Штамм Staphylococcus aureus, характеризующийся устойчивостью к даптомицину и используемый в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к антибиотикам Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/445 

Штаммы Staphylococcus aureus, характеризующиеся устойчивостью к даптомицину и используемые в качестве контрольных тест-культур для определения чувствительности к антибиотикам

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Основой лечения инфекций, вызванных MRSA, являются антибиотики из классов гликопептидов (ванкомицин), липопептидов (даптомицин), оксазолидинонов (линезолид). На сегодняшний день диско-диффузионный метод (ДДМ) не рекомендуется для оценки чувствительности к даптомицину у S. aureus. Для достоверной оценки чувствительности необходимо количественное определение МПК. В этой связи важным является наличие контрольных референс-штаммов с верифицированными механизмами устойчивости и известным уровнем МПК к даптомицину. Штаммы SA0077 dap и A dap/40 получены при селекции in vitro на увеличивающихся концентрациях даптомицина и характеризуются мутациями в генах биосинтеза мембранных фосфолипидов, а также в генах метаболизма глицерола. Штаммы имеют высокий уровень устойчивости к даптомицину (МПК≥64 мкг/мл) и могут быть использованы в качестве тест-культур для оценки чувствительности к даптомицину, а также препаратов, действующих на цитоплазматическую мембрану, противомикробных пептидов; для поиска новых мишеней в клетке с целью разработки новых потенциальных антимикробных соединений

Метициллин-резистентные золотистые стафилококки (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) являются важнейшими патогенами человека, характеризуются множественной устойчивостью к антибиотикам различных групп и рассматриваются как одна из угроз мировому здравоохранению. Основой лечения инфекций, вызванных MRSA, являются антибиотики из классов гликопептидов (ванкомицин), липопептидов (даптомицин), оксазолидинонов (линезолид). Даптомицин - препарат, разрешенный для клинического использования в 2003 году, однако уже через год в США были описаны первые устойчивые изоляты стафилококков и энтерококков [1]. Мишень действия этого антибиотика - цитоплазматическая мембрана грамположительных бактерий. Даптомицин способствует образованию каналов в цитоплазматической мембране. Устойчивость к даптомицину встречается редко и описаны единичные случаи у MRSA. Механизм устойчивости к даптомицину связан с мутациями в гене mprF, участвующего в формировании мембран. Мутации в фосфотидиотрансферазе (pgsA) и кардиолипин - синтазе (cls2) способствуют снижению количества фосфатидилглицерола, что также приводит к устойчивости. Помимо этого устойчивость связана с другими маркерами - мутациями в генах кодирующих белки биосинтеза клеточной стенки (walK, walR, rpoB, rpoC). Часто наблюдается перекрестная устойчивость между ванкомицином и даптомицином [2].

На сегодняшний день диско-диффузионный метод (ДДМ) не рекомендуется для оценки чувствительности к даптомицину у S. aureus. Для достоверной оценки чувствительности необходимо количественное определение МПК. В этой связи важным является наличие контрольных референс-штаммов с верифицированными механизмами устойчивости и известным уровнем МПК к даптомицину. Также стоит отметить, что в последние несколько лет разрабатываются новые антибактериальные препараты на основе катионных противомикробных пептидов млекопитающих (Cationic Antimicrobial Peptides, CAMPs) [3, 4]. Механизм действия данных соединений схож с механизмом действия даптомицина, это нарушение целостности клеточной мембраны. Для возможной модификации новых соединений, их тестирования необходимы контрольные штаммы, проявляющие устойчивость к даптомицину с верифицированными механизмами резистентности.

