Штамм Staphylococcus aureus A9, характеризующийся толерантностью к ципрофлоксацину и используемый в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к антибиотикам Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/445 

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Современные стандарты клинической практики сосредоточены на скрининге резистентности с помощью определения только МПК и соответственно категорий «чувствительности» или «резистентности». Однако антибиотикотолерантность, не связанная с повышением МПК, не учитывается. Для пациентов, которые находятся в процессе лечения антибактериальной терапией, уровень толерантности возбудителя следует контролировать в течение всего периода лечения. Толерантность у S. aureus описана ко многим антибиотикам, включая бета-лактамы, даптомицин и ванкомицин. Толерантность ассоциирована с неблагоприятными клиническими исходами. В этой связи для выявления данного феномена необходимы контрольные штаммы. Штамм Staphylococcus aureus А9 характеризуется толерантностью действию к ципрофлоксацина, штамм может быть использован в опытах по моделированию фармакодинамических параметров при использовании фторхинолоновых антибиотиков; для тестирования новых потенциальных антимикробных соединений; как референс-штамм для изучения феномена антибиотикотолерантности. Штамм характеризуются мутациями в гене пептидил-тРНК-гидролазе (pth), получен при селекции in vitro при циклическом воздействии высоких концентраций ципрофлоксацина (штамм А9) на протяжении 10 циклов. В качестве исходного штамма использовался референс-штамм АТСС29213. Толерантность к ципрофлоксацину осуществляется за счет увеличения периода времени эффективного киллинга 99% популяции.

Типичный процесс развития толерантности происходит за счет циклического воздействия антибиотиков. В какой-то степени это напоминает антибиотикотерапию. При этом уровень толерантности клеточной популяции (параметр минимальный период времени, необходимый для киллинга 99% клеточной популяции - MDK99%) продолжает увеличиваться в течение циклов воздействия, при этом МПК не изменяется. Не выявленная толерантность является серьезной проблемой для клинической практики, не только потому что выжившие клетки могут снова вырасти и вызвать повтор заболевания, но и потому, что это способствует развитию резистентности. К сожалению, современный стандарт клинической практики сосредоточен на скрининге резистентности с помощью определения только МПК. Однако толерантность, не связанная с повышением МПК не учитывается. Для пациентов, которые находятся в процессе лечения антибактериальной терапией, уровень толерантности возбудителя следует контролировать в течение всего периода лечения [1]. Толерантность у S. aureus описана ко многим антибиотикам, включая бета-лактамы, даптомицин и ванкомицин. Толерантность ассоциирована с неблагоприятными клиническими исходами [2]. В этой связи для выявления данного феномена необходимы контрольные штаммы. Патентный поиск показал, что отсутствуют аналогичные штаммы S. aureus. Так же и ограничены работы, где получены антибиотиколерантные штаммы. Например, в работе [3] при циклическом воздействии in vitro на штаммы S. aureus были получены даптомицин-толерантные варианты. Авторы отмечали, что исследуемые штаммы характеризовались увеличением параметра MDK99% и геномное секвенирование выявило специфические мутации. Данные штаммы не доступны в публичных депозитариях и не входят в международные коллекции микроорганизмов, например АТСС. Предлагаемый штамм, получен в настоящем исследовании, при селекции на ципрофлоксацине, характеризуется толерантностью и является общедоступным. В работах [4, 5] использовался даптомицин для получения толерантных штаммов. В работах [6, 7] была проведена оценка толерантности и появления персистеров в структуре биопленок штаммов S. aureus, однако отсутствовал подход лабораторного моделирования эволюции.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Задачей изобретения является получение штамма Staphylococcus aureus А9 с толерантностью к действию ципрофлоксацина, для использования в качестве контрольных тест-культур в методах определения чувствительности к антибиотикам, таких как «time-killing» или фармакодинамическое моделирование.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении штамма Staphylococcus aureus А9 с толерантностью к ципрофлоксацину.

