НОВЫЙ ОСЛАБЛЕННЫЙ ШТАММ ВИРУСА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИНЫ Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к штаммам вируса, генетически модифицированным из нового штамма метапневмовируса человека.

Настоящее изобретение относится к данным модифицированным штаммам, вирулентность которых ослаблена, для их применения в профилактическом или терапевтическом лечении вирусных инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae,a также вакцинным композициям, содержащим указанные модифицированные штаммы вируса.

Введение

Острые инфекции нижних дыхательных путей представляют собой одну из главных причин заболеваемости и смертности в мировом масштабе. У детей в возрасте менее 5 лет, в частности, они представляют вплоть до более чем 15% смертности, в зависимости от оцениваемых стран, и таким образом являются второй причиной смертности согласно Всемирной Организацией Здравоохранения.

Большинство острых инфекций нижних дыхательных путей, ассоциированных с различными патологиями, находящимися в диапазоне от простой простуды до серьезной пневмонии, значительным образом вызвано вирусами, такими как вирусы, принадлежащие к следующим семействам:

(i) вирус семейства Orthomyxoviridae (в частности, содержащего вирусы гриппа);

(ii) вирус семейства Paramyxoviridae;

(iii) вирус семейства Adenoviridae;

(iv) вирус семейства Picornaviridae;

(v) вирус семейства Coronaviridae и

(vi) вирус семейства Pneumoviridae, в частности, содержащего респираторно-синцитиальный вирус человека и метапневмовирус человека.

Респираторно-синцитиальный вирус человека (hRSV - от англ. human syncytial respiratory virus) и метапневмовирус человека (hMPV - от англ. human metapneumovirus) представляют собой вирусы, обуславливающие острые инфекции дыхательных путей, такие как бронхиолиты, бронхиты или пневмонии. Они главным образом подвергают опасности группы населения, которые представляют собой меленьких детей, в возрасте меньше чем 5 лет, пожилых людей и индивидов с подавленным иммунитетом.

hRSV является главным этиологическим агентом бронхиолитов и пневмоний у младенцев в возрасте меньше чем 1 год, с повышенной частотой встречаемости в возрасте меньше 6 месяцев. У взрослых инфицирование hRSV является редким и слабым, за исключением пожилых субъектов. Передача по существу происходит через дыхательные пути, в результате репликации вируса в дыхательных путях.

hRSV был выделен в 1957 году. Он представляет собой вирус с одноцепочечной РНК отрицательной полярности, «оболочечного типа», с капсидом спиралевидной симметрии. Он принадлежит к семейству Pneumoviridae и к роду Orthopneumovirus.

hMPV широко распространен при бронхиолитах и пневмониях у младенцев и в частности тяжело воздействует на детей в возрасте от 1 до 3 лет.

Основные симптомы инфицирования hMPV у детей включают ринорею, кашель, респираторный дистресс или в качестве альтернативы лихорадку. hMPV может также вызывать инфекции верхних дыхательных путей, будучи способным быть ассоциированным с ушными инфекциями, тогда как нереспираторные симптомы, такие как диарея, рвота и возникновение эритемы, являются редкими. hMPV предпочтительно нацелен на реснитчатые клетки респираторного дерева человека.

Инфицирование hMPV вызывает гистопатологические модификации в легких организма-хозяина и оказывает в частности следующее физиологическое действие:

- повреждение на уровне дыхательного эпителия;

- избыточная продукция слизи и

- острое воспаление, главным образом на уровне промежуточных легочных тканей, связанное с важной секрецией провоспалительных цитокинов и хемокинов.

При патологиях дыхательных путей у взрослых hMPV идентифицирован у 5 -10% взрослых или пожилых людей, имеющих острую инфекцию дыхательных путей, и у 3-5% взрослых, имеющих обострение хронической легочной патологии или пневмонии, приобретенной в обществе.

hMPV был выделен и описан впервые в 2001 году в Нидерландах (van den Hoogen et al., 2001). В следующим году несколько штаммов hMPV выделяли у пациентов, находящихся в Северной Америке (Peret et al., 2002). hMPV представляют собой вирусы с отрицательной одноцепочечной РНК, принадлежащие к семейству Pneumoviridae и к роду Metapneumovirus.

Средний возраст детей, госпитализированных вследствие осложнений инфекции, вызванной hMPV, составляет от 6 до 12 месяцев, а именно старше чем в случае инфекции, вызванной hRSV, которая главным образом встречается в возрасте от 0 до 3 месяцев. Однако, эпидемиология hMPV имеет целый ряд общих точек с эпидемиологией hRSV:

- он присутствует на всех континентах;

- его годовое распространение главным образом происходит зимой и весной, перекрываясь с распространением hRSV;

- его передача, возможно, также происходит посредством капель слюны.

На сегодняшний момент на рынке не существует профилактического или терапевтического воздействия, которое было бы эффективным и специфичным в отношении инфекции, вызываемой вирусами hRSV и hMPV, несмотря на то, что проводится активное исследование (Mazur et al., 2018).

Для лечения рибавирин, не освобожденный от нежелательных эффектов, или внутривенные иммуноглобулины, очень дорогие, могут использоваться иногда в серьезных случаях инфекций, вызванных hMPV или hRSV. В настоящее время разрабатываются другие типы лечений, такие как применение слитых пептидов-ингибиторов, сульфатированных гликозаминогликанов, интерферирующих РНК и некоторых иммуномодуляторов.

Обычный и широко предпочитаемый в настоящее время клинический подход заключается в лечении главным образом симптомов инфекции, одновременно помещая пациентов на искусственное дыхание (введение кислорода или механическая вентиляция) и посредством введения им бронхолитиков, кортикостероидов и/или антибиотиков для предупреждения или лечения бактериальных суперинфекций.

В отношении вакцинации групп населения, особенно подвергающихся воздействию hMPV, представляющих собой младенцев, маленьких детей и пожилых, крайне важно иметь незамедлительно безопасные и эффективные вакцины для уменьшения тяжести поражения дыхательных путей, которые оказывают сильное действие в данных возрастных диапазонах.

Разработка вакцины против hRSV и hMPV, таким образом, представляет не только сложную задачу, касающуюся здоровья, но также реальный социоэкономический вопрос с целью уменьшения высокой стоимости лечения и госпитализаций, ассоциированных с данными инфекциями, и сокращения применения антибиотиков в контексте бактериальных суперинфекций и, таким образом, ограничения возникновения устойчивости.

Предшествующий уровень техники

В Таблицах 1, 2 и 3 ниже перечислены разные подходы, находящиеся в разработке, для получения живых ослабленных вакцин из диких штаммов hMPV.

Штаммы вирусов считаются ослабленными in vitro, когда они демонстрируют пониженную способность к репликации, по сравнению с вирусом дикого типа (WT -от англ. wild type), и/или когда данные штаммы вируса приводят к более ограниченному образованию вспышек инфекции, в частности, синцития (соседние клетки, сливающиеся после инфицирования вирусом). In vivo, ослабленные штаммы вируса реплицируются при более низкой максимальной нагрузке и/или вызывают менее тяжелую патологию (с точки зрения потери массы или профиля воспаления, или гистопатологического повреждения), чем дикий штамм вируса.

Термин «Vero» обозначает линию клеток почки африканской зеленой мартышки, широко используемую в клеточной культуре для тестирования разных вирусов.

Термин «LLC-MK2» обозначает клеточную линию, происходящую из клеток почки макак-резусов, используемую для анализов инфекции, вызванной разными вирусами.

Символ указывает на то, что исследуемые клетки подвержены инфицированию вирусом.

Следующие сокращения используют для моделей исследования in vivo: М в случае мыши; Н в случае хомяка; CR в случае хлопковой крысы; СМ в случае яванского макака; AGM в случае африканской зеленой мартышки; Ch в случае шимпанзе; Rh в случае макака-резуса; и SCID в случае тяжелого комбинированного иммунодефицита (от англ. Severe Combined Immuno Deficiency).

Все анализируемые ослабленные штаммы вируса происходят из дикого штамма CAN97-83 подгруппы А2.

Международная заявка WO 2005/014626 относится к нескольким штаммам hMPV, обозначаемым следующими обозначениями: CAN 97-83, CAN 98-75 и HMPV 00-1. В данной заявке описан штамм рекомбинантного hMPV, обозначаемый CAN 97-83, генетически модифицированный для ослабления его вирулентности. Предложенные модификации в особенности относятся к полному удалению генов, кодирующих белки G и/или SH. Модифицированные штаммы вирусов могут быть использованы в терапии человека, для предупреждения или лечения инфекций, вызванных пневмовирусами. Введение дикого штамма или данных ослабленных штаммов хомякам делает возможным защитить их впоследствии от инфекции CAN97-83 hMPV. Однако, в WO 2005/014626 не упоминается обо всех защитных свойствах, в частности, не проведен контроль над массой обработанных животных. Такие же результаты эксперимента описаны в научных статьях, приведенных в таблице 2.

С теми же ослабленными штаммами, далее были получены результаты in vivo на животной модели обезьяны; штаммы рекомбинантного вируса с удаленными генами SH, G и М2-2 продолжают реплицироваться в дыхательных путях обезьян; и, кроме того, вызывают продукцию нейтрализующих антител, ровно как дикий штамм вируса CAN97-83.

Другие выделенные штаммы hMPV описаны в патенте США 8841433, также предложено их применение для получения вакцин.

Вакцины на основе применения ослабленных штаммов живых вирусов имеют целый ряд преимуществ.

С одной стороны, вакцины, полученные из ослабленных живых вирусов, имеют преимущество, заключающееся в том, что они вызывают сильный иммунный ответ на вирус, чья способность размножаться значимо снижена, таким образом, делая возможным избежать возникновения патологии, одновременно имитируя природную инфекцию. Во время разработки данных ослабленных штаммов важно найти идеальное равновесие между ослаблением и иммуногенностью.

С другой стороны, данные вакцины могут быть введены интраназальным путем, и таким образом имитируют природный способ поступления диких вирусов, таким образом, вызывая иммунный ответ, довольно похожий на физиологический ответ на инфекцию.

Кроме того, данная стратегия вакцинации не вызывает усиленной воспалительной реакции, как может происходить с инактивированными вакцинами. Наконец, добавление адъюванта обычно не является необходимым.

Таким образом, это является оптимальной стратегией вакцинирования для профилактики у групп населения, находящихся в группе риска, таких как маленькие дети и младенцы.

Описание изобретения

Предметом изобретения является ослабленный штамм вируса, происходящий из конкретного клинического штамма rC-85473 человеческого мета пне в мо в и руса, содержащий последовательность генома, представленную последовательностью SEQ ID NO. 1, причем указанный ослабленный штамм содержит одну или более генетических модификаций указанной последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющих вирулентность указанного штамма.

Ослабленные штаммы вируса согласно изобретению, в частности, представляют собой рекомбинантные штаммы, модифицированные посредством инактивации или удаления по меньшей мере одного гена, кодирующего один из акцессорных белков G и SH, с получением рекомбинантных вирусов, обозначаемых ΔG rC-85473 и ΔSH rC-85473, соответственно.

Более конкретно, предмет настоящего изобретения представляет собой ослабленный штамм вируса, происходящий из клинического штамма мета пне в мо в и руса человека, содержащего последовательность генома, представленную последовательностью SEQ ID NO. 1, причем указанный ослабленный штамм содержит по меньшей мере одну генетическую мутацию, выбранную из: инактивации гена, кодирующего акцессорный белок G, и инактивации гена, кодирующего акцессорный белок SH.

Данные штаммы отличались в отношении их инфекционности и их вирусной репликации в in vitro (линия клеток LLC-MK2) и ex vivo (восстановленный дыхательный эпителий человека, культивируемый на границе раздела воздух-жидкость) клеточных моделях, а также в отношении патогенеза вируса и их свойства вакцинной защиты в мышиной модели инфицирования hMPV.

Результаты, представленные в экспериментальном разделе, подчеркивают специфичные свойства данных штаммов вируса ΔG rC-85473 и ΔSH rC-85473, в сравнении со свойствами штаммов вирусов, модифицированных похожим путем, также с удаленными генами G или SH, но происходящих из другого клинического штамма hMPV (CAN98-75).

Вирусы ΔG или ΔSH rC-85473 имеют, в частности, следующее:

(i) характерный признак ослабленного вируса в мышиной модели, в отличие от рекомбинантного вируса ΔSH CAN98-75, который, в свою очередь, является очень вирулентным;

(ii) при сохранении их способности к репликации в системах связывания клеток (референсная линия LLC-MK2) и в суспензии, в отличие от рекомбинантных вирусов CAN98-75, которые гораздо менее продуктивны;

(iii) вирусы ΔG или ΔSH C-85473 преимущественно обладают следующими значимыми защитными свойствами: 100% выживаемость инфицированных мышей, маленькая потеря массы, индукция ответа, опосредованного нейтрализующими антителами, на гомологичный штамм вируса С-85473, серотип А) и по меньшей мере на один гетерологичный штамм (CAN98-75, серотип В), а также уменьшенный легочный патогенез у инфицированных животных, по сравнению с инфекционной стимуляцией, вызываемой диким hMPV (штамм rC-85473), который вызывает 50%-ную летальность в неиммунизированных контрольных группах.

Данный ослабленный штамм вируса может использоваться in vivo, ex vivo и in vitro как экспрессионный вектор по меньшей мере одного экзогенного гена, в частности, гена, кодирующего вирусный антиген и, кроме того, вирусные антигены, происходящие из респираторно-синцитиального вируса человека (hRSV) и, в частности, его слитый белок F.

Изобретение также относится к данному ослабленному штамму вируса для его применения в качестве лекарственного средства, и более конкретно для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae.

Наконец, изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей, в фармацевтически приемлемом носителе, по меньшей мере один ослабленный штамм вируса, такой как определено выше, и возможно адъювант.

Описание графических материалов

Фиг. 1. Рекомбинантные hMPV, полученные из клинических штаммов С-85473 и CAN98-75

[Фиг. 1А] Схематичное представление генома рекомбинантных вирусов, полученных посредством обратной генетики из клинического штамма С-85473, и в который клонирована кодирующая последовательность GFP (от англ. Green Fluorescent Protein - зеленый флуоресцентный белок) на своем 3' конце. Вирус rC-85473 содержит геном дикого штамма С-85473, экспрессирующий, кроме того, ген GFP. Геномы рекомбинантных вирусов, происходящих из штамма С-85473 и с удаленными генами SH (ΔSH-rC-85473) или G (ΔG-rC-85473), представлены ниже. Генетически модифицированные вирусы являются функциональными и репликативными, как например, показано на изображениях клеток LLC-MK2, инфицированных данными вирусами с множественностью инфекции (MOI - от англ. Multiplicity of Infection) 0,01, и за ними наблюдали посредством флуоресцентной микроскопии через трое суток после инфицирования.

[Фиг. 1В] Схематичное представление генома рекомбинантных вирусов, полученных посредством обратной генетики из клинического штамма CAN98-75, и в который клонирована кодирующая последовательность GFP (зеленый флуоресцентный белок). Вирус rCAN98-75 содержит геном дикого штамма CAN98-75, экспрессирующий, кроме того, ген GFP на своем 3' конце. Геномы рекомбинантных вирусов, происходящих из штамма CAN98-75 и с удаленными генами SH (ΔSH-rCAN98-75) или G (ΔG-rCAN98-75), представлены ниже. Генетически модифицированные вирусы являются функциональными и репликативными, как например, показано на изображениях клеток LLC-MK2, инфицированных данными вирусами с MOI 0,01, и за ними наблюдали посредством флуоресцентной микроскопии через трое суток после инфицирования.

Фиг 2. In vitro способности к репликации штаммов вируса rC-85473 и rCAN98-75 и штаммов, происходящих из них.

[Фиг. 2А] Вирусная нагрузка, оцениваемая по TCID50 (от англ. Tissue Culture Infections Dose - доза заражения 50% культуры ткани)/мл в супернатантах клеток, собираемых каждые сутки на протяжении 7 суток после инфицирования клеток LLC-MK2 рекомбинантными вирусами rCAN98-75 (черные кружки), ΔSH-rCAN 98-75 (черные квадраты) и ΔG-rCAN98-75 (черные треугольники) с множественностью инфекции (MOI) 0,01.

[Фиг. 2В] Вирусная нагрузка, оцениваемая посредством TCID50/мл в супернатантах клеток, собираемых каждые сутки на протяжении 7 суток после инфицирования клеток LLC-MK2 рекомбинантными вирусами rC-85473 (черные кружки), ΔSН-rC-85473 (черные квадраты) и ΔG-rC-85473 (черные треугольники) с множественностью инфекции (MOI) 0,01.

** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001 (двухфакторные дисперсионные анализы).

Фиг 3: In vivo характеристика рекомбинантных hMPV rCAN98-75 и rC-85473 посредством инфицирования мышей BALB/c: кривые массы и вирусные нагрузки легкого через 5 суток после инфицирования.

[Фиг. 3А] Мышей BALB/c инфицировали посредством интраназальной инстилляции культуральной среды OptiMem («имитационный» отрицательный контроль, черные треугольники) или 2,5×10⁵ БОЕ (бляшкообразующая единица) рекомбинантных вирусов rCAN98-75 (черные кружки), ΔSH-rCAN98-75 (серые квадраты) и ΔG-rCAN98-75 (серые треугольники). Массу и выживаемость мышей контролировали ежесуточно на протяжении 14 суток.

[Фиг. 3В] Через 5 суток после инфицирования 5 мышей на группу (за исключением группы отрицательного контроля) подвергались умерщвлению для измерения вирусных нагрузок при легочной инфекции TCID50/грамм легкого.

[Фиг. 3С] Мышей BALB/c инфицировали посредством интраназальной инстилляции культуральной среды OptiMem («имитационный» отрицательный контроль, черные ромбы) или 5×10⁵ TCID50 рекомбинантных вирусов rC-85473 (черные кружки), ΔSH-rC-85473 (серые квадраты) и ΔG-rC-85473 (серые треугольники). Массу и выживаемость мышей контролировали ежесуточно на протяжении 14 суток.

[Фиг. 3D] Через 5 суток после инфицирования 5 мышей на группу (за исключением группы отрицательного контроля) подвергались умерщвлению для измерения вирусных нагрузок при легочной инфекции ТСЮ50/грамм легкого.

Статистические критерии: двухфакторные дисперсионные анализы для сравнения каждого вируса с условием «имитации». * р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

Фиг. 4: In vivo защитные свойства рекомбинантных hMPV ΔG-rC-85473 и ΔSH-rC-85473 в модели инфекционной стимуляции мышей BALB/c.

[Фиг. 4А] Диаграмма протокола иммунизации (наверху) с последующим протоколом инфекционной стимуляции (внизу). Летальная доза соответствует 1×10⁶ TCID⁵⁰.

[Фиг. 4В] Инфекционная стимуляция мышей, иммунизированных штаммами вируса rC-85473 (черные кружки), ΔSH-rC-85473 (серые квадраты) или ΔG-rC-85473 (серые треугольники) или неиммунизированных («имитация», черные треугольники)

Через 21 сутки после иммунизации мышей инфицировали посредством интраназальной инстилляции летальной дозы (1×10⁶ TCID⁵⁰) дикого вируса rC-85473. Их массу отслеживали ежесуточно на протяжении 14 суток.

[Фиг. 4С] Кривые выживаемости мышей разных групп иммунизированных мышей после стимуляции.

«Имитационные» неиммунизированные мыши имеют только 50%-ную выживаемость; мыши, иммунизированные рекомбинантными вирусами rC-85473, ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473, имеют 100%-ную выживаемость.

[Фиг. 4D] Через 5 суток после инфекционной стимуляции (а именно, в сутки 26 после иммунизации) 4 мыши каждой группы подвергались умерщвлению для измерения их вирусных нагрузок при инфицировании легкого TCID50/г легкого, «н.в.» означает не выявляемый.

[Фиг. 4Е] Через 5 суток после инфекционной стимуляции (а именно, в сутки 26 после иммунизации) 4 мыши каждой группы подвергались умерщвлению для измерения их вирусных нагрузок при инфицировании легкого посредством ОТ-кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) (ген N).

Статистические критерии: двухфакторные дисперсионные анализы для сравнения каждого вируса с условием имитации. * р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

Фиг. 5: In vitro способности рекомбинантных вирусов rC-85473 и rCAN98-75 и их версий с делецией к связыванию с клеткой

[Фиг. 5А] Процентное содержание клеток LLC-MK2, в зависимости от времени связывания, инфицированных вирусом rCAN98-75 (кружки) и его ослабленными формами ΔSH-rCAN98-75 (квадраты) и ΔG-rCAN98-75 (треугольники).

[Фиг. 5В] Процентное содержание клеток LLC-MK2, в зависимости от времени связывания, инфицированных вирусом rC-85473 (кружки) и его ослабленными формами ΔSH-rC-85473 (квадраты) и ΔG-rC-85473 (треугольники).

Фиг. 6: Ex vivo способности к репликации рекомбинантных вирусов rC-85473 и rCAN98-75 на 3D модели восстановленного дыхательного эпителия человека и при культивировании на границе раздела воздух-жидкость.

[Фиг. 6А] Модели дыхательного эпителия человека в культуре инфицировали рекомбинантными вирусами rCAN98-75, ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75 (фотографии верхнего ряда) или рекомбинантными вирусами rC-85473 (белый), ΔSH-rC-85473 (темно-серый) и ΔG-rC-85473 (не поддающийся определению) (фотографии нижнего ряда).

[Фиг. 6В] Количественная оценка измеряемого потомства вируса (посредством количественной оценки вирусного генома) на апикальной поверхности эпителия, инфицированного рекомбинантными вирусами rCAN98-75 (WT, белый), ΔSH-rCAN98-75 (темно-серый) и ΔG-rCAN98-75 (светло-серый) (слева от пунктирной линии), или рекомбинантными вирусами rC-85473 (WT), ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 (справа от пунктирной линии).

[Фиг. 6С] Количественная оценка генома вируса, находящегося в эпителии, инфицированном рекомбинантными вирусами rCAN98-75 (WT, белый), ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75 (слева от пунктирной линии), или рекомбинантными вирусами rC-85473 (WT, белый), ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 (справа от пунктирной линии).

Фиг. 7. Секреция цитокинов и хемокинов, индуцированная инфицированием рекомбинантными вирусами rC-85473, на 3D модели восстановленного дыхательного эпителия человека и при культивировании на границе раздела воздух-жидкость.

Восстановленный дыхательный эпителий человека (MucilAir® НАЕ, Epithelix) инфицировали рекомбинантными вирусами rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 при MOI 0,1. Спустя 5 суток после инфицирования, количество нескольких цитокинов и хемокинов измеряют посредством методики Luminex (Bio Plex Pro kit assay, BioRad) из основной среды инфицированного эпителия:

[Фиг. 7А] Хемокины МСР-1, IP-10, RANTES, IL-8, Т-лимфоцит привлекающий G-CSF (от англ. Granulocyte colony-stimulating factor - Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), моноциты/макрофаги, эозинофилы и/или нейтрофилы.

[Фиг. 7В] Количественная оценка провоспалительных цитокинов IFN-γ (от англ. interferon gamma - интерферон гамма) и TNF-α (от англ. tumour necrosis factor alpha - фактор некроза опухоли-альфа).

[Фиг. 7С] Количественная оценка цитокина IL-7, стимулирующего дифференцировку Т- и В-лимфоцитов.

[Фиг. 7D] Фактор роста FGF (от англ. fibroblast growth factor - фактор роста фибробластов), участвующий в восстановлении тканей.

Статистические критерии: однофакторный дисперсионный анализ для сравнения вирусов ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 с вирусом rC-85473. *, р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

Фиг. 8. In vitro индуцированная вирусом секреция провоспалительных цитокинов 11-1β и TNF-α в модели иммортализованных мышиных макрофагов, инфицированных рекомбинантными hMPV rC-85473.

[Фиг. 8А] Оцениваемая вирусная нагрузка в БОЕ/мл в супернатантах клеток, собираемых каждые сутки на протяжении 2 суток после инфицирования клеточной линии иммортализованных мышиных макрофагов (линия BMDM, происходящая из костного мозга диких мышей), рекомбинантными вирусами rC-85473 (черный), ΔSH-rC-85473 (темно-серый) или ΔG-rC-85473 (светло-серый) при MOI 0,1.

[Фиг. 8В] Количество провоспалительного цитокина TNF-α, оцениваемого посредством анализа ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay -твердофазный иммуноферментный анализ), из клеточных супернатантов, собираемых каждые сутки на протяжении 2 суток после инфицирования иммортализованных мышиных макрофагов рекомбинантными вирусами rC-85473 (черный), ΔSН-rC-85473 (темно-серый) или ΔG-rC-85473 (светло-серый) при MOI 0,1, в сравнении с неинфицированными «имитационными» иммортализованными мышиными макрофагами (белый).

[Фиг. 8С] Количество провоспалительного цитокина IL-1β, оцениваемого посредством анализа ELISA, из клеточных супернатантов, собираемых каждые сутки на протяжении 2 суток после инфицирования иммортализованных мышиных макрофагов рекомбинантными вирусами rC-85473 (черный), ΔSH-rC-85473 (темно-серый) или ΔG-rC-85473 (светло-серый) при MOI 0,1, в сравнении с неинфицированными «имитационными» иммортализованными мышиными макрофагами (белый).

Статистические критерии: двухфакторный дисперсионный анализ для сравнения вирусов ΔSН-rC-85473 и ΔG-rC-85473 с вирусом rC-85473. * р меньше 0,05 и ** р мкньше 0,01.

Фиг. 9. Воспаление легких и рекрутинг клеток иммунной системы в месте инфицирования in vivo, через 5 суток после инфицирования мышей BALB/c рекомбинантными hMPV rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 (воспаление легких исключительно в случае ΔG-rC-85473).

[Фиг. 9А] Совокупный балльный показатель гистопатологии легкого, рассчитываемый в соответствии с оценкой интенсивности воспаления бронхиальных/эндобронхиальных, перибронхиальных, периваскулярных, интерстициальных, плевральных и внутриальвеолярных тканей легких мышей BALB/c, инфицированных вирусами rC-85473 (черный), ΔSH-rC-85473 (темно-серый), ΔG-rC-85473 (светло-серый) или «имитационных» неинфицированных, причем указанные ткани собирают и фиксируют посредством формальдегида через 5 суток после инфицирования вирусом.

[Фиг. 9В] Фенотипирование иммунных клеток, определяемое с помощью иммуномечения (антитела против CD45, против CD11b, против CD170, против Ly6C, против Ly6G, против CD11c, против CD115, против В220, против CD3ε, против CD4, против CD8a) посредством проточной цитометрии, из лизатов легких мышей BALB/c, инфицированных вирусами rC-85473 и ΔSH-rC-85473, спустя 5 суток после инфицирования. Рекрутированные клетки иммунной системы подразделяют на четыре категории: CD8+ Т-лимфоциты (CD8+ Т-клетки), CD4+ Т-лимфоциты (CD4+ Т-клетки), моноциты/макрофаги и нейтрофилы.

Статистические критерии: однофакторный дисперсионный анализ для сравнения вирусов ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 с вирусом rC-85473. ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

Фиг. 10. Характеристика in vivo вторичного иммунного ответа в мышиной модели BALB/c, иммунизированной рекомбинантными hMPV ΔG-C-85473 и ΔSH-C-85473, после инфекционной стимуляции.

Через 1 и/или 5 суток после инфекционной стимуляции вирусом WT rC-85473, как например, описано на Фиг. 4А, количество нескольких цитокинов и хемокинов измеряют методикой Luminex (BioPlex Pro kit assay, BioRad) из лизатов легкого [Фиг. 10А-С]; фенотипирование клеток иммунной системы, инфильтрированных в ткань легкого, определяют с помощью иммуномечения (антитела против CD45, против Ly6G, против CD11b, против CD170/Siglec-F, против Ly6C, против CD11c, против F4/80, против В220, против CD3ε, против CD4 и против CD8a) посредством проточной цитометрии, из лизатов легкого [Фиг. 10D-F]; и совокупный балльный показатель гистопатологии легкого рассчитывают в соответствии с оценкой интенсивности воспаления бронхиальных/эндобронхиальных, перибронхиальных, периваскулярных, интерстициальных, плевральных и внутриальвеолярных тканей легких мышей, фиксированных с помощью формальдегида [Фиг. 10G].

На Фиг. 10А-10G представлены:

- черным, группа мышей BALB/c, иммунизированных вирусом rC-85473;

- темно-серым, группа, иммунизированная вирусом ΔSH-C-85473;

- светло-серым, группа, иммунизированная вирусом ΔG-C-85473;

- и, если представлено, белым так называемая «имитационная» неиммунизированная группа.

N равен 2 или 3 мыши/группа, соответственно, в случае гистопатологических анализов или анализов секреции цитокинов/рекрутинга клеток.

Статистические критерии: двухфакторный дисперсионный анализ для сравнения каждой группы друг с другом * р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

[Фиг. 10А] Количественная оценка провоспалительных цитокинов IL-6 и IFN-y, после 1 и 5 суток инфекционной стимуляции.

[Фиг. 10В] Количественная оценка противовоспалительного цитокина IL-10, после 1 и 5 суток инфекционной стимуляции.

[Фиг. 10С] Количественная оценка привлечения хемокинов G-CSF, МСР-1, М1Р-1α и MIP-1β и стимуляции активации и дифференцировки иммунных клеток после 1 и 5 суток инфекционного стимулирования.

[Фиг. 10D] Количественная оценка CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, инфильтрированных в ткань легкого мышей BALB/c, после 1 и 5 суток инфекционного стимулирования.

[Фиг. 10Е] Количественная оценка В-лимфоцитов, инфильтрированных в ткань легкого мышей BALB/c, после 1 и 5 суток инфекционного стимулирования.

[Фиг. 10F] Количественная оценка макрофагов и нейтрофилов, инфильтрированных в ткань легкого мышей BALB/c, после 1 и 5 суток инфекционного стимулирования.

[Фиг. 10G] Совокупный балльный показатель, после 5 суток инфекционного стимулирования.

Подробное описание изобретения

Вирусные штаммы метапневмовируса человека (hMPV)

hMPV идентифицировали в 2001 году, как являющиеся частью семейства Pneumoviridae.

Организация генома hMPV аналогична hRSV. Он подразделен на несколько ORF (от англ. Open Reading Frames - открытые рамки считывания), кодирующих белки N, Р, М, F, М2 (М2-1 и М2-2), SH, G и L. Общая структура генома представлена для вирусов rC-8543 и rCAN98-75 на фиг. 1А и 1В.

Вирусы - члены семейства Pneumoviridae экспрессируют на своей поверхности три гликопротеина, обозначаемых белками F, G и SH.

Слитый гликопротеин F, высококонсервативный среди разных подгрупп hMPV, участвует в проникновении вируса в клетки-мишени и образовании синцития, иными словами, больших многоядерных клеток, полученных в результате слияния отдельных клеток после их инфицирования вирусом. Также считается, что гликопротеин F является главным антигеном вирусов hRSV и hMPV, делая возможным индуцировать продукцию нейтрализующих антител.