Проведенный патентный поиск в Российских базах данных показал, что отсутствуют аналоги штаммов с устойчивостью к даптомицину для целей определения чувствительности к антибиотикам или как модельных микроорганизмов для поиска мишеней для разработки новых антибиотиков. В Американской коллекции типовых культур (АТСС, American Type Culture Collection) также отсутствует информация об аналогичных штаммах. В настоящее время опубликовано достаточно много экспериментальных работ по in vitro селекции устойчивости к даптомицину, однако штаммы, полученные в данных работах либо не доступны (отсутствуют в публичных депозиториях), либо не полностью охарактеризованы механизмы устойчивости. Полученные в настоящем изобретении штаммы характеризуются уникальными комбинациями мутаций и генетических изменений, которые ранее не описывались в экспериментальных работах. В работе Sulaiman et al [5] были получены даптомицин-устойчивые штаммы стафилококков в процессе селекции in vitro. Преимущественно штаммы характеризовались различными мутациями в гене mprF, при этом уровень МПК к даптомицину возрастал в 3-4 раза. В данной работе авторы подвергали культуры S. aureus кратковременным (3-6 часов) воздействием даптомицина в течение семи дней, то есть использовали совершенно иную эволюционную модель. Это является принципиальным отличием данной работы от предлагаемого изобретения. Во-вторых, авторы добились незначительного роста МПК (3-4 раза), в предлагаемом изобретении было достигнуто увеличение МПК даптомицина у штаммов в 64-128 раз. В работе [6] были получены даптомицин-резистентные штаммы, главной особенностью исследования являлось то, что штаммы формировали устойчивость на фоне терапии антибиотиком (то есть наблюдение эволюции in vivo). Выделенные клинические изоляты характеризовались наличием мутаций в mprF и были ассоциированы с формированием гетерорезистентности к ванкомицину. Уровень МПК у таких штаммов составлял 2-4 мкг/мл. Как и с предыдущим примером, увеличение МПК в данной работе было незначительным, а мутации в основном выявлены в гене mprF. В работе [7] использовались различные генно-инженерные подходы для получения устойчивости к даптомицину, в частности изменения уровня экспрессии и различные мутации в гене mprF. Главный результат, который получили авторы, мутации в mprF и изменение его экспрессии связаны с устойчивостью непосредственно к даптомицину. При этом не исследовались другие возможные мутации и изменения в геноме. Таким образом, предлагаемые в настоящем изобретении штаммы проявляют высокий уровень устойчивости к даптомицину, характеризуются стабильным фенотипом, и имеют уникальную комбинацию мутаций в геномах.

Аналогичные штаммы не описаны

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении штаммов S. aureus с мутациями в геноме, опосредующими устойчивость к даптомицину.

Указанный результат достигается путем in vitro селекции штаммов на возрастающих концентрациях даптомицина в среде до достижения устойчивости и увеличение показателя МПК до 4-8 мкг/мл. Оценка устойчивости осуществляется методом серийных разведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК). Верификация геномных изменений осуществляется посредством полногеномного секвенирования устойчивых штаммов, полученных после селекции.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Происхождение штаммов и селекция устойчивости in vitro

Штаммы S. aureus SA0077 dap и S. aureus A dap/40 после инкубации при 37°C в аэробной атмосфере формируют ровные круглые колонии желтоватого цвета с неярко выраженным гемолизом на колумбийском агаре с 5% бараньей кровью (BioMedia, Россия). Морфологические, культуральные свойства типичны для вида S. aureus. Штамм SA0077 dap является производным от клинического штамма SA0077. Штамм SA0077 был выделен от пациента со стафилококковой инфекцией в 2011 г. в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва и характеризовался чувствительностью к даптомицину (МПК=0,5 мкг/мл). Штамм S. aureus A dap/40 является производным от штамма АТСС29213 с изначальной чувствительностью к даптомицину. Для получения резистентных фенотипов для обоих штаммов была проведена селекция устойчивости in vitro по следующей схеме.

Селекцию проводили в 2 мл сердечно-мозгового бульона (bioMerieux, Франция) содержащего даптомицин (Molekula, Англия) с добавлением солей кальция в конечной концентрации 50 мг/л. Использовался стартовый клеточный инокулюмом 10⁹ КОЕ/мл. На первом этапе делали ряд разведений антибиотика с концентрацией от 0,5 до 4 мкг/мл и добавляли приготовленный инокулюм, культивировали в термостате при 37°С до появления роста (в среднем 48 часов) хотя бы в одной из концентраций. Полученную суспензию использовали для пересева на среды с увеличенной концентрацией даптомицина. Всего осуществлено 40 пассажей со ступенчатым увеличением концентраций антибиотика от 0,5 до 128 мкг/мл. Во время селекции проводили контроль изменения МПК с использованием серийных разведений, РАР-анализ с ванкомицином, а также геномное секвенирование.

