Штаммы Staphylococcus aureus, характеризующиеся устойчивостью к ванкомицину и используемые в качестве контрольных тест-культур для определения чувствительности к гликопептидным антибиотикам Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/445 

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Гликопептиды являются основой для лечения инфекций, вызываемых MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus). Для достоверной оценки чувствительности к ванкомицину используется количественное определение МПК и для выявления гетерорезистентности применяется популяционный анализ (РАР). В этой связи необходимо наличие контрольных референс-штаммов с верифицированными механизмами устойчивости и известным уровнем МПК к гликопептидам. Штаммы Staphylococcus aureus SA0077 van и S. aureus A van/40 характеризуются устойчивостью и гетерорезистентностью к ванкомицину. Лабораторные штаммы получены в ходе селекции in vitro в течение 40 пассажей на возрастающих концентрациях ванкомицина. После селекции in vitro была сформирована гетерорезистентность к ванкомицину. Фенотипы детерминированы разным набором мутаций в генах биосинтеза клеточной стенки. Штаммы могут быть использованы в качестве тест-культур для оценки чувствительности к гликопептидным антибиотикам или как референс-штаммы для постановки РАР анализа; для поиска новых мишеней в клетке с целью разработки новых потенциальных антибактериальных препаратов; для тестирования новых потенциальных антимикробных соединений

Устойчивость к антибиотикам является одной из наиболее серьезных проблем современной медицины. В XXI веке отмечено явное ускорения формирования и распространения новых механизмов резистентности. Все сложнее поддаются лечению заболевания, которые вызываются группой нозокомиальных патогенов «ESKAPE», в которую также входит и Staphylococcus aureus. Сложность терапии таких инфекций заключается в растущей устойчивости к антибактериальным препаратам, высокими рисками неблагоприятных исходов, включая летальность, а также значительные финансовые затраты на лечение пациентов. Важнейший фенотип среди золотистых стафилококков - метициллинрезистентные стафилококки (MRSA, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), проявляющие устойчивость ко всей группе бета-лактамных антибиотиков. На сегодняшний день MRSA являются одной из ведущих причин внутрибольничных инфекций, внебольничных инфекций. Гликопептиды являются основой для лечения инфекций, вызываемых MRSA и до конца 1980-х годов оставались единственными эффективными антибиотиками в отношении данного патогена. В середине 1990-х были впервые описаны клинические изоляты с низким уровнем устойчивости к ванкомицину, позже, вначале 2000-х описаны ванкомицин-резистентные стафилококки. По результатам метаанализа [1], включающего анализ 155 публикаций со всех континентов и охватывающих более 75 000 изолятов за 20 летний период показал, что частота выделения VISA (Vancomycin intermediate S. aureus) изолятов составляла более 6,3%, a VRSA (Vancomycin resistant S. aureus) - 1,5%. Отмечается и увеличение количества частоты встречаемости VISA за последние десять лет. Механизм формирования VISA достаточно сложный и связан с накоплением мутаций в генах, ответственных за биосинтез клеточной стенки. Снижение чувствительности к гликопептидам также связано с феноменом гетерорезистентности [2]. По мере развития методов лабораторной диагностики и совершенствования подходов для определения чувствительности бактерий к антибиотикам стало понятно, что использование диско-диффузионного метода (ДДМ) неприемлемо для детекции устойчивости к гликопептидам у стафилококков. На сегодняшний день ДДМ не рекомендуется для оценки чувствительности к ванкомицину у S. aureus, это связано с выявлением ложной чувствительности или устойчивости. Для достоверной оценки чувствительности к ванкомицину необходимо количественное определение МПК, а «золотым стандартом» выявления гетерорезистентности является популяционный анализ (РАР). Количественная оценка (определение МПК) важна для адекватного назначения ванкомицина, так как уровень МПК=2 мкг/мл часто ассоциирован с неблагоприятными исходами. В этой связи важным является наличие контрольных референс-штаммов с верифицированными механизмами устойчивости и известным уровнем МПК к гликопептидам. Проведенный патентный поиск в Российских базах данных показал, что отсутствуют аналоги штаммов с устойчивостью к ванкомицину для целей определения чувствительности к антибиотикам или как модельных микроорганизмов для поиска мишеней для разработки новых антибиотиков. Наиболее известные эталонные штаммы с устойчивостью к ванкомицину из Американской коллекции типовых культур (АТСС, American Type Culture Collection) представлены двумя вариантами, это штамм Mu50 (АТСС700699) и Mu3 (АТСС700698), имеющими уровень МПК ванкомицина 4-8 мкг/мл. Однако, данные штаммы были выделены достаточно давно в середине 1990-х годов [3] и при сравнении с полученными штаммами в настоящем изобретении, характеризуются меньшим уровнем гетерорезистентности, отличаются по генотипам (практически не циркулируют на территории РФ), а также характеризуются не стабильным фенотипом (необходимость культивирования в присутствии ванкомицина). В целом стоит отметить, что работ по in vitro селекции устойчивости к ванкомицину достаточно много, однако штаммы полученные в данных работах не доступны (отсутствуют в публичных депозиториях) или не полностью охарактеризованы механизмы устойчивости. В работе Meehl et al [4] используя генно-инженерные подходы были получены разные штаммы варианта Mu50 с устойчивостью к ванкомицину. В данном исследовании экспериментально была подтверждена роль мутаций в системах GraSR, VraFG в формировании устойчивости к ванкомицину. Одной из слабых сторон данного исследования является, то что использовался один модельный штамм Mu50. Помимо этого, отсутствуют данные полногеномного секвенирования. Не исключено, что входе генетических манипуляций могли возникнуть компенсаторные вторичные мутации. В работе [5] удалось получить высокий уровень устойчивости при селекции in vitro при одновременном воздействии ванкомицина и метансульфоната, при этом МПК ванкомицина возрастало до 32 мкг/мл. Авторы использовали разные клинические изоляты. По результатам геномного секвенирования были выявлены различные мутации в разных генах, кодирующих белки разных систем бактериальной клетки: graS, ausA, rpoB, rpoC, walK и другие. Главное отличие данной работы это использование двойного воздействия мутирующих факторов: антибиотик плюс химический агент.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Задачей изобретения является получение ванкомицин-устойчивых штаммов S. aureus с различными мутациями в геноме, для использования в качестве контрольных тест-культур в методах определения чувствительности к антибиотикам.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении штаммов S. aureus с мутациями в геноме, опосредующими устойчивость к ванкомицину.