Белок G представляет собой мембранный белок типа II, причем его С-концевой конец находится снаружи от клетки. Данный белок не является существенным для сборки вирусных компонентов и для репликации in vitro. В случае hRSV показано, что удаление гена, кодирующего данный белок, ослабляло вирулентность штамма во время инфицирования дыхательных путей мышей.

Белок SH также представляет собой мембранный белок типа II, функция которого в вирусном цикле все еще является неизвестной. В случае hRSV удаление гена, кодирующего белок SH, генерирует рекомбинантный вирус, способный к размножению in vitro, и вирулентность которого ослаблена в верхних дыхательных путях мышей, но не в нижней части указанных путей.

Генетический анализ клинических штаммов hMPV сделал возможным определить две главные группы (серотипы А и В) и четыре «небольшие» подгруппы (А1, А2, В1 и В2), главным образом в зависимости от вариабельности последовательности гликопротеинов поверхностного связывания (G) и слитых гликопротеинов (F). Затем было показано, что данные группы опять же могут быть подразделены на сублинии, такие как А2а и A2b (Huck et al., 2006).

Среди широко изученных штаммов вирусов можно привести штамм NL 00-1, принадлежащий к серотипу А1; штамм CAN 97-83, принадлежащий к серотипу А2; и штамм CAN 98-75, принадлежащий к серотипу В2.

В основе настоящего изобретения лежит вирусный штамм метапневмовируса человека, обозначаемый rC-85473, выделенный из образца пациента в Канаде, на который, в частности, ссылаются в статье (Hamelin et al., 2010).

Применение белка F данного штамма, в комбинации с белком М, было предложено в качестве стратегии вакцинации (Aerts et al., 2015а).

Применение данного штамма вируса rC-85473, инактивированного обработкой формалином, в качестве инактивированного живого вакцинного штамма, описано в статье (Palwithino et al., 2015). Подвергнутую тепловой инактивации версию штамма rC-85473 также тестировали (Hamelin et al., 2007).

Совсем недавно, сильные способности данного штамма к слиянию исследованы подробно, исходя из белковой последовательности его белка F (Dubois et al., 2017).

На последовательность гена F и гена М штамма rC-85473 дана ссылка в GenBank, соответственно, с номерами доступа KМ408076.1 и KМ408077.1.

Полная последовательность генома данного штамма вируса rC-85473, содержащая 13394 нуклеотида, раскрыта в данном документе впервые: она представлена в прилагаемом перечне последовательностей под референсной SEQ ID NO. 1.

Ниже в Таблице 4 показана выраженная в процентах идентичность данного штамма rC-85473 с тремя другими вирусными штаммами метапневмовируса человека: CAN 97-83, CAN 98-75 и NL 00-1.

Относительно высокой гомологии последовательностей, наблюдаемой в случае штамма NL 00-1, можно сделать вывод о том, что данный штамм rC-85473 является членом подгруппы А1.

Штамм rC-85473 характеризуется значительными фузогенными способностями, делающими возможным его проникновение в клетки-мишени с высокой частотой/высокой степенью инфицирования. Данная значительная фузогенная способность данного штамма позволяет получать особенно удлиненные синцитии. Синцитии представляют собой гигантские многоядерные клетки. Вирус rC-85473 обладает высокой способностью к индукции слияния клеток in vitro, приводя к образованию данных сильно удлиненных синтициев, состоящих из очень большего числа клеточных ядер.

Показано, что 5 аминокислот функционального домена HRA белка F, аминокислот, уникальных среди других известных штаммов hMPV, частично ответственны за данный гиперфузогенный фенотип (Aerts et al., 2015b; Dubois et al., 2017).

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения пептидная последовательность белка F ослабленного штамма вируса, происходящего из штамма rC-85473, содержит данные 5 аминокислот функционального домена HRA, как например, описано в (Dubois et al., 2017).

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения пептидная последовательность белка F ослабленного штамма вируса, полученного из штамма rC-85473, не является модифицированной и, таким образом, является идентичной пептидной последовательности белка F штамма rC-85473, как например, описано в (Dubois et al., 2017).

Технология обратной генетики

Технология обратной генетики делает возможным создание, из последовательности нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, и из соответствующих клеток-хозяев, функционального вируса, заключенного в капсид.

Рекомбинантный штамм rC-85473 человеческого метапневмовируса, таким образом, получали из клинического штамма, обозначаемого С-85473, выделенного у пациента.

Первая система обратной генетики, применяемая в отношении hMPV, была описана в 2004 году (Biachesi et al., 2004). Данная технология также описана в статье (Aerts et al., 2015b).

Принцип данной технологии, которая обеспечивает продукцию рекомбинантных hMPV, основан на применении линии клеток почки хомяка (ВНK-21), модифицированной для экспрессии конститутивно РНК-полимеразы бактериофага Т7 (клетки ВНK-Т7 или BSR-T7/5).

Элементы генома распространены в следующих пяти плазмидных элементах: плазмида, кодирующая антигеном hMPV, и 4 «сателлитные» плазмиды, кодирующие вирусные белки аппарата транскрипции (L, Р, N и М2-1).

После совместной трансфекции данных клеток антигеномной плазмидой hMPV и четырьмя «сателлитными» плазмидами, РНК-цепь, соответствующая цепи вирусного генома (отрицательная цепь РНК), транскрибируется посредством полимеразы Т7 со своего промотора.

Четыре белка, участвующих в транскрипции вируса hMPV, также экспрессируются трансфицированными клетками-хозяевами с образованием активного РНК-зависимого РНК-полимеразного (RdRP) комплекса. Данная функциональная вирусная полимераза, таким образом, транскрибирует геномную РНК в вирусную мРНК, затем реплицирует ее в новые молекулы вирусной геномной РНК, посредством транскрипции матричных цепей.

Трансляция и сборка вирусных белков с геномной РНК, таким образом, обеспечивают почкование инфекционных частиц hMPV из цитоплазматической мембраны трансфицированных клеток ВНК-Т7. Затем, амплификация рекомбинантных вирусов обеспечивается, благодаря добавлению в сокультуру клеток LLC-MK2 (ATCCCCL-7), пермиссивных в отношении инфекции.

Таким образом, исходя из геномной последовательности конкретного штамма вируса, возможно, получать рекомбинантные вирусы, благодаря данным модифицированным клеткам, которые имеются в продаже.

Ослабленный штамм вируса, происходящий из штамма rC-85473 Настоящее изобретение относится к ослабленному штамму вируса, полученному из штамма метапневмовируса человека, содержащего геномную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO. 1, причем указанный ослабленный штамм содержит одну или более генетических модификаций указанной последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющих вирулентность указанного штамма.

В настоящей заявке термины «вирус» и «штамм вируса» используются в равной мере для обозначения конкретного штамма вируса, как например, идентифицировано ранее.

В смысле изобретения считается, что термин «полученный штамм» означает рекомбинантный штамм вируса, полученный посредством введения генетических модификаций в геном штамма вируса, так называемого «исходного штамма». Исходный штамм преимущественно представляет собой дикий штамм, например, клинический изолят.

Все генетические модификации, вводимые в исходный штамм, нацелены на ослабление вирулентности указанного исходного штамма, а не на модификацию идентичности его генома.

В частности, данные генетические модификации касаются только генов, кодирующих белки, не являющиеся крайне важными для репликации вируса, иными словами «акцессорные белки», такие как белки SH и G. В данном генетически модифицированном ослабленном штамме пептидная последовательность белка F исходного штамма rC-85473 не модифицирована, и, таким образом, имеет такую же пептидную последовательность, как и исходный штамм.

Вирулентность штамма вируса соответствует степени быстроты размножения вируса в данном организме, таким образом, его скорости заражения. Считается, что фраза «ослабление вирулентности», таким образом, означает уменьшение скорости заражения вирусом в организме.

Данное ослабление может принимать вид уменьшения в способностях к репликации штамма вируса, и/или уменьшения в его способности инфицировать клетки-мишени, и/или вместо этого уменьшения в патологии, вызываемой вирусной инфекцией организма.

Таким образом, считается, что фраза «ослабленный штамм вируса» означает, в смысле изобретения, рекомбинантный вирус, вирулентность которого уменьшена, по сравнению с вирулентностью исходного штамма вируса, иными словами, меньше, чем вирулентность исходного штамма вируса.

Для измерения вирулентности вирусного штамма, можно проводить in vitro, ex vivo или in vivo анализы, такие как, например, анализы способности к репликации in vitro (измеряется посредством титрования ТСID50/мл или количественной ПЦР), осуществляя контроль посредством наблюдения под микроскопом развития in vitro и ex vivo цитопатических эффектов, или осуществляя контроль над клиническими признаками патологии, наблюдение за легочной гистопатологией и измерение вирусных нагрузок легкого в модели инфицирования in vivo.

Для сравнения физиологических эффектов дикого штамма и ослабленного штамма, также возможно измерить/определить разные физиологические параметры, модифицированные на уровне легкого и/или других иммунных систем организма-хозяина вируса.

Как описано в примерах 7, 8 и 9 настоящей заявки, следующие эффекты, вызываемые вирусом, могут быть оценены для сравнения физиологических эффектов ослабленных штаммов вируса, или в сравнении друг с другом или с диким штаммом вируса:

- секреция провоспалительных цитокинов (клетками эпителия и/или макрофагами);

- секреция хемокинов;

- секреция факторов роста;

- уровень воспаления легких (балльная оценка, вычисляемая по оцениванию интенсивности воспаления тканей); и

- фенотипирование иммунных клеток, рекрутированных в месте инфицирования in vivo.

Данные разные измерения позволяют узнать более точно физиологический эффект каждого штамма вируса и выбрать в зависимости от данных характеристик те, которые будут наиболее подходящими для разработки ослабленной живой противовирусной вакцины.

Генетические модификации, вводимые в штамм вируса, для получения его ослабления

Настоящее изобретение относится к ослабленному штамму вируса, происходящему из штамма метапневмовируса человека, содержащего геномную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO. 1, причем указанный ослабленный штамм содержит одну или более генетических модификаций указанной последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющих вирулентность указанного штамма.

Считается, что под фразой «генетические модификации, ослабляющие вирулентность указанного штамма» подразумеваются генетические модификации относительно генов, кодирующих белки, не являющиеся крайне важными для репликации вируса, хорошо известные специалисту в данной области. Среди данных белков, в частности, известны белки G и SH, описанные выше.

Иными словами настоящая заявка относится к ослабленному штамму вируса, полученному из штамма метапневмовируса человека, содержащего геномную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO. 1, причем указанный ослабленный штамм генетически модифицирован для ослабления его вирулентности, что означает, что вводимые генетические мутации вводили исключительно в гены, кодирующие белки, не являющиеся крайне важными для репликации данного вируса.

Разные генетические модификации, делающие возможным ослабление вирулентности штамма вируса, известны специалисту в данной области. Данные модификации могут быть введены в геном исходного штамма rC-85473.

Генетические модификации обозначают, в смысле изобретения, все модификации исходной нуклеотидной последовательности, такие как делеция одного или более нуклеотидов, добавление одного или более нуклеотидов, и замена одного или более нуклеотидов. Данные модификации в частности содержат все модификации, позволяющие сдвинуть генетическую рамку считывания или ввести стоп-кодон в середину кодирующей последовательности, или удалить всю или часть одной или более кодирующих последовательностей.

Среди генетических модификаций, предназначенных для ослабления вирулентности штамма вируса, в частности, известны генетические модификации, позволяющие инактивировать или даже удалить один или более генов, кодирующих белки, не являющиеся крайне важными для репликации вируса в культуре.

Например, ослабленные вирусные штаммы метапневмовируса человека получены посредством инактивации, в частности, посредством удаления генов, кодирующих акцессорные белки SH, G и М2-2.

Однако, в зависимости от характеристик исходного штамма вируса, из которого получают ослабленные штаммы, функциональные характеристики ослабленных штаммов вируса могли бы очень отличаться, причем вирулентность штаммов зависит как от исходного генома, так и от сделанных генетических модификаций.

Согласно первому аспекту изобретения ослабленный штамм вируса согласно изобретению характеризуется тем, что модификации последовательности SEQ ID NO.1 включают инактивацию гена, кодирующего белок SH.

Более конкретно, ослабленный штамм вируса согласно изобретению характеризуется тем, что генетическая модификация последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющая вирулентность указанного штамма, заключается в инактивации гена, кодирующего белок SH.

В смысле изобретения, инактивация гена означает тот факт, что данный ген модифицирован таким путем, что продукт данного гена больше не экспрессируется или экспрессируется в неактивной форме, экспрессируется в таком маленьком количестве, что активность данного белка является несуществующей. Данная инактивация гена может осуществляться всеми методиками, хорошо известными специалисту в данной области.

В частности, инактивация гена может быть получена в результате введения точечной мутации в ген, в результате частичного или полного удаления кодирующих последовательностей гена или, вместо этого, в результате модификации промотора гена. Данные разные генетические модификации будут проводиться в соответствии с любой из методик молекулярной биологии, хорошо известных специалисту в данной области.

В смысле изобретения считается, что фраза «удаление гена» означает удаление из генома штамма вируса значимой части кодирующей последовательности данного гена, в частности:

- когда оно включает частичное удаление, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% указанной кодирующей последовательности;

- когда оно включает полное удаление, 100% указанной кодирующей последовательности.

Согласно предпочтительному воплощению в ослабленном штамме вируса согласно изобретению ген, кодирующий белок SH, полностью удален, что означает, что вся (100%) кодирующая последовательность для белка SH была удалена из исходной последовательности SEQ ID NO. 1.

В частности, указанный штамм вируса содержит нуклеотидную последовательность, такую как представлено в SEQ ID NO. 2. Более конкретно, последовательность указанного штамма вируса состоит из нуклеотидной последовательности, такой как представлено в SEQ ID NO. 2.

Как проиллюстрировано в примерах данный ослабленный штамм, обозначаемый (ΔSH-rC-85473, обладает следующими характеристиками:

- In vitro, инфицирование и репликация на клетках в культуре является нормальным (отсутствует отличие от характеристик исходного штамма);

- In vivo, инфицирование мышей данным рекомбинантным вирусом (ΔSH-rC-85473 вызывает только очень маленькую потерю массы, в отличие от инфицирования исходным штаммом; выживаемость инфицированных мышей составляет 100%, тогда как данный ослабленный вирус реплицируется в тканях легкого;

- In vivo, перед иммунизацией мышей данным ослабленным штаммом защищает 100% мышей, стимулируемых летальной дозой дикого вируса rC-85473. Данная защита также проиллюстрирована отсутствием выявления инфекционного вируса rC-85473 в легких, спустя 5 суток после стимуляции; и большой нагрузкой микронейтрализации в сравнении с гомологичным штаммом вируса (С-85473, серотипа А) и в сравнении с по меньшей мере одним гетерологичным штаммом (CAN98-75, серотипа В) сывороток в D+21 после инфекционной стимуляции;

In vitro, способность к связыванию с клетками LLC-MK2 в культуре и инфицированию клеток гораздо лучше в случае ослабленного вируса ΔSH-rC-85473 (примерно 60% инфицированных клеток), в сравнении со способностью к связыванию с клетками и инфицированию клеток вируса ΔSH-rCAN98-75 (примерно 40% инфицированных клеток);

- Ex vivo, инфицирование модели дыхательного эпителия данным ослабленным штаммом вызывает секрецию цитокинов и хемокинов в количестве, эквивалентном или меньше, чем количество, вызываемое диким штаммом; воспалительный ответ, однако, уменьшается по сравнению с воспалительным ответом, вызываемым диким штаммом (фиг. 7А, 7В);

- In vitro, инфицирование макрофагов данным ослабленным штаммом индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов, но с кинетикой, отличной от кинетики, вызываемой диким штаммом вируса (Фиг. 8В, 8С);

- In vivo, индуцируемое вирусом воспаление тканей легкого значимо меньше после инфицирования данным ослабленным штаммом, чем в случае дикого штамма (Фиг. 9А); однако, рекрутирование иммунных клеток все еще обеспечивается (фиг. 9В).

Согласно второму аспекту изобретения ослабленный штамм вируса согласно изобретению характеризуется тем, что модификации последовательности SEQ ID NO. 1 включают инактивацию гена, кодирующего белок G.

Более конкретно, ослабленный вирусный штамм согласно изобретению характеризуется тем, генетическая модификация последовательности SEQ ID NO.1, ослабляющая вирулентность указанного штамма, заключается в инактивации гена, кодирующего белок G.

Согласно предпочтительному воплощению в ослабленном штамме вируса согласно изобретению ген, кодирующий белок G, полностью удален, что означает, что вся (100%) кодирующая последовательность для белка G удалена из исходной последовательности SEQ ID NO. 1.

В частности, указанный штамм вируса содержит нуклеотидную последовательность, такую как представлено в SEQ ID NO. 3. Более конкретно, последовательность указанного штамма вируса состоит из нуклеотидной последовательности, такой как представлено в SEQ ID NO. 3.

Как проиллюстрировано в примерах данный ослабленный штамм, обозначенный ΔG-rC-85473, имеет следующие характеристики:

- In vitro, в модели клеток LLC-MK2, инфицирование и репликация на клетках в культуре являются нормальными (отсутствует отличие от характеристик исходного штамма);

- In vivo, инфицирование мышей, инфицируемых данным рекомбинантным вирусом ΔG-rC-85473, индуцирует только очень маленькую потерю массы; выживаемость инфицированных мышей составляет 100%; тогда как данный вирус реплицируется в тканях легкого;

- In vivo, предварительная иммунизация мышей данным ослабленным штаммом защищает 100% мышей, стимулированных летальной дозой дикого вируса rC-85473. Данная защита также проиллюстрирована отсутствием выявления инфекционного вируса и дикого генома rC-85473 в легких в D+5 после стимуляции; и высокой нагрузкой микронейтрализации в сравнении с гомологичным штаммом вируса (С-85473, серотипа А) и в сравнении с по меньшей мере одним гетерологичным штаммом (CAN98-75, серотипа В) сывороток в D+21 после инфекционной стимуляции;

- In vitro, способность связываться с клетками LLC-MK2 в культуре и инфицировать клетки гораздо лучше в случае ослабленного вируса ΔG-rC-85473 (примерно 60% инфицированных клеток), в сравнении со способностью связываться с клетками LLC-MK2 в культуре и инфицировать клетки вируса ΔG-rCAN98-75 (меньше чем 20% инфицированных клеток).

- Ex vivo, инфицирование модели дыхательного эпителия данным ослабленным штаммом индуцирует секрецию цитокинов и хемокинов в количестве, значительно меньшем, чем количество, индуцируемое диким штаммом (фиг. 7);

- In vitro, инфицирование макрофагов данным ослабленным штаммом индуцирует секрецию TNF-α, эквивалентно секреции, индуцируемой диким штаммом вируса; но только индуцирует очень незначительную секрецию IL-1β (Фиг. 8В, 8С);

- In vivo, индуцируемое вирусом воспаление тканей легкого значительно меньше после инфицирования данным ослабленным штаммом, чем в случае дикого штамма или чем в случае ослабленного штамма (ΔSH-rC-85473 (фиг. 9А).

Согласно третьему аспекту изобретения ослабленный штамм вируса согласно изобретению характеризуется тем, что модификации последовательности SEQ ID NO. 1 включают инактивацию двух генов, кодирующих белок G и белок SH.

Более конкретно, ослабленный штамм вируса согласно изобретению характеризуется тем, что генетические модификации последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющие вирулентность указанного штамма, заключаются в инактивации двух генов, из которых один кодирует белок SH и другой - белок G.

Согласно конкретному воплощению инактивация двух генов соответствует полному удалению одного или другого или данных двух генов, кодирующих белки G и SH.

Кроме того, понятно, что любая другая генетическая модификация, позволяющая ослаблять вирулентность штамма rC-85437, могла быть введена в геном указанного штамма, представленный последовательностью SEQ ID NO. 1.

Введение экзогенных генов в геном штамма вируса rC-85473 Согласно одному аспекту изобретения нуклеотидная последовательность ослабленного штамма вируса согласно изобретению могла быть генетически модифицирована введением по меньшей мере одного экзогенного гена.

Таким образом, ослабленный штамм вируса согласно изобретению имеет последовательность генома, которая содержит по меньшей мере один экзогенный ген. Данный экзогенный ген мог в частности представлять собой ген, кодирующий вирусный антиген.

В смысле данного изобретения считается, что термин «вирусный антиген» означает белковый элемент или элемент другой природы, экспрессируемый вирусом, который иммунологическая система индивида распознает как чужеродный и который вызывает ответ в указанном индивиде в результате продукции специфичных антител и/или стимуляции клеточного иммунного ответа.

Вирусные антигены в частности могли быть выбраны из антигенов, экспрессируемых по меньшей мере одним вирусом гриппа или по меньшей мере одним вирусом семейства Pneumoviridae, таким как hRSV, или по меньшей мере одним вирусом семейства Paramyxoviridae, таким как вирус парагриппа.

Более конкретно, указанный вирусный антиген мог быть выбран из всего или части белка F hRSV, и всего или части гемагглютинина вируса гриппа или парагриппа.

Данный ослабленный штамм вируса позволит во время его введения пациенту образовывать множественный иммунный ответ, и на экспрессируемый вирусный антиген и на hMPV.

Такой штамм, позволяющий получить объединенный иммунный ответ на несколько вирусов после единичного введения, является очень преимущественным.

Кроме того, такой ослабленный штамм вируса, содержащий по меньшей мере один экзогенный ген, мог быть использован in vivo, ex vivo или in vitro, в качестве экспрессионного вектора по меньшей мере одного экзогенного гена в клетках-мишенях метапневмовируса человека.

Фраза «клетки-мишени метапневмовируса человека» обозначает эпителиальные клетки дыхательных путей индивидов, подверженных инфицированию данным вирусом. Данная экспрессия также обозначает все клеточные линии, делающие возможной in vitro репликацию указанного вируса.

Ослабленный штамм вируса для его применения в качестве лекарственного средства

Настоящее изобретение также относится к ослабленному штамму вируса, такому как определено выше, для его применения в качестве лекарственного средства.

Действительно, данный штамм может быть использован, в частности, для лечения или предупреждения вирусных инфекций.

Термин «лечить» означает факт противодействия инфекции, вызываемой вирусом у человека или животного организма. Благодаря введению по меньшей мере одной композиции согласно изобретению, уровень вирусной инфекции (инфекционной нагрузки) в организме собирается снижаться, и предпочтительно вирус собирается полностью исчезнуть из данного организма. Термин «лечить» также означает факт ослабления симптомов, ассоциированных с вирусной инфекцией (респираторный синдром, почечная недостаточность, лихорадка и т.д.).

В смысле изобретения термин «предупреждать» означает факт избегания или по меньшей мере снижения риска возникновения инфекции у человека или животного организма. Благодаря введению по меньшей мере одного ослабленного штамма вируса согласно изобретению человеческие или животные клетки указанного организма становятся менее пермиссивными по отношению к инфекции и, таким образом, являются самыми подходящими для того, чтобы не быть инфицированными указанным вирусом.

Более конкретно, изобретение относится к ослабленному вирусному штамму, такому как определено выше, для его применения для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae.

Понятно, что данный ослабленный штамм вируса будет предпочтительно интегрирован в вакцинную композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для суспендирования указанного штамма и для его введения.

Указанная вакцинная композиция содержит по меньшей мере один ослабленный штамм вируса согласно изобретению, делая возможной стимуляцию специфичным образом иммунной системы человека или животного организма.

Таким образом, вакцинная композиция содержит по меньшей мере один ослабленный живой штамм вируса, который играет роль антигена, а именно соединения, индуцирующего специфичный иммунный ответ в организме, который будет сохранять память о нем.

Такая вакцинная композиция могла бы использоваться в качестве профилактической вакцины, а именно, предназначенной для стимуляции специфичного иммунного ответа до инфицирования организма патогенным вирусом.

Такая вакцинная композиция могла бы также использоваться в качестве терапевтической вакцины, а именно, предназначенной для стимуляции специфичного иммунного ответа, наряду с инфицированием организма указанным патогенным вирусом.

Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых Pneumoviridae, у человека, включающему введение индивидам, подверженным инфицированию такими вирусами, по меньшей мере одного ослабленного штамма вируса, такого как описано ранее.

Настоящее изобретению также относится к способу предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых Pneumoviridae у человека, включающему введение индивидам, подверженным инфицированию такими вирусами, по меньшей мере одной вакцинной композиции, содержащей по меньшей мере один ослабленный штамм вируса, такой как описано ранее.

Согласно конкретному воплощению изобретения инфекции представляют собой инфекции, вызываемые метапневмовирусами человека.

Согласно другому конкретному воплощению изобретения инфекции представляют собой инфекции, вызываемые ортопневмовирусами, такими как респираторно-синцитиальный вирус человека (hRSV).

Изобретение также относится к ослабленному штамму вируса, последовательность которого содержит по меньшей мере один экзогенный ген, кодирующий вирусный антиген, для его применения для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых вирусами, где по меньшей мере один вирусный антиген экспрессируется указанным ослабленным штаммом вируса.

Согласно конкретному воплощению ослабленный штамм вируса согласно изобретению, содержащий в качестве экзогенного вирусного антигена белок F hRSV, мог быть использован для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых hRSV.

Согласно другому конкретному воплощению ослабленный штамм вируса согласно изобретению, содержащий в качестве экзогенного вирусного антигена гемагглютинин вируса гриппа, мог быть использован для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых вирусом гриппа.

Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один ослабленный штамм вируса

Настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей в фармацевтически приемлемом носителе по меньшей мере один ослабленный штамм вируса согласно изобретению и возможно адъювант.

Согласно изобретению термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает носители или вспомогательные вещества, а именно соединения, не оказывающие специфичного действия на инфекцию, рассматриваемую в данном документе. Данные носители или вспомогательные вещества являются фармацевтически приемлемыми, что говорит о том, что их можно вводить индивиду или животному без риска значимых вредных эффектов или недопустимых нежелательных действий.

Понятно, что вакцинная композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере одно эффективное количество ослабленного штамма вируса. Считается, что термин «эффективное количество» означает, в смысле данного изобретения, количество ослабленного штамма вируса, достаточное для того, чтобы спровоцировать иммунный ответ в организме, которому его вводят.

Вакцинные композиции, используемые согласно настоящему изобретению, подходят для перорального, сублингвального, ингаляционного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения.

Согласно конкретному воплощению изобретения вакцинная композиция согласно изобретению характеризуется тем, что она находится в фармацевтической форме, предназначенной для введения посредством ингаляции.

Ингаляция обозначает поглощение дыхательными путями. В частности, это является способом поглощения соединений в терапевтических целях некоторых веществ в виде газа, микрокапель или порошков в суспензии.

Введение фармацевтических или ветеринарных композиций посредством ингаляции, иными словами посредством носовых и/или буккальных проходов, хорошо известно специалисту в данной области.

Различают два типа введения посредством ингаляции:

- введение посредством инсуффляции, когда композиции находятся в виде порошков, и

- введение посредством распыления, когда композиции находятся в виде аэрозолей (суспензий) или в виде растворов, например, находящихся под давлением водных растворов. В таком случае для введения фармацевтической или ветеринарной композиции будет рекомендовано применение небулайзера или спрея.

Фармацевтическая форма, рассматриваемая в данном документе, таким образом, преимущественно выбрана из: порошка, водной суспензии капель или раствора, находящегося под давлением.

Популяция индивидов для вакцинации главным образом представляет собой детскую популяцию, иными словами состоящую из индивидов в возрасте менее чем 18 лет и более конкретно маленьких детей в возрасте меньше чем 5 лет и младенцев. Действительно, вирусы семейства Pneumoviridae главным образом инфицируют данных индивидов, которые имеют склонность к менее сильному иммунитету, чем индивиды более старшего возраста.

Изобретение также относится к вакцинной композиции, как например, описано выше, для ее применения для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae.

Примеры

Пример 1: Рекомбинантные hMPV, полученные из клинических штаммов С-85473 и CAN98-75. 1А

Генетические конструкции, представленные на фиг. 1А и 1В, получали для того, чтобы вирусы были выявляемы за счет экспрессии GFP (зеленый флуоресцентный белок), и для введения в рекомбинантные референсные штаммы rC-85473 и rCAN98-75 генетических модификаций, предназначенных для ослабления их вирулентности:

- удаление гена, кодирующего белок SH (ΔSH);

- удаление гена, кодирующего белок G (ΔG).

Полные последовательности данных генетических конструкций представлены в SEQ ID NO. 4 (GFP rC-85473), SEQ ID NO.5 (GFP ΔSH-rC-85473), SEQ ID NO.6 (GFP ΔG-rC-85473) и SEQ ID NO. 8 (GFP rCAN98-75). Последовательности штаммов вируса, происходящие из rCAN98-75 и связанные с GFP, не представлены, но доступны для специалиста в данной области в зависимости от других представленных генетических конструкций.

Как показано на фотографиях клеток LLC-MK2, инфицированных, с множественностью инфекции (MOI) 0,01, вирусами, являющимися видимыми, благодаря GFP, следующие полученные рекомбинантные вирусы: ΔSH-rCAN98-75, ΔG-rCAN98-75, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 являются функциональными и репликативными. Клетки наблюдают посредством флуоресцентной микроскопии через трое суток после инфицирования.

Фотографии указывают на то, что рекомбинантные вирусы rCAN98-75 кажутся менее инфекционными и менее репликативными, чем рекомбинантные вирусы rC-85473: интенсивность флуоресценции ниже, и синцитии имеют более уменьшенные размеры.

Пример 2: In vitro способности рекомбинантных вирусов rC-85473 и rCAN98-75 к репликации

Клетки LLC-MK2 инфицировали отдельно, с множественностью инфекции 0,01, следующими рекомбинантными вирусами:

- rCAN98-75, ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75 (фиг. 2А)

- rC-85473, ΔSH- rC-85473 и ΔG-rC-85473 (фиг. 2В)

Клеточные супернатанты собирали каждые сутки на протяжении 7 суток, в трехкратной повторности, затем их вирусные нагрузки оценивали в ТСID50/мл. Двухфакторные дисперсионные статистические анализы проводили для сравнения каждого рекомбинантного вируса с делецией (ΔSH и ΔG) с диким рекомбинантным вирусом.

На Фиг. 2А и 2В показаны полученные результаты: способности к репликации и продукции отличаются в зависимости от природы исходного штамма, CAN98-75 или С-85473, в случае ослабленных рекомбинантных вирусов.

Рекомбинантные вирусы rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 обладают способностями к репликации и продукции, гораздо лучшими, чем способности к репликации и продукции вирусов rCAN98-75, ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75. Вирусы ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75 являются наименее эффективными, тогда как вирусы ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 обладают наилучшими способностями к продукции в культуре на клетках LLC-MK2.

Ниже в таблицах представлены средние нагрузки вирусных стоков, полученных и концентрированных для каждого рекомбинантного вируса rCAN98-75, ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75 (таблица 5) и rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 (таблица 6).