Верификация механизмов резистентности

Механизмы устойчивости верифицированы методами полногеномного секвенирования. Проведен анализ всех мутационных событий, за мутационное событие принимали изменение нуклеотидной последовательности, приводящее к появлению миссенс или нонсенс мутаций, делеций, инсерций. Синонимичные мутации не анализировались. Предварительно для всех полученных ридов было проведено удаление адаптерных последовательностей, и фильтрация низкокачественных прочтений с использованием программ FastQC, trimmomatic. Геномы исходных штаммов (до селекции) были собраны de novo, с использованием SPAdes. Выравнивание на референс-геном осуществлялось с помощью программ: bowtie2 2.2.6, Пакет R 3.4.4 и breseq 0.33.1. Алгоритм анализа включал следующие этапы. На полученные сборки исходных геномов выравнивали риды этих же геномов, при этом все выявленные мутации и нуклеотидные гетеро - позиции отмечались как «ложные» и исключались из дальнейшего анализа при сравнении с мутантами, для предотвращения интерпретации ложноположительных мутаций. Помимо этого, из анализа были исключены все мобильные генетические элементы, профаговые области, адгезины, поверхностные белки вирулентности и протяженные нуклеотидные гомополимерные области, вследствие высокой скорости накопления неспецифических мутаций в этих локусах. Для выявления генетических изменений, риды штаммов после 5,20 и 40 пассажей, выравнивали на контиги контрольных геномов. Проводили аннотацию генетических изменений с помощью программы breseq в режиме mixed allele model. Коррекцию аннотаций, а также оценку гипотетических белков проводили с помощью NCBI protein BLAST и UniProt при этом использовали референс - геном S. aureus COL (GenBank: СР000046.1). Для детальной подтверждающей оценки гетеро-мутаций использовали визуальную оценку данных bam - файлов в программе Unipro Ugene.

Фенотипические характеристики Штамм S. aureus SA0077 dap - характеризуется MRSA фенотипом, проявляет устойчивость к даптомицину (МПК 32 мкг/мл, при 10 пересевах на средах без антибиотиков МПК снижается до 16 мкг/мл). Имеет МПК ванкомицина 2 мкг/мл, телаванцина - 0,25 мкг/мл. Чувствительность к липогликопептидам (оритаванцину, далбаванцину). Устойчивость к бета-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам, макролидам, линкозамидам. Сохраняет чувствительность к оксазолидинонам, рифампицину, тетрациклину, тигециклину, триметоприму/сульфаметоксазолу, фузидиевой кислоте и мупироцину. Скорость роста значительно снижена по сравнению с оригинальным штаммом, время деления клеток на среде с сердечно-мозговой вытяжкой составляет 66 (±5%) минут (у штамма до селекции - 26 минут), ЛАГ-фаза роста увеличена до 228 минут. Характеризуется морфологической диссоциацией, при посеве на кровяной агар формирует белые и желтые колонии.

Штамм S. aureus A dap/40 - получен от исходного штамма АТСС29213. Проявляет устойчивость к даптомицину (МПК - 64 мкг/мл), ванкомицину и тейкопланину (МПК - 4 мкг/мл). Чувствительность к липогликопептидам: МПК оритаванцина - 2 мкг/мл, далбаванцина - 0,125 мкг/мл, телаванцина - 0,25 мкг/мл. При 10 пересевах на средах без антибиотиков МПК даптомицина снижается до 16-32 мкг/мл. Чувствительность к пенициллину за счет элиминации плазмиды blaZ. Фенотип чувствительности к другим антибиотикам соответствует фенотипу штамма АТСС29213. Скорость роста после селекции незначительно снижена по сравнению с оригинальным штаммом, однако ЛАГ-фаза роста увеличена до 228 минут. Формирует колонии выраженного желтого цвета.

Генотипические характеристики: Штамм S. aureus SA0077 dap.Генотип ST8-t008-SCCmec IV c. Размер хромосомы 2,8Mb, плазмидные элементы общей протяженностью не более 60 Kb, GC состав - 32,7%.

Мутации в генах биосинтеза мембранных фосфолипидов и регуляторных элементах являются основными маркерами устойчивости к даптомицину (Таблица 1).

Штамм S. aureus A dap/40. Генотип ST5 полностью соответствует эталонному исходному штамму АТСС29213 за исключением элиминации blaZ+плазмиды и наличия мутаций после селекции in vitro. Мутации в генах биосинтеза мембранных фосфолипидов и биосинтеза клеточной стенки, делеция генов, участвующих в метаболизме глицерола (glpP-glpD) ассоциированы с устойчивостью к даптомицину (Таблица 2).

Условия хранения штаммов

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет. После хранения культура образует однотипные колонии. После селекции и верификации механизмов резистентности штаммы были депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур с присвоением следующих регистрационных номеров. Штамм метициллинрезистентного Staphylococcus aureus SA0077 dap депонирован под регистрационным номером В-9988, штамм Staphylococcus aureus A dap/40, депонирован под номером В-9983.

Государственная коллекция патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» (ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ» (ФБУН ГНЦ ПМБ)) 142279, Московская область, г.о. Серпухов, п. Оболенск, Территория «Квартал А», д. 24

Тел. 36-00-03, факс 36-00-10, код (4967), E-mail:info(a)obolensk.org, http://www.obolensk.org Название на латинском языке: Staphylococcus aureus штамм SA0077 dap, Staphylococcus aureus штамм A dap/40

Регистрационный номер в коллекции: Staphylococcus aureus штамм SA0077 dap регистрационный номер В-9988; Staphylococcus aureus штамм A dap/40 - регистрационный номер В-9983

Дата депонирования: Staphylococcus aureus штамм SA0077 dap регистрационный номер В-9988 (свидетельство №332 от 06 июня 2022); Staphylococcus aureus штамм A dap/40 - регистрационный номер В-9983 (свидетельство №327 от 06 июня 2022).

Примеры использования в качестве контрольных штаммов при постановке чувствительности к антибиотикам.

Пример 1.

Антибиотикочувствительность оценивали методом серийных микроразведений с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в бульоне Cation-Adjusted Mueller Hinton (САМН) II Broth («Becton Dickinson», США) с добавлением солей кальция в конечной концентрации 50 мг/л в соответствие с протоколами CLSI от 2021 и EUCAST (версия 2021). Была использована субстанция даптомицина («Molekula», Англия). Постановку опыта проводили в 96 луночных планшетах (НПО «Медполимер», Санкт-Петербург). В качестве контрольных культур были использованы: S. aureus АТСС 29213 (чувствительный штамм), S. aureus SA0077 dap и & aureus A dap/40 (устойчивые штаммы). Контроли использовались в каждой серии постановок, и в общей сложности было проведено не менее 10 измерений на каждый контрольный штамм. Постановка серийных разведений осуществлялась в соответствие с ISO 20776-1-2010. При обработке данных на платформе WHONET ver 5.6. рассчитывали следующие параметры: распределение и диапазон МПК, МПК50, МПК90, средняя геометрическая МПК (МПКсг), количество и процент чувствительных изолятов (S), устойчивых (R), с промежуточной чувствительностью (I). В качестве тестовых изолятов были выбраны клинические изоляты MRSA (n=256) из коллекции бактериальных культур ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России. В Таблице 3 представлены результаты исследования.

Таким образом, штаммы SA0077 dap и A dap/40 характеризуются стабильной устойчивостью к даптомицину и могут быть использованы в качестве контрольных при оценке чувствительности к антибиотикам методом серийных разведений.

Пример 2.

Постановка градиентных диффузионных тестов. В работу были включены 10 клинических изолятов MRSA с разной чувствительностью к ванкомицину, определенные методом серийных разведений (МПК = 0,5-2 мкг/мл). Штаммы SA0077 dap и A dap/40 использовались как контрольные (контроль резистентности). Использовали градиентные диффузионные тесты с ванкомицином (VA, M.I.C.EVALUATORS®, Oxoid, Англия) и даптомицином (DPC, ETEST®, bioMerieux, Франция) в соответствие с инструкциями производителей. Полоска градиентного диффузионного теста состоит из стандартного градиента концентрации антибиотика, который используется для определения МПК (мкг/мл). Использовали агар Мюллера-Хинтона (БиоРад, США). Постановка диффузионного теста осуществлялась в соответствии ISO 20776-1-2010. Тестируемые изоляты характеризовались МПК даптомицина 0,06-0,5 мкг/мл, МПК ванкомицина 0,5-1 мкг/мл; контрольный штамм АТСС29213 имел МПК даптомицина 0,06 мкг/мл, МПК ванкомицина 0,5 мкг/мл фиг.1А); тест-штамм A dap/40 имел МПК даптомицина - 8 мкг/мл, МПК ванкомицина - 1 мкг/мл (фиг.1В); тест-штамм SA0077 dap имел МПК даптомицина - 4 мкг/мл (зона двойного роста, мелкие колонии), ванкомицина - 0,5 мкг/мл (фиг.1С). Таким образом, штаммы SA0077 dap и A dap/40 характеризуются устойчивостью к даптомицину и могут быть использованы в качестве контрольных при оценке чувствительности к антибиотикам с использованием градиентных диффузионных тестов.

Штаммы Staphylococcus aureus (SA0077 dap и A dap/40), характеризующиеся устойчивостью к даптомицину и могут быть использованы в качестве тест-культур для оценки чувствительности к липопептидным антибиотикам; для поиска новых мишеней в клетке с целью разработки новых антибактериальных препаратов; для тестирования новых потенциальных антимикробных соединений.

Получение штаммов, их фенотипическая и генотипическая характеристика выполнялись в рамках выполнения проектов Российского Научного Фонда (проекты 18-75-10114 и 18-75-10114-П).

Литература

1. Rybak М.J. The efficacy and safety of daptomycin: first in a new class of antibiotics for Gram-positive bacteria // Clin Microbiol Infect. 2006. T. 12 Suppl 1. C. 24-32. doi 10.1111/j.1469-0691.2006.01342.x

2. Tran Т.Т., Munita J.M., Arias C.A. Mechanisms of drug resistance: daptomycin resistance // Ann N Y Acad Sci. 2015. T. 1354. C. 32-53. doi 10.1111/nyas.12948

3. Bhuiyan M.S., Jiang J.H., Kostoulias X. et al. The Resistance to Host Antimicrobial Peptides in Infections Caused by Daptomycin-Resistant Staphylococcus aureus // Antibiotics (Basel). 2021. T. 10. №2. doi 10.3390/antibiotics10020096

4. Miller W.R., Bayer A.S., Arias C.A. Mechanism of Action and Resistance to Daptomycin in Staphylococcus aureus and Enterococci // Cold Spring Harb Perspect Med. 2016. T. 6. №11. doi 10.1101/cshperspect.a026997

5. Sulaiman J.E., Lam H. Novel Daptomycin Tolerance and Resistance Mutations in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Adaptive Laboratory Evolution // mSphere. 2021. T. 6. №

5. C. e0069221. doi 10.1128/mSphere.00692-21

6. Thitiananpakorn K., Aiba Y., Tan X. E. et al. Association of mprF mutations with cross-resistance to daptomycin and vancomycin in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) // Sci Rep.2020. T. 10. №1. C. 16107. doi 10.1038/s41598-020-73108-x

7. Ernst С.M., Slavetinsky C.J., Kuhn S. et al. Gain-of-Function Mutations in the Phospholipid Flippase MprF Confer Specific Daptomycin Resistance // mBio. 2018. T. 9. №6. doi 10.1128/mBio.01659-18.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Staphylococcus aureus SA0077 dap и штамм Staphylococcus aureus A dap/40, обладающие высоким уровнем устойчивости к даптомицину, депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером В-9988 и В-9983, соответственно, (варианты). Изобретения обеспечивают расширение арсенала средств, используемых в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к липопептидным антибиотикам. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Штамм метициллинрезистентного Staphylococcus aureus SA0077 dap, использующийся в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к липопептидным антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером В-9988.

2. Штамм Staphylococcus aureus A dap/40, характеризующийся устойчивостью к даптомицину, используемый в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к липопептидным антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером В-9983.