Указанный результат достигается путем in vitro селекции штамма при циклическом воздействии высоких (шоковых) концентраций ципрофлоксацина. Оценка устойчивости осуществляется методом серийных разведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК), толерантность оценивается методом «time-killing». Верификация геномных изменений осуществляется посредством полногеномного секвенирования после 10 циклов воздействия высоких концентраций антибиотиков.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Получение антибиотикотолерантного штамма in vitro

В качестве исходного штамма был взят штамм из Американской коллекции эталонных штаммов (АТСС): АТСС29213. Данный штамм характеризуется метициллинчувствительным фенотипом (MSSA), генотип ST5. За основу in vitro селекции использовали схему предложенную Fridman et al. [8]. Опыт выполняли по следующей схеме. Изначально получали ночной инокулюм, далее делали разведение клеточной биомассы исследуемых штаммов в соотношение 1:100. При этом оценивали плотность клеточной биомассы, используя количественный метод с подсчетом КОЕ/мл живых клеток. После в среду добавляли антибиотик. Жидкую среду с антибиотиком и инокулятом инкубировали при 37°С и шейкировании 250 rpm. После 5-6 ти часов воздействия антибиотиком снова проводили оценку плотности клеточной биомассы с подсчетом КОЕ на плотной питательной среде. Далее весь объем среды и клеток (в нашем опыте 100 мл) дважды отмывали от антибиотика, получали клеточный осадок и ресуспензировали в свежей среде жидкой питательной среде. Среду снова инкубировали для получения ночного инокулюма. Все вышеописанные манипуляции составляли один цикл селекции. Воздействовали ципрофлоксацином с концентрацией 16 мкг/мл (МПК исходного штамма было <0,5 мкг/мл). Время воздействия (часы) определяли в предварительных «time-killing» экспериментах, подбирая оптимальное значения наиболее эффективного киллинга бактерий. Для ципрофлоксацина это время составило - 6 часов. За этот период происходила 99,9% гибель бактериальной популяции. В процессе селекции в каждый цикл была проведена оценка доли выживших клеток после воздействия шоковыми концентрациями антибиотиков. Проведен анализ кривых в опытах «time-killing» до и после воздействия. Проведена оценка чувствительности до и после селекции. В процессе селекции штамм был секвенирован в трех точках: до селекции (исходные, «дикие» варианты), при первом изменении % киллинга бактериальной популяции, и после селекции. Для проведения полногеномного секвенирования использовался набор Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina) с парными ридами 300 п.н. Секвенирование проводили на платформе Miseq (Illumina). В процессе биоинформатического анализа мы оценивали все мутационные события. Синонимичные мутации не анализировались. Изначально проводили фильтрацию ридов. Геномы исходных штаммов (до селекции) были собраны de novo, с использованием SPAdes. Алгоритм поиска мутаций включал следующие этапы. На полученные сборки исходных геномов выравнивали риды этих же геномов, при этом все выявленные мутации и нуклеотидные гетеро-позиции отмечались как «ложные» и исключались из дальнейшего анализа при сравнении с мутантами, для предотвращения интерпретации ложноположительных мутаций. Помимо этого, из анализа были исключены все мобильные генетические элементы, профаговые области, адгезины, поверхностные белки вирулентности и протяженные нуклеотидные гомополимерные области, вследствие высокой скорости накопления неспецифических мутаций в этих локусах. Для выявления генетических изменений, риды штаммов после селекции, выравнивали на контиги контрольных геномов. Проводили выявление гетеро-мутаций, анализ аллельной глубины, а также аннотацию генетических изменений с помощью пакета программ breseq (barricklab.org).

При селекции на ципрофлоксацине (штамм А9) не было выявлено устойчивости к фторхинолонам (левофлоксацину, моксифлоксацину, ципрофлоксацину) на протяжении всех десяти циклов воздействия. В ходе селекции к 4-6 циклу отмечалось снижение эффекта киллинга с 0,1-1% (КОЕ 10²-10³ КОЕ/мл) до 10-100% (10⁷-10⁸ КОЕ/мл). При оценке кривых в опытах по «time - killing» было выявлено увеличение продолжительности времени воздействия для 99% киллинга популяции. Так, до селекции эффективный киллинг 99% популяции составлял 3-5 часов, после селекции - 24 часа. Такое явление свидетельствует о появлении толерантности. По результатам секвенирования выявлены мутации в гене метаболизма РНК пептидил-тРНК-гидролазе (pth).

Фенотипические характеристики

Штамм S. aureus А9, фенотип чувствительности к антибиотикам при оценке стандартными методами полностью совпадает с фенотипом штамма АТСС29213. Скорость роста незначительно снижена по сравнению с оригинальным штаммом. Проявляет толерантность к ципрофлоксацину за счет увеличения периода времени эффективного киллинга.