Вирусные нагрузки рассчитывали в единицах «ТСID50», что представляет конечное разведение вируса, при котором 50% клеточной ткани разрушено инфекцией, или демонстрирует видимые цитопатические эффекты (доза заражения 50% культуры ткани).

Данные вирусные нагрузки подтверждают предшествующие результаты, а именно, что ослабленные штаммы вирусов, происходящие из С-85437, обладают удовлетворительными способностями к репликации, не уменьшенными в сравнении со способностями к репликации исходного штамма.

Пример 3: In vivo характеристика рекомбинантных hMPV rCAN98-75 и rC-85473 на модели инфицирования вирусом мышей BALB/c

Мышей BALB/c инфицировали посредством интраназальной инстилляции:

- культуральной среды OptiMem (имитация) или

- 2,5×10⁵ единиц флуоресцирующих фокусов (FFU - от англ. Fluorescent Focal Unit) рекомбинантных вирусов, экспрессирующих GFP: rCAN98-75, (ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75, или

- 5×10⁵ TCID50 вирусов, не экспрессирующих GFP: rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473.

Данные две используемые дозы вирусов эквивалентны (дикие вирусы создают эквивалентные эффекты у мышей после инфицирования).

Массу и выживаемость мышей отслеживали ежесуточно на протяжении 14 суток (масса, средняя по 10 мышам, ±SEM (от англ. standard error of mean -стандартная ошибка среднего).

Кроме того, через 5 суток после инфицирования, 5 мышей на группу подвергались умерщвлению для измерения вирусных нагрузок при инфицировании легкого в TCID50.

Статистические анализы проводили (двухфакторный дисперсионный анализ) для сравнения каждого вируса с условием имитации. * р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

На Фиг. 3А и 3В показаны результаты, полученные с вирусами rCAN98-75, ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75; на фиг. 3С и 3D показаны результаты, полученные с вирусами rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473.

Данные результаты указывают на то, что рекомбинантные вирусы ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473 вызывают только очень небольшую потерю массы; фактически, данные группы мышей ведут подобно неинфицированной группе мышей.

Кроме того, вирусные нагрузки легкого (Фиг. 3D) похожи на вирусные нагрузки легкого, наблюдаемые в группе, инфицированной вирусом rC-85473, указывая на репликацию в легком ослабленных вирусов с делецией.

Результаты различаются у рекомбинантных вирусов ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75: вирус ΔSH-rCAN98-75 вызывает очень большую потерю массы (Фиг. 3А); тогда как вирус ΔG-rCAN98-75 вызывает только очень незначительное уменьшение массы (Фиг. 3А), из-за его низкой способности к репликации в легких (Фиг. 3В).

Пример 4: In vivo защитные свойства рекомбинантных hMPV ΔG-rC-85473 и ΔSH-rC-85473 в мышиной модели BALB/c после инфекционной стимуляции диким вирусом rC-85473

Протокол иммунизации и инфекционной стимуляции показан на фиг. 4А.

Мышей BALB/c иммунизировали посредством интраназальной инстилляции культуральной среды OptiMem («имитационный» отрицательный контроль) или 5×10⁵ TCID⁵⁰ рекомбинантных вирусов rC-85473, ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473.

Через 21 сутки после иммунизации мышей инфицировали (инфекционная стимуляция) посредством интраназальной инстилляции летальной дозы (1×10⁶ TCID⁵⁰) дикого вируса rC-85473.

Массу и выживаемость мышей отслеживали ежесуточно на протяжении 14 суток (масса, средняя по 10 мышам, ±SEM, Фиг. 4В).

Выживаемость мышей контролировали ежесуточно на протяжении 14 суток после стимуляции для мышей разных групп (имитация с 50%-ной выживаемостью и иммунизировали рекомбинантными вирусами rC-85473, ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473, демонстрируя 100%-ную выживаемость). Результаты показаны на Фиг. 4С.

Через 5 суток после инфекционной стимуляции (а именно, в сутки 26 после иммунизации), 4 мыши каждой группы подвергались умерщвлению для измерения их вирусных нагрузок при легочной инфекции в TCID50 (Фиг. 4D) и ОТ-кПЦР (ген N, Фиг. 4Е).

Статистические критерии: двухфакторный дисперсионный анализ для сравнения каждого вируса с условием имитации. *р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

Данные результаты подтверждают, что рекомбинантные вирусы (ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473 вызывают только очень маленькую потерю массы (группы мышей ведут подобно группе неинфицированных мышей) и что, в данных экспериментальных условиях, защищают 100% мышей, стимулируемых летальной дозой дикого вируса rC-85473. Данная защита также проиллюстрирована отсутствием выявления инфекционного вируса и дикого генома rC-85473 (nd) в легких в D+5 после стимуляции и высокой нагрузкой микронейтрализации сывороток в D+21 после стимуляции (больше 160) мышей, иммунизированных заранее рекомбинантными вирусами (ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473.

Ниже в Таблице 7 показаны результаты анализов микронейтрализации, проводимых на сыворотках от мышей разных групп в D+20 (за 1 сутки до инфекционной стимуляции) и в D+42 (через 21 сутки после инфекционной стимуляции).

После инактивации на протяжении 30 минут при 56°С и разведения сывороток их инкубировали с 100 TCID50 (а именно, 100 инфекционных единиц, как например, определено в соответствии с TCDI50/мл) вируса rC-85473 или вируса rCAN98-75 в течение 2 часов при 37°С. Далее данную смесь применяли в отношении клеток LLC-MK2 для определения нагрузки нейтрализации.

Нагрузку в отношении нейтрализующих антител определяют по наибольшему разведению сыворотки, при которой клетки LLC-MK2, инкубируемые со смесью сыворотка плюс вирус, не демонстрируют цитопатических эффектов, иными словами, считаются негативными в отношении инфицирования (на основе тестов, проводимых в двухкратной повторности).

На фигурах представлено разведение анализируемых сывороток, при котором нагрузки в отношении специфичных антител эффективно нейтрализуют вирусную инфекцию (нагрузка микронейтрализации).

Результат 5 или 10 является характерным для первичного иммунного ответа (первая встреча с вирусом). Результат больше чем или равный 160 является характерным для максимального иммунного ответа и свидетельствует о том, что организм уже встречался с вирусом ранее и, таким образом, иммунизирован.

Штаммы вируса, происходящие из исходного штамма rC-85473, позволяют получать удовлетворительный нейтрализующий гуморальный ответ на hMPV С-85473 (серотип А) и, по меньшей мере, на вирус CAN98-75 (серотип В) после предварительной иммунизации ослабленными штаммами.

Пример 5: In vitro способности рекомбинантных вирусов rC-85473 и rCAN98-75 к связыванию с клетками

Клетки LLC-MK2 инфицировали (t равно 0):

- вирусом rCAN98-75 и его ослабленными формами ΔSH-rCAN98-75 и ΔG-rCAN98-75 (фиг. 5А);

- вирусом rC-85473 и его ослабленными формами ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 (фиг. 5В);

Клетки инфицировали на льду в течение 0,5, 1, 2 или 3 ч для того, чтобы менять время связывания вирусов с клетками перед промывкой, затем инкубировали при 37°С в течение 24 ч.

Процентное содержание инфицированных клеток, измеренное через 24 ч после инфицирования, характеризует количество вируса, способного связываться с клетками за отведенное время (0,5, 1, 2 или 3 ч).

Результаты указывают на разные способности связывания с клетками LLC-MK2 в культуре (и, таким образом, способности инфицирования) для рекомбинантных вирусов в зависимости от источника их генома CAN98-75 или С-85473.

Результаты показывают гораздо лучшую способность связывания с клеткой и инфицирования клетки в случае ослабленных вирусов ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473 (примерно 60% инфицированных клеток), по сравнению с результатами для вирусов ΔSH-rCAN98-75 (40%) и ΔG-rCAN98-75 (меньше чем 20% инфицированных клеток).

Пример 6: Ex vivo способности рекомбинантных вирусов rC-85473 и rCAN98-75 к репликации в 3D модели восстановленного дыхательного эпителия человека и культивируемого на границе раздела воздух-жидкость

Восстановленный дыхательный эпителий человека (MucilAir® НАЕ, Epithelix) и поддерживаемый в культуре на границе раздела воздух-жидкость в соответствии с инструкциями поставщика Epithelix использовали для проведения данных экспериментов ex vivo.

Фотографии, показанные на фиг. 6А, показывают, что рекомбинантные вирусы rCAN98-75 оказываются менее инфекционными и менее репликативными, чем рекомбинантные вирусы rC-85473 (более низкая интенсивность флуоресценции и более уменьшенные размеры участков инфицирования).

Результаты количественной оценки вирусного генома в эпителии (фиг. 6С) подтверждают способности к репликации рекомбинантных вирусов rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473, а также рекомбинантных вирусов rCAN98-75 и (ΔSH-rCAN98-75, в отличие от вируса ΔG-rCAN98-75, который очень слабо реплицируется.

Результаты количественной оценки вирусного генома на поверхности апикального полюса эпителия (фиг. 6В) указывают на продукцию рекомбинантных вирусов rCAN98-75, ΔSH-rCAN98-75, ΔG-rCAN98-75, rC-85473 и ΔSH- rC-85473.

С другой стороны, геном вируса ΔG-rC-85473 не выявляют, что указывает на отсутствие продукции вирусного потомства. Гипотеза заключается в том, что вирус ΔG-rC-85473 мог потерять способность к почкованию на поверхности инфицированных клеток в данном комплексе и стратифицированной системе ех vivo.

Данные различия могли бы выступать в пользу изобретательского характера настоящего изобретения, фокусируясь на разных свойствах у рекомбинантных вирусов разных источников относительно штамма вируса hMPV, для защиты кандидатов ослабленных живых вакцин по настоящему изобретению ΔSH-rC-85473 и ΔG- rC-85473.

Пример 7: Секреция цитокинов и хемокинов, индуцируемая инфицированием рекомбинантными вирусами rC-85473, на 3D модели восстановленного дыхательного эпителия человека и культивируемого на границе раздела воздух-жидкость

Восстановленный дыхательный эпителий человека (MucilAir® НАЕ, Epithelix), поддерживаемый в культуре на границе раздела воздух-жидкость в соответствии с инструкциями поставщика Epithelix, использовали для проведения данных экспериментов ex vivo.

Количественная оценка селекции цитокинов и хемокинов, секретируемых в основную среду инфицированного эпителия, отражает индукцию клеточного ответа, который отличается в зависимости от оцениваемых рекомбинантных вирусов rC-85473 (фиг. 7).

а) вирус ΔG-rC-85473 индуцирует секрецию значимо меньшего количества разных анализируемых цитокинов и хемокинов, по сравнению с диким штаммом rC-85473, за исключением провоспалительного цитокина TNF-α. Данные согласуются с результатами, показанными на фиг.6, которые демонстрируют, что инфекционность данного вируса в восстановленном дыхательном эпителии человека значимо снижена, по сравнению с инфекционностью дикого штамма.

b) вирус ΔSH-rC-85473, даже при том, что его способность к инфицированию и репликации в модели восстановленного дыхательного эпителия человека повышена, по сравнению со способностью к инфицированию и репликации дикого рекомбинантного вируса rC-85473 (фиг. 6), индуцирует секрецию эквивалентного или меньшего количества панели цитокинов и хемокинов, оцениваемую по сравнению с секрецией, индуцируемой диким вирусом.

Уровни секретируемых хемокинов МСР-1, IP-10, RANTES, IL-8, G-CSF и провоспалительных цитокинов IFN-γ и TNF-α, по-видимому, указывают на то, что эпителиальные клетки, инфицируемые данным вирусом ΔSH-rC-85473, способны рекрутировать следующие клетки иммунной системы: Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, эозинофилы и/или нейтрофилы, необходимые для формирования иммунного ответа и адаптивного ответа хозяина.

Кроме того, вирус ΔSH-rC-85473 приводит к секреции IL-7, цитокина, индуцирующего дифференцировку неактивных лимфоцитов в активные Т- и В-лимфоциты, и FGF, фактора роста, участвующего в восстановлении органических тканей, в количествах, похожих на дикий вирус rC-85473.

Таким образом, инфицирование вирусом ΔSH-rC-85473 делает возможным формирование эпителиальными клетками первичного защитного ответа на инфекцию, при ассоциации с более ослабленным воспалительным ответом хозяина, в сравнении с воспалительным ответом, вызываемым диким вирусом.

Данные различия, таким образом, будут выступать за применение рекомбинантных вирусов, происходящих из штамма rC-85473, в качестве ослабленной живой вакцины и предпочтительно из ослабленного штамма ΔSH-rC-85473.

Пример 8: Репликация вируса и секреция провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α in vitro рекомбинантных hMPV rC-85473 на модели иммортализованных макрофагов мыши

Иммортализованную линию мышиных макрофагов использовали для оценки репликации и способности к индукции провоспалительных цитокинов под действием рекомбинантных вирусов rC-85473, ΔSH-rC-85473 и ΔG-rC-85473.

Макрофаги образуют часть первичных клеток иммунной системы, рекрутированных в месте инфицирования (в настоящем случае, дыхательный эпителий). Макрофаги содействуют воспалительному ответу, врожденному ответу и стимуляции адаптивного ответа хозяина.

Макрофагов инфицировали рекомбинантными вирусами rC-85473, ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473, и их клеточные супернатанты собирали каждые сутки на протяжении 2 суток. Результаты показаны на фиг. 8.

a) вирусные нагрузки, измеряемые в БОЕ/мл, демонстрируют, что вирус ΔSH-rC-85473 обладает уменьшенной способностью к репликации на макрофагах, по сравнению с диким рекомбинантный вирусом, тогда как вирус ΔG-rC-85473 демонстрирует репликацию вируса, похожую на дикий вирус (фиг. 8А). Двухфакторные дисперсионные анализы проводили для сравнения кинетики репликации вируса с делецией ΔSH-rC-85473 с кинетикой репликации дикого рекомбинантного вируса.

b) далее, секрецию провоспалительных цитокинов TNF-α (фиг. 8В) и IL-1β (фиг. 8С) измеряли в супернатанте инфицированных макрофагов.

Вирус ΔSH-rC-85473 приводит к получению профиля цитокинов, значимо отличающегося от профиля цитокинов дикого вируса rC-85473 с более ранним пиком секреции, спустя 1 сутки после инфицирования, в сравнении с диким вирусом, который ассоциирован с пиком секреции через 2 суток после инфицирования, относительно данных двух цитокинов.

Вирус ΔG-rC-85473 индуцирует секрецию цитокина TNF-α на уровнях, сопоставимых с диким вирусом, но не индуцирует секрецию цитокина IL-1β во время первых 2 суток инфицирования.

Данные результаты демонстрируют, что вирус ΔSH-rC-85473 сохраняет способность инфицировать мышиные макрофаги и главным образом приводить к секреции провоспалительных цитокинов, несмотря на модифицированную кинетику.

Вирус ΔG-rC-85473 эффективно инфицирует мышиные макрофаги, но индуцирует более слабую секрецию провоспалительных цитокинов, как наблюдалось на модели восстановленного дыхательного эпителия человека.

Пример 9: Воспаление легких и рекрутинг клеток иммунной системы в месте инфицирования in vivo, индуцируемый после 5 суток инфицирования мышей BALB/c, под действием рекомбинантных hMPV rC-85473, ΔG-rC-85473 и ΔSH-rC-85473

Мышей BALB/c инфицировали посредством интраназальной инстилляции:

- культуральной среды OptiMem (имитация)

- 5×10⁵ TCID⁵⁰ рекомбинантных вирусов rC-85473, ΔSH-rC-85473 или ΔG-rC-85473.

После 5 суток инфицирования 5 мышей на группу подвергались умерщвлению, и их легкие брали для гистопатологического анализа, и проводили измерение балльных показателей воспаления, возникающего в результате инфицирования (фиг. 9А).

Статистические анализы проводили (двухфакторный дисперсионный анализ) для сравнения каждого условия друг с другом: *р меньше 0,05, ** р меньше 0,01 и *** р меньше 0,001.

На Фиг. 9А показано, как дикий вирус rC-85473 индуцирует сильное воспаление легких у инфицированных мышей, тогда как вирусы ДЭН-rC-85473 и ΔG-rC-85473 приводят к воспалению, уровень которого значимо ниже, чем в случае дикого вируса, в соответствии с уменьшенной тяжестью патологии с ослабленными штаммами, продемонстрированной ранее на фиг. 3.

Кроме того, через 5 суток после инфицирования 5 мышей на группу подвергались умерщвлению, и их легкие брали для абсолютной количественной оценки клеток иммунной системы - CD4+, CD8+ лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов, инфильтрированных в ткань легкого после инфицирования (фиг. 9В).

Статистические анализы проводили (однофакторный дисперсионный анализ) для сравнения условия ΔSH-rC-85473 с условием rC-85473: ** р меньше 0,01.

На Фиг. 9В продемонстрировано, что разные популяции клеток иммунной системы (CD4+ Т, CD8+ Т, нейтрофилов и макрофагов) подвергались рекрутингу в месте инфицирования после 5 суток инокуляции вирусов rC-85473 и ДВН-rC-85473, но в более низком количестве в случае ослабленного штамма, в частности, в отношении CD4+ лимфоцитов.

Таким образом, очевидно, что вирус ΔSH-rC-85473 приводит к пониженному уровню воспаления легких, в соответствии с ослаблением патологии, индуцируемой вирусом в мышиной модели (фиг. 3), и уменьшению секреции цитокинов инфицированными эпителиальными клетками (фиг. 7), одновременно обеспечивая эффективный рекрутинг разных клеток иммунной системы в месте инфицирования.

Данные разные результаты (фиг. 7-9) демонстрируют разные свойства у дикого рекомбинантного rC-85473 и вирусов с делецией в отношении их постинфекционных физиологических эффектов.

Ослабленный штамм ΔSH-rC-85473 кажется особенно перспективными в отношении разработки ослабленной живой вакцины относительно его свойств с точки зрения: (i) секреции воспалительных цитокинов и хемокинов эпителиальными клетками и клетками-макрофагами, (ii) индукции воспаления легких in vivo и (iii) инфильтрации in vivo клеток иммунной системы в инфицируемый орган. В действительности, инфицирование хозяина данным ослабленным штаммом ассоциировано как с эффективным первичным иммунным ответом (эквивалентным первичному иммунному ответу, наблюдаемому в случае дикого вируса), так и с ослабленным воспалительным ответом.

Пример 10: Секреция цитокинов/хемокинов, рекрутинг клеток иммунной системы в месте инфицирования in vivo и воспаление легких в модели мышей BALB/c, иммунизированных рекомбинантными hMPV rΔG-C-85473 и ΔSH-C-85473, поле инфекционной стимуляции

После инфицирования вирусом комплексный воспалительный и иммунный ответ формируется в месте инфицирования, благодаря секреции цитокинов и хемокинов инфицированными эпителиальными клетками (см. фиг. 7) и резидентными клетками иммунной системы (фиг. 8). Сначала, эффекторные клетки врожденного ответа (неспецифичного) подвергаются рекрутингу и затем, во-вторых, активируются эффекторные клетки адаптивного ответа (специфичного). Когда инфицированный индивид предварительно иммунизирован или вакцинирован, чем быстрее, важнее и специфичнее адаптивный ответ, тем эффективнее вторичный иммунный ответ. Это является характеристикой данного иммунного ответа, называемого вторичным, который описан в данном примере.

Мышей BALB/c иммунизировали посредством интраназальной инстилляции культуральной среды OptiMem («имитационный» отрицательный контроль) или 5×10⁵ TCID⁵⁰ рекомбинантных вирусов rC-85473, ΔSH-C-85473 или ΔG-C-85473.

Спустя 21 сутки после иммунизации, мышей инфицировали (инфекционная стимуляция) посредством интраназальной инстилляции летальной дозы (1×10⁶ TCID⁵⁰) дикого вируса rC-85473. Протокол иммунизации и инфекционной стимуляции показан на фиг.4 А.

Спустя 1 или 5 суток после инфекционной стимуляции (а именно, в сутки 22 или 26 после иммунизации, соответственно), 3 мыши каждой группы подвергались умерщвлению для количественной оценки селекции цитокинов и хемокинов, секретируемых в ткани легкого: результаты показаны на фиг. 10А, 10В и 10С. Данные результаты демонстрируют индукцию местного иммунного ответа, которая отличается в зависимости от рекомбинантных вирусов rC-85473, используемых для иммунизации мышей BALB/c:

- группы, иммунизированные вирусами ΔG-C-85473 и ΔSH-C-85473, демонстрируют более сильную секрецию провоспалительного цитокина IL-6 и хемокина МСР-1, чем группа, иммунизированная вирусом WT rC-85473, незамедлительно спустя 1 сутки после инфекционной стимуляции.

- кроме того, группа, иммунизированная вирусом ΔSH-С-85473, также демонстрирует значимое увеличение секреции противовоспалительного цитокина IL-10 и хемокинов G-CSF и MIP-1β, в сравнении с группой, иммунизированной вирусом WT и/или вирусом ΔG-С-85473.

Спустя 5 суток, уровни всех анализируемых цитокинов/хемокинов были резко снижены, по сравнению с уровнями, измеряемыми в сутки 1 после стимуляции, что демонстрирует ресорбцию цитокинов и воспалительный ответ, индуцируемый стимуляцией.

Данные результаты указывают на то, что иммунизация ослабленными вирусами ΔG-C-85473, и более конкретно ΔSH-C-85473, приводит к местному формированию цитокинового ответа, отличного от цитокинового ответа, индуцируемого иммунизацией соответствующим неослабленным вирусом WT.

Для оценки рекрутинга клеток иммунной системы в месте инфицирования измеряли количество основных популяций клеток иммунной системы, которые инфильтрируют в ткань легкого для того, чтобы бороться с инфекцией; результаты показаны на фиг. 10D, 10Е и 10F.

Таким образом, рекрутинг Т-лимфоцитов (CD8+ цитотоксические и CD4+ хелперы) и В-лимфоцитов значимо увеличен после иммунизации вирусом ΔSH-C-85473, по сравнению с группой, иммунизированной вирусом WT rC-85473, и по сравнению с группой, иммунизированной вирусом ΔG-C-85473 (значимое различие исключительно для В-лимфоцитов, фиг. 10Е), спустя 5 суток после инфекционной стимуляции.

Популяции рекрутированных макрофагов и нейтрофилов не показывают значимых различий между разными анализируемыми вирусами (фиг. 10F).

Группа мышей, иммунизированных вирусом ΔG-C-85473, демонстрирует профиль рекрутинга клеток, похожий на профиль группы, иммунизированной вирусом WT, что указывает на то, что вирус ΔG-C-85473 является таким же эффективным в отношении индукции иммунного ответа, как и дикий вирус (WT). Напротив, когда мышей иммунизировали заранее вирусом ΔSH-C-85473, адаптивный иммунный ответ в ответ на инфекционное стимулирование является более значимым, одновременно оставаясь уравновешенным, тогда как врожденный ответ, по-видимому, не подвергается воздействию, что дает основание полагать, что вирус ΔSH-C-85473 не будет вызывать более эффективный вторичный иммунный ответ.

Наконец, через 5 суток после стимулирования 2 мыши на группу подвергались умерщвлению для измерения бальных показателей воспаления легких, являющегося результатом стимулирования каждой иммунизированной или «имитационной» неиммунизированной группы; результаты показаны на фиг. 10G.

Как и ожидалось от применения летального инокулюма вируса WT rC-85473, который соответствует 50% смертности популяции [см. фиг. 4С], суммарный балльный показатель воспаления имитационно-иммунизированной группы является очень высоким. Как указано ранее, балльные показатели воспаления групп, иммунизированных вирусом WT rC-85473 или ΔG-C-85473, являются весьма сопоставимыми друг с другом и слегка уменьшенными, по сравнению с имитационно-иммунизированной группой, даже несмотря на то, что мыши данных групп не демонстрируют никакой смертности [Фиг. 4С].

Результаты фиг. 10 показывают, что мыши, иммунизированные вирусом ΔSH-С-85473, формируют очень ослабленный воспалительный ответ после инфекционной стимуляции, что дает основание полагать, что поражения легкого были уменьшены в данной группе. Аналогично, функциональные характеристики легкого были сохранены во время инфицирования.

Таким образом, ослабленный вирус ΔSH-C-85473 мог обеспечивать лучший рекрутинг клеток иммунной системы в легком, в количестве и в качестве, в ответ на вторичное инфицирование, и, таким образом, содействовать ограничению патофизиологии и воспаления легкого инфицированного хозяина. Данный более эффективный ответ хозяина также мог отражать лучший вторичный иммунный ответ на вирус hMPV.

В заключение, данный ослабленный вирус ΔSH-C-85473 обладает следующими характеристиками:

(i) он индуцирует большие количества провоспалительных, противовоспалительных цитокинов и хемокинов, чем другие анализируемые вирусы.

(ii) это обеспечивает более значимый, но уравновешенный, рекрутинг клеток иммунной системы (CD8+/CD4+ Т-лимфоциты и В-лимфоциты) в месте инфицирования,

(iii) одновременно генерируя ограниченное воспаление легких

Ссылки

Патенты WO 2005/014626 США 8841433

Библиографические ссылки по порядку цитирования в тексте

van den Hoogen BG, of Jong JC, Groen J, Kuiken T, of Groot R, Fouchier RA, et al. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. Nat Med. 2001; 7(6):719-24

Peret TC, Boivin G, Li Y, Couillard M, Humphrey C, Osterhaus AD, Erdman DD, Anderson LJ. Characterization of human metapneum о viruses isolated from patients in North America. J Infect Dis. 2002 Jun 1; 185(11):1660-3.

Mazur NI, Higgins D, Nunes MC, Melero JA, Langedijk AC, Horsley N, Buchholz UJ, Openshaw PJ, McLellan JS, Englund JA, Mejias A, Karron RA, Simoes EA, Knezevic I, Ramilo O, Piedra PA, Chu HY, Falsey AR, Nair H, Kragten-Tabatabaie L, Greenough A, Baraldi E, Papadopoulos NG, Vekemans J, Polack FP, Powell M, Satav A, Walsh EE, Stein RT, Graham BS, Bont LJ; Respiratory Syncytial Virus Network (ReSViNET) Foundation. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Dis. 2018 Jun 15. pii: S1473-3099(18)30292-5.

Herfst S, of Graaf M, Schrauwen EJ, Sprong L, Hussain K, van den Hoogen BG, Osterhaus AD, Fouchier RA. Generation of temperature-sensitive human metapneumovirus strains that provide protective immunity in hamsters. J Gen Virol. 2008 Jul; 89(Pt 7):1553-62.

Wei Y, Zhang Y, Cai H, Mirza AM, Iorio RM, Peeples ME, Niewiesk S, Li J. Roles of the putative integrin-binding motif of the human metapneumovirus fusion (f) protein in cell-cell fusion, viral infectivity, and pathogenesis. J Virol. 2014 Apr; 88(8):4338-52.

Yu CM, Li RP, Chen X, Liu P, Zhao XD. Replication and pathogenicity of attenuated human metapneumovirus F mutants in severe combined immunodeficiency mice. Vaccine. 2012 Jan 5; 30(2):231-6.

Liu P, Shu Z, Qin X, Dou Y, Zhao Y, Zhao X. A live attenuated human metapneumovirus vaccine strain provides complete protection against homologous viral infection and cross-protection against heterologous viral infection in BALB/c mice. Clin Vaccine Immunol. 2013 Aug; 20(8): 1246-54.

Zhang Y, Wei Y, Zhang X, Cai H, Niewiesk S, Li J. Rational design of human metapneumovirus live attenuated vaccine candidates by inhibiting viral mRNA cap methyltransferase. J Virol. 2014 Oct; 88(19):11411 -29

Biacchesi S, Skiadopoulos MH, Tran KC, Murphy BR, Collins PL, Buchholz UJ. Recovery of human metapneumovirus from cDNA: optimization of growth in vitro and expression of additional genes. Virology. 2004; 321(2):247-59

Biacchesi S, Skiadopoulos MH, Yang L, Lamirande EW, Tran KC, Murphy BR, Collins PL, Buchholz UJ. Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH and/or binding G glycoprotein: deletion of G yields a promising vaccine candidate. Journal of Virology. 2004 Dec; 78(23): 12877-87.

Biacchesi S, Pham QN, Skiadopoulos MH, Murphy BR, Collins PL, Buchholz UJ. infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH, G, or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates. Journal of virology. 2005; 79(19):12608-13.

Buchholz UJ, Biacchesi S, Pham QN, Tran KC, Yang L, Luongo CL, Skiadopoulos MH, Murphy BR, Collins PL. Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus: effects on RNA synthesis, attenuation, and immunogenicity. J Virol. 2005 Jun; 79(11):6588-97.

Schickli JH, Kaur J, Macphail M, Guzzetta JM, Spaete RR, Tang RS. Deletion of human metapneumovirus M2-2 increases mutation frequency and attenuates growth in hamsters. Virol J. 2008 Jun 3;5:69.

Pham QN, Biacchesi S, Skiadopoulos MH, Murphy BR, Collins PL, Buchholz UJ. Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo. J Virol. 2005 Dec; 79(24):15114-22.

Tang RS, Schickli JH, MacPhail M, Fernandes F, Bicha L, Spaete J, Fouchier RA, Osterhaus AD, Spaete R, Haller AA. Effects of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus antigen insertion in two 3' proximal genome positions of bovine/human parainfluenza virus type 3 on virus replication and immunogenicity. J Virol. 2003 Oct; 77(20): 10819-28.

Tang RS, Mahmood K, Macphail M, Guzzetta JM, Haller AA, Liu H, Kaur J, Lawlor HA, Stillman EA, Schickli JH, Fouchier RA, Osterhaus AD, Spaete RR. A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirusfhMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys. Vaccine. 2005 Feb 25; 23(14): 1657-67.

Russell CJ, Jones BG, Sealy RE, Surman SL, Mason JN, Hayden RT, Tripp RA, Takimoto T, Hurwitz JL. A Sendai recombinant virus vaccine expressing a gene for truncated human metapneumovirus (hMPV) fusion protein protects cotton rats from hMPV challenge. Virology. 2017 Sep; 509:60-66.

Huck B, Scharf G, Neumann-Haefelin D, Puppe W, Weigl J, Falcone V. Novel human metapneumovirus sublineage, Emerg Infect Dis. 2006 Jan; 12(1): 147-50.

Aerts L, Rhéaume C, Carbonneau J, Lavigne S, Couture C, Hamelin ME, Boivin G. Adjuvant effect of the human metapneumovirus (HMPV) matrix protein in HMPV subunit vaccines. J Gen Virol. 2015 Apr; 96(Pt 4):767-74.

Dubois J, Cavanagh MH, Terrier O, Hamelin ME, Lina B, Shi R, et al. Mutations in the fusion protein heptad repeat domains of human metapneumovirus impact on the formation of syncytia. The Journal of general virology. 2017; 98(6):1174-80.

Aerts L, Cavanagh MH, Dubois J, Carbonneau J, Rheaume C, Lavigne S, et al. Effect of in vitro syncytium formation on the severity of human metapneumovirus disease in a murine model. PloS one. 2015; 10(3):e0120283.

Hamelin ME, Gagnon C, Prince GA, Kiener P, Suzich J, Ulbrandt N, Boivin G. Prophylactic and therapeutic benefits of a monoclonal antibody against the fusion protein of human metapneumovirus in a mouse model. Antiviral Res. 2010 Oct; 88(1):31-7.

Palwithino CE, Cespedes PF, Lay MK, Riedel CA, Kalergis AM, Bueno SM. Understanding Lung Immunopathology Caused by the Human Metapneumovirus: Implications for Rational Vaccine Design. Crit Rev Immunol. 2015;35(3): 185-202. Review.

Hamelin ME, Couture C, Sackett MK, Boivin G. Enhanced lung disease and Th2 response following human metapneumovirus infection in mice immunised with the inactivated virus. J Gen Virol. 2007 Dec; 88(Pt 12):3391-400. PubMed PMID: 18024909.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)

ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE

(INSERM)

UNIVERSITE LAVAL

<120> НОВЫЙ ОСЛАБЛЕННЫЙ ШТАММ ВИРУСА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ

ВАКЦИНЫ

<130> B376379PCT

<150> FR1856801

<151> 2018-07-23

<150> FR1902934

<151> 2019-03-21

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13394

<212> ДНК

<213> метапевмовирус

<400> 1

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatgtctct

60

tcaagggatt cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta

120

cacaataaaa agagatgtgg gtacaacaac tgcagtgaca ccctcatcat tgcaacaaga

180

aataacgctg ttgtgtggag aaattctgta tgctaaacat gctgattaca aatatgctgc

240

agaaatagga atacaatata ttagcacagc tttaggatca gagagagtgc agcagattct

300

gaggaactca ggcagtgaag tccaagtggt cttaaccaga acgtactctc tggggaaagt

360

taaaaacaat aaaggagaag atttacagat gttagacata cacggggtag agaagagctg

420

ggtagaagag atagacaaag aagcaaggaa aacaatggca accttgctta aggaatcatc

480

aggtaatatc ccacaaaatc agaggccctc agcaccagac acacccataa tcttattatg

540

tgtaggtgca ttaatattta ctaagctagc atcaaccata gaagtgggac tagagaccac

600

agtcagaagg gctaaccgtg tactaagtga tgcactcaag agatacccta gaatggacat

660

cccaaaaatt gccagatcct tctatgactt atttgaacaa aaagtgtatc acagaagttt

720

gttcattgag tatggcaaag cattaggctc atcatctaca ggcagcaaag cagaaagtct

780

atttgttaat atattcatgc aagcttatgg agccggtcaa acaatgctaa ggtggggggt

840

cattgccagg tcatccaaca atataatgtt aggacatgta tctgtccaag ctgagttaaa

900

acaggtcaca gaagtctatg acttggtgcg agaaatgggc cctgaatctg gacttctaca

960

tttaaggcaa agcccaaaag ctggactgtt atcactagcc aactgtccca actttgcaag

1020

tgttgttctc ggaaatgcct caggcttagg cataatcggt atgtatcgtg ggagagtacc

1080

aaacacagaa ttattttcag cagcagaaag ttatgccaaa agtttgaaag agagcaataa

1140

aatcaatttc tcttcattag gacttacaga tgaagagaaa gaggctgcag aacatttctt

1200

aaatgtgagt gacgacagtc aaaatgatta tgagtaatta aaaaagtggg acaagtcaaa

1260

atgtctttcc ctgaaggaaa agatattctt ttcatgggta atgaagcagc aaaattagca

1320

gaagctttcc agaaatcatt aaggaaacca agtcataaaa gatctcaatc tattatagga

1380

gaaaaagtga acactgtatc agaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctgcaaaa

1440

ccaaccatac tgtcagaacc aaagttagca tggactgata aaggtggggc aatcaaaact

1500

gaaataaagc aagcaatcaa agtcatggat cctattgagg aagaagagtc tactgagaag

1560

aaggtgctgc cctccagtga tgggaaaacc cctgcagaaa agaaactgaa accatcaact

1620

aacaccaaaa agaaagtttc gtttacacca aatgaaccag gaaaatatac aaagttggaa

1680

aaagatgctc tagatttgct ctcagataat gaagaagaag atgcagaatc ttcaatctta

1740

acctttgaag aaagagatac ttcatcgtta agcattgagg ccagattgga atcaatagag

1800

gagaaattaa gcatgatatt agggctatta agaacactca acattgctac agcaggaccc

1860

acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggcg taagagagga attaatagca

1920

gacataataa aggaagccaa agggaaagca gcagaaatga tggaagagga aatgagtcaa

1980

cgatcaaaaa taggaaacgg tagtgtaaaa ctaacagaga aagcaaaaga gcttaacaaa

2040

attgttgaag atgaaagcac aagtggagaa tctgaagaag aagaagaacc aaaagacata

2100

caagacaata gtcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtagtttaa taaaaataaa

2160

caatgggaca agtaaaaatg gagtcctacc tagtagacac ttatcaaggc attccttaca

2220

cagcagctgt tcaagttgat ctaatagaaa aggacctgtt acctgcaagc ctaacaatat

2280

ggttcccttt gtttcaggcc aacacaccac cagcagtgct gctcgatcag ttgaaaaccc

2340

taacaataac cactctgtat gctgcatcac aaaatggtcc aatactcaaa gtgaatgcat

2400

cagcccaagg tgcagcaatg tctgtacttc ccaaaaaatt tgaagtcaat gcgactgtag

2460

cactcgatga atatagcaaa ttggaatttg acaaactcac agtctgtgaa gtaaaaacag

2520

tttacttaac aaccatgaaa ccatacggga tggtatcaaa atttgtgagc tcagccaaat

2580

cagttggcaa aaaaacacat gatctaatcg cactgtgtga ttttatggat ctagaaaaga

2640

acacacctgt tacaatacca gcattcatca aatcagtttc aatcaaagag agtgagtcag

2700

ctactgttga agctgctata agcagtgaag cagaccaagc tctaacacag gccaaaattg

2760

caccttatgc gggattgatt atgatcatga ctatgaacaa tcccaaaggc atattcaaaa

2820

agcttggagc tgggactcaa gttatagtag aactaggagc atatgtccag gctgaaagca

2880

taagtaaaat atgcaagact tggagccatc aagggacaag atatgtgttg aagtccagat

2940

aacagccaag caccttggcc aagagctact aactctatct catagattat aaagtcacca

3000

ttctagttat ataaaaatca agttagaaca agaattaaat caatcaagaa tgggacaaat

3060

aaaaatgtct tggaaagtgg tgatcatttt ttcattgtta ataacacctc aacacggtct

3120

taaagagagc tatttagaag agtcatgtag cactataact gaaggatatc tcagtgttct

3180

gaggacaggt tggtatacca acgtttttac actggaggta ggtgatgtag agaaccttac

3240

atgtgctgat ggacctagct taataaaaac agaattagac ctgaccaaaa gtgcactaag

3300

agaactcaga acagtttctg ctgatcaact ggcaagagag gagcaaattg agaatcccag

3360

acaatctaga tttgttctag gagcaatagc actcggtgtt gcaacagcag ctgcagttac

3420

agcaggtgtt gcaattgcca aaaccatccg gcttgaaagt gaagtaacag caattaagaa

3480

tgccctcaaa aagaccaatg aagcagtatc tacattgggg aatggagttc gagtgttggc

3540

aactgcagtg agggagctgg aagattttgt gagcaagaat ctaacacgtg caatcaacaa

3600

aaacaagtgc gacattgctg acctgaaaat ggccgttagc ttcagtcaat tcaacagaag

3660

gtttctaaat gttgtgcggc aattttcaga caatgctgga ataacaccag caatatcctt

3720

ggacttaatg acagatgctg aactagccag agctgtttcc aacatgccaa catctgcagg

3780

acaaataaaa ctgatgttgg agaaccgtgc aatggtaaga agaaaggggt tcggaatcct

3840

gataggagtt tacggaagct ccgtaattta catggtgcaa ctgccaatct ttggagttat

3900

agacacgcct tgctggatag taaaagcggc cccttcttgc tcagaaaaaa agggaaacta

3960

tgcttgcctt ttaagagaag atcaaggatg gtattgtcag aatgcagggt caactgttta

4020

ctacccaaat gaaaaagact gcgaaacaag aggagaccat gtcttttgcg acacagcagc

4080

aggaatcaat gttgctgagc agtcaaagga gtgcaacatc aacatatcca ctactaatta

4140

cccatgcaaa gttagcacag gaagacaccc tatcagtatg gttgcactgt ctcctcttgg

4200

ggctttggtt gcttgctaca agggagtgag ctgttccatt ggcagcaaca gagtagggat

4260

catcaagcaa ctgaacaaag gctgctctta tataaccaac caagacgcag acacagtgac

4320

aatagacaac actgtatacc agctaagcaa agttgagggc gaacagcatg ttataaaagg

4380

aaggccagtg tcaagcagct ttgatccagt caaatttcct gaagatcaat tcaatgttgc

4440

acttgaccaa gttttcgaaa gcattgagaa cagtcaggcc ttggtggatc aatcaaacag

4500

aatcctaagc agtgcagaga aaggaaacac tggcttcatc attgtaataa ttctaattgc

4560

tgtccttggc tctaccatga tcctagtgag tgtttttatc ataataaaga aaacaaagaa

4620

acccacagga gcacctccag agctgagtgg tgtcacaaac aatggcttca taccacataa

4680

ttagttaatt aaaaataaag taaattaaat taaaataaaa taaaattaaa attaaaataa

4740

aataaaaata aaaatttggg acaaatcata atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa

4800

gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag tgcaagttta accacaatta ctggagttgg

4860

ccagatagat acttactaat aagatcaaat tatttattaa atcaactttt aaggaacact

4920

gatagagctg atggcttatc aataatatca ggagcaggca gagaagatag gacacaagat

4980

tttgtcctag gttccaccaa tgtggttcaa ggttatattg atgataacca aagcataaca

5040

aaagctgcag cctgttacag tctacataat ataatcaaac aactacaaga agttgaagtt

5100

aggcaggcta gagataacaa accatctgac agcaaacatg tggcacttca caacttagtc

5160

ctatcttata tggagatgag caaaattcct gcatctttaa tcaacaatct caaaagactg

5220

ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag cttataattg acttatcagc aggtgctgaa

5280

aatgactctt catatgcctt gcaagacagt gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg

5340

tcctgttttc attactatag aggttgatta catgatatgg actcataagg acttaaaaga

5400

agctttatct aatgggatag tgaagtctca tactaacatt tacaattgtt atttagaaaa

5460

catagaaatt atatatgtca aggcttactt aagttagtaa aaacacatca gagtgggata

5520

aatgacaatg ataacattag atgtcattaa aagtgatggg tcttcaaaaa catgtactca

5580

cctcaaaaaa ttaattaaag accactctgg taaagtgctt attgtactta agttaatatt

5640

agctttacta acatttctca cagtgacaat caccatcaat tatataaaag tagaaaacaa

5700

tctgcaaata tgtcagtcaa aaactgaatc agacaaaaag gactcatcat caaataccac

5760

atcagtcaca accaagacta ctctaaatca tgatataaca cagtatttta aaagtttgat

5820

tcaaaggtat acaaactctg caataaacag agacacatgc tggaaaataa gcagaaatca

5880

atgcacaaac ataacaacat acaaattttt atgttttaaa tctgaagaaa caaaaaccaa

5940

caattgtgat aaactgacag atttatgcag aaacaaacca aaaccagctg ttgaagtgta

6000

tcacatagta gaatgccatt gtatatacac agttaaatgg aagtgctatc attacccaat

6060

agatgaaacc caatcctaaa taacactaga ttaggatcca tccaagtctg ttagttcaac

6120

aatttagtta tttaaaaata ttttgaaaac aagtaagttt ctatgatact tcataataat

6180

aagtaataat taattgctta atcatcatca caacattatt cgaaaccata actattcaat

6240

ttaagaagta aaaacaataa tatgggacaa gtagttatgg aggtgaaagt ggagaacatt

6300

cgaacaatag atatgctcaa agcaagagtg aaaaatcgtg tggcacgcag caaatgcttt

6360

aaaaatgcct ctttgatcct aataggaata actacattga gtatagccct caatatctat

6420

ctaatcataa actatacaat gcaagaaaac acatccgaat cagaacatca caccagctca

6480

tcacccatgg aatccagcag ggaaactcca acagtcccta tggacaactc agacaccaat

6540

ccaggctcac agtatccaac tcaacagtcc acagaaggct ccacactcta ctttgcagcc

6600

tcagcaagct caccagagac agaaccaaca tcaacaccag acacaacaag ccgcccgccc

6660

ttcgtcgaca cacacacaac actaccaagt gcaagcagaa caaggacaag tccggcagtc

6720

cacacaaaaa acaatccaag gacaagcccc agaacacatt ccccaccatg ggcaatgaca

6780

aggacggtcc gtggaaccac cactctccgc acaagcagca caagaaaaag accgtccaca

6840

gcatcagtcc aacctgacag cagcgcaaca acccacaaac acgaagaagc aagcccagtg

6900

agcccgcaaa catctgcgag cacagcaaga ccacaaagga agggcatgga ggccagcaca

6960

tcaacaacat acaaccaaac tagttaacaa aaaatacaaa ataactctaa gataaaccat

7020

atagacacca acaattgaga agccaaaagg caattcacaa tctctccaaa aaggcaacaa

7080

caccatatta gctccgctta aatctccctg gaaaaaacac tcgcccatat accaactata

7140

ccacaaccat cccaagaaaa aaagctgggt aaaacaacac ccaagagaca aataacaatg

7200

gatcctctta atgaatccac tgttaatgtc tatcttcccg actcatatct taaaggagtg

7260

atttctttta gtgagactaa tgcaattggt tcatgtctct taaaaagacc ttacctaaaa

7320

aatgacaaca ctgcaaaagt tgccatagag aatcctgtta tcgagcatgt tagactcaaa

7380

aatgcaatca attctaagat gaaaatatca gattacagga tagtagagcc agtaaacatg

7440

caacatgaaa ttatgaagaa tgtacacagt tgtgagctca cattattaaa acagttttta

7500

acaaggagta aaaatattag cactcttaaa ttaaatatga tatgtgattg gctgcagtta

7560

aagtctacat cagatgatac ctcaatctta agttttatag atgtagaatt tatacctagc

7620

tgggtaagca attggtttag taattggtac aatctcaaca agttgattct ggaattcagg

7680

aaagaagaag taataagaac tggttcaatc ttgtgtaggt cattgggtaa attagttttt

7740

gttgtatcat catacggatg tatagtcaag agcaacaaaa gcaaaagagt gagcttcttc

7800

acatacaatc aactgttaac atggaaagat gtgatgttaa gtagattcaa tgcaaatttc

7860

tgtatatggg taagcaacag tctgaatgaa aatcaagaag ggttagggtt gagaagtaat

7920

ctgcaaggca tattaactaa taagctatat gaaactgtag attatatgct tagtttgtgt

7980

tgcaatgaag gtttctcact tgtgaaagag tttgagggtt ttattatgag tgaaatcctt

8040

aggattactg aacatgctca attcagtact agatttagaa atactttatt aaatggatta

8100

actgatcaat tgacaaaatt aaaaaataaa aacagactca gagttcatgg taccgtgtta

8160

gaaaataatg attatccaat gtatgaagtt gtacttaaat tattaggaga tactttgaga

8220

tgtattaaat tattaatcaa taaaaactta gagaatgctg ctgaattata ctatatattt

8280

agaatattcg gtcacccaat ggtagatgaa agagatgcaa tggatgctgt caaattaaac

8340

aatgaaatca caaaaatcct caggttggag agcttgacag aactaagagg ggcattcata

8400

ttaaggatta tcaaaggatt tgtagacaac aacaaaagat ggccgaaaat taaaaactta

8460

aaagtgctta gtaaaagatg gactatgtac ttcaaagcaa aaagttaccc tagtcaactt

8520

gaattaagtg aacaagattt tttagagctt gctgcaatac agtttgaaca agagttttct

8580

gttcctgaaa aaaccaacct tgagatggta ttaaatgata aagctatatc acctcctaaa

8640

agattaattt ggtctgtgta cccaaaaaat tacttacctg agacaataaa aaatcgatat

8700

ctagaagaga ctttcaatgc aagtgatagt ctcaaaacaa gaagagtact agagtactat

8760

ttgaaagata ataaattcga ccaaaaagaa cttaaaagtt atgtggttaa acaagaatat

8820

ttaaatgata aggatcatat tgtctcgcta actggaaaag aaagagaatt aagtgtaggt

8880

agaatgtttg ctatgcaacc aggaaaacag cgacaaatac aaatattggc tgaaaaattg

8940

ttagctgata atattgtacc ctttttccca gaaactttaa caaagtatgg tgatctagat

9000

cttcagagaa taatggaaat caaatcagaa ctttcttcta ttaaaaccag aagaaatgat

9060

agttataata attacattgc aagagcatcc atagtaacag atttaagtaa gttcaaccaa

9120

gcctttaggt atgaaactac agcgatctgt gcggatgtag cagatgaact acatggaaca

9180

caaagcctat tctgttggtt acatcttatc gttcctatga ctacaatgat atgtgcctat

9240

agacatgcac caccagaaac aaaaggtgaa tatgatatag ataagataga agagcaaagt

9300

ggtttatata gatatcatat gggtggtatt gaaggatggt gtcaaaaact ctggacaatg

9360

gaagctatat ctttattaga tgttgtatct gtaaagacac gatgtcaaat gacatcttta

9420

ttaaacggtg acaaccaatc aatagatgta agtaaaccag ttaagttatc tgagggttta

9480

gatgaagtga aagcagatta tagcttggct gtaaaaatgc taaaagaaat aagagatgca

9540

tacagaaata taggccataa acttaaagaa ggggaaacat atatatcaag agatcttcag

9600

tttataagta aggtgattca atctgaagga gtaatgcatc ctacccctat aaaaaagatc

9660

ttaagagtgg gaccatggat aaacacaata ttagatgaca ttaaaaccag tgcagagtca

9720

atagggagtc tatgtcagga attagaattt aggggggaaa gcataatagt tagtctgata

9780

ttaaggaatt tttggctgta taatttatac atgcatgaat caaagcaaca ccccctagca

9840

gggaagcagt tattcaaaca actaaataaa acattaacat cagtgcagag attttttgaa

9900

attaaaaagg aaaatgaagt agtagatcta tggatgaaca taccaatgca gtttggagga

9960

ggagatccag tagtcttcta tagatctttc tatagaagga cccctgattt tttaactgaa

10020

gcaatcagtc atgtagatat tctgttaaaa atatcagcca acataagaaa tgaagcgaaa

10080

ataagtttct tcaaagcctt actgtcaata gaaaaaaatg aacgtgctac actgacaaca

10140

ctaatgagag accctcaagc tgtgggctca gagcgacaag caaaagtaac aagtgatatc

10200

aatagaacag cagttaccag catcttaagt ctttctccaa atcaactttt cagcgatagt

10260

gctatacact acagtagaaa tgaagaagag gtcggaatca ttgctgacaa cataacacct

10320

gtttatcctc atggactgag agttttgtat gaatcattac cttttcataa agctgaaaaa

10380

gttgtaaata tgatatcagg aacaaaatcc ataaccaact tattacagag aacatctgct

10440

attaatggtg aagatattga cagagctgta tccatgatgc tggagaacct aggattatta

10500

tctagaatat tgtcagtagt tgttgatagt atagaaattc caaccaaatc taatggtagg

10560

ctgatatgtt gtcagatatc tagaacccta agggagacat catggaataa tatggaaata

10620

gttggagtaa catcccctag catcactaca tgcatggatg tcatatatgc aactagctct

10680

catttgaaag ggataatcat tgaaaagttc agcactgaca gaactacaag aggtcaaaga

10740

ggtccaaaga gcccttgggt aggatcgagc acgcaagaga aaaaattagt tcctgtttat

10800

aacagacaaa ttctttcaaa acaacaaaga gaacagctag aagcaattgg aaaaatgaga

10860

tgggtatata aagggacacc aggtttaaga cgattactca ataagatttg tcttggaagt

10920

ttaggcatta gttacaaatg tgtaaaacct ttattaccta ggtttatgag tgtaaatttc

10980

ctacacaggt tatctgtcag tagtagacct atggaattcc cagcatcagt tccagcttat

11040

agaacaacaa attaccattt tgacactagt cctattaatc aagcactaag tgaaagattt

11100

gggaatgaag atattaattt ggtcttccaa aatgcaatca gctgtggaat tagcataatg

11160

agtgtagtag aacaattaac tggtaggagt ccaaaacagt tagttttaat accccaatta

11220

gaagaaatag acattatgcc accaccagtg tttcaaggga aattcaatta taagctagta

11280

gataagataa cttctgacca acatatcttc agtccagaca aaatagatat gttaacactg

11340

gggaaaatgc tcatgccaac tataaaaggt cagaaaacag atcagttctt gaacaagaga

11400

gagaattatt tccatgggaa caatcttatt gagtctttgt cagcagcgtt agcatgtcat

11460

tggtgtggga tattaacaga gcaatgtata gaaaataata ttttcaagaa agactggggt

11520

gacgggttca tatcggatca tgcttttatg gacttcaaaa tattcctatg tgtctttaaa

11580

actaaacttt tatgtagttg gggatcccaa gggaaaaaca ttaaagatga agatatagta

11640

gatgaatcga tagataaact gttaaggatt gataatactt tttggagaat gttcagcaag

11700

gttatgtttg aatcaaaggt taagaaaagg ataatgttat atgatgtaaa atttctatca

11760

ttagtaggtt atatagggtt taagaattgg tttatagaac agttgagatc agctgagttg

11820

catgaggtac cttggattgt caatgccgaa ggtgatctgg ttgagatcaa gtcaattaaa

11880

atctatttgc aactgataga gcagagttta tttttaagaa taactgtttt gaactataca

11940

gatatggcac atgctctcac aagattaatc agaaagaagt tgatgtgtga taatgcacta

12000

ttaacttcaa ttccatcccc aatggttaac ttaactcaag ttattgatcc tacagaacaa

12060

ttagcttatt tccctaagat aacatttgaa aggctaaaaa attatgacac tagttcaaat

12120

tatgctaaag gaaagctaac aaggaattac atgatactgt tgccatggca acatgttaat

12180

agatataact ttgtctttag ttctactgga tgtaaagtta gtctaaaaac atgcattgga

12240

aaacttatga aagatctaaa ccctaaagtt ctgtacttta ttggagaagg ggcaggaaat

12300

tggatggcca gaacagcatg tgaatatcct gacatcaaat ttgtatacag aagtttaaaa

12360

gatgaccttg atcatcatta tcctttggaa taccagagag tgataggaga attaagcagg

12420

ataatagata gtggtgaagg gctttcaatg gaaacaacag atgcaactca aaaaactcat

12480

tgggatttga tacacagagt aagcaaagat gctttattaa taactttatg tgatgcagaa

12540

tttaaggaca gagatgattt ttttaagatg gtaattctat ggaggaaaca tgtattatca

12600

tgcagaattt gcactaccta tgggacagac ctctatttat tcgcaaagta tcatgctaaa

12660

gactgcaata taaaattacc tttttttgtg agatcagttg ccacctttat tatgcaaggt

12720

agtaaactgt caggctcgga atgctacata ctcttaacac taggccacca caacaattta

12780

ccttgtcatg gagaaataca aaattctaag atgaaaatag cagcgtgtaa tgatttttat

12840

gctgcaaaaa aacttgacaa taaatcaatt gaagccaact gtaaatcact tttatcaggg

12900

ctaagaatac cgataaataa gaaggaatta aatagacaga gaaggttatt aacactacaa

12960

agcaaccatt cttctgtagc aacagttgga ggtagcaagg tcatagagtc taaatggtta

13020

acaaacaagg caaacacaat aattgattgg ttagaacata ttttaaattc tccaaaaggt

13080

gaattaaatt atgatttttt tgaagcatta gaaaatactt accctaatat gattaaacta

13140

atagataatc tagggaatgc agagattaaa aaactgatca aagtaactgg atatatgctt

13200

gtaagtaaaa aatgaaaaat gataaaaatg ataaaatagg tgacaacttc atactattcc

13260

aaagtaatca tttgattatg caattatgta atagttaatt aaaaactaaa aatcaaaagt

13320

taaaaactaa taactgtcat taagtttatt aaaaataaga aattataatt ggatgtatac

13380

ggtttttttg ccgt

13394

<210> 2

<211> 12645

<212> ДНК

<213> метапевмовирус

<400> 2

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatgtctct

60

tcaagggatt cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta

120

cacaataaaa agagatgtgg gtacaacaac tgcagtgaca ccctcatcat tgcaacaaga

180

aataacgctg ttgtgtggag aaattctgta tgctaaacat gctgattaca aatatgctgc

240

agaaatagga atacaatata ttagcacagc tttaggatca gagagagtgc agcagattct

300

gaggaactca ggcagtgaag tccaagtggt cttaaccaga acgtactctc tggggaaagt

360

taaaaacaat aaaggagaag atttacagat gttagacata cacggggtag agaagagctg

420

ggtagaagag atagacaaag aagcaaggaa aacaatggca accttgctta aggaatcatc

480

aggtaatatc ccacaaaatc agaggccctc agcaccagac acacccataa tcttattatg

540

tgtaggtgca ttaatattta ctaagctagc atcaaccata gaagtgggac tagagaccac

600

agtcagaagg gctaaccgtg tactaagtga tgcactcaag agatacccta gaatggacat

660

cccaaaaatt gccagatcct tctatgactt atttgaacaa aaagtgtatc acagaagttt

720

gttcattgag tatggcaaag cattaggctc atcatctaca ggcagcaaag cagaaagtct

780

atttgttaat atattcatgc aagcttatgg agccggtcaa acaatgctaa ggtggggggt

840

cattgccagg tcatccaaca atataatgtt aggacatgta tctgtccaag ctgagttaaa

900

acaggtcaca gaagtctatg acttggtgcg agaaatgggc cctgaatctg gacttctaca

960

tttaaggcaa agcccaaaag ctggactgtt atcactagcc aactgtccca actttgcaag

1020

tgttgttctc ggaaatgcct caggcttagg cataatcggt atgtatcgtg ggagagtacc

1080

aaacacagaa ttattttcag cagcagaaag ttatgccaaa agtttgaaag agagcaataa

1140

aatcaatttc tcttcattag gacttacaga tgaagagaaa gaggctgcag aacatttctt

1200

aaatgtgagt gacgacagtc aaaatgatta tgagtaatta aaaaagtggg acaagtcaaa

1260

atgtctttcc ctgaaggaaa agatattctt ttcatgggta atgaagcagc aaaattagca

1320

gaagctttcc agaaatcatt aaggaaacca agtcataaaa gatctcaatc tattatagga

1380

gaaaaagtga acactgtatc agaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctgcaaaa

1440

ccaaccatac tgtcagaacc aaagttagca tggactgata aaggtggggc aatcaaaact

1500

gaaataaagc aagcaatcaa agtcatggat cctattgagg aagaagagtc tactgagaag

1560

aaggtgctgc cctccagtga tgggaaaacc cctgcagaaa agaaactgaa accatcaact

1620

aacaccaaaa agaaagtttc gtttacacca aatgaaccag gaaaatatac aaagttggaa

1680

aaagatgctc tagatttgct ctcagataat gaagaagaag atgcagaatc ttcaatctta

1740

acctttgaag aaagagatac ttcatcgtta agcattgagg ccagattgga atcaatagag

1800

gagaaattaa gcatgatatt agggctatta agaacactca acattgctac agcaggaccc

1860

acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggcg taagagagga attaatagca

1920

gacataataa aggaagccaa agggaaagca gcagaaatga tggaagagga aatgagtcaa

1980

cgatcaaaaa taggaaacgg tagtgtaaaa ctaacagaga aagcaaaaga gcttaacaaa

2040

attgttgaag atgaaagcac aagtggagaa tctgaagaag aagaagaacc aaaagacata

2100

caagacaata gtcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtagtttaa taaaaataaa

2160

caatgggaca agtaaaaatg gagtcctacc tagtagacac ttatcaaggc attccttaca

2220

cagcagctgt tcaagttgat ctaatagaaa aggacctgtt acctgcaagc ctaacaatat

2280

ggttcccttt gtttcaggcc aacacaccac cagcagtgct gctcgatcag ttgaaaaccc

2340

taacaataac cactctgtat gctgcatcac aaaatggtcc aatactcaaa gtgaatgcat

2400

cagcccaagg tgcagcaatg tctgtacttc ccaaaaaatt tgaagtcaat gcgactgtag

2460

cactcgatga atatagcaaa ttggaatttg acaaactcac agtctgtgaa gtaaaaacag

2520

tttacttaac aaccatgaaa ccatacggga tggtatcaaa atttgtgagc tcagccaaat

2580

cagttggcaa aaaaacacat gatctaatcg cactgtgtga ttttatggat ctagaaaaga

2640

acacacctgt tacaatacca gcattcatca aatcagtttc aatcaaagag agtgagtcag

2700

ctactgttga agctgctata agcagtgaag cagaccaagc tctaacacag gccaaaattg

2760

caccttatgc gggattgatt atgatcatga ctatgaacaa tcccaaaggc atattcaaaa

2820

agcttggagc tgggactcaa gttatagtag aactaggagc atatgtccag gctgaaagca

2880

taagtaaaat atgcaagact tggagccatc aagggacaag atatgtgttg aagtccagat

2940

aacagccaag caccttggcc aagagctact aactctatct catagattat aaagtcacca

3000

ttctagttat ataaaaatca agttagaaca agaattaaat caatcaagaa tgggacaaat

3060

aaaaatgtct tggaaagtgg tgatcatttt ttcattgtta ataacacctc aacacggtct

3120

taaagagagc tatttagaag agtcatgtag cactataact gaaggatatc tcagtgttct

3180

gaggacaggt tggtatacca acgtttttac actggaggta ggtgatgtag agaaccttac

3240

atgtgctgat ggacctagct taataaaaac agaattagac ctgaccaaaa gtgcactaag

3300

agaactcaga acagtttctg ctgatcaact ggcaagagag gagcaaattg agaatcccag

3360

acaatctaga tttgttctag gagcaatagc actcggtgtt gcaacagcag ctgcagttac

3420

agcaggtgtt gcaattgcca aaaccatccg gcttgaaagt gaagtaacag caattaagaa

3480

tgccctcaaa aagaccaatg aagcagtatc tacattgggg aatggagttc gagtgttggc

3540

aactgcagtg agggagctgg aagattttgt gagcaagaat ctaacacgtg caatcaacaa

3600

aaacaagtgc gacattgctg acctgaaaat ggccgttagc ttcagtcaat tcaacagaag

3660

gtttctaaat gttgtgcggc aattttcaga caatgctgga ataacaccag caatatcctt

3720

ggacttaatg acagatgctg aactagccag agctgtttcc aacatgccaa catctgcagg

3780

acaaataaaa ctgatgttgg agaaccgtgc aatggtaaga agaaaggggt tcggaatcct

3840

gataggagtt tacggaagct ccgtaattta catggtgcaa ctgccaatct ttggagttat

3900

agacacgcct tgctggatag taaaagcggc cccttcttgc tcagaaaaaa agggaaacta

3960

tgcttgcctt ttaagagaag atcaaggatg gtattgtcag aatgcagggt caactgttta

4020

ctacccaaat gaaaaagact gcgaaacaag aggagaccat gtcttttgcg acacagcagc

4080

aggaatcaat gttgctgagc agtcaaagga gtgcaacatc aacatatcca ctactaatta

4140

cccatgcaaa gttagcacag gaagacaccc tatcagtatg gttgcactgt ctcctcttgg

4200

ggctttggtt gcttgctaca agggagtgag ctgttccatt ggcagcaaca gagtagggat

4260

catcaagcaa ctgaacaaag gctgctctta tataaccaac caagacgcag acacagtgac

4320

aatagacaac actgtatacc agctaagcaa agttgagggc gaacagcatg ttataaaagg

4380

aaggccagtg tcaagcagct ttgatccagt caaatttcct gaagatcaat tcaatgttgc

4440

acttgaccaa gttttcgaaa gcattgagaa cagtcaggcc ttggtggatc aatcaaacag

4500

aatcctaagc agtgcagaga aaggaaacac tggcttcatc attgtaataa ttctaattgc

4560

tgtccttggc tctaccatga tcctagtgag tgtttttatc ataataaaga aaacaaagaa

4620

acccacagga gcacctccag agctgagtgg tgtcacaaac aatggcttca taccacataa

4680

ttagttaatt aaaaataaag taaattaaat taaaataaaa taaaattaaa attaaaataa

4740

aataaaaata aaaatttggg acaaatcata atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa

4800

gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag tgcaagttta accacaatta ctggagttgg

4860

ccagatagat acttactaat aagatcaaat tatttattaa atcaactttt aaggaacact

4920

gatagagctg atggcttatc aataatatca ggagcaggca gagaagatag gacacaagat

4980

tttgtcctag gttccaccaa tgtggttcaa ggttatattg atgataacca aagcataaca

5040

aaagctgcag cctgttacag tctacataat ataatcaaac aactacaaga agttgaagtt

5100

aggcaggcta gagataacaa accatctgac agcaaacatg tggcacttca caacttagtc

5160

ctatcttata tggagatgag caaaattcct gcatctttaa tcaacaatct caaaagactg

5220

ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag cttataattg acttatcagc aggtgctgaa

5280

aatgactctt catatgcctt gcaagacagt gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg

5340

tcctgttttc attactatag aggttgatta catgatatgg actcataagg acttaaaaga

5400

agctttatct aatgggatag tgaagtctca tactaacatt tacaattgtt atttagaaaa

5460

catagaaatt atatatgtca aggcttactt aagttagtaa aaacacatca gagtgggaca

5520

agtagttatg gaggtgaaag tggagaacat tcgaacaata gatatgctca aagcaagagt

5580

gaaaaatcgt gtggcacgca gcaaatgctt taaaaatgcc tctttgatcc taataggaat

5640

aactacattg agtatagccc tcaatatcta tctaatcata aactatacaa tgcaagaaaa

5700

cacatccgaa tcagaacatc acaccagctc atcacccatg gaatccagca gggaaactcc

5760

aacagtccct atggacaact cagacaccaa tccaggctca cagtatccaa ctcaacagtc

5820

cacagaaggc tccacactct actttgcagc ctcagcaagc tcaccagaga cagaaccaac

5880

atcaacacca gacacaacaa gccgcccgcc cttcgtcgac acacacacaa cactaccaag

5940

tgcaagcaga acaaggacaa gtccggcagt ccacacaaaa aacaatccaa ggacaagccc

6000

cagaacacat tccccaccat gggcaatgac aaggacggtc cgtggaacca ccactctccg

6060

cacaagcagc acaagaaaaa gaccgtccac agcatcagtc caacctgaca gcagcgcaac

6120

aacccacaaa cacgaagaag caagcccagt gagcccgcaa acatctgcga gcacagcaag

6180

accacaaagg aagggcatgg aggccagcac atcaacaaca tacaaccaaa ctagttaaca

6240

aaaaatacaa aataactcta agataaacca tatagacacc aacaattgag aagccaaaag

6300

gcaattcaca atctctccaa aaaggcaaca acaccatatt agctccgctt aaatctccct

6360

ggaaaaaaca ctcgcccata taccaactat accacaacca tcccaagaaa aaaagctggg

6420

taaaacaaca cccaagagac aaataacaat ggatcctctt aatgaatcca ctgttaatgt

6480

ctatcttccc gactcatatc ttaaaggagt gatttctttt agtgagacta atgcaattgg

6540

ttcatgtctc ttaaaaagac cttacctaaa aaatgacaac actgcaaaag ttgccataga

6600

gaatcctgtt atcgagcatg ttagactcaa aaatgcaatc aattctaaga tgaaaatatc

6660

agattacagg atagtagagc cagtaaacat gcaacatgaa attatgaaga atgtacacag

6720

ttgtgagctc acattattaa aacagttttt aacaaggagt aaaaatatta gcactcttaa

6780

attaaatatg atatgtgatt ggctgcagtt aaagtctaca tcagatgata cctcaatctt

6840

aagttttata gatgtagaat ttatacctag ctgggtaagc aattggttta gtaattggta

6900

caatctcaac aagttgattc tggaattcag gaaagaagaa gtaataagaa ctggttcaat

6960

cttgtgtagg tcattgggta aattagtttt tgttgtatca tcatacggat gtatagtcaa

7020

gagcaacaaa agcaaaagag tgagcttctt cacatacaat caactgttaa catggaaaga

7080

tgtgatgtta agtagattca atgcaaattt ctgtatatgg gtaagcaaca gtctgaatga

7140

aaatcaagaa gggttagggt tgagaagtaa tctgcaaggc atattaacta ataagctata

7200

tgaaactgta gattatatgc ttagtttgtg ttgcaatgaa ggtttctcac ttgtgaaaga

7260

gtttgagggt tttattatga gtgaaatcct taggattact gaacatgctc aattcagtac

7320

tagatttaga aatactttat taaatggatt aactgatcaa ttgacaaaat taaaaaataa

7380

aaacagactc agagttcatg gtaccgtgtt agaaaataat gattatccaa tgtatgaagt

7440

tgtacttaaa ttattaggag atactttgag atgtattaaa ttattaatca ataaaaactt

7500

agagaatgct gctgaattat actatatatt tagaatattc ggtcacccaa tggtagatga

7560

aagagatgca atggatgctg tcaaattaaa caatgaaatc acaaaaatcc tcaggttgga

7620

gagcttgaca gaactaagag gggcattcat attaaggatt atcaaaggat ttgtagacaa

7680

caacaaaaga tggccgaaaa ttaaaaactt aaaagtgctt agtaaaagat ggactatgta

7740

cttcaaagca aaaagttacc ctagtcaact tgaattaagt gaacaagatt ttttagagct

7800

tgctgcaata cagtttgaac aagagttttc tgttcctgaa aaaaccaacc ttgagatggt

7860

attaaatgat aaagctatat cacctcctaa aagattaatt tggtctgtgt acccaaaaaa

7920

ttacttacct gagacaataa aaaatcgata tctagaagag actttcaatg caagtgatag

7980

tctcaaaaca agaagagtac tagagtacta tttgaaagat aataaattcg accaaaaaga

8040

acttaaaagt tatgtggtta aacaagaata tttaaatgat aaggatcata ttgtctcgct

8100

aactggaaaa gaaagagaat taagtgtagg tagaatgttt gctatgcaac caggaaaaca

8160

gcgacaaata caaatattgg ctgaaaaatt gttagctgat aatattgtac cctttttccc

8220

agaaacttta acaaagtatg gtgatctaga tcttcagaga ataatggaaa tcaaatcaga

8280

actttcttct attaaaacca gaagaaatga tagttataat aattacattg caagagcatc

8340

catagtaaca gatttaagta agttcaacca agcctttagg tatgaaacta cagcgatctg

8400

tgcggatgta gcagatgaac tacatggaac acaaagccta ttctgttggt tacatcttat

8460

cgttcctatg actacaatga tatgtgccta tagacatgca ccaccagaaa caaaaggtga

8520

atatgatata gataagatag aagagcaaag tggtttatat agatatcata tgggtggtat

8580

tgaaggatgg tgtcaaaaac tctggacaat ggaagctata tctttattag atgttgtatc

8640

tgtaaagaca cgatgtcaaa tgacatcttt attaaacggt gacaaccaat caatagatgt

8700

aagtaaacca gttaagttat ctgagggttt agatgaagtg aaagcagatt atagcttggc

8760

tgtaaaaatg ctaaaagaaa taagagatgc atacagaaat ataggccata aacttaaaga

8820

aggggaaaca tatatatcaa gagatcttca gtttataagt aaggtgattc aatctgaagg

8880

agtaatgcat cctaccccta taaaaaagat cttaagagtg ggaccatgga taaacacaat

8940

attagatgac attaaaacca gtgcagagtc aatagggagt ctatgtcagg aattagaatt

9000

taggggggaa agcataatag ttagtctgat attaaggaat ttttggctgt ataatttata

9060

catgcatgaa tcaaagcaac accccctagc agggaagcag ttattcaaac aactaaataa

9120

aacattaaca tcagtgcaga gattttttga aattaaaaag gaaaatgaag tagtagatct

9180

atggatgaac ataccaatgc agtttggagg aggagatcca gtagtcttct atagatcttt

9240

ctatagaagg acccctgatt ttttaactga agcaatcagt catgtagata ttctgttaaa

9300

aatatcagcc aacataagaa atgaagcgaa aataagtttc ttcaaagcct tactgtcaat

9360

agaaaaaaat gaacgtgcta cactgacaac actaatgaga gaccctcaag ctgtgggctc

9420

agagcgacaa gcaaaagtaa caagtgatat caatagaaca gcagttacca gcatcttaag

9480

tctttctcca aatcaacttt tcagcgatag tgctatacac tacagtagaa atgaagaaga

9540

ggtcggaatc attgctgaca acataacacc tgtttatcct catggactga gagttttgta

9600

tgaatcatta ccttttcata aagctgaaaa agttgtaaat atgatatcag gaacaaaatc

9660

cataaccaac ttattacaga gaacatctgc tattaatggt gaagatattg acagagctgt

9720

atccatgatg ctggagaacc taggattatt atctagaata ttgtcagtag ttgttgatag

9780

tatagaaatt ccaaccaaat ctaatggtag gctgatatgt tgtcagatat ctagaaccct

9840

aagggagaca tcatggaata atatggaaat agttggagta acatccccta gcatcactac

9900

atgcatggat gtcatatatg caactagctc tcatttgaaa gggataatca ttgaaaagtt

9960

cagcactgac agaactacaa gaggtcaaag aggtccaaag agcccttggg taggatcgag

10020

cacgcaagag aaaaaattag ttcctgttta taacagacaa attctttcaa aacaacaaag

10080

agaacagcta gaagcaattg gaaaaatgag atgggtatat aaagggacac caggtttaag

10140

acgattactc aataagattt gtcttggaag tttaggcatt agttacaaat gtgtaaaacc

10200

tttattacct aggtttatga gtgtaaattt cctacacagg ttatctgtca gtagtagacc

10260

tatggaattc ccagcatcag ttccagctta tagaacaaca aattaccatt ttgacactag

10320

tcctattaat caagcactaa gtgaaagatt tgggaatgaa gatattaatt tggtcttcca

10380

aaatgcaatc agctgtggaa ttagcataat gagtgtagta gaacaattaa ctggtaggag

10440

tccaaaacag ttagttttaa taccccaatt agaagaaata gacattatgc caccaccagt

10500

gtttcaaggg aaattcaatt ataagctagt agataagata acttctgacc aacatatctt

10560

cagtccagac aaaatagata tgttaacact ggggaaaatg ctcatgccaa ctataaaagg

10620

tcagaaaaca gatcagttct tgaacaagag agagaattat ttccatggga acaatcttat

10680

tgagtctttg tcagcagcgt tagcatgtca ttggtgtggg atattaacag agcaatgtat

10740

agaaaataat attttcaaga aagactgggg tgacgggttc atatcggatc atgcttttat

10800

ggacttcaaa atattcctat gtgtctttaa aactaaactt ttatgtagtt ggggatccca

10860

agggaaaaac attaaagatg aagatatagt agatgaatcg atagataaac tgttaaggat

10920

tgataatact ttttggagaa tgttcagcaa ggttatgttt gaatcaaagg ttaagaaaag

10980

gataatgtta tatgatgtaa aatttctatc attagtaggt tatatagggt ttaagaattg

11040

gtttatagaa cagttgagat cagctgagtt gcatgaggta ccttggattg tcaatgccga

11100

aggtgatctg gttgagatca agtcaattaa aatctatttg caactgatag agcagagttt

11160

atttttaaga ataactgttt tgaactatac agatatggca catgctctca caagattaat

11220

cagaaagaag ttgatgtgtg ataatgcact attaacttca attccatccc caatggttaa

11280

cttaactcaa gttattgatc ctacagaaca attagcttat ttccctaaga taacatttga

11340

aaggctaaaa aattatgaca ctagttcaaa ttatgctaaa ggaaagctaa caaggaatta

11400

catgatactg ttgccatggc aacatgttaa tagatataac tttgtcttta gttctactgg

11460

atgtaaagtt agtctaaaaa catgcattgg aaaacttatg aaagatctaa accctaaagt

11520

tctgtacttt attggagaag gggcaggaaa ttggatggcc agaacagcat gtgaatatcc

11580

tgacatcaaa tttgtataca gaagtttaaa agatgacctt gatcatcatt atcctttgga

11640

ataccagaga gtgataggag aattaagcag gataatagat agtggtgaag ggctttcaat

11700

ggaaacaaca gatgcaactc aaaaaactca ttgggatttg atacacagag taagcaaaga

11760

tgctttatta ataactttat gtgatgcaga atttaaggac agagatgatt tttttaagat

11820

ggtaattcta tggaggaaac atgtattatc atgcagaatt tgcactacct atgggacaga

11880

cctctattta ttcgcaaagt atcatgctaa agactgcaat ataaaattac ctttttttgt

11940

gagatcagtt gccaccttta ttatgcaagg tagtaaactg tcaggctcgg aatgctacat

12000

actcttaaca ctaggccacc acaacaattt accttgtcat ggagaaatac aaaattctaa

12060

gatgaaaata gcagcgtgta atgattttta tgctgcaaaa aaacttgaca ataaatcaat

12120

tgaagccaac tgtaaatcac ttttatcagg gctaagaata ccgataaata agaaggaatt

12180

aaatagacag agaaggttat taacactaca aagcaaccat tcttctgtag caacagttgg

12240

aggtagcaag gtcatagagt ctaaatggtt aacaaacaag gcaaacacaa taattgattg

12300

gttagaacat attttaaatt ctccaaaagg tgaattaaat tatgattttt ttgaagcatt

12360

agaaaatact taccctaata tgattaaact aatagataat ctagggaatg cagagattaa

12420

aaaactgatc aaagtaactg gatatatgct tgtaagtaaa aaatgaaaaa tgataaaaat

12480

gataaaatag gtgacaactt catactattc caaagtaatc atttgattat gcaattatgt

12540

aatagttaat taaaaactaa aaatcaaaag ttaaaaacta ataactgtca ttaagtttat

12600

taaaaataag aaattataat tggatgtata cggttttttt gccgt

12645

<210> 3

<211> 12473

<212> ДНК

<213> метапевмовирус

<400> 3

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatgtctct

60

tcaagggatt cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta

120

cacaataaaa agagatgtgg gtacaacaac tgcagtgaca ccctcatcat tgcaacaaga

180

aataacgctg ttgtgtggag aaattctgta tgctaaacat gctgattaca aatatgctgc

240

agaaatagga atacaatata ttagcacagc tttaggatca gagagagtgc agcagattct

300

gaggaactca ggcagtgaag tccaagtggt cttaaccaga acgtactctc tggggaaagt

360

taaaaacaat aaaggagaag atttacagat gttagacata cacggggtag agaagagctg

420

ggtagaagag atagacaaag aagcaaggaa aacaatggca accttgctta aggaatcatc

480

aggtaatatc ccacaaaatc agaggccctc agcaccagac acacccataa tcttattatg

540

tgtaggtgca ttaatattta ctaagctagc atcaaccata gaagtgggac tagagaccac

600

agtcagaagg gctaaccgtg tactaagtga tgcactcaag agatacccta gaatggacat

660

cccaaaaatt gccagatcct tctatgactt atttgaacaa aaagtgtatc acagaagttt

720

gttcattgag tatggcaaag cattaggctc atcatctaca ggcagcaaag cagaaagtct

780

atttgttaat atattcatgc aagcttatgg agccggtcaa acaatgctaa ggtggggggt

840

cattgccagg tcatccaaca atataatgtt aggacatgta tctgtccaag ctgagttaaa

900

acaggtcaca gaagtctatg acttggtgcg agaaatgggc cctgaatctg gacttctaca

960

tttaaggcaa agcccaaaag ctggactgtt atcactagcc aactgtccca actttgcaag

1020

tgttgttctc ggaaatgcct caggcttagg cataatcggt atgtatcgtg ggagagtacc

1080

aaacacagaa ttattttcag cagcagaaag ttatgccaaa agtttgaaag agagcaataa

1140

aatcaatttc tcttcattag gacttacaga tgaagagaaa gaggctgcag aacatttctt

1200

aaatgtgagt gacgacagtc aaaatgatta tgagtaatta aaaaagtggg acaagtcaaa

1260

atgtctttcc ctgaaggaaa agatattctt ttcatgggta atgaagcagc aaaattagca

1320

gaagctttcc agaaatcatt aaggaaacca agtcataaaa gatctcaatc tattatagga

1380

gaaaaagtga acactgtatc agaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctgcaaaa

1440

ccaaccatac tgtcagaacc aaagttagca tggactgata aaggtggggc aatcaaaact

1500

gaaataaagc aagcaatcaa agtcatggat cctattgagg aagaagagtc tactgagaag

1560

aaggtgctgc cctccagtga tgggaaaacc cctgcagaaa agaaactgaa accatcaact

1620

aacaccaaaa agaaagtttc gtttacacca aatgaaccag gaaaatatac aaagttggaa

1680

aaagatgctc tagatttgct ctcagataat gaagaagaag atgcagaatc ttcaatctta

1740

acctttgaag aaagagatac ttcatcgtta agcattgagg ccagattgga atcaatagag

1800

gagaaattaa gcatgatatt agggctatta agaacactca acattgctac agcaggaccc

1860

acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggcg taagagagga attaatagca

1920

gacataataa aggaagccaa agggaaagca gcagaaatga tggaagagga aatgagtcaa

1980

cgatcaaaaa taggaaacgg tagtgtaaaa ctaacagaga aagcaaaaga gcttaacaaa

2040

attgttgaag atgaaagcac aagtggagaa tctgaagaag aagaagaacc aaaagacata

2100

caagacaata gtcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtagtttaa taaaaataaa

2160

caatgggaca agtaaaaatg gagtcctacc tagtagacac ttatcaaggc attccttaca

2220

cagcagctgt tcaagttgat ctaatagaaa aggacctgtt acctgcaagc ctaacaatat

2280

ggttcccttt gtttcaggcc aacacaccac cagcagtgct gctcgatcag ttgaaaaccc

2340

taacaataac cactctgtat gctgcatcac aaaatggtcc aatactcaaa gtgaatgcat

2400

cagcccaagg tgcagcaatg tctgtacttc ccaaaaaatt tgaagtcaat gcgactgtag

2460

cactcgatga atatagcaaa ttggaatttg acaaactcac agtctgtgaa gtaaaaacag

2520

tttacttaac aaccatgaaa ccatacggga tggtatcaaa atttgtgagc tcagccaaat

2580

cagttggcaa aaaaacacat gatctaatcg cactgtgtga ttttatggat ctagaaaaga

2640

acacacctgt tacaatacca gcattcatca aatcagtttc aatcaaagag agtgagtcag

2700

ctactgttga agctgctata agcagtgaag cagaccaagc tctaacacag gccaaaattg

2760

caccttatgc gggattgatt atgatcatga ctatgaacaa tcccaaaggc atattcaaaa

2820

agcttggagc tgggactcaa gttatagtag aactaggagc atatgtccag gctgaaagca

2880

taagtaaaat atgcaagact tggagccatc aagggacaag atatgtgttg aagtccagat

2940

aacagccaag caccttggcc aagagctact aactctatct catagattat aaagtcacca

3000

ttctagttat ataaaaatca agttagaaca agaattaaat caatcaagaa tgggacaaat

3060

aaaaatgtct tggaaagtgg tgatcatttt ttcattgtta ataacacctc aacacggtct

3120

taaagagagc tatttagaag agtcatgtag cactataact gaaggatatc tcagtgttct

3180

gaggacaggt tggtatacca acgtttttac actggaggta ggtgatgtag agaaccttac

3240

atgtgctgat ggacctagct taataaaaac agaattagac ctgaccaaaa gtgcactaag

3300

agaactcaga acagtttctg ctgatcaact ggcaagagag gagcaaattg agaatcccag

3360

acaatctaga tttgttctag gagcaatagc actcggtgtt gcaacagcag ctgcagttac

3420

agcaggtgtt gcaattgcca aaaccatccg gcttgaaagt gaagtaacag caattaagaa

3480

tgccctcaaa aagaccaatg aagcagtatc tacattgggg aatggagttc gagtgttggc

3540

aactgcagtg agggagctgg aagattttgt gagcaagaat ctaacacgtg caatcaacaa

3600

aaacaagtgc gacattgctg acctgaaaat ggccgttagc ttcagtcaat tcaacagaag

3660

gtttctaaat gttgtgcggc aattttcaga caatgctgga ataacaccag caatatcctt

3720

ggacttaatg acagatgctg aactagccag agctgtttcc aacatgccaa catctgcagg

3780

acaaataaaa ctgatgttgg agaaccgtgc aatggtaaga agaaaggggt tcggaatcct

3840

gataggagtt tacggaagct ccgtaattta catggtgcaa ctgccaatct ttggagttat

3900

agacacgcct tgctggatag taaaagcggc cccttcttgc tcagaaaaaa agggaaacta

3960

tgcttgcctt ttaagagaag atcaaggatg gtattgtcag aatgcagggt caactgttta

4020

ctacccaaat gaaaaagact gcgaaacaag aggagaccat gtcttttgcg acacagcagc

4080

aggaatcaat gttgctgagc agtcaaagga gtgcaacatc aacatatcca ctactaatta

4140

cccatgcaaa gttagcacag gaagacaccc tatcagtatg gttgcactgt ctcctcttgg

4200

ggctttggtt gcttgctaca agggagtgag ctgttccatt ggcagcaaca gagtagggat

4260

catcaagcaa ctgaacaaag gctgctctta tataaccaac caagacgcag acacagtgac

4320

aatagacaac actgtatacc agctaagcaa agttgagggc gaacagcatg ttataaaagg

4380

aaggccagtg tcaagcagct ttgatccagt caaatttcct gaagatcaat tcaatgttgc

4440

acttgaccaa gttttcgaaa gcattgagaa cagtcaggcc ttggtggatc aatcaaacag

4500

aatcctaagc agtgcagaga aaggaaacac tggcttcatc attgtaataa ttctaattgc

4560

tgtccttggc tctaccatga tcctagtgag tgtttttatc ataataaaga aaacaaagaa

4620

acccacagga gcacctccag agctgagtgg tgtcacaaac aatggcttca taccacataa

4680

ttagttaatt aaaaataaag taaattaaat taaaataaaa taaaattaaa attaaaataa

4740

aataaaaata aaaatttggg acaaatcata atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa

4800

gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag tgcaagttta accacaatta ctggagttgg

4860

ccagatagat acttactaat aagatcaaat tatttattaa atcaactttt aaggaacact

4920

gatagagctg atggcttatc aataatatca ggagcaggca gagaagatag gacacaagat

4980

tttgtcctag gttccaccaa tgtggttcaa ggttatattg atgataacca aagcataaca

5040

aaagctgcag cctgttacag tctacataat ataatcaaac aactacaaga agttgaagtt

5100

aggcaggcta gagataacaa accatctgac agcaaacatg tggcacttca caacttagtc

5160

ctatcttata tggagatgag caaaattcct gcatctttaa tcaacaatct caaaagactg

5220

ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag cttataattg acttatcagc aggtgctgaa

5280

aatgactctt catatgcctt gcaagacagt gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg

5340

tcctgttttc attactatag aggttgatta catgatatgg actcataagg acttaaaaga

5400

agctttatct aatgggatag tgaagtctca tactaacatt tacaattgtt atttagaaaa

5460

catagaaatt atatatgtca aggcttactt aagttagtaa aaacacatca gagtgggata

5520

aatgacaatg ataacattag atgtcattaa aagtgatggg tcttcaaaaa catgtactca

5580

cctcaaaaaa ttaattaaag accactctgg taaagtgctt attgtactta agttaatatt

5640

agctttacta acatttctca cagtgacaat caccatcaat tatataaaag tagaaaacaa

5700

tctgcaaata tgtcagtcaa aaactgaatc agacaaaaag gactcatcat caaataccac

5760

atcagtcaca accaagacta ctctaaatca tgatataaca cagtatttta aaagtttgat

5820

tcaaaggtat acaaactctg caataaacag agacacatgc tggaaaataa gcagaaatca

5880

atgcacaaac ataacaacat acaaattttt atgttttaaa tctgaagaaa caaaaaccaa

5940

caattgtgat aaactgacag atttatgcag aaacaaacca aaaccagctg ttgaagtgta

6000

tcacatagta gaatgccatt gtatatacac agttaaatgg aagtgctatc attacccaat

6060

agatgaaacc caatcctaaa taacactaga ttaggatcca tccaagtctg ttagttcaac

6120

aatttagtta tttaaaaata ttttgaaaac aagtaagttt ctatgatact tcataataat

6180

aagtaataat taattgctta atcatcatca caacattatt cgaaaccata actattcaat

6240

ttaagaagta aaaacaataa tatgagacaa ataacaatgg atcctcttaa tgaatccact

6300

gttaatgtct atcttcccga ctcatatctt aaaggagtga tttcttttag tgagactaat

6360

gcaattggtt catgtctctt aaaaagacct tacctaaaaa atgacaacac tgcaaaagtt

6420

gccatagaga atcctgttat cgagcatgtt agactcaaaa atgcaatcaa ttctaagatg

6480

aaaatatcag attacaggat agtagagcca gtaaacatgc aacatgaaat tatgaagaat

6540

gtacacagtt gtgagctcac attattaaaa cagtttttaa caaggagtaa aaatattagc

6600

actcttaaat taaatatgat atgtgattgg ctgcagttaa agtctacatc agatgatacc

6660

tcaatcttaa gttttataga tgtagaattt atacctagct gggtaagcaa ttggtttagt

6720

aattggtaca atctcaacaa gttgattctg gaattcagga aagaagaagt aataagaact

6780

ggttcaatct tgtgtaggtc attgggtaaa ttagtttttg ttgtatcatc atacggatgt

6840

atagtcaaga gcaacaaaag caaaagagtg agcttcttca catacaatca actgttaaca

6900

tggaaagatg tgatgttaag tagattcaat gcaaatttct gtatatgggt aagcaacagt

6960

ctgaatgaaa atcaagaagg gttagggttg agaagtaatc tgcaaggcat attaactaat

7020

aagctatatg aaactgtaga ttatatgctt agtttgtgtt gcaatgaagg tttctcactt

7080

gtgaaagagt ttgagggttt tattatgagt gaaatcctta ggattactga acatgctcaa

7140

ttcagtacta gatttagaaa tactttatta aatggattaa ctgatcaatt gacaaaatta

7200

aaaaataaaa acagactcag agttcatggt accgtgttag aaaataatga ttatccaatg

7260

tatgaagttg tacttaaatt attaggagat actttgagat gtattaaatt attaatcaat

7320

aaaaacttag agaatgctgc tgaattatac tatatattta gaatattcgg tcacccaatg

7380

gtagatgaaa gagatgcaat ggatgctgtc aaattaaaca atgaaatcac aaaaatcctc

7440

aggttggaga gcttgacaga actaagaggg gcattcatat taaggattat caaaggattt

7500

gtagacaaca acaaaagatg gccgaaaatt aaaaacttaa aagtgcttag taaaagatgg

7560

actatgtact tcaaagcaaa aagttaccct agtcaacttg aattaagtga acaagatttt

7620

ttagagcttg ctgcaataca gtttgaacaa gagttttctg ttcctgaaaa aaccaacctt

7680

gagatggtat taaatgataa agctatatca cctcctaaaa gattaatttg gtctgtgtac

7740

ccaaaaaatt acttacctga gacaataaaa aatcgatatc tagaagagac tttcaatgca

7800

agtgatagtc tcaaaacaag aagagtacta gagtactatt tgaaagataa taaattcgac

7860

caaaaagaac ttaaaagtta tgtggttaaa caagaatatt taaatgataa ggatcatatt

7920

gtctcgctaa ctggaaaaga aagagaatta agtgtaggta gaatgtttgc tatgcaacca

7980

ggaaaacagc gacaaataca aatattggct gaaaaattgt tagctgataa tattgtaccc

8040

tttttcccag aaactttaac aaagtatggt gatctagatc ttcagagaat aatggaaatc

8100

aaatcagaac tttcttctat taaaaccaga agaaatgata gttataataa ttacattgca

8160

agagcatcca tagtaacaga tttaagtaag ttcaaccaag cctttaggta tgaaactaca

8220

gcgatctgtg cggatgtagc agatgaacta catggaacac aaagcctatt ctgttggtta

8280

catcttatcg ttcctatgac tacaatgata tgtgcctata gacatgcacc accagaaaca

8340

aaaggtgaat atgatataga taagatagaa gagcaaagtg gtttatatag atatcatatg

8400

ggtggtattg aaggatggtg tcaaaaactc tggacaatgg aagctatatc tttattagat

8460

gttgtatctg taaagacacg atgtcaaatg acatctttat taaacggtga caaccaatca

8520

atagatgtaa gtaaaccagt taagttatct gagggtttag atgaagtgaa agcagattat

8580

agcttggctg taaaaatgct aaaagaaata agagatgcat acagaaatat aggccataaa

8640

cttaaagaag gggaaacata tatatcaaga gatcttcagt ttataagtaa ggtgattcaa

8700

tctgaaggag taatgcatcc tacccctata aaaaagatct taagagtggg accatggata

8760

aacacaatat tagatgacat taaaaccagt gcagagtcaa tagggagtct atgtcaggaa

8820

ttagaattta ggggggaaag cataatagtt agtctgatat taaggaattt ttggctgtat

8880

aatttataca tgcatgaatc aaagcaacac cccctagcag ggaagcagtt attcaaacaa

8940

ctaaataaaa cattaacatc agtgcagaga ttttttgaaa ttaaaaagga aaatgaagta

9000

gtagatctat ggatgaacat accaatgcag tttggaggag gagatccagt agtcttctat

9060

agatctttct atagaaggac ccctgatttt ttaactgaag caatcagtca tgtagatatt

9120

ctgttaaaaa tatcagccaa cataagaaat gaagcgaaaa taagtttctt caaagcctta

9180

ctgtcaatag aaaaaaatga acgtgctaca ctgacaacac taatgagaga ccctcaagct

9240

gtgggctcag agcgacaagc aaaagtaaca agtgatatca atagaacagc agttaccagc

9300

atcttaagtc tttctccaaa tcaacttttc agcgatagtg ctatacacta cagtagaaat

9360

gaagaagagg tcggaatcat tgctgacaac ataacacctg tttatcctca tggactgaga

9420

gttttgtatg aatcattacc ttttcataaa gctgaaaaag ttgtaaatat gatatcagga

9480

acaaaatcca taaccaactt attacagaga acatctgcta ttaatggtga agatattgac

9540

agagctgtat ccatgatgct ggagaaccta ggattattat ctagaatatt gtcagtagtt

9600

gttgatagta tagaaattcc aaccaaatct aatggtaggc tgatatgttg tcagatatct

9660

agaaccctaa gggagacatc atggaataat atggaaatag ttggagtaac atcccctagc

9720

atcactacat gcatggatgt catatatgca actagctctc atttgaaagg gataatcatt

9780

gaaaagttca gcactgacag aactacaaga ggtcaaagag gtccaaagag cccttgggta

9840

ggatcgagca cgcaagagaa aaaattagtt cctgtttata acagacaaat tctttcaaaa

9900

caacaaagag aacagctaga agcaattgga aaaatgagat gggtatataa agggacacca

9960

ggtttaagac gattactcaa taagatttgt cttggaagtt taggcattag ttacaaatgt

10020

gtaaaacctt tattacctag gtttatgagt gtaaatttcc tacacaggtt atctgtcagt

10080

agtagaccta tggaattccc agcatcagtt ccagcttata gaacaacaaa ttaccatttt

10140

gacactagtc ctattaatca agcactaagt gaaagatttg ggaatgaaga tattaatttg

10200

gtcttccaaa atgcaatcag ctgtggaatt agcataatga gtgtagtaga acaattaact

10260

ggtaggagtc caaaacagtt agttttaata ccccaattag aagaaataga cattatgcca

10320

ccaccagtgt ttcaagggaa attcaattat aagctagtag ataagataac ttctgaccaa

10380

catatcttca gtccagacaa aatagatatg ttaacactgg ggaaaatgct catgccaact

10440

ataaaaggtc agaaaacaga tcagttcttg aacaagagag agaattattt ccatgggaac

10500

aatcttattg agtctttgtc agcagcgtta gcatgtcatt ggtgtgggat attaacagag

10560

caatgtatag aaaataatat tttcaagaaa gactggggtg acgggttcat atcggatcat

10620

gcttttatgg acttcaaaat attcctatgt gtctttaaaa ctaaactttt atgtagttgg

10680

ggatcccaag ggaaaaacat taaagatgaa gatatagtag atgaatcgat agataaactg

10740

ttaaggattg ataatacttt ttggagaatg ttcagcaagg ttatgtttga atcaaaggtt

10800

aagaaaagga taatgttata tgatgtaaaa tttctatcat tagtaggtta tatagggttt

10860

aagaattggt ttatagaaca gttgagatca gctgagttgc atgaggtacc ttggattgtc

10920

aatgccgaag gtgatctggt tgagatcaag tcaattaaaa tctatttgca actgatagag

10980

cagagtttat ttttaagaat aactgttttg aactatacag atatggcaca tgctctcaca

11040

agattaatca gaaagaagtt gatgtgtgat aatgcactat taacttcaat tccatcccca

11100

atggttaact taactcaagt tattgatcct acagaacaat tagcttattt ccctaagata

11160

acatttgaaa ggctaaaaaa ttatgacact agttcaaatt atgctaaagg aaagctaaca

11220

aggaattaca tgatactgtt gccatggcaa catgttaata gatataactt tgtctttagt

11280

tctactggat gtaaagttag tctaaaaaca tgcattggaa aacttatgaa agatctaaac

11340

cctaaagttc tgtactttat tggagaaggg gcaggaaatt ggatggccag aacagcatgt

11400

gaatatcctg acatcaaatt tgtatacaga agtttaaaag atgaccttga tcatcattat

11460

cctttggaat accagagagt gataggagaa ttaagcagga taatagatag tggtgaaggg

11520

ctttcaatgg aaacaacaga tgcaactcaa aaaactcatt gggatttgat acacagagta

11580

agcaaagatg ctttattaat aactttatgt gatgcagaat ttaaggacag agatgatttt

11640

tttaagatgg taattctatg gaggaaacat gtattatcat gcagaatttg cactacctat

11700

gggacagacc tctatttatt cgcaaagtat catgctaaag actgcaatat aaaattacct

11760

ttttttgtga gatcagttgc cacctttatt atgcaaggta gtaaactgtc aggctcggaa

11820

tgctacatac tcttaacact aggccaccac aacaatttac cttgtcatgg agaaatacaa

11880

aattctaaga tgaaaatagc agcgtgtaat gatttttatg ctgcaaaaaa acttgacaat

11940

aaatcaattg aagccaactg taaatcactt ttatcagggc taagaatacc gataaataag

12000

aaggaattaa atagacagag aaggttatta acactacaaa gcaaccattc ttctgtagca

12060

acagttggag gtagcaaggt catagagtct aaatggttaa caaacaaggc aaacacaata

12120

attgattggt tagaacatat tttaaattct ccaaaaggtg aattaaatta tgattttttt

12180

gaagcattag aaaatactta ccctaatatg attaaactaa tagataatct agggaatgca

12240

gagattaaaa aactgatcaa agtaactgga tatatgcttg taagtaaaaa atgaaaaatg

12300

ataaaaatga taaaataggt gacaacttca tactattcca aagtaatcat ttgattatgc

12360

aattatgtaa tagttaatta aaaactaaaa atcaaaagtt aaaaactaat aactgtcatt

12420

aagtttatta aaaataagaa attataattg gatgtatacg gtttttttgc cgt

12473

<210> 4

<211> 14141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ген GFP вставлен между положениями 40 и 784

<400> 4

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatggtgag

60

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt

120

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct

180

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac

240

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga

300

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga

360

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg

420

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga

480

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa

540

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta

600

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag

660

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga

720

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagttaatta

780

aaaagtggga caagtgaaaa tgtctcttca agggattcac ctgagtgatc tatcatacaa

840

gcatgctata ttaaaagagt ctcagtacac aataaaaaga gatgtgggta caacaactgc

900

agtgacaccc tcatcattgc aacaagaaat aacgctgttg tgtggagaaa ttctgtatgc

960

taaacatgct gattacaaat atgctgcaga aataggaata caatatatta gcacagcttt

1020

aggatcagag agagtgcagc agattctgag gaactcaggc agtgaagtcc aagtggtctt

1080

aaccagaacg tactctctgg ggaaagttaa aaacaataaa ggagaagatt tacagatgtt

1140

agacatacac ggggtagaga agagctgggt agaagagata gacaaagaag caaggaaaac

1200

aatggcaacc ttgcttaagg aatcatcagg taatatccca caaaatcaga ggccctcagc

1260

accagacaca cccataatct tattatgtgt aggtgcatta atatttacta agctagcatc

1320

aaccatagaa gtgggactag agaccacagt cagaagggct aaccgtgtac taagtgatgc

1380

actcaagaga taccctagaa tggacatccc aaaaattgcc agatccttct atgacttatt

1440

tgaacaaaaa gtgtatcaca gaagtttgtt cattgagtat ggcaaagcat taggctcatc

1500

atctacaggc agcaaagcag aaagtctatt tgttaatata ttcatgcaag cttatggagc

1560

cggtcaaaca atgctaaggt ggggggtcat tgccaggtca tccaacaata taatgttagg

1620

acatgtatct gtccaagctg agttaaaaca ggtcacagaa gtctatgact tggtgcgaga

1680

aatgggccct gaatctggac ttctacattt aaggcaaagc ccaaaagctg gactgttatc

1740

actagccaac tgtcccaact ttgcaagtgt tgttctcgga aatgcctcag gcttaggcat

1800

aatcggtatg tatcgtggga gagtaccaaa cacagaatta ttttcagcag cagaaagtta

1860

tgccaaaagt ttgaaagaga gcaataaaat caatttctct tcattaggac ttacagatga

1920

agagaaagag gctgcagaac atttcttaaa tgtgagtgac gacagtcaaa atgattatga

1980

gtaattaaaa aagtgggaca agtcaaaatg tctttccctg aaggaaaaga tattcttttc

2040

atgggtaatg aagcagcaaa attagcagaa gctttccaga aatcattaag gaaaccaagt

2100

cataaaagat ctcaatctat tataggagaa aaagtgaaca ctgtatcaga aacattggaa

2160

ttacctacta tcagtagacc tgcaaaacca accatactgt cagaaccaaa gttagcatgg

2220

actgataaag gtggggcaat caaaactgaa ataaagcaag caatcaaagt catggatcct

2280

attgaggaag aagagtctac tgagaagaag gtgctgccct ccagtgatgg gaaaacccct

2340

gcagaaaaga aactgaaacc atcaactaac accaaaaaga aagtttcgtt tacaccaaat

2400

gaaccaggaa aatatacaaa gttggaaaaa gatgctctag atttgctctc agataatgaa

2460

gaagaagatg cagaatcttc aatcttaacc tttgaagaaa gagatacttc atcgttaagc

2520

attgaggcca gattggaatc aatagaggag aaattaagca tgatattagg gctattaaga

2580

acactcaaca ttgctacagc aggacccaca gcagcaagag atgggatcag agatgcaatg

2640

attggcgtaa gagaggaatt aatagcagac ataataaagg aagccaaagg gaaagcagca

2700

gaaatgatgg aagaggaaat gagtcaacga tcaaaaatag gaaacggtag tgtaaaacta

2760

acagagaaag caaaagagct taacaaaatt gttgaagatg aaagcacaag tggagaatct

2820

gaagaagaag aagaaccaaa agacatacaa gacaatagtc aagaagatga catttaccag

2880

ttaattatgt agtttaataa aaataaacaa tgggacaagt aaaaatggag tcctacctag

2940

tagacactta tcaaggcatt ccttacacag cagctgttca agttgatcta atagaaaagg

3000

acctgttacc tgcaagccta acaatatggt tccctttgtt tcaggccaac acaccaccag

3060

cagtgctgct cgatcagttg aaaaccctaa caataaccac tctgtatgct gcatcacaaa

3120

atggtccaat actcaaagtg aatgcatcag cccaaggtgc agcaatgtct gtacttccca

3180

aaaaatttga agtcaatgcg actgtagcac tcgatgaata tagcaaattg gaatttgaca

3240

aactcacagt ctgtgaagta aaaacagttt acttaacaac catgaaacca tacgggatgg

3300

tatcaaaatt tgtgagctca gccaaatcag ttggcaaaaa aacacatgat ctaatcgcac

3360

tgtgtgattt tatggatcta gaaaagaaca cacctgttac aataccagca ttcatcaaat

3420

cagtttcaat caaagagagt gagtcagcta ctgttgaagc tgctataagc agtgaagcag

3480

accaagctct aacacaggcc aaaattgcac cttatgcggg attgattatg atcatgacta

3540

tgaacaatcc caaaggcata ttcaaaaagc ttggagctgg gactcaagtt atagtagaac

3600

taggagcata tgtccaggct gaaagcataa gtaaaatatg caagacttgg agccatcaag

3660

ggacaagata tgtgttgaag tccagataac agccaagcac cttggccaag agctactaac

3720

tctatctcat agattataaa gtcaccattc tagttatata aaaatcaagt tagaacaaga

3780

attaaatcaa tcaagaatgg gacaaataaa aatgtcttgg aaagtggtga tcattttttc

3840

attgttaata acacctcaac acggtcttaa agagagctat ttagaagagt catgtagcac

3900

tataactgaa ggatatctca gtgttctgag gacaggttgg tataccaacg tttttacact

3960

ggaggtaggt gatgtagaga accttacatg tgctgatgga cctagcttaa taaaaacaga

4020

attagacctg accaaaagtg cactaagaga actcagaaca gtttctgctg atcaactggc

4080

aagagaggag caaattgaga atcccagaca atctagattt gttctaggag caatagcact

4140

cggtgttgca acagcagctg cagttacagc aggtgttgca attgccaaaa ccatccggct

4200

tgaaagtgaa gtaacagcaa ttaagaatgc cctcaaaaag accaatgaag cagtatctac

4260

attggggaat ggagttcgag tgttggcaac tgcagtgagg gagctggaag attttgtgag

4320

caagaatcta acacgtgcaa tcaacaaaaa caagtgcgac attgctgacc tgaaaatggc

4380

cgttagcttc agtcaattca acagaaggtt tctaaatgtt gtgcggcaat tttcagacaa

4440

tgctggaata acaccagcaa tatccttgga cttaatgaca gatgctgaac tagccagagc

4500

tgtttccaac atgccaacat ctgcaggaca aataaaactg atgttggaga accgtgcaat

4560

ggtaagaaga aaggggttcg gaatcctgat aggagtttac ggaagctccg taatttacat

4620

ggtgcaactg ccaatctttg gagttataga cacgccttgc tggatagtaa aagcggcccc

4680

ttcttgctca gaaaaaaagg gaaactatgc ttgcctttta agagaagatc aaggatggta

4740

ttgtcagaat gcagggtcaa ctgtttacta cccaaatgaa aaagactgcg aaacaagagg

4800

agaccatgtc ttttgcgaca cagcagcagg aatcaatgtt gctgagcagt caaaggagtg

4860

caacatcaac atatccacta ctaattaccc atgcaaagtt agcacaggaa gacaccctat

4920

cagtatggtt gcactgtctc ctcttggggc tttggttgct tgctacaagg gagtgagctg

4980

ttccattggc agcaacagag tagggatcat caagcaactg aacaaaggct gctcttatat

5040

aaccaaccaa gacgcagaca cagtgacaat agacaacact gtataccagc taagcaaagt

5100

tgagggcgaa cagcatgtta taaaaggaag gccagtgtca agcagctttg atccagtcaa

5160

atttcctgaa gatcaattca atgttgcact tgaccaagtt ttcgaaagca ttgagaacag

5220

tcaggccttg gtggatcaat caaacagaat cctaagcagt gcagagaaag gaaacactgg

5280

cttcatcatt gtaataattc taattgctgt ccttggctct accatgatcc tagtgagtgt

5340

ttttatcata ataaagaaaa caaagaaacc cacaggagca cctccagagc tgagtggtgt

5400

cacaaacaat ggcttcatac cacataatta gttaattaaa aataaagtaa attaaattaa

5460

aataaaataa aattaaaatt aaaataaaat aaaaataaaa atttgggaca aatcataatg

5520

tctcgcaagg ctccatgcaa atatgaagtg cggggcaaat gcaatagagg aagtgagtgc

5580

aagtttaacc acaattactg gagttggcca gatagatact tactaataag atcaaattat

5640

ttattaaatc aacttttaag gaacactgat agagctgatg gcttatcaat aatatcagga

5700

gcaggcagag aagataggac acaagatttt gtcctaggtt ccaccaatgt ggttcaaggt

5760

tatattgatg ataaccaaag cataacaaaa gctgcagcct gttacagtct acataatata

5820

atcaaacaac tacaagaagt tgaagttagg caggctagag ataacaaacc atctgacagc

5880

aaacatgtgg cacttcacaa cttagtccta tcttatatgg agatgagcaa aattcctgca

5940

tctttaatca acaatctcaa aagactgccg agagagaaac tgaaaaaatt agcaaagctt

6000

ataattgact tatcagcagg tgctgaaaat gactcttcat atgccttgca agacagtgaa

6060

agcactaatc aagtgcagtg agcatggtcc tgttttcatt actatagagg ttgattacat

6120

gatatggact cataaggact taaaagaagc tttatctaat gggatagtga agtctcatac

6180

taacatttac aattgttatt tagaaaacat agaaattata tatgtcaagg cttacttaag

6240

ttagtaaaaa cacatcagag tgggataaat gacaatgata acattagatg tcattaaaag

6300

tgatgggtct tcaaaaacat gtactcacct caaaaaatta attaaagacc actctggtaa

6360

agtgcttatt gtacttaagt taatattagc tttactaaca tttctcacag tgacaatcac

6420

catcaattat ataaaagtag aaaacaatct gcaaatatgt cagtcaaaaa ctgaatcaga

6480

caaaaaggac tcatcatcaa ataccacatc agtcacaacc aagactactc taaatcatga

6540

tataacacag tattttaaaa gtttgattca aaggtataca aactctgcaa taaacagaga

6600

cacatgctgg aaaataagca gaaatcaatg cacaaacata acaacataca aatttttatg

6660

ttttaaatct gaagaaacaa aaaccaacaa ttgtgataaa ctgacagatt tatgcagaaa

6720

caaaccaaaa ccagctgttg aagtgtatca catagtagaa tgccattgta tatacacagt

6780

taaatggaag tgctatcatt acccaataga tgaaacccaa tcctaaataa cactagatta

6840

ggatccatcc aagtctgtta gttcaacaat ttagttattt aaaaatattt tgaaaacaag

6900

taagtttcta tgatacttca taataataag taataattaa ttgcttaatc atcatcacaa

6960

cattattcga aaccataact attcaattta agaagtaaaa acaataatat gggacaagta

7020

gttatggagg tgaaagtgga gaacattcga acaatagata tgctcaaagc aagagtgaaa

7080

aatcgtgtgg cacgcagcaa atgctttaaa aatgcctctt tgatcctaat aggaataact

7140

acattgagta tagccctcaa tatctatcta atcataaact atacaatgca agaaaacaca

7200

tccgaatcag aacatcacac cagctcatca cccatggaat ccagcaggga aactccaaca

7260

gtccctatgg acaactcaga caccaatcca ggctcacagt atccaactca acagtccaca

7320

gaaggctcca cactctactt tgcagcctca gcaagctcac cagagacaga accaacatca

7380

acaccagaca caacaagccg cccgcccttc gtcgacacac acacaacact accaagtgca

7440

agcagaacaa ggacaagtcc ggcagtccac acaaaaaaca atccaaggac aagccccaga

7500

acacattccc caccatgggc aatgacaagg acggtccgtg gaaccaccac tctccgcaca

7560

agcagcacaa gaaaaagacc gtccacagca tcagtccaac ctgacagcag cgcaacaacc

7620

cacaaacacg aagaagcaag cccagtgagc ccgcaaacat ctgcgagcac agcaagacca

7680

caaaggaagg gcatggaggc cagcacatca acaacataca accaaactag ttaacaaaaa

7740

atacaaaata actctaagat aaaccatata gacaccaaca attgagaagc caaaaggcaa

7800

ttcacaatct ctccaaaaag gcaacaacac catattagct ccgcttaaat ctccctggaa

7860

aaaacactcg cccatatacc aactatacca caaccatccc aagaaaaaaa gctgggtaaa

7920

acaacaccca agagacaaat aacaatggat cctcttaatg aatccactgt taatgtctat

7980

cttcccgact catatcttaa aggagtgatt tcttttagtg agactaatgc aattggttca

8040

tgtctcttaa aaagacctta cctaaaaaat gacaacactg caaaagttgc catagagaat

8100

cctgttatcg agcatgttag actcaaaaat gcaatcaatt ctaagatgaa aatatcagat

8160

tacaggatag tagagccagt aaacatgcaa catgaaatta tgaagaatgt acacagttgt

8220

gagctcacat tattaaaaca gtttttaaca aggagtaaaa atattagcac tcttaaatta

8280

aatatgatat gtgattggct gcagttaaag tctacatcag atgatacctc aatcttaagt

8340

tttatagatg tagaatttat acctagctgg gtaagcaatt ggtttagtaa ttggtacaat

8400

ctcaacaagt tgattctgga attcaggaaa gaagaagtaa taagaactgg ttcaatcttg

8460

tgtaggtcat tgggtaaatt agtttttgtt gtatcatcat acggatgtat agtcaagagc

8520

aacaaaagca aaagagtgag cttcttcaca tacaatcaac tgttaacatg gaaagatgtg

8580

atgttaagta gattcaatgc aaatttctgt atatgggtaa gcaacagtct gaatgaaaat

8640

caagaagggt tagggttgag aagtaatctg caaggcatat taactaataa gctatatgaa

8700

actgtagatt atatgcttag tttgtgttgc aatgaaggtt tctcacttgt gaaagagttt

8760

gagggtttta ttatgagtga aatccttagg attactgaac atgctcaatt cagtactaga

8820

tttagaaata ctttattaaa tggattaact gatcaattga caaaattaaa aaataaaaac

8880

agactcagag ttcatggtac cgtgttagaa aataatgatt atccaatgta tgaagttgta

8940

cttaaattat taggagatac tttgagatgt attaaattat taatcaataa aaacttagag

9000

aatgctgctg aattatacta tatatttaga atattcggtc acccaatggt agatgaaaga

9060

gatgcaatgg atgctgtcaa attaaacaat gaaatcacaa aaatcctcag gttggagagc

9120

ttgacagaac taagaggggc attcatatta aggattatca aaggatttgt agacaacaac

9180

aaaagatggc cgaaaattaa aaacttaaaa gtgcttagta aaagatggac tatgtacttc

9240

aaagcaaaaa gttaccctag tcaacttgaa ttaagtgaac aagatttttt agagcttgct

9300

gcaatacagt ttgaacaaga gttttctgtt cctgaaaaaa ccaaccttga gatggtatta

9360

aatgataaag ctatatcacc tcctaaaaga ttaatttggt ctgtgtaccc aaaaaattac

9420

ttacctgaga caataaaaaa tcgatatcta gaagagactt tcaatgcaag tgatagtctc

9480

aaaacaagaa gagtactaga gtactatttg aaagataata aattcgacca aaaagaactt

9540

aaaagttatg tggttaaaca agaatattta aatgataagg atcatattgt ctcgctaact

9600

ggaaaagaaa gagaattaag tgtaggtaga atgtttgcta tgcaaccagg aaaacagcga

9660

caaatacaaa tattggctga aaaattgtta gctgataata ttgtaccctt tttcccagaa

9720

actttaacaa agtatggtga tctagatctt cagagaataa tggaaatcaa atcagaactt

9780

tcttctatta aaaccagaag aaatgatagt tataataatt acattgcaag agcatccata

9840

gtaacagatt taagtaagtt caaccaagcc tttaggtatg aaactacagc gatctgtgcg

9900

gatgtagcag atgaactaca tggaacacaa agcctattct gttggttaca tcttatcgtt

9960

cctatgacta caatgatatg tgcctataga catgcaccac cagaaacaaa aggtgaatat

10020

gatatagata agatagaaga gcaaagtggt ttatatagat atcatatggg tggtattgaa

10080

ggatggtgtc aaaaactctg gacaatggaa gctatatctt tattagatgt tgtatctgta

10140

aagacacgat gtcaaatgac atctttatta aacggtgaca accaatcaat agatgtaagt

10200

aaaccagtta agttatctga gggtttagat gaagtgaaag cagattatag cttggctgta

10260

aaaatgctaa aagaaataag agatgcatac agaaatatag gccataaact taaagaaggg

10320

gaaacatata tatcaagaga tcttcagttt ataagtaagg tgattcaatc tgaaggagta

10380

atgcatccta cccctataaa aaagatctta agagtgggac catggataaa cacaatatta

10440

gatgacatta aaaccagtgc agagtcaata gggagtctat gtcaggaatt agaatttagg

10500

ggggaaagca taatagttag tctgatatta aggaattttt ggctgtataa tttatacatg

10560

catgaatcaa agcaacaccc cctagcaggg aagcagttat tcaaacaact aaataaaaca

10620

ttaacatcag tgcagagatt ttttgaaatt aaaaaggaaa atgaagtagt agatctatgg

10680

atgaacatac caatgcagtt tggaggagga gatccagtag tcttctatag atctttctat

10740

agaaggaccc ctgatttttt aactgaagca atcagtcatg tagatattct gttaaaaata

10800

tcagccaaca taagaaatga agcgaaaata agtttcttca aagccttact gtcaatagaa

10860

aaaaatgaac gtgctacact gacaacacta atgagagacc ctcaagctgt gggctcagag

10920

cgacaagcaa aagtaacaag tgatatcaat agaacagcag ttaccagcat cttaagtctt

10980

tctccaaatc aacttttcag cgatagtgct atacactaca gtagaaatga agaagaggtc

11040

ggaatcattg ctgacaacat aacacctgtt tatcctcatg gactgagagt tttgtatgaa

11100

tcattacctt ttcataaagc tgaaaaagtt gtaaatatga tatcaggaac aaaatccata

11160

accaacttat tacagagaac atctgctatt aatggtgaag atattgacag agctgtatcc

11220

atgatgctgg agaacctagg attattatct agaatattgt cagtagttgt tgatagtata

11280

gaaattccaa ccaaatctaa tggtaggctg atatgttgtc agatatctag aaccctaagg

11340

gagacatcat ggaataatat ggaaatagtt ggagtaacat cccctagcat cactacatgc

11400

atggatgtca tatatgcaac tagctctcat ttgaaaggga taatcattga aaagttcagc

11460

actgacagaa ctacaagagg tcaaagaggt ccaaagagcc cttgggtagg atcgagcacg

11520

caagagaaaa aattagttcc tgtttataac agacaaattc tttcaaaaca acaaagagaa

11580

cagctagaag caattggaaa aatgagatgg gtatataaag ggacaccagg tttaagacga

11640

ttactcaata agatttgtct tggaagttta ggcattagtt acaaatgtgt aaaaccttta

11700

ttacctaggt ttatgagtgt aaatttccta cacaggttat ctgtcagtag tagacctatg

11760

gaattcccag catcagttcc agcttataga acaacaaatt accattttga cactagtcct

11820

attaatcaag cactaagtga aagatttggg aatgaagata ttaatttggt cttccaaaat

11880

gcaatcagct gtggaattag cataatgagt gtagtagaac aattaactgg taggagtcca

11940

aaacagttag ttttaatacc ccaattagaa gaaatagaca ttatgccacc accagtgttt

12000

caagggaaat tcaattataa gctagtagat aagataactt ctgaccaaca tatcttcagt

12060

ccagacaaaa tagatatgtt aacactgggg aaaatgctca tgccaactat aaaaggtcag

12120

aaaacagatc agttcttgaa caagagagag aattatttcc atgggaacaa tcttattgag

12180

tctttgtcag cagcgttagc atgtcattgg tgtgggatat taacagagca atgtatagaa

12240

aataatattt tcaagaaaga ctggggtgac gggttcatat cggatcatgc ttttatggac

12300

ttcaaaatat tcctatgtgt ctttaaaact aaacttttat gtagttgggg atcccaaggg

12360

aaaaacatta aagatgaaga tatagtagat gaatcgatag ataaactgtt aaggattgat

12420

aatacttttt ggagaatgtt cagcaaggtt atgtttgaat caaaggttaa gaaaaggata

12480

atgttatatg atgtaaaatt tctatcatta gtaggttata tagggtttaa gaattggttt

12540

atagaacagt tgagatcagc tgagttgcat gaggtacctt ggattgtcaa tgccgaaggt

12600

gatctggttg agatcaagtc aattaaaatc tatttgcaac tgatagagca gagtttattt

12660

ttaagaataa ctgttttgaa ctatacagat atggcacatg ctctcacaag attaatcaga

12720

aagaagttga tgtgtgataa tgcactatta acttcaattc catccccaat ggttaactta

12780

actcaagtta ttgatcctac agaacaatta gcttatttcc ctaagataac atttgaaagg

12840

ctaaaaaatt atgacactag ttcaaattat gctaaaggaa agctaacaag gaattacatg

12900

atactgttgc catggcaaca tgttaataga tataactttg tctttagttc tactggatgt

12960

aaagttagtc taaaaacatg cattggaaaa cttatgaaag atctaaaccc taaagttctg

13020

tactttattg gagaaggggc aggaaattgg atggccagaa cagcatgtga atatcctgac

13080

atcaaatttg tatacagaag tttaaaagat gaccttgatc atcattatcc tttggaatac

13140

cagagagtga taggagaatt aagcaggata atagatagtg gtgaagggct ttcaatggaa

13200

acaacagatg caactcaaaa aactcattgg gatttgatac acagagtaag caaagatgct

13260

ttattaataa ctttatgtga tgcagaattt aaggacagag atgatttttt taagatggta

13320

attctatgga ggaaacatgt attatcatgc agaatttgca ctacctatgg gacagacctc

13380

tatttattcg caaagtatca tgctaaagac tgcaatataa aattaccttt ttttgtgaga

13440

tcagttgcca cctttattat gcaaggtagt aaactgtcag gctcggaatg ctacatactc

13500

ttaacactag gccaccacaa caatttacct tgtcatggag aaatacaaaa ttctaagatg

13560

aaaatagcag cgtgtaatga tttttatgct gcaaaaaaac ttgacaataa atcaattgaa

13620

gccaactgta aatcactttt atcagggcta agaataccga taaataagaa ggaattaaat

13680

agacagagaa ggttattaac actacaaagc aaccattctt ctgtagcaac agttggaggt

13740

agcaaggtca tagagtctaa atggttaaca aacaaggcaa acacaataat tgattggtta

13800

gaacatattt taaattctcc aaaaggtgaa ttaaattatg atttttttga agcattagaa

13860

aatacttacc ctaatatgat taaactaata gataatctag ggaatgcaga gattaaaaaa

13920

ctgatcaaag taactggata tatgcttgta agtaaaaaat gaaaaatgat aaaaatgata

13980

aaataggtga caacttcata ctattccaaa gtaatcattt gattatgcaa ttatgtaata

14040

gttaattaaa aactaaaaat caaaagttaa aaactaataa ctgtcattaa gtttattaaa

14100

aataagaaat tataattgga tgtatacggt ttttttgccg t

14141

<210> 5

<211> 13392

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Ген GFP вставлен между положениями 40 и 784

<400> 5

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatggtgag

60

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt

120

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct

180

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac

240

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga

300

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga

360

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg

420

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga

480

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa

540

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta

600

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag

660

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga

720

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagttaatta

780

aaaagtggga caagtgaaaa tgtctcttca agggattcac ctgagtgatc tatcatacaa

840

gcatgctata ttaaaagagt ctcagtacac aataaaaaga gatgtgggta caacaactgc

900

agtgacaccc tcatcattgc aacaagaaat aacgctgttg tgtggagaaa ttctgtatgc

960

taaacatgct gattacaaat atgctgcaga aataggaata caatatatta gcacagcttt

1020

aggatcagag agagtgcagc agattctgag gaactcaggc agtgaagtcc aagtggtctt

1080

aaccagaacg tactctctgg ggaaagttaa aaacaataaa ggagaagatt tacagatgtt

1140

agacatacac ggggtagaga agagctgggt agaagagata gacaaagaag caaggaaaac

1200

aatggcaacc ttgcttaagg aatcatcagg taatatccca caaaatcaga ggccctcagc

1260

accagacaca cccataatct tattatgtgt aggtgcatta atatttacta agctagcatc

1320

aaccatagaa gtgggactag agaccacagt cagaagggct aaccgtgtac taagtgatgc

1380

actcaagaga taccctagaa tggacatccc aaaaattgcc agatccttct atgacttatt

1440

tgaacaaaaa gtgtatcaca gaagtttgtt cattgagtat ggcaaagcat taggctcatc

1500

atctacaggc agcaaagcag aaagtctatt tgttaatata ttcatgcaag cttatggagc

1560

cggtcaaaca atgctaaggt ggggggtcat tgccaggtca tccaacaata taatgttagg

1620

acatgtatct gtccaagctg agttaaaaca ggtcacagaa gtctatgact tggtgcgaga

1680

aatgggccct gaatctggac ttctacattt aaggcaaagc ccaaaagctg gactgttatc

1740

actagccaac tgtcccaact ttgcaagtgt tgttctcgga aatgcctcag gcttaggcat

1800

aatcggtatg tatcgtggga gagtaccaaa cacagaatta ttttcagcag cagaaagtta

1860

tgccaaaagt ttgaaagaga gcaataaaat caatttctct tcattaggac ttacagatga

1920

agagaaagag gctgcagaac atttcttaaa tgtgagtgac gacagtcaaa atgattatga

1980

gtaattaaaa aagtgggaca agtcaaaatg tctttccctg aaggaaaaga tattcttttc

2040

atgggtaatg aagcagcaaa attagcagaa gctttccaga aatcattaag gaaaccaagt

2100

cataaaagat ctcaatctat tataggagaa aaagtgaaca ctgtatcaga aacattggaa

2160

ttacctacta tcagtagacc tgcaaaacca accatactgt cagaaccaaa gttagcatgg

2220

actgataaag gtggggcaat caaaactgaa ataaagcaag caatcaaagt catggatcct

2280

attgaggaag aagagtctac tgagaagaag gtgctgccct ccagtgatgg gaaaacccct

2340

gcagaaaaga aactgaaacc atcaactaac accaaaaaga aagtttcgtt tacaccaaat

2400

gaaccaggaa aatatacaaa gttggaaaaa gatgctctag atttgctctc agataatgaa

2460

gaagaagatg cagaatcttc aatcttaacc tttgaagaaa gagatacttc atcgttaagc

2520

attgaggcca gattggaatc aatagaggag aaattaagca tgatattagg gctattaaga

2580

acactcaaca ttgctacagc aggacccaca gcagcaagag atgggatcag agatgcaatg

2640

attggcgtaa gagaggaatt aatagcagac ataataaagg aagccaaagg gaaagcagca

2700

gaaatgatgg aagaggaaat gagtcaacga tcaaaaatag gaaacggtag tgtaaaacta

2760

acagagaaag caaaagagct taacaaaatt gttgaagatg aaagcacaag tggagaatct

2820

gaagaagaag aagaaccaaa agacatacaa gacaatagtc aagaagatga catttaccag

2880

ttaattatgt agtttaataa aaataaacaa tgggacaagt aaaaatggag tcctacctag

2940

tagacactta tcaaggcatt ccttacacag cagctgttca agttgatcta atagaaaagg

3000

acctgttacc tgcaagccta acaatatggt tccctttgtt tcaggccaac acaccaccag

3060

cagtgctgct cgatcagttg aaaaccctaa caataaccac tctgtatgct gcatcacaaa

3120

atggtccaat actcaaagtg aatgcatcag cccaaggtgc agcaatgtct gtacttccca

3180

aaaaatttga agtcaatgcg actgtagcac tcgatgaata tagcaaattg gaatttgaca

3240

aactcacagt ctgtgaagta aaaacagttt acttaacaac catgaaacca tacgggatgg

3300

tatcaaaatt tgtgagctca gccaaatcag ttggcaaaaa aacacatgat ctaatcgcac

3360

tgtgtgattt tatggatcta gaaaagaaca cacctgttac aataccagca ttcatcaaat

3420

cagtttcaat caaagagagt gagtcagcta ctgttgaagc tgctataagc agtgaagcag

3480

accaagctct aacacaggcc aaaattgcac cttatgcggg attgattatg atcatgacta

3540

tgaacaatcc caaaggcata ttcaaaaagc ttggagctgg gactcaagtt atagtagaac

3600

taggagcata tgtccaggct gaaagcataa gtaaaatatg caagacttgg agccatcaag

3660

ggacaagata tgtgttgaag tccagataac agccaagcac cttggccaag agctactaac

3720

tctatctcat agattataaa gtcaccattc tagttatata aaaatcaagt tagaacaaga

3780

attaaatcaa tcaagaatgg gacaaataaa aatgtcttgg aaagtggtga tcattttttc

3840

attgttaata acacctcaac acggtcttaa agagagctat ttagaagagt catgtagcac

3900

tataactgaa ggatatctca gtgttctgag gacaggttgg tataccaacg tttttacact

3960

ggaggtaggt gatgtagaga accttacatg tgctgatgga cctagcttaa taaaaacaga

4020

attagacctg accaaaagtg cactaagaga actcagaaca gtttctgctg atcaactggc

4080

aagagaggag caaattgaga atcccagaca atctagattt gttctaggag caatagcact

4140

cggtgttgca acagcagctg cagttacagc aggtgttgca attgccaaaa ccatccggct

4200

tgaaagtgaa gtaacagcaa ttaagaatgc cctcaaaaag accaatgaag cagtatctac

4260

attggggaat ggagttcgag tgttggcaac tgcagtgagg gagctggaag attttgtgag

4320

caagaatcta acacgtgcaa tcaacaaaaa caagtgcgac attgctgacc tgaaaatggc

4380

cgttagcttc agtcaattca acagaaggtt tctaaatgtt gtgcggcaat tttcagacaa

4440

tgctggaata acaccagcaa tatccttgga cttaatgaca gatgctgaac tagccagagc

4500

tgtttccaac atgccaacat ctgcaggaca aataaaactg atgttggaga accgtgcaat

4560

ggtaagaaga aaggggttcg gaatcctgat aggagtttac ggaagctccg taatttacat

4620

ggtgcaactg ccaatctttg gagttataga cacgccttgc tggatagtaa aagcggcccc

4680

ttcttgctca gaaaaaaagg gaaactatgc ttgcctttta agagaagatc aaggatggta

4740

ttgtcagaat gcagggtcaa ctgtttacta cccaaatgaa aaagactgcg aaacaagagg

4800

agaccatgtc ttttgcgaca cagcagcagg aatcaatgtt gctgagcagt caaaggagtg

4860

caacatcaac atatccacta ctaattaccc atgcaaagtt agcacaggaa gacaccctat

4920

cagtatggtt gcactgtctc ctcttggggc tttggttgct tgctacaagg gagtgagctg

4980

ttccattggc agcaacagag tagggatcat caagcaactg aacaaaggct gctcttatat

5040

aaccaaccaa gacgcagaca cagtgacaat agacaacact gtataccagc taagcaaagt

5100

tgagggcgaa cagcatgtta taaaaggaag gccagtgtca agcagctttg atccagtcaa

5160

atttcctgaa gatcaattca atgttgcact tgaccaagtt ttcgaaagca ttgagaacag

5220

tcaggccttg gtggatcaat caaacagaat cctaagcagt gcagagaaag gaaacactgg

5280

cttcatcatt gtaataattc taattgctgt ccttggctct accatgatcc tagtgagtgt

5340

ttttatcata ataaagaaaa caaagaaacc cacaggagca cctccagagc tgagtggtgt

5400

cacaaacaat ggcttcatac cacataatta gttaattaaa aataaagtaa attaaattaa

5460

aataaaataa aattaaaatt aaaataaaat aaaaataaaa atttgggaca aatcataatg

5520

tctcgcaagg ctccatgcaa atatgaagtg cggggcaaat gcaatagagg aagtgagtgc

5580

aagtttaacc acaattactg gagttggcca gatagatact tactaataag atcaaattat

5640

ttattaaatc aacttttaag gaacactgat agagctgatg gcttatcaat aatatcagga

5700

gcaggcagag aagataggac acaagatttt gtcctaggtt ccaccaatgt ggttcaaggt

5760

tatattgatg ataaccaaag cataacaaaa gctgcagcct gttacagtct acataatata

5820

atcaaacaac tacaagaagt tgaagttagg caggctagag ataacaaacc atctgacagc

5880

aaacatgtgg cacttcacaa cttagtccta tcttatatgg agatgagcaa aattcctgca

5940

tctttaatca acaatctcaa aagactgccg agagagaaac tgaaaaaatt agcaaagctt

6000

ataattgact tatcagcagg tgctgaaaat gactcttcat atgccttgca agacagtgaa

6060

agcactaatc aagtgcagtg agcatggtcc tgttttcatt actatagagg ttgattacat

6120

gatatggact cataaggact taaaagaagc tttatctaat gggatagtga agtctcatac

6180

taacatttac aattgttatt tagaaaacat agaaattata tatgtcaagg cttacttaag

6240

ttagtaaaaa cacatcagag tgggacaagt agttatggag gtgaaagtgg agaacattcg

6300

aacaatagat atgctcaaag caagagtgaa aaatcgtgtg gcacgcagca aatgctttaa

6360

aaatgcctct ttgatcctaa taggaataac tacattgagt atagccctca atatctatct

6420

aatcataaac tatacaatgc aagaaaacac atccgaatca gaacatcaca ccagctcatc

6480

acccatggaa tccagcaggg aaactccaac agtccctatg gacaactcag acaccaatcc

6540

aggctcacag tatccaactc aacagtccac agaaggctcc acactctact ttgcagcctc

6600

agcaagctca ccagagacag aaccaacatc aacaccagac acaacaagcc gcccgccctt

6660

cgtcgacaca cacacaacac taccaagtgc aagcagaaca aggacaagtc cggcagtcca

6720

cacaaaaaac aatccaagga caagccccag aacacattcc ccaccatggg caatgacaag

6780

gacggtccgt ggaaccacca ctctccgcac aagcagcaca agaaaaagac cgtccacagc

6840

atcagtccaa cctgacagca gcgcaacaac ccacaaacac gaagaagcaa gcccagtgag

6900

cccgcaaaca tctgcgagca cagcaagacc acaaaggaag ggcatggagg ccagcacatc

6960

aacaacatac aaccaaacta gttaacaaaa aatacaaaat aactctaaga taaaccatat

7020

agacaccaac aattgagaag ccaaaaggca attcacaatc tctccaaaaa ggcaacaaca

7080

ccatattagc tccgcttaaa tctccctgga aaaaacactc gcccatatac caactatacc

7140

acaaccatcc caagaaaaaa agctgggtaa aacaacaccc aagagacaaa taacaatgga

7200

tcctcttaat gaatccactg ttaatgtcta tcttcccgac tcatatctta aaggagtgat

7260

ttcttttagt gagactaatg caattggttc atgtctctta aaaagacctt acctaaaaaa

7320

tgacaacact gcaaaagttg ccatagagaa tcctgttatc gagcatgtta gactcaaaaa

7380

tgcaatcaat tctaagatga aaatatcaga ttacaggata gtagagccag taaacatgca

7440

acatgaaatt atgaagaatg tacacagttg tgagctcaca ttattaaaac agtttttaac

7500

aaggagtaaa aatattagca ctcttaaatt aaatatgata tgtgattggc tgcagttaaa

7560

gtctacatca gatgatacct caatcttaag ttttatagat gtagaattta tacctagctg

7620

ggtaagcaat tggtttagta attggtacaa tctcaacaag ttgattctgg aattcaggaa

7680

agaagaagta ataagaactg gttcaatctt gtgtaggtca ttgggtaaat tagtttttgt

7740

tgtatcatca tacggatgta tagtcaagag caacaaaagc aaaagagtga gcttcttcac

7800

atacaatcaa ctgttaacat ggaaagatgt gatgttaagt agattcaatg caaatttctg

7860

tatatgggta agcaacagtc tgaatgaaaa tcaagaaggg ttagggttga gaagtaatct

7920

gcaaggcata ttaactaata agctatatga aactgtagat tatatgctta gtttgtgttg

7980

caatgaaggt ttctcacttg tgaaagagtt tgagggtttt attatgagtg aaatccttag

8040

gattactgaa catgctcaat tcagtactag atttagaaat actttattaa atggattaac

8100

tgatcaattg acaaaattaa aaaataaaaa cagactcaga gttcatggta ccgtgttaga

8160

aaataatgat tatccaatgt atgaagttgt acttaaatta ttaggagata ctttgagatg

8220

tattaaatta ttaatcaata aaaacttaga gaatgctgct gaattatact atatatttag

8280

aatattcggt cacccaatgg tagatgaaag agatgcaatg gatgctgtca aattaaacaa

8340

tgaaatcaca aaaatcctca ggttggagag cttgacagaa ctaagagggg cattcatatt

8400

aaggattatc aaaggatttg tagacaacaa caaaagatgg ccgaaaatta aaaacttaaa

8460

agtgcttagt aaaagatgga ctatgtactt caaagcaaaa agttacccta gtcaacttga

8520

attaagtgaa caagattttt tagagcttgc tgcaatacag tttgaacaag agttttctgt

8580

tcctgaaaaa accaaccttg agatggtatt aaatgataaa gctatatcac ctcctaaaag

8640

attaatttgg tctgtgtacc caaaaaatta cttacctgag acaataaaaa atcgatatct

8700

agaagagact ttcaatgcaa gtgatagtct caaaacaaga agagtactag agtactattt

8760

gaaagataat aaattcgacc aaaaagaact taaaagttat gtggttaaac aagaatattt

8820

aaatgataag gatcatattg tctcgctaac tggaaaagaa agagaattaa gtgtaggtag

8880

aatgtttgct atgcaaccag gaaaacagcg acaaatacaa atattggctg aaaaattgtt

8940

agctgataat attgtaccct ttttcccaga aactttaaca aagtatggtg atctagatct

9000

tcagagaata atggaaatca aatcagaact ttcttctatt aaaaccagaa gaaatgatag

9060

ttataataat tacattgcaa gagcatccat agtaacagat ttaagtaagt tcaaccaagc

9120

ctttaggtat gaaactacag cgatctgtgc ggatgtagca gatgaactac atggaacaca

9180

aagcctattc tgttggttac atcttatcgt tcctatgact acaatgatat gtgcctatag

9240

acatgcacca ccagaaacaa aaggtgaata tgatatagat aagatagaag agcaaagtgg

9300

tttatataga tatcatatgg gtggtattga aggatggtgt caaaaactct ggacaatgga

9360

agctatatct ttattagatg ttgtatctgt aaagacacga tgtcaaatga catctttatt

9420

aaacggtgac aaccaatcaa tagatgtaag taaaccagtt aagttatctg agggtttaga

9480

tgaagtgaaa gcagattata gcttggctgt aaaaatgcta aaagaaataa gagatgcata

9540

cagaaatata ggccataaac ttaaagaagg ggaaacatat atatcaagag atcttcagtt

9600

tataagtaag gtgattcaat ctgaaggagt aatgcatcct acccctataa aaaagatctt

9660

aagagtggga ccatggataa acacaatatt agatgacatt aaaaccagtg cagagtcaat

9720

agggagtcta tgtcaggaat tagaatttag gggggaaagc ataatagtta gtctgatatt

9780

aaggaatttt tggctgtata atttatacat gcatgaatca aagcaacacc ccctagcagg

9840

gaagcagtta ttcaaacaac taaataaaac attaacatca gtgcagagat tttttgaaat

9900

taaaaaggaa aatgaagtag tagatctatg gatgaacata ccaatgcagt ttggaggagg

9960

agatccagta gtcttctata gatctttcta tagaaggacc cctgattttt taactgaagc

10020

aatcagtcat gtagatattc tgttaaaaat atcagccaac ataagaaatg aagcgaaaat

10080

aagtttcttc aaagccttac tgtcaataga aaaaaatgaa cgtgctacac tgacaacact

10140

aatgagagac cctcaagctg tgggctcaga gcgacaagca aaagtaacaa gtgatatcaa

10200

tagaacagca gttaccagca tcttaagtct ttctccaaat caacttttca gcgatagtgc

10260

tatacactac agtagaaatg aagaagaggt cggaatcatt gctgacaaca taacacctgt

10320

ttatcctcat ggactgagag ttttgtatga atcattacct tttcataaag ctgaaaaagt

10380

tgtaaatatg atatcaggaa caaaatccat aaccaactta ttacagagaa catctgctat

10440

taatggtgaa gatattgaca gagctgtatc catgatgctg gagaacctag gattattatc

10500

tagaatattg tcagtagttg ttgatagtat agaaattcca accaaatcta atggtaggct

10560

gatatgttgt cagatatcta gaaccctaag ggagacatca tggaataata tggaaatagt

10620

tggagtaaca tcccctagca tcactacatg catggatgtc atatatgcaa ctagctctca

10680

tttgaaaggg ataatcattg aaaagttcag cactgacaga actacaagag gtcaaagagg

10740

tccaaagagc ccttgggtag gatcgagcac gcaagagaaa aaattagttc ctgtttataa

10800

cagacaaatt ctttcaaaac aacaaagaga acagctagaa gcaattggaa aaatgagatg

10860

ggtatataaa gggacaccag gtttaagacg attactcaat aagatttgtc ttggaagttt

10920

aggcattagt tacaaatgtg taaaaccttt attacctagg tttatgagtg taaatttcct

10980

acacaggtta tctgtcagta gtagacctat ggaattccca gcatcagttc cagcttatag

11040

aacaacaaat taccattttg acactagtcc tattaatcaa gcactaagtg aaagatttgg

11100

gaatgaagat attaatttgg tcttccaaaa tgcaatcagc tgtggaatta gcataatgag

11160

tgtagtagaa caattaactg gtaggagtcc aaaacagtta gttttaatac cccaattaga

11220

agaaatagac attatgccac caccagtgtt tcaagggaaa ttcaattata agctagtaga

11280

taagataact tctgaccaac atatcttcag tccagacaaa atagatatgt taacactggg

11340

gaaaatgctc atgccaacta taaaaggtca gaaaacagat cagttcttga acaagagaga

11400

gaattatttc catgggaaca atcttattga gtctttgtca gcagcgttag catgtcattg

11460

gtgtgggata ttaacagagc aatgtataga aaataatatt ttcaagaaag actggggtga

11520

cgggttcata tcggatcatg cttttatgga cttcaaaata ttcctatgtg tctttaaaac

11580

taaactttta tgtagttggg gatcccaagg gaaaaacatt aaagatgaag atatagtaga

11640

tgaatcgata gataaactgt taaggattga taatactttt tggagaatgt tcagcaaggt

11700

tatgtttgaa tcaaaggtta agaaaaggat aatgttatat gatgtaaaat ttctatcatt

11760

agtaggttat atagggttta agaattggtt tatagaacag ttgagatcag ctgagttgca

11820

tgaggtacct tggattgtca atgccgaagg tgatctggtt gagatcaagt caattaaaat

11880

ctatttgcaa ctgatagagc agagtttatt tttaagaata actgttttga actatacaga

11940

tatggcacat gctctcacaa gattaatcag aaagaagttg atgtgtgata atgcactatt

12000

aacttcaatt ccatccccaa tggttaactt aactcaagtt attgatccta cagaacaatt

12060

agcttatttc cctaagataa catttgaaag gctaaaaaat tatgacacta gttcaaatta

12120

tgctaaagga aagctaacaa ggaattacat gatactgttg ccatggcaac atgttaatag

12180

atataacttt gtctttagtt ctactggatg taaagttagt ctaaaaacat gcattggaaa

12240

acttatgaaa gatctaaacc ctaaagttct gtactttatt ggagaagggg caggaaattg

12300

gatggccaga acagcatgtg aatatcctga catcaaattt gtatacagaa gtttaaaaga

12360

tgaccttgat catcattatc ctttggaata ccagagagtg ataggagaat taagcaggat

12420

aatagatagt ggtgaagggc tttcaatgga aacaacagat gcaactcaaa aaactcattg

12480

ggatttgata cacagagtaa gcaaagatgc tttattaata actttatgtg atgcagaatt

12540

taaggacaga gatgattttt ttaagatggt aattctatgg aggaaacatg tattatcatg

12600

cagaatttgc actacctatg ggacagacct ctatttattc gcaaagtatc atgctaaaga

12660

ctgcaatata aaattacctt tttttgtgag atcagttgcc acctttatta tgcaaggtag

12720

taaactgtca ggctcggaat gctacatact cttaacacta ggccaccaca acaatttacc

12780

ttgtcatgga gaaatacaaa attctaagat gaaaatagca gcgtgtaatg atttttatgc

12840

tgcaaaaaaa cttgacaata aatcaattga agccaactgt aaatcacttt tatcagggct

12900

aagaataccg ataaataaga aggaattaaa tagacagaga aggttattaa cactacaaag

12960

caaccattct tctgtagcaa cagttggagg tagcaaggtc atagagtcta aatggttaac

13020

aaacaaggca aacacaataa ttgattggtt agaacatatt ttaaattctc caaaaggtga

13080

attaaattat gatttttttg aagcattaga aaatacttac cctaatatga ttaaactaat

13140

agataatcta gggaatgcag agattaaaaa actgatcaaa gtaactggat atatgcttgt

13200

aagtaaaaaa tgaaaaatga taaaaatgat aaaataggtg acaacttcat actattccaa

13260

agtaatcatt tgattatgca attatgtaat agttaattaa aaactaaaaa tcaaaagtta

13320

aaaactaata actgtcatta agtttattaa aaataagaaa ttataattgg atgtatacgg

13380

tttttttgcc gt

13392

<210> 6

<211> 13220

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ген GFP вставлен между положениями 40 и 784

<400> 6

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatggtgag

60

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt

120

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct

180

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac

240

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga

300

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga

360

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg

420

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga

480

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa

540

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta

600

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag

660

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga

720

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagttaatta

780

aaaagtggga caagtgaaaa tgtctcttca agggattcac ctgagtgatc tatcatacaa

840

gcatgctata ttaaaagagt ctcagtacac aataaaaaga gatgtgggta caacaactgc

900

agtgacaccc tcatcattgc aacaagaaat aacgctgttg tgtggagaaa ttctgtatgc

960

taaacatgct gattacaaat atgctgcaga aataggaata caatatatta gcacagcttt

1020

aggatcagag agagtgcagc agattctgag gaactcaggc agtgaagtcc aagtggtctt

1080

aaccagaacg tactctctgg ggaaagttaa aaacaataaa ggagaagatt tacagatgtt

1140

agacatacac ggggtagaga agagctgggt agaagagata gacaaagaag caaggaaaac

1200

aatggcaacc ttgcttaagg aatcatcagg taatatccca caaaatcaga ggccctcagc

1260

accagacaca cccataatct tattatgtgt aggtgcatta atatttacta agctagcatc

1320

aaccatagaa gtgggactag agaccacagt cagaagggct aaccgtgtac taagtgatgc

1380

actcaagaga taccctagaa tggacatccc aaaaattgcc agatccttct atgacttatt

1440

tgaacaaaaa gtgtatcaca gaagtttgtt cattgagtat ggcaaagcat taggctcatc

1500

atctacaggc agcaaagcag aaagtctatt tgttaatata ttcatgcaag cttatggagc

1560

cggtcaaaca atgctaaggt ggggggtcat tgccaggtca tccaacaata taatgttagg

1620

acatgtatct gtccaagctg agttaaaaca ggtcacagaa gtctatgact tggtgcgaga

1680

aatgggccct gaatctggac ttctacattt aaggcaaagc ccaaaagctg gactgttatc

1740

actagccaac tgtcccaact ttgcaagtgt tgttctcgga aatgcctcag gcttaggcat

1800

aatcggtatg tatcgtggga gagtaccaaa cacagaatta ttttcagcag cagaaagtta

1860

tgccaaaagt ttgaaagaga gcaataaaat caatttctct tcattaggac ttacagatga

1920

agagaaagag gctgcagaac atttcttaaa tgtgagtgac gacagtcaaa atgattatga

1980

gtaattaaaa aagtgggaca agtcaaaatg tctttccctg aaggaaaaga tattcttttc

2040

atgggtaatg aagcagcaaa attagcagaa gctttccaga aatcattaag gaaaccaagt

2100

cataaaagat ctcaatctat tataggagaa aaagtgaaca ctgtatcaga aacattggaa

2160

ttacctacta tcagtagacc tgcaaaacca accatactgt cagaaccaaa gttagcatgg

2220

actgataaag gtggggcaat caaaactgaa ataaagcaag caatcaaagt catggatcct

2280

attgaggaag aagagtctac tgagaagaag gtgctgccct ccagtgatgg gaaaacccct

2340

gcagaaaaga aactgaaacc atcaactaac accaaaaaga aagtttcgtt tacaccaaat

2400

gaaccaggaa aatatacaaa gttggaaaaa gatgctctag atttgctctc agataatgaa

2460

gaagaagatg cagaatcttc aatcttaacc tttgaagaaa gagatacttc atcgttaagc

2520

attgaggcca gattggaatc aatagaggag aaattaagca tgatattagg gctattaaga

2580

acactcaaca ttgctacagc aggacccaca gcagcaagag atgggatcag agatgcaatg

2640

attggcgtaa gagaggaatt aatagcagac ataataaagg aagccaaagg gaaagcagca

2700

gaaatgatgg aagaggaaat gagtcaacga tcaaaaatag gaaacggtag tgtaaaacta

2760

acagagaaag caaaagagct taacaaaatt gttgaagatg aaagcacaag tggagaatct

2820

gaagaagaag aagaaccaaa agacatacaa gacaatagtc aagaagatga catttaccag

2880

ttaattatgt agtttaataa aaataaacaa tgggacaagt aaaaatggag tcctacctag

2940

tagacactta tcaaggcatt ccttacacag cagctgttca agttgatcta atagaaaagg

3000

acctgttacc tgcaagccta acaatatggt tccctttgtt tcaggccaac acaccaccag

3060

cagtgctgct cgatcagttg aaaaccctaa caataaccac tctgtatgct gcatcacaaa

3120

atggtccaat actcaaagtg aatgcatcag cccaaggtgc agcaatgtct gtacttccca

3180

aaaaatttga agtcaatgcg actgtagcac tcgatgaata tagcaaattg gaatttgaca

3240

aactcacagt ctgtgaagta aaaacagttt acttaacaac catgaaacca tacgggatgg

3300

tatcaaaatt tgtgagctca gccaaatcag ttggcaaaaa aacacatgat ctaatcgcac

3360

tgtgtgattt tatggatcta gaaaagaaca cacctgttac aataccagca ttcatcaaat

3420

cagtttcaat caaagagagt gagtcagcta ctgttgaagc tgctataagc agtgaagcag

3480

accaagctct aacacaggcc aaaattgcac cttatgcggg attgattatg atcatgacta

3540

tgaacaatcc caaaggcata ttcaaaaagc ttggagctgg gactcaagtt atagtagaac

3600

taggagcata tgtccaggct gaaagcataa gtaaaatatg caagacttgg agccatcaag

3660

ggacaagata tgtgttgaag tccagataac agccaagcac cttggccaag agctactaac

3720

tctatctcat agattataaa gtcaccattc tagttatata aaaatcaagt tagaacaaga

3780

attaaatcaa tcaagaatgg gacaaataaa aatgtcttgg aaagtggtga tcattttttc

3840

attgttaata acacctcaac acggtcttaa agagagctat ttagaagagt catgtagcac

3900

tataactgaa ggatatctca gtgttctgag gacaggttgg tataccaacg tttttacact

3960

ggaggtaggt gatgtagaga accttacatg tgctgatgga cctagcttaa taaaaacaga

4020

attagacctg accaaaagtg cactaagaga actcagaaca gtttctgctg atcaactggc

4080

aagagaggag caaattgaga atcccagaca atctagattt gttctaggag caatagcact

4140

cggtgttgca acagcagctg cagttacagc aggtgttgca attgccaaaa ccatccggct

4200

tgaaagtgaa gtaacagcaa ttaagaatgc cctcaaaaag accaatgaag cagtatctac

4260

attggggaat ggagttcgag tgttggcaac tgcagtgagg gagctggaag attttgtgag

4320

caagaatcta acacgtgcaa tcaacaaaaa caagtgcgac attgctgacc tgaaaatggc

4380

cgttagcttc agtcaattca acagaaggtt tctaaatgtt gtgcggcaat tttcagacaa

4440

tgctggaata acaccagcaa tatccttgga cttaatgaca gatgctgaac tagccagagc

4500

tgtttccaac atgccaacat ctgcaggaca aataaaactg atgttggaga accgtgcaat

4560

ggtaagaaga aaggggttcg gaatcctgat aggagtttac ggaagctccg taatttacat

4620

ggtgcaactg ccaatctttg gagttataga cacgccttgc tggatagtaa aagcggcccc

4680

ttcttgctca gaaaaaaagg gaaactatgc ttgcctttta agagaagatc aaggatggta

4740

ttgtcagaat gcagggtcaa ctgtttacta cccaaatgaa aaagactgcg aaacaagagg

4800

agaccatgtc ttttgcgaca cagcagcagg aatcaatgtt gctgagcagt caaaggagtg

4860

caacatcaac atatccacta ctaattaccc atgcaaagtt agcacaggaa gacaccctat

4920

cagtatggtt gcactgtctc ctcttggggc tttggttgct tgctacaagg gagtgagctg

4980

ttccattggc agcaacagag tagggatcat caagcaactg aacaaaggct gctcttatat

5040

aaccaaccaa gacgcagaca cagtgacaat agacaacact gtataccagc taagcaaagt

5100

tgagggcgaa cagcatgtta taaaaggaag gccagtgtca agcagctttg atccagtcaa

5160

atttcctgaa gatcaattca atgttgcact tgaccaagtt ttcgaaagca ttgagaacag

5220

tcaggccttg gtggatcaat caaacagaat cctaagcagt gcagagaaag gaaacactgg

5280

cttcatcatt gtaataattc taattgctgt ccttggctct accatgatcc tagtgagtgt

5340

ttttatcata ataaagaaaa caaagaaacc cacaggagca cctccagagc tgagtggtgt

5400

cacaaacaat ggcttcatac cacataatta gttaattaaa aataaagtaa attaaattaa

5460

aataaaataa aattaaaatt aaaataaaat aaaaataaaa atttgggaca aatcataatg

5520

tctcgcaagg ctccatgcaa atatgaagtg cggggcaaat gcaatagagg aagtgagtgc

5580

aagtttaacc acaattactg gagttggcca gatagatact tactaataag atcaaattat

5640

ttattaaatc aacttttaag gaacactgat agagctgatg gcttatcaat aatatcagga

5700

gcaggcagag aagataggac acaagatttt gtcctaggtt ccaccaatgt ggttcaaggt

5760

tatattgatg ataaccaaag cataacaaaa gctgcagcct gttacagtct acataatata

5820

atcaaacaac tacaagaagt tgaagttagg caggctagag ataacaaacc atctgacagc

5880

aaacatgtgg cacttcacaa cttagtccta tcttatatgg agatgagcaa aattcctgca

5940

tctttaatca acaatctcaa aagactgccg agagagaaac tgaaaaaatt agcaaagctt

6000

ataattgact tatcagcagg tgctgaaaat gactcttcat atgccttgca agacagtgaa

6060

agcactaatc aagtgcagtg agcatggtcc tgttttcatt actatagagg ttgattacat

6120

gatatggact cataaggact taaaagaagc tttatctaat gggatagtga agtctcatac

6180

taacatttac aattgttatt tagaaaacat agaaattata tatgtcaagg cttacttaag

6240

ttagtaaaaa cacatcagag tgggataaat gacaatgata acattagatg tcattaaaag

6300

tgatgggtct tcaaaaacat gtactcacct caaaaaatta attaaagacc actctggtaa

6360

agtgcttatt gtacttaagt taatattagc tttactaaca tttctcacag tgacaatcac

6420

catcaattat ataaaagtag aaaacaatct gcaaatatgt cagtcaaaaa ctgaatcaga

6480

caaaaaggac tcatcatcaa ataccacatc agtcacaacc aagactactc taaatcatga

6540

tataacacag tattttaaaa gtttgattca aaggtataca aactctgcaa taaacagaga

6600

cacatgctgg aaaataagca gaaatcaatg cacaaacata acaacataca aatttttatg

6660

ttttaaatct gaagaaacaa aaaccaacaa ttgtgataaa ctgacagatt tatgcagaaa

6720

caaaccaaaa ccagctgttg aagtgtatca catagtagaa tgccattgta tatacacagt

6780

taaatggaag tgctatcatt acccaataga tgaaacccaa tcctaaataa cactagatta

6840

ggatccatcc aagtctgtta gttcaacaat ttagttattt aaaaatattt tgaaaacaag

6900

taagtttcta tgatacttca taataataag taataattaa ttgcttaatc atcatcacaa

6960

cattattcga aaccataact attcaattta agaagtaaaa acaataatat gagacaaata

7020

acaatggatc ctcttaatga atccactgtt aatgtctatc ttcccgactc atatcttaaa

7080

ggagtgattt cttttagtga gactaatgca attggttcat gtctcttaaa aagaccttac

7140

ctaaaaaatg acaacactgc aaaagttgcc atagagaatc ctgttatcga gcatgttaga

7200

ctcaaaaatg caatcaattc taagatgaaa atatcagatt acaggatagt agagccagta

7260

aacatgcaac atgaaattat gaagaatgta cacagttgtg agctcacatt attaaaacag

7320

tttttaacaa ggagtaaaaa tattagcact cttaaattaa atatgatatg tgattggctg

7380

cagttaaagt ctacatcaga tgatacctca atcttaagtt ttatagatgt agaatttata

7440

cctagctggg taagcaattg gtttagtaat tggtacaatc tcaacaagtt gattctggaa

7500

ttcaggaaag aagaagtaat aagaactggt tcaatcttgt gtaggtcatt gggtaaatta

7560

gtttttgttg tatcatcata cggatgtata gtcaagagca acaaaagcaa aagagtgagc

7620

ttcttcacat acaatcaact gttaacatgg aaagatgtga tgttaagtag attcaatgca

7680

aatttctgta tatgggtaag caacagtctg aatgaaaatc aagaagggtt agggttgaga

7740

agtaatctgc aaggcatatt aactaataag ctatatgaaa ctgtagatta tatgcttagt

7800

ttgtgttgca atgaaggttt ctcacttgtg aaagagtttg agggttttat tatgagtgaa

7860

atccttagga ttactgaaca tgctcaattc agtactagat ttagaaatac tttattaaat

7920

ggattaactg atcaattgac aaaattaaaa aataaaaaca gactcagagt tcatggtacc

7980

gtgttagaaa ataatgatta tccaatgtat gaagttgtac ttaaattatt aggagatact

8040

ttgagatgta ttaaattatt aatcaataaa aacttagaga atgctgctga attatactat

8100

atatttagaa tattcggtca cccaatggta gatgaaagag atgcaatgga tgctgtcaaa

8160

ttaaacaatg aaatcacaaa aatcctcagg ttggagagct tgacagaact aagaggggca

8220

ttcatattaa ggattatcaa aggatttgta gacaacaaca aaagatggcc gaaaattaaa

8280

aacttaaaag tgcttagtaa aagatggact atgtacttca aagcaaaaag ttaccctagt

8340

caacttgaat taagtgaaca agatttttta gagcttgctg caatacagtt tgaacaagag

8400

ttttctgttc ctgaaaaaac caaccttgag atggtattaa atgataaagc tatatcacct

8460

cctaaaagat taatttggtc tgtgtaccca aaaaattact tacctgagac aataaaaaat

8520

cgatatctag aagagacttt caatgcaagt gatagtctca aaacaagaag agtactagag

8580

tactatttga aagataataa attcgaccaa aaagaactta aaagttatgt ggttaaacaa

8640

gaatatttaa atgataagga tcatattgtc tcgctaactg gaaaagaaag agaattaagt

8700

gtaggtagaa tgtttgctat gcaaccagga aaacagcgac aaatacaaat attggctgaa

8760

aaattgttag ctgataatat tgtacccttt ttcccagaaa ctttaacaaa gtatggtgat

8820

ctagatcttc agagaataat ggaaatcaaa tcagaacttt cttctattaa aaccagaaga

8880

aatgatagtt ataataatta cattgcaaga gcatccatag taacagattt aagtaagttc

8940

aaccaagcct ttaggtatga aactacagcg atctgtgcgg atgtagcaga tgaactacat

9000

ggaacacaaa gcctattctg ttggttacat cttatcgttc ctatgactac aatgatatgt

9060

gcctatagac atgcaccacc agaaacaaaa ggtgaatatg atatagataa gatagaagag

9120

caaagtggtt tatatagata tcatatgggt ggtattgaag gatggtgtca aaaactctgg

9180

acaatggaag ctatatcttt attagatgtt gtatctgtaa agacacgatg tcaaatgaca

9240

tctttattaa acggtgacaa ccaatcaata gatgtaagta aaccagttaa gttatctgag

9300

ggtttagatg aagtgaaagc agattatagc ttggctgtaa aaatgctaaa agaaataaga

9360

gatgcataca gaaatatagg ccataaactt aaagaagggg aaacatatat atcaagagat

9420

cttcagttta taagtaaggt gattcaatct gaaggagtaa tgcatcctac ccctataaaa

9480

aagatcttaa gagtgggacc atggataaac acaatattag atgacattaa aaccagtgca

9540

gagtcaatag ggagtctatg tcaggaatta gaatttaggg gggaaagcat aatagttagt

9600

ctgatattaa ggaatttttg gctgtataat ttatacatgc atgaatcaaa gcaacacccc

9660

ctagcaggga agcagttatt caaacaacta aataaaacat taacatcagt gcagagattt

9720

tttgaaatta aaaaggaaaa tgaagtagta gatctatgga tgaacatacc aatgcagttt

9780

ggaggaggag atccagtagt cttctataga tctttctata gaaggacccc tgatttttta

9840

actgaagcaa tcagtcatgt agatattctg ttaaaaatat cagccaacat aagaaatgaa

9900

gcgaaaataa gtttcttcaa agccttactg tcaatagaaa aaaatgaacg tgctacactg

9960

acaacactaa tgagagaccc tcaagctgtg ggctcagagc gacaagcaaa agtaacaagt

10020

gatatcaata gaacagcagt taccagcatc ttaagtcttt ctccaaatca acttttcagc

10080

gatagtgcta tacactacag tagaaatgaa gaagaggtcg gaatcattgc tgacaacata

10140

acacctgttt atcctcatgg actgagagtt ttgtatgaat cattaccttt tcataaagct

10200

gaaaaagttg taaatatgat atcaggaaca aaatccataa ccaacttatt acagagaaca

10260

tctgctatta atggtgaaga tattgacaga gctgtatcca tgatgctgga gaacctagga

10320

ttattatcta gaatattgtc agtagttgtt gatagtatag aaattccaac caaatctaat

10380

ggtaggctga tatgttgtca gatatctaga accctaaggg agacatcatg gaataatatg

10440

gaaatagttg gagtaacatc ccctagcatc actacatgca tggatgtcat atatgcaact

10500

agctctcatt tgaaagggat aatcattgaa aagttcagca ctgacagaac tacaagaggt

10560

caaagaggtc caaagagccc ttgggtagga tcgagcacgc aagagaaaaa attagttcct

10620

gtttataaca gacaaattct ttcaaaacaa caaagagaac agctagaagc aattggaaaa

10680

atgagatggg tatataaagg gacaccaggt ttaagacgat tactcaataa gatttgtctt

10740

ggaagtttag gcattagtta caaatgtgta aaacctttat tacctaggtt tatgagtgta

10800

aatttcctac acaggttatc tgtcagtagt agacctatgg aattcccagc atcagttcca

10860

gcttatagaa caacaaatta ccattttgac actagtccta ttaatcaagc actaagtgaa

10920

agatttggga atgaagatat taatttggtc ttccaaaatg caatcagctg tggaattagc

10980

ataatgagtg tagtagaaca attaactggt aggagtccaa aacagttagt tttaataccc

11040

caattagaag aaatagacat tatgccacca ccagtgtttc aagggaaatt caattataag

11100

ctagtagata agataacttc tgaccaacat atcttcagtc cagacaaaat agatatgtta

11160

acactgggga aaatgctcat gccaactata aaaggtcaga aaacagatca gttcttgaac

11220

aagagagaga attatttcca tgggaacaat cttattgagt ctttgtcagc agcgttagca

11280

tgtcattggt gtgggatatt aacagagcaa tgtatagaaa ataatatttt caagaaagac

11340

tggggtgacg ggttcatatc ggatcatgct tttatggact tcaaaatatt cctatgtgtc

11400

tttaaaacta aacttttatg tagttgggga tcccaaggga aaaacattaa agatgaagat

11460

atagtagatg aatcgataga taaactgtta aggattgata atactttttg gagaatgttc

11520

agcaaggtta tgtttgaatc aaaggttaag aaaaggataa tgttatatga tgtaaaattt

11580

ctatcattag taggttatat agggtttaag aattggttta tagaacagtt gagatcagct

11640

gagttgcatg aggtaccttg gattgtcaat gccgaaggtg atctggttga gatcaagtca

11700

attaaaatct atttgcaact gatagagcag agtttatttt taagaataac tgttttgaac

11760

tatacagata tggcacatgc tctcacaaga ttaatcagaa agaagttgat gtgtgataat

11820

gcactattaa cttcaattcc atccccaatg gttaacttaa ctcaagttat tgatcctaca

11880

gaacaattag cttatttccc taagataaca tttgaaaggc taaaaaatta tgacactagt

11940

tcaaattatg ctaaaggaaa gctaacaagg aattacatga tactgttgcc atggcaacat

12000

gttaatagat ataactttgt ctttagttct actggatgta aagttagtct aaaaacatgc

12060

attggaaaac ttatgaaaga tctaaaccct aaagttctgt actttattgg agaaggggca

12120

ggaaattgga tggccagaac agcatgtgaa tatcctgaca tcaaatttgt atacagaagt

12180

ttaaaagatg accttgatca tcattatcct ttggaatacc agagagtgat aggagaatta

12240

agcaggataa tagatagtgg tgaagggctt tcaatggaaa caacagatgc aactcaaaaa

12300

actcattggg atttgataca cagagtaagc aaagatgctt tattaataac tttatgtgat

12360

gcagaattta aggacagaga tgattttttt aagatggtaa ttctatggag gaaacatgta

12420

ttatcatgca gaatttgcac tacctatggg acagacctct atttattcgc aaagtatcat

12480

gctaaagact gcaatataaa attacctttt tttgtgagat cagttgccac ctttattatg

12540

caaggtagta aactgtcagg ctcggaatgc tacatactct taacactagg ccaccacaac

12600

aatttacctt gtcatggaga aatacaaaat tctaagatga aaatagcagc gtgtaatgat

12660

ttttatgctg caaaaaaact tgacaataaa tcaattgaag ccaactgtaa atcactttta

12720

tcagggctaa gaataccgat aaataagaag gaattaaata gacagagaag gttattaaca

12780

ctacaaagca accattcttc tgtagcaaca gttggaggta gcaaggtcat agagtctaaa

12840

tggttaacaa acaaggcaaa cacaataatt gattggttag aacatatttt aaattctcca

12900

aaaggtgaat taaattatga tttttttgaa gcattagaaa atacttaccc taatatgatt

12960

aaactaatag ataatctagg gaatgcagag attaaaaaac tgatcaaagt aactggatat

13020

atgcttgtaa gtaaaaaatg aaaaatgata aaaatgataa aataggtgac aacttcatac

13080

tattccaaag taatcatttg attatgcaat tatgtaatag ttaattaaaa actaaaaatc

13140

aaaagttaaa aactaataac tgtcattaag tttattaaaa ataagaaatt ataattggat

13200

gtatacggtt tttttgccgt

13220

<210> 7

<211> 13280

<212> ДНЕ

<213> метапневмовирус

<400> 7

acgcgaaaaa aacgcgtata aattaaattc caaacaaaac gggacaaata aaaatgtctc

60

ttcaagggat tcacctaagt gatctgtcat ataaacatgc tatattaaaa gagtctcaat

120

acacaataaa aagagatgta ggcaccacaa ctgcagtgac accttcatca ttgcagcaag

180

agataacact tttgtgtgga gagattcttt acactaaaca tactgattac aaatatgctg

240

cagagatagg gatacaatat atttgcacgg ctctaggatc agaaagagta caacagattt

300

taagaaattc aggcagtgaa gttcaggtgg ttctaaccaa gacatactct ttagggaaag

360

gtaaaaatag taaaggggaa gagttgcaaa tgttagatat acatggagtg gaaaagagtt

420

gggtagaaga aatagacaaa gaggcaagaa aaacaatggt gactttgcta aaggaatcat

480

caggtaacat cccacaaaac cagaggcctt cagcaccaga cacaccaata attttattat

540

gtgtaggtgc tttaatattc actaaactag catcaacaat agaagttgga ctagagacta

600

cagttagaag agctaacaga gtgctaagtg atgcgctcaa aagataccct agggtagata

660

taccgaagat tgctagatct ttctatgaac tatttgagca gaaagtgtat tacaggagtc

720

tattcattga gtatgggaaa gctttaggct catcttcaac aggaagcaaa gcagaaagtt

780

tgtttgtaaa tatatttatg caagcttatg gagccggtca aacaatgcta aggtggggtg

840

tcattgccag atcatctaac aacataatgc taggacatgt gtctgtgcaa gctgaattga

900

agcaagttac agaggtttat gatttggtga gagaaatggg tcctgaatct gggcttttac

960

atctaagaca aagtccaaag gcaggactgt tatcgttggc caattgcccc gattttgcta

1020

gtgttgttct tggtaatgct tcaggtctag gtataatcgg aatgtacaga ggaagagtgc

1080

caaacacaga gctattttct gcagcagaaa gttatgccag aagcttaaaa gaaagcaaca

1140

aaatcaactt ctcctcatta gggctcacag acgaagaaaa agaagctgca gaacacttct

1200

taaacatgag tgatgacaat caagatgatt atgagtaatt aaaaaactgg gacaagtcaa

1260

aatgtcattc cctgaaggaa aagatatcct gttcatgggt aatgaagcag caaaaatagc

1320

agaagctttc cagaaatcac taaaaagatc aggtcacaaa agaacccagt ctattgtagg

1380

ggaaaaagta aacactatat cagaaactct agagctacct accatcagca aacctgcacg

1440

atcatctaca ctgctagagc caaaattggc atgggcagac agcagcagag ccaccaaaac

1500

cacagaaaaa caaacaacca aaacaacaga tcctgttgaa gaagaggaac tcaatgaaaa

1560

gaagatatca ccttccagtg atgggaagac tcccgcagag aaaaaatcaa aatctccaac

1620

caatgtaaaa aagaaagttt ccttcacatc aaatgaacca gggaaatata ccaaactaga

1680

aaaagatgcc ctagatttgc tctcagacaa tgaggaagaa gacgcagagt cctcaatctt

1740

aacctttgaa gagagagaca catcatcact aagcattgag gctagactag aatcaataga

1800

agagaagcta agcatgatat taggactgct tcgtacactt aacattgcaa cagcaggacc

1860

aacggctgca agagatggaa tcagagatgc aatgattggt ataagagaag aactaatagc

1920

agaaataata aaagaagcaa agggaaaagc agctgaaatg atggaagagg aaatgaatca

1980

aaggtcaaaa ataggtaatg gcagtgtaaa actaaccgag aaggcaaaag aacttaataa

2040

aattgttgaa gacgagagca caagcggtga atcagaagaa gaagaagaac caaaagaaac

2100

tcaggataac aatcaaggag aagatattta ccagttaatc atgtagttta ataaaaataa

2160

acaatgggac aagtcaagat ggagtcctat ctagtggaca cttatcaagg cattccctac

2220

acagctgctg ttcaagttga tctggtagaa aaagacttac taccagcaag tttgacaata

2280

tggtttcctc tattccaagc caacacacca ccagcggttt tgctcgatca gctaaagacc

2340

ttgacaataa caactctgta tgctgcatca cagaatggtc caatactcaa ggtaaatgca

2400

tcagctcagg gtgctgctat gtctgtactt cccaaaaaat tcgaagtaaa tgcaactgtg

2460

gcacttgatg aatacagcaa acttgacttt gacaagttaa cggtttgcga tgttaaaaca

2520

gtttatttga caaccatgaa accatatggg atggtgtcaa aatttgtgag ttcagccaaa

2580

tcagttggca acaagacaca tgatctaatt gcactgtgtg acttcatgga cctagagaaa

2640

aatatacctg tgacaatacc agcattcata aagtcagttt caatcaaaga gagtgagtca

2700

gccactgttg aagctgcaat aagcagtgag gccgaccaag cattaacaca agccaaaatt

2760

gcaccctatg caggactaat catgatcatg accatgaaca atccaaaagg tatattcaag

2820

aaactaggag ctggaacaca agtgatagta gagctagggg catatgttca agccgagagc

2880

atcagcagga tctgcaagag ctggagtcac caaggaacaa gatatgtact aaaatccaga

2940

taaaaataac tgtcctaatc aataattgct tatataatct taaagatcaa tgagcttatt

3000

attatagtta tataaaaaaa tttagaacta ggaaggtatt aatagaaagc gggacaagta

3060

aaaatgtctt ggaaagtgat gattatcatt tcgttactca taacacctca gcacggacta

3120

aaggaaagtt atttagaaga atcatgtagt actataactg aaggatatct cagtgtttta

3180

agaacaggtt ggtacaccaa tgtctttaca ttagaagttg gtgatgttga aaatcttaca

3240

tgtactgatg gacctagctt aatcaaaaca gaacttgacc taaccaaaag tgctctaaga

3300

gaactcaaaa cagtttctgc tgatcagtta gcgagagaag aacaaattga aaatcccaga

3360

caatcaaggt ttgtcctagg tgcaatagct cttggtgttg ccacagcagc agcagtcaca

3420

gcaggcattg cgatagccaa aaccataagg cttgagagtg aagtgaatgc aatcaaaggt

3480

gctctcaaaa caaccaatga ggcagtatcc acactaggaa atggagtgcg agtcctagcc

3540

accgcagtaa gagagctgaa agaatttgtg agcaaaaacc tgactagtgc aattaacaag

3600

aacaaatgtg acattgctga tctgaagatg gctgtcagct tcagtcaatt caacagaaga

3660

ttcctaaatg ttgtgcggca gttttcagac aatgcaggga taacaccagc aatatcattg

3720

gacctaatga ctgatgctga gctggccaga gctgtatcat acatgccaac atctgcagga

3780

cagataaaac taatgttaga gaaccgtgca atggtgagga gaaaaggatt tggaatcttg

3840

ataggggtct acggaagctc cgtgatttac atggtccagc tgccgatctt tggtgtcata

3900

gatacacctt gttggataat caaggcagct ccctcttgtt cagaaaaaga tggaaactat

3960

gcttgcctcc taagagagga tcaagggtgg tattgtaaaa atgcaggatc cactgtttac

4020

tacccaaata aaaaagactg cgaaacaaga ggtgatcatg ttttttgtga cacagctgca

4080

gggatcaatg ttgctgagca atcaagagaa tgcaacatca acatatctac aaccaactac

4140

ccatgcaaag tcagcacagg aagacaccct atcagcatgg ttgcactatc acctctcggt

4200

gctttggtgg cttgctacaa aggggttagc tgttcaattg gcagtaatcg ggttggaata

4260

atcaaacaac tacctaaagg ctgctcatac ataactaacc aggacgcaga cactgtaaca

4320

attgacaaca ctgtgtatca actaagcaaa gttgagggtg aacagcatgt aataaaaggg

4380

agaccagttt caagcagttt cgatccaatc aagtttcctg aggatcagtt caatgttgcg

4440

cttgatcaag tctttgaaag cattgaaaac agtcaagcac tagtggacca gtcaaacaaa

4500

attctgaaca gtgcagaaaa aggaaacact ggcttcatta ttgtaataat tttgattgct

4560

gttcttgggt taaccatgat ttcagtgagc atcatcatca taatcaaaaa aacaaggaaa

4620

cccacagggg cacctccaga gctgaatggt gttaccaacg gcggttttat accgcatagt

4680

tagttaatta aaaaatggga caaatcatca tgtctcgtaa agctccatgc aaatatgaag

4740

tacggggcaa gtgcaacagg ggaagtgagt gcaaattcaa ccacaattac tggagttggc

4800

ctgataggta tttattgtta agatcaaatt atctcttgaa tcagctttta agaaacactg

4860

ataaggctga tggtttgtca ataatatcag gagcaggtag agaagacagg actcaagact

4920

ttgttcttgg ttctactaat gtggttcaag ggtacattga tgacaatcaa ggaataacaa

4980

aggctgcagc ttgctatagt ctacataaca taataaaaca gctacaagaa atagaagtaa

5040

gacaggccag agataataag ctttctgaca gcaaacatgt ggcacttcac aacttgatat

5100

tatcctatat ggagatgagc aaaactcctg catccctgat taataaccta aagaaactac

5160

caagagaaaa actgaaaaaa ttagcgaaat taataattga tttatcagca ggaactgata

5220

atgactcttc atatgccttg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag taagcatggt

5280

cccaaattca tcaccataga ggcagatgat atgatatgga cacacaaaga attaaaagag

5340

acactgtctg atgggatagc aaaatcacac accaatattt acagttgtta tttagaaaat

5400

atagaaataa tatatgttaa agcttactta agttagtaaa aaataaatag aatgggataa

5460

atgacaatga aaacattaga tgtcataaaa agtgacggat cctcagaaac atgtaatcaa

5520

ctcaaaaaaa taataaaaaa acactcaggt aaattgctta ttgcatcaaa accgacattg

5580

gccttattga cgtccttcac agtaacaatt actgtcaact atacaaaagt agaaaataat

5640

ttgcaggcat gtcaattaaa aaatgaatca gacaaaaagg acacaaagct aaataccaca

5700

tcaacaacaa tcagacccat tcctgatcta aatgcagtac agtacctgaa aaggctgatt

5760

cagaaacaca ccaactctgt cacaaaagac agagatacct gttggagaat acacacgaat

5820

caatgcacaa atataaaaat atataagttc ttatgttttg ggtctatgaa ttcaacaaat

5880

acagactgtg aagaaccaac agttctatgc gacaaaaagt caaaaaccat gacagaaaaa

5940

cataggaaag cagagtgtca ccgtccacat acaaccgagt ggtggtgcca ttatctttaa

6000

gagaaaactc agttttcaac attaaaatca gaacaaatca tatctagatc tattaatata

6060

atagtctagt tatttaaaaa ctctaaatat tgtctagact tcacaacacc ctgcggtcat

6120

atgcaataat caatggtcaa accactgttg caaacccacc tataatacaa tcactgagta

6180

atacaaaaca agaaaatggg acaagtggcc atggaagcaa gagtggagaa cattcgggca

6240

atagacatgt tcaaagcaaa gatgaaaaac cgtataagaa gtagcaagtg ccatagaaat

6300

gctacactga tccttattgg atcaacagca ccaagtatgg cactcaacac ccttttaatc

6360

attgatcatg caacatcaaa aaacatgacc aaagtggaac actgtgtcaa catgccgccg

6420

gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc tctgcagcag acccaaacac caaacccaat

6480

ccacagcagg caacacagct gaccacagag gattcaacat ctctagcagc aaccctagag

6540

gaccatctac acacagggac aactccaaca ccagatgcaa cagtctccca gcaaaccaca

6600

gacgagcaca caacactgct gagatcaacc aacagacaga ccacccaaac aaccgcagag

6660

aaaaagccaa ccagagcaac aaccaaaaaa gaaaccacaa ctcgaaccac aagcacagct

6720

gcaacccaaa cactcaacac caccaaccaa actagcaatg gaagagaggc aaccacaaca

6780

tctgccagat ccagaaacaa tgccacaact caaagcagcg atcaaacaac ccaggcagca

6840

gacccaagct cccaatcaca acatacacag aaaagcacaa caacaacaca caacacagac

6900

acatcttctc caagtagtta acaaaaaaac tataaaataa ccatgaaaac caaaaaacta

6960

gaaaagttaa tttgaactca gaaaagaaca caaacactat atgaattgtt tgagcgtata

7020

tactaatgaa atagcatctg tttgtgcatc aataatacca tcattattta agaaataaga

7080

agaagctaaa attcaaggga caaataacaa tggatccgtt ttgtgaatcc actgtcaatg

7140

tctatcttcc tgattcatat ctcaaaggag taatatcttt cagtgaaacc aatgcaattg

7200

gctcatgcct tttgaaaaga ccctatctta aaaaagataa cactgctaaa gttgctgtag

7260

aaaaccctgt tgttgaacat gtcagactta gaaatgcagt catgaccaaa atgaagatat

7320

cagattataa agtggttgaa ccaattaata tgcagcatga aataatgaaa aatatacaca

7380

gttgtgagct cacattatta aaacaattct taacaagaag taaaaacatt agctccctaa

7440

aattaagtat gatatgtgat tggttacagt taaaatccac ctcagataac acatcaattc

7500

ttaattttat agatgtggag tttatacccg tttgggtgag caattggttt agtaactggt

7560

ataatctcaa taaattaatc ttagagttta gaagagagga agtaataaga actggttcaa

7620

ttttatgcag atcactaggc aagttagttt tcattgtatc atcttatggg tgtgtagtaa

7680

aaagcaacaa aagtaaaaga gtaagttttt tcacatataa ccaactgtta acatggaaag

7740

atgtgatgtt aagtaggttc aatgcaaact tttgtatatg ggtaagtaac aacctgaaca

7800

aaaatcaaga aggactagga tttagaagta atctacaagg tatgttaact aataaattat

7860

atgaaactgt tgattatatg ttaagtctat gtagcaatga agggttctca ctagtgaaag

7920

agttcgaagg ctttattatg agtgaaattc ttaaaattac tgagcatgct caattcagta

7980

ctaggtttag gaatacttta ttaaatgggt tgactgaaca attatcaatg ttgaaagcta

8040

aaaacagatc tagagttctt ggcactatat tagaaaacaa tgattacccc atgtatgaag

8100

tagtacttaa attattaggg gacactttga aaagtataaa attattaatt aacaagaatt

8160

tagaaaatgc tgcagaatta tattatatat tcagaatttt tggacaccct atggtagatg

8220

agagggaagc aatggatgct gttaaattaa ataatgagat tacaaaaatt cttaaactgg

8280

agagcttaac agaactaaga ggagcattta tactaagaat tataaaaggg tttgtagata

8340

ataataaaag atggcctaaa attaagaatt taaaagtgct cagtaaaaga tgggttatgt

8400

atttcaaagc taaaagttac cctagccaac ttgagctaag tgtacaagat tttttagaac

8460

ttgctgcagt acaattcgaa caggaatttt ctgtccctga aaaaaccaat cttgagatgg

8520

tattaaatga taaagcaata tctccaccaa aaaagttaat atggtcggta tatccaaaaa

8580

attatctacc tgaaattata aaaaatcaat atttagaaga ggtcttcaat gcaagtgaca

8640

gtcaaagaac gaggagagtc ttagaatttt acttaaaaga ttgcaaattt gatcaaaaag

8700

acctcaaacg ttatgtaact aaacaagagt atctaaatga caaagaccac attgtctcat

8760

taactgggaa agaaagagaa ttaagtgtag gcaggatgtt tgcaatgcaa cctggcaaac

8820

aaagacaaat acagatacta gccgagaaac ttttagctga taatattgta ccctttttcc

8880

cagaaacttt aacaaagtat ggtgacttgg atctccaaag aattatggaa atgaaatcag

8940

aactttcttc cattaaaact aggaagaatg atagttacaa caattatatt gcaagagcct

9000

ccatagtaac agacctaagt aaattcaatc aagcctttag atatgaaacc acagctatct

9060

gcgcagacgt agcagatgag ttacatggca cgcaaagctt attttgttgg ttacatctta

9120

ttgttcccat gaccacaatg atatgtgcat acagacatgc accaccagaa acaaaggggg

9180

agtatgatat agacaaaata gaagagcaaa gtgggctata cagataccat atgggaggga

9240

ttgaagggtg gtgtcagaag ttatggacaa tggaggcgat atccttgtta gatgtagtat

9300

ctgttaagac tcgttgtcag atgacctctc tattaaacgg agacaatcaa tcaatagatg

9360

tcagtaaacc agtaaaattg tctgaaggta tagatgaagt aaaagcagat tatagcttag

9420

caattaaaat gcttaaagag ataagagatg cctataaaaa cattggccat aaactcaaag

9480

aaggtgaaac atatatatca agagatcttc aatttataag taaggtgatt caatctgagg

9540

gggtcatgca tcctaccccc ataaaaaaga tattaagggt aggtccctgg ataaatacaa

9600

tactagatga cattaaaact agtgcagaat caatagggag tctgtgtcaa gaactagagt

9660

tcagaggaga aagtatacta gttagcttga tattaaggaa tttctggctg tataacttat

9720

acatgcatga gtcaaaacag catccgttag ctggaaaaca actgtttaaa caattgaaca

9780

aaacactaac atctgtgcaa agattttttg agctgaagaa agaaaatgat gtggttgacc

9840

tatggatgaa tataccaatg cagtttggag ggggagaccc agtagttttt tacagatctt

9900

tttacagaag gactcctgat ttcttgactg aagcaatcag ccatgtggat ttactgttaa

9960

aagtttcaaa caatattaaa aatgagacta agatacgatt ctttaaagcc ttattatcta

10020

tagaaaagaa tgaacgtgct acattaacaa cactaatgag agacccccag gcggtaggat

10080

cggaaagaca agctaaggta acaagtgata taaatagaