 2160

gcaagctccc tgcagagcgg agtgccatcc agattctctg gcaggggctc cggcacagac 2220

ttcaccctga ccatctctag cctgcaggcc gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag 2280

tcttatagca tcccccagac atttggccag ggcaccaagc tggagatcaa gaccacaacc 2340

ccagcaccaa ggccacctac acctgcacca accatcgcct ctcagcccct gagcctgaga 2400

cctgaggcat gtaggccagc agcaggagga gcagtccata caaggggtct ggattttgca 2460

tgcgacatct acatctgggc acctctggca ggaacatgtg gcgtgctcct gctcagcctg 2520

gtcatcaccc tgtactgcaa gagaggcagg aagaagctgc tgtatatctt caagcagccc 2580

ttcatgcgcc ccgtgcagac aacccaggag gaggatggct gctcctgtag gttcccagaa 2640

gaggaggagg gaggatgtga gctgcgcgtg aagttttccc ggtctgccga cgcacctgca 2700

taccagcagg gccagaacca gctgtataac gagctgaatc tgggccggag agaggagtac 2760

gatgtgctgg acaagaggcg cggcagagat ccagagatgg gcggcaagcc ccggagaaag 2820

aaccctcagg agggcctgta caatgagctg cagaaggata agatggccga ggcctattct 2880

gagatcggca tgaagggaga gaggcgccgg ggcaagggac acgacggact gtaccaggga 2940

ctgagcacag ccaccaagga tacctatgac gccctgcata tgcaggcact gcctccaagg 3000

tga 3003

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> TRAC_T01-target

<400> 33

ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CD52_T01-target

<400> 34

ttcctcctac tcaccatcag cctcctggtt atggtacagg taagagcaa 49

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CD22_T01 target

<400> 35

tctggttttc ttccagatcc tcccaagaag gtgaccacag tgattcaaa 49

<210> 36

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CD20_T01 target

<400> 36

tttgctgcca tttctggaat gattctttca atcatggaca tacttaata 49

<210> 37

<211> 588

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> IRES

<400> 37

gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60

gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120

ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180

gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540

gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaacc 588

<210> 38

<211> 21

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> T2A peptide

<400> 38

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 39

<211> 23

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> E2A peptide

<400> 39

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 40

<211> 25

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> F2A peptide

<400> 40

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 H-CDR1

<400> 41

Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala

1 5 10

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 H-CDR2

<400> 42

Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn

1 5

<210> 43

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 H-CDR3

<400> 43

Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

1 5 10

<210> 44

<211> 6

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 L-CDR1

<400> 44

Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

1 5

<210> 45

<211> 3

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 L-CDR2

<400> 45

Ala Ala Ser

1

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR22 L-CDR3

<400> 46

Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 H-CDR1

<400> 47

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 H-CDR2

<400> 48

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 H-CDR3

<400> 49

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 50

<211> 6

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 L-CDR1

<400> 50

Gln Ser Val Ser Ser Tyr

1 5

<210> 51

<211> 3

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 L-CDR2

<400> 51

Asp Ala Ser

1

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CAR20 L-CDR3

<400> 52

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генетически сконструированной Т-клетке, экспрессирующей на своей поверхности химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный в отношении CD22 (CAR22), и химерный антигенный рецептор, специфичный в отношении CD20 (CAR20), способу ее получения, а также к фармацевтической композиции, ее содержащей. Также раскрыты выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, а также вектор, его содержащий. Изобретение эффективно для лечения рака, связанного с экспрессией CD22, для лечения рака, связанного с экспрессией CD20, а также для лечения рака, связанного с экспрессией CD20 и CD22. 10 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 табл., 9 пр.

1. Генетически сконструированная Т-клетка, экспрессирующая на своей поверхности химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный в отношении CD22 (CAR22), и химерный антигенный рецептор, специфичный в отношении CD20 (CAR20),

а) где указанный CAR22 включает:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную легкую цепь (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD3дзета; и

б) где указанный CAR20 включает:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную легкую цепь (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD3дзета;

где указанный CAR22 и указанный CAR20 кодируются экзогенной нуклеиновой кислотой, встроенной в геном указанной Т-клетки; причем указанная экзогенная нуклеиновая кислота в направлении от 5' к 3' содержит:

(i) промотор,

(ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR20,

(iii) нуклеиновую кислоту, кодирующую саморасщепляющийся пептид;

(iv) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный CAR22,

причем один и тот же промотор контролирует экспрессию указанных CAR20 и CAR22.

2. Генетически сконструированная Т-клетка по п. 1, в которой указанный CAR22 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и указанный CAR20 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

3. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из пп. 1 и 2, в которой указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 32.

4. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из пп. 1-3, где указанная сконструированная Т-клетка представляет собой Т-клетку, которая является TCR-отрицательной.

5. Генетически сконструированная Т-клетка по п. 4, причем указанная сконструированная Т-клетка содержит по меньшей мере один аллель, кодирующий TCR альфа, TCR бета и/или CD3, инактивированный мутацией.

6. Генетически сконструированная Т-клетка по любому из пп. 4, 5, причем указанная сконструированная Т-клетка содержит по меньшей мере один аллель, выбранный из β2m, PD1, CTLA4, dCK, CD52 и/или GR, который был инактивирован.

7. Фармацевтическая композиция для лечения рака, связанного с экспрессией CD20 и CD22, содержащая сконструированные Т-клетки по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

8. Фармацевтическая композиция для лечения рака, связанного с экспрессией CD20, содержащая сконструированные Т-клетки по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

9. Фармацевтическая композиция для лечения рака, связанного с экспрессией CD22, содержащая сконструированные Т-клетки по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

10. Выделенный полинуклеотид, кодирующий CAR20 и CAR22, который содержит:

а) промотор, который контролирует экспрессию CAR20, за которым следует нуклеиновая кислота, кодирующая указанный CAR20, где указанный CAR20 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD20, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную легкую цепь (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD3дзета;

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR22, где указанный CAR22 содержит:

i) по меньшей мере один внеклеточный домен, содержащий:

- антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении CD22, содержащий вариабельную тяжелую цепь (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную легкую цепь (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, а также необязательно лидерную последовательность,

- шарнирный домен из CD8альфа,

ii) трансмембранный домен из CD8альфа, и

iii) внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен 4-1ВВ и сигнальный домен CD3дзета;

причем указанные нуклеиновые кислоты а) и б) находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая саморасщепляющийся пептид, расположена между указанными нуклеиновыми кислотами а) и б).

11. Выделенный полинуклеотид по п. 10, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 32.

12. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по любому из пп. 10, 11.

13. Способ получения сконструированной Т-клетки по любому из пп. 1-6, включающий введение в Т-клетку полинуклеотида по любому из пп. 10-11 или вектора по п. 12.

14. Применение сконструированной Т-клетки по любому из пп. 1-6 для лечения рака, связанного с экспрессией CD20 и CD22.

15. Применение сконструированной Т-клетки по любому из пп. 1-6 для лечения рака, связанного с экспрессией CD20.

16. Применение сконструированной Т- клетки по любому из пп. 1-6 для лечения рака, связанного с экспрессией CD22.

17. Применение сконструированной Т-клетки по любому из пп. 14-16, где указанный рак выбран из группы, состоящей из лимфомы, лимфомы Ходжкина (ЛХ), неходжкинской лимфомы (НХЛ), лейкоза, множественной миеломы (ММ), В-хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ), волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), острого лимфоцитарного рака, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).

название	год	авторы	номер документа
CD20 ТЕРАПИЯ, CD22 ТЕРАПИЯ И КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ КЛЕТКАМИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР (CAR) K CD19	2016	Биттер Ханс Бордо Дженнифер Мэри Браннетти Барбара Брогдон Дженнифер Дакаппагари Навин Кумар Джилл Саар Хайфилл Стивен Хуан Лу Джун Карл Х. Ким Дзу Йоунг Лэй Мин Ли На Лоэв Андреас Орландо Елена Руелла Марко Трэн Таи Чжан Цзиминь Чжоу Ли	RU2752918C2
ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА	2017	Браннетти, Барбара Брогдон, Дженнифер Энгельс, Борис Гранда, Брайан Хуан, Лу Лэй, Мин Ли, На Чжан, Цзиминь Гимарэс, Карла Джилл, Саар Руэлла, Марко Янг, Регина М.	RU2826270C2
КЛЕТКА	2015	Пюле Мартен Кордоба Шон Онуоха Симоби Томас Саймон	RU2768019C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИММУНОТЕРАПИИ ПРОТИВ CD20	2017	Пресс Оливер Тилл Брайан	RU2782699C2
НОВЫЕ КОНСТРУКЦИИ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ TNFR2	2019	Абель, Тобиас Фенар, Давид Гертнер-Дарденн, Жюли Майер, Франсуа	RU2808254C2
БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С NKG2D, CD16 И С ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ АНТИГЕНОМ	2018	Чан, Грегори, П. Чеунг, Энн, Ф. Хани, Уилльям Лунде, Брэдли, М. Принц, Бьянка	RU2826991C2
ИММУННЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ОБРАТНЫЙ УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР, ДЛЯ НАЦЕЛИВАНИЯ НА РАЗЛИЧНЫЕ МНОГОЧИСЛЕННЫЕ АНТИГЕНЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ИНФЕКЦИЙ И АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ	2019	Бахманн, Михаэль	RU2824391C2
Выделенный альтернативный внутриклеточный сигнальный домен химерного антигенного рецептора и включающий его химерный антигенный рецептор	2019	Гершович Павел Михайлович Карабельский Александр Владимирович Улитин Андрей Борисович Мадера Дмитрий Александрович Иванов Роман Алексеевич Морозов Дмитрий Валентинович	RU2742000C2
ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА FLT3	2018	Сасу, Барбра Джонсон Деттлинг, Даниэль Элизабет Соммер, Сесар Адольфо Йеунг, Йик Энди Хамзе, Мустафа Марк	RU2820859C2
ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ M971	2018	Орентас Римас Дж. Пастан, Ира, Х. Димитров Димитер С. Макколл Кристал Л.	RU2770411C1

HE HUANG, MD, A Study of CD20/CD22 Targeted CAR T-cell Therapy for Relapsed or Refractory Lymphoid Malignancies, ClinicalTrials.gov ID: NCT04283006, 20.02.2020
WO 2018067992 A1, 12.04.2018
US 8591889 B2, 26.11.2013
WO 2018178377 A1, 04.10.2018
ШТЫРОВ Е
М
и др., CAR T-клеточная терапия как современный метод лечения онкологических

Т-КЛЕТКИ С ДВУМЯ ХИМЕРНЫМИ АНТИГЕННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ CAR Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 C07K14/725 C12N5/783 A61K40/11 A61K40/31 A61K40/42 A61P35/00 A61P35/02

Описание патента на изобретение RU2839662C1

Похожие патенты RU2839662C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 839 662 C1

Реферат патента 2025 года Т-КЛЕТКИ С ДВУМЯ ХИМЕРНЫМИ АНТИГЕННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ CAR

Формула изобретения RU 2 839 662 C1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2025 года RU2839662C1

RU 2 839 662 C1