Генотипические характеристики:

Штамм S. aureus А9. Генотип полностью соответствует исходному штамму АТСС29213. Выявлены мутации в гене пептидил-тРНК-гидролазе (pth): M76K+F126S.

Условия хранения штаммов

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет. После хранения культура образует однотипные колонии.

В качестве исходного родительского штамма использовался коммерческий штамм Staphylococcus aureus АТСС 29213 (Culti-Loops™, Thermo Scientific™). (2) После проведенной селекции in vitro под воздействием шоковых концентраций ципрофлоксацина был получен штамм Staphylococcus aureus А9, который не отличался фенотипическими признаками от исходного штамма. Морфологические, тинкториальные, физиологические признаки перечислены ниже. Исходный и производный штаммы Способны расти на разных минимальных средах; формировали беловато-желтые колонии 3 - 5 мм с не выраженным гемолизом на среде с эритроцитарной массой человека (кровяной агар); (1) характеризовались положительными коагулазной и каталазной реакциями: обладали лепитиназной активностью, гидролизовали лецитин. (2) Штаммы способны расти на основных средах при 37°С (диапазон 30-41°С) и при оптимальном уровне рН: 7,0-7,5. Скорость роста, определяемая в 100 мл жидкой среды сердечно-мозгового бульона при периодическом культивировании при 37°С и орбитальном шейкировании (250 оборотов в минуту), была снижена на 10% у производного штамма А9. Исходный и производный штаммы характеризовались устойчивостью к пенициллину за счет наличия плазмид blaZ+, чувствительностью к оксациллину, цефокситину, макролидам/линкозамидам, гликопептидам, аминогликозидам, тетрациклинам, оксазолидинонам, фузидиевой кислоте и мупироцину. Размер геномов составлял 2,8 млн п.н., GC состав - 32,5%, наличие вне хромосомных элементов - плазмида blaZ. Штамм S. aureus А9 депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером В-9982(3) (свидетельство о депонировании №326, от 06.06.2022(4)). (1)

Примеры использования в качестве контрольных штаммов при постановке чувствительности к антибиотикам.

Пример 1.

Постановка эксперимента «time-killing» в 24-часовом формате с ципрофлоксацином и гентамицином с концентрацией 16 мкг/мл. В эксперимент включены 2 клинических изолята S. aureus и 1 контрольный штамма (А9). Опыт осуществляли по традиционной схеме, ночной инокулюм разводили до ~ 10⁸-10⁹ КОЕ/мл и добавляли в бульон Мюллера-Хинтон с антибиотиком в соотношении 1:100 мл. Инкубировали при 37°С. Через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 24 часа собирали 100 мкл среды с инокулятами и делали последовательные разведения с последующими высевами на питательную среду, где делали подсчет выросших колоний. Анализировали график зависимости от времени инкубации (час) и клеточной плотности (КОЕ/мл). Тестируемые клинические изоляты характеризовались стандартной кривой отмирания, контрольный штамм А9 характеризовался увеличенным интервалом времени, необходимым для 99% отмирания клеточной биомассы. На фиг. 1. представлены кривые отмирания штамма А9, а также клинических изолятов 1 и 2 при суточном мониторинге роста под воздействием ципрофлоксацина с концентрацией 16 мкг/мл.

Таким образом, штамм А9 характеризуется толерантностью к действию ципрофлоксацина и может быть использован в качестве контрольного при постановке «time-killing» опытов для анализа оценки эффективности бактерицидного воздействия антибиотиков.

Пример 2.

Постановка теста определения толерантности в формате диско-дискоффузонного метода (TDtest). TDtest предложен Gefen et al [9] и состоит из двух этапов. Первый этап аналогичен стандартному диско-диффузионному методу с некоторыми исключениями. Для опыта необходимо использовать 10⁶-10⁷ КОЕ/мл тестируемых бактерий из стационарной фазы роста. Концентрация антибиотика в дисках должна быть ниже МПК в зоне ингибирования вокруг диска после суток инкубации при 37°С. Для этого можно опытным путем рассчитать требуемую нагрузку на диск, либо использовать в одной постановке целый нагруженный диск (диаметр 6 мм, Whatman, №1), половина диска или четверть диска. Аппликация дисков и последующие манипуляции осуществляются стандартным способом. Второй этап осуществляются после инкубации тестируемых культур с нагруженными дисками. Диск с антибиотиком заменяется диском с глюкозой (нагрузка 2 мг, 40% раствор стерильной глюкозы, 5 мкл на диск) и дополнительно культуры инкубируются еще 18-24 часов на той же питательной среде (агар Мюллера-Хинтон). На вторые сутки осуществляется анализ. Если в зоне ингибиции роста вкруг диска с глюкозой появляются колонии, то это свидетельствует о наличие толерантности. В опыте использовали два клинических изолята S. aureus и контрольный штамм А9. При детекции толерантности, штамм А9 давал рост (мелкие колонии в зоне ингибиции вокруг диска) после аппликации диска с глюкозой. Тестируемые клинические изоляты не формировали дополнительных колоний после инкубирования с глюкозой. На фиг. 2-5 представлены результаты учета диско-дискоффузонного теста на толерантность (TDtest). На фиг. 2 показана постановка дисков с антибиотиками у тестируемого клинического изолята; на фиг. 3 показана постановка дисков с антибиотиками у тест-штамма А9. После инкубации с глюкозой, у клинического изолята практически отсутствует рост в зоне ингибиции роста, что показано на фиг. 4. При инкубации с глюкозой у тест-штамма А9 наблюдается появление мелких колоний в зоне ингибиции роста (положительный тест на толерантность, фиг. 5).

Таким образом, штамм А9 может быть использован в качестве контрольного при постановке опытов для выявления толерантности к антибиотикам.

Получение штамма, его фенотипическая и генотипическая характеристика выполнялись в рамках выполнения проектов Российского Научного Фонда (проекты 18-75-10114 и 18-75-10114-П).

Литература

1. Sulaiman J.Е., Lam Н. Evolution of Bacterial Tolerance Under Antibiotic Treatment and Its Implications on the Development of Resistance // Front Microbiol. 2021. T. 12. C. 617412. doi 10.3389/fmicb.2021.617412

2. Kuehl R., Morata L., Meylan S. et al. When antibiotics fail: a clinical and microbiological perspective on antibiotic tolerance and persistence of Staphylococcus aureus // J Antimicrob Chemother. 2020. T. 75. №5. C. 1071-1086. doi 10.1093/jac/dkz559

3. Sulaiman J.E., Lam H. Novel Daptomycin Tolerance and Resistance Mutations in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Adaptive Laboratory Evolution // mSphere. 2021. T. 6. №5. C. e0069221. doi 10.1128/mSphere.00692-21

4. Mechler L., Herbig A., Paprotka K. et al. A novel point mutation promotes growth phase-dependent daptomycin tolerance in Staphylococcus aureus // Antimicrob Agents Chemother. 2015. T. 59. №9. C. 5366-76. doi 10.1128/AAC.00643-15

5. Shen Т., Hines K.M., Ashford N.K. et al. Varied Contribution of Phospholipid Shedding From Membrane to Daptomycin Tolerance in Staphylococcus aureus // Front Mol Biosci. 2021. T. 8. C. 679949. doi 10.3389/fmolb.2021.679949

6. Karimaei S., Kazem Aghamir S.M., Foroushani A.R., Pourmand M.R. Antibiotic tolerance in biofilm persister cells of Staphylococcus aureus and expression of toxin-antitoxin system genes // Microb Pathog. 2021. T. 159. C. 105126. doi 10.1016/j.micpath.2021.105126

7. Lamret F., Colin M., Mongaret C. et al. Antibiotic Tolerance of Staphylococcus aureus Biofilm in Periprosthetic Joint Infections and Antibiofilm Strategies // Antibiotics (Basel). 2020. T. 9. №9. doi 10.3390/antibiotics9090547

8. Fridman О., Goldberg A., Ronin I. et al. Optimization of lag time underlies antibiotic tolerance in evolved bacterial populations // Nature. 2014. T. 513. №7518. C. 418-21. doi 10.1038/nature13469

9. Gefen O., Chekol В., Strahilevitz J., Balaban N.Q. TDtest: easy detection of bacterial tolerance and persistence in clinical isolates by a modified disk-diffusion assay // Sci Rep.2017. T. 7. C. 41284. doi 10.1038/srep41284.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Staphylococcus aureus A9, характеризующийся толерантностью к ципрофлоксацину, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером В-9982. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, используемых в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к антибиотикам. 5 ил., 2 пр.

Штамм Staphylococcus aureus A9, характеризующийся толерантностью к ципрофлоксацину, используемый в качестве контрольной тест-культуры для определения чувствительности к антибиотикам, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером В-9982.