Указанный результат достигается путем in vitro селекции штаммов на возрастающих концентрациях ванкомицина в среде до достижения устойчивости и увеличение показателя МПК до 4-8 мкг/мл. Оценка устойчивости осуществляется методом серийных разведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) и популяционного анализ (РАР). Верификация геномных изменений осуществляется посредством полногеномного секвенирования устойчивых штаммов, полученных после селекции.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Происхождение штаммов и селекция устойчивости in vitro

Штаммы S. aureus SA0077 van и S. aureus A van/40 после инкубации при 37°C в аэробной атмосфере формируют ровные круглые колонии желтоватого цвета с неярко выраженным гемолизом на колумбийском агаре с 5% бараньей кровью (BioMedia, Россия). Морфологические, культуральные свойства типичны для вида S. aureus. Штамм SA0077 van является производным от клинического штамма SA0077. Штамм SA0077 был выделен от пациента со стафилококковой инфекцией в 2011 г. в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва и характеризовался чувствительностью к ванкомицину (МПК<2 мкг/мл). Штамм S. aureus A van/40 является производным от штамма АТСС29213 с изначальной чувствительностью к ванкомицину. Для получения резистентных фенотипов для обоих штаммов была проведена селекция устойчивости in vitro по следующей схеме.

Селекцию проводили в 2 мл сердечно-мозгового бульона (bioMerieux, Франция) содержащего ванкомицин (Molekula, Англия), со стартовым клеточным инокулюмом 10⁹ КОЕ/мл. На первом этапе делали ряд разведений антибиотика с концентрацией от 1 до 8 мкг/мл и добавляли приготовленный инокулюм, культивировали в термостате при 37°С до появления роста (в среднем 48 часов) хотя бы в одной из концентраций. Полученную суспензию использовали для пересева на среды с увеличенной концентрацией ванкомицина. Всего осуществлено 40 пассажей со ступенчатым увеличением концентраций антибиотика от 1 до 64 мкг/мл. Во время селекции проводили контроль изменения МПК с использованием серийных разведений, РАР-анализ, а также геномное секвенирование.

Верификация механизмов резистентности

Механизмы устойчивости верифицированы методами полногеномного секвенирования. Проведен анализ всех мутационных событий, за мутационное событие принимали изменение нуклеотидной последовательности, приводящее к появлению миссенс или нонсенс мутаций, делеций, инсерций. Синонимичные мутации не анализировались. Предварительно для всех полученных ридов было проведено удаление адаптерных последовательностей, и фильтрация низкокачественных прочтений с использованием программ FastQC, trimmomatic. Геномы исходных штаммов (до селекции) были собраны de novo, с использованием SPAdes. Выравнивание на референс-геном осуществлялось с помощью программ: bowtie2 2.2.6, Пакет R 3.4.4 и breseq 0.33.1. Алгоритм анализа включал следующие этапы. На полученные сборки исходных геномов выравнивали риды этих же геномов, при этом все выявленные мутации и нуклеотидные гетеро - позиции отмечались как «ложные» и исключались из дальнейшего анализа при сравнении с мутантами, для предотвращения интерпретации ложноположительных мутаций. Помимо этого, из анализа были исключены все мобильные генетические элементы, профаговые области, адгезины, поверхностные белки вирулентности и протяженные нуклеотидные гомополимерные области, вследствие высокой скорости накопления неспецифических мутаций в этих локусах. Для выявления генетических изменений, риды штаммов после 5, 20 и 40 пассажей, выравнивали на контиги контрольных геномов. Проводили аннотацию генетических изменений с помощью программы breseq в режиме mixed allele model. Коррекцию аннотаций, а также оценку гипотетических белков проводили с помощью NCBI protein BLAST и UniProt при этом использовали референс - геном S. aureus COL (GenBank: СР000046.1). Для детальной подтверждающей оценки гетеро-мутаций использовали визуальную оценку данных bam - файлов в программе Unipro Ugene.

Фенотипические характеристики

Штамм S. aureus SA0077 van - характеризуется MRSA фенотипом, проявляет устойчивость к ванкомицину и тейкопланину (МПК ванкомицина 8 мкг/мл, при 10 пересевах на средах без антибиотиков МПК снижается до 4 мкг/мл). Проявляет умеренную устойчивость к даптомицину (МПК=2 мкг/мл) и липогликопептидам (оритаванцину, далбаванцину, телаванцину). Устойчивость к бета-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам, макролидам, линкозамидам. Сохраняет чувствительность к оксазолидинонам, рифампицину, тетрациклину, тигециклину, триметоприму/сульфаметоксазолу, фузидиевой кислоте и мупироцину. Скорость роста снижена по сравнению с оригинальным штаммом, время деления клеток на среде с сердечно-мозговой вытяжкой составляет 40 (±7%) минут (у штамма до селекции - 26 минут). Характеризуется морфологической диссоциацией, при посеве на кровяной агар формирует мелкие и крупные колонии.

Штамм S. aureus A van/40 - получен от исходного штамма АТСС29213, фенотип чувствительности к антибиотикам, за исключением гликопептидов, соответствует фенотипу штамма АТСС29213. Проявляет устойчивость к ванкомицину (МПК - 4 мкг/мл) и тейкопланину (МПК - 4 мкг/мл). Проявляет умеренную устойчивость к даптомицину (МПК=2 мкг/мл) и липогликопептидам (оритаванцину, далбаванцину, телаванцину). При 10 пересевах на средах без антибиотиков МПК гликопептидов снижается до 2 мкг/мл. Скорость роста после селекции незначительно снижена по сравнению с оригинальным штаммом.

Генотипические характеристики:

Штамм S. aureus SA0077 van. Генотип ST8-t008-SCCmec IVc. Размер хромосомы 2,8 Mb, плазмидные элементы общей протяженностью не более 60 Kb, GC состав - 32,7%.

Мутации в генах биосинтеза клеточной стенки и регуляторных элементах являются основными маркерами устойчивости к ванкомицину (Таблица 1).

Штамм S. aureus A van/40. Генотип ST5 полностью соответствует эталонному исходному штамму АТСС29213 за исключением элиминации blaZ+плазмиды и наличия мутаций после селекции in vitro. Мутации, ассоциированные с гетерорезистентностью к ванкомицину, выявлены в генах биосинтеза клеточной стенки и регуляторных элементах (Таблица 2).

Условия хранения штаммов

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет. После хранения культура образует однотипные колонии.

После селекции и верификации механизмов резистентности штаммы были депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) с присвоением следующих регистрационных номеров. Штамм метициллинрезистентного Staphylococcus aureus SA0077 van депонирован под регистрационным номером В-9989, штамм Staphylococcus aureus A van/40 депонирован под регистрационным номером В-9984

Примеры использования в качестве контрольных штаммов при постановке чувствительности к антибиотикам.

Пример 1.

Антибиотикочувствительность оценивали методом серийных микроразведений с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в бульоне Cation-Adjusted Mueller Hinton (САМИ) II Broth («Becton Dickinson», США) в соответствие с протоколами CLSI от 2021 и EUCAST (версия 2021). Была использована субстанция ванкомицина («Molekula», Англия). Постановку опыта проводили в 96 луночных планшетах (НПО «Медполимер», Санкт-Петербург). В качестве контрольных культур были использованы: S. aureus АТСС 29213 (чувствительный штамм), S. aureus SA0077 van и S. aureus A van/40 (устойчивые штаммы). Контроли использовались в каждой серии постановок, и в общей сложности было проведено не менее 10 измерений на каждый контрольный штамм. Постановка серийных разведений осуществлялась в соответствие с ISO 20776-1-2010. При обработке данных на платформе WHONET ver 5.6. рассчитывали следующие параметры: распределение и диапазон МПК, МПК50, МПК90, средняя геометрическая МПК (МПК_СГ), количество и процент чувствительных изолятов (S), устойчивых (R), с промежуточной чувствительностью (I). В качестве тестовых изолятов были выбраны клинические изоляты MRSA (n=256) из коллекции бактериальных культур ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России. В Таблице 3 представлены результаты исследования.

Таким образом, штаммы SA0077 van и A van/40 характеризуются стабильной устойчивостью к ванкомицину и могут быть использованы в качестве контрольных при оценке чувствительности к антибиотикам методом серийных разведений.

Пример 2.

Постановка градиентных диффузионных тестов. В работу были включены 10 клинических изолятов MRSA с разной чувствительностью к ванкомицину, определенные методом серийных разведений (МПК=0,5-2 мкг/мл). Штаммы SA0077 van и A van/40 использовались как контрольные (контроль резистентности). Использовали градиентные диффузионные тесты с ванкомицином (VA, M.I.C.EVALUATORS®, Oxoid, Англия) и даптомицином (DPC, ETEST®, bioMerieux, Франция) в соответствие с инструкциями производителей. Полоска градиентного диффузионного теста состоит из стандартного градиента концентрации антибиотика, который используется для определения МПК (мкг/мл). Использовали агар Мюллера-Хинтона (БиоРад, США).

Постановка диффузионного теста осуществлялась в соответствии ISO 20776-1-2010. Тестируемые изоляты характеризовались МПК ванкомицина 1-2 мкг/мл, МПК даптомицина 0,25-1 мкг/мл; контрольный штамм АТСС29213 имел МПК ванкомицина 0,5 мкг/мл, МПК даптомицина 0,064 мкг/мл (рис. 1А); тест-штамм А van/40 имел МПК ванкомицина - 4 мкг/мл, МПК даптомицина - 0,25 мкг/мл (рис. 1В); тест-штамм SA0077 van имел МПК ванкомицина - 4 мкг/мл, даптомицина - 0,75 мкг/мл (рис. 1С). Фиг. 1 Пример учета результатов градиентных диффузионных тестов: А - чувствительный контрольный штамм АТСС29213; В - контрольный штамм A van/40; С - контрольный штамм SA0077 van. Обозначения тестов градиентных диффузионных тестов: VA - ванкомицин, DPC - даптомицин.

Таким образом, штаммы SA0077 van и A van/40 характеризуются устойчивостью к ванкомицину и могут быть использованы в качестве контрольных при оценке чувствительности к антибиотикам с использованием градиентных диффузионных тестов.

Пример 3.

Популяционный анализ (Population analysis profile, РАР) проводили в микро-варианте по методике [6] на агаре BHI (Bio-Rad, Франция). Использовали ряд разведений ванкомицина от 0 до 16 мкг/мл (9 разведений). Использовали стартовую взвесь микроорганизмов с плотностью 2,5 по шкале мутности McFarland. Учет результатов проводили в течение 24-72 часов. Оценивали следующие параметры - зависимость роста клеточной биомассы (КОЕ/мл) от концентрации ванкомицина и площадь под кривой (Area under curve, AUC). Параметр AUC рассчитывали методом трапеций. Для предсказания фенотипа VISA рассчитывали соотношение PAP/AUC относительно референсного штамма Ми50 по формуле: AUC (тестируемый штамм) / AUC (референсный штамм). Интерпретацию результатов осуществляли исходя из следующих критериев: при получении PAP/AUC<0,9 - оценивали как VSSA (vancomycin susceptible S. aureus) фенотип, при PAP/AUC>0,9 - оценивали как VISA или гетерорезистентный фенотип (vancomycin intermediate S. aureus). Для опыта были взяты пять бактериальных культур - три контрольных штамма (SA0077 van, A van/40 и Mu50) и два клинических штамма MRSA с МПК к ванкомицину 2 мкг/мл. Для клинических изолятов MRSA соотношение PAP/AUC составляло 0,55 (AUC=62) и 0,45 (AUC=50) соответственно, что оценивается как отсутствие гетерорезистентности (PAP/AUC<0,9). Контрольные штаммы SA0077 van и А van/40 имели соотношение PAP/AUC 1,3 (AUC=143) и 1,13 (AUC=127), соответственно. Полученные значения свидетельствуют о наличие гетерорезистентности. Значение параметра AUC для штамма Mu50 составляло 112. Графики РАР-анализа представлены на Фиг. 2. Результаты РАР-анализа. Контрольные штаммы SA0077 van и A van/40 имеют более выраженную площадь (AUC) по сравнению с референс-культурой Mu50.

Таким образом, штаммы SA0077 van и A van/40 характеризуются гетерорезистентностью к ванкомицину, имеют соотношение PAP/AUC более 0,9 относительно референс-культуры Mu50 и могут быть использованы в качестве контрольных при постановки РАР-анализа для выявления гетерорезистентности к ванкомицину.

Штаммы Staphylococcus aureus (SA0077 van и A van/40), характеризующиеся устойчивостью к ванкомицину могут быть использованы в качестве тест-культур для оценки чувствительности к гликопептидным антибиотикам; для поиска новых мишеней в клетке с целью разработки новых антибактериальных препаратов; для тестирования новых потенциальных антимикробных соединений.

Получение штаммов, их фенотипическая и генотипическая характеристика выполнялись в рамках выполнения проектов Российского Научного Фонда (проекты 18-75-10114 и 18-75-10114-П).

Литература

1. Shariati A., Dadashi М., Moghadam М. Т. et al. Global prevalence and distribution of vancomycin resistant, vancomycin intermediate and heterogeneously vancomycin intermediate Staphylococcus aureus clinical isolates: a systematic review and meta-analysis // Sci Rep. 2020. T. 10. №1. C. 12689. doi 10.1038/s41598-020-69058-z

2. Hiramatsu K., Kayayama Y., Matsuo M. et al. Vancomycin-intermediate resistance in Staphylococcus aureus // J Glob Antimicrob Resist. 2014. T. 2. №4. C. 213-224. doi 10.1016/j.jgar.2014.04.006

3. Hiramatsu K., Aritaka N., Hanaki H. et al. Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin // Lancet. 1997. T. 350. №9092. C. 1670-3. doi 10.1016/S0140-6736(97)07324-8

4. Meehl M., Herbert S., Gotz F., Cheung A. Interaction of the GraRS two-component system with the VraFG ABC transporter to support vancomycin-intermediate resistance in Staphylococcus aureus // Antimicrob Agents Chemother. 2007. T. 51. №8. C. 2679-89. doi 10.1128/AAC.00209-07

5. Ishii K., Tabuchi F., Matsuo M. et al. Phenotypic and genomic comparisons of highly vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strains developed from multiple clinical MRSA strains by in vitro mutagenesis // Sci Rep.2015. T. 5. C. 17092. doi 10.1038/srepl7092

6. Wootton M., Howe R. A., Hillman R. et al. A modified population analysis profile (PAP) method to detect hetero-resistance to vancomycin in Staphylococcus aureus in a UK hospital // J Antimicrob Chemother. 2001. T. 47. №4. C. 399-403. doi 10.1093/jac/47.4.399.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм метициллинрезистентного Staphylococcus aureus SA0077 van, имеющий мутации в генах биосинтеза клеточной стенки, опосредующие устойчивость к ванкомицину. Указанный штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9989. Также предложен штамм Staphylococcus aureus A van/40, характеризующийся устойчивостью к ванкомицину за счет мутаций в генах биосинтеза клеточной стенки, регуляторных элементах. Указанный штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9984. Штаммы могут быть использованы в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к гликопептидным антибиотикам. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Штамм метициллинрезистентного Staphylococcus aureus SA0077 van, имеющий мутации в генах биосинтеза клеточной стенки, опосредующие устойчивость к ванкомицину, и использующийся в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к гликопептидным антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9989.

2. Штамм Staphylococcus aureus A van/40, характеризующийся устойчивостью к ванкомицину за счет мутаций в генах биосинтеза клеточной стенки, регуляторных элементах и используемый в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к гликопептидным антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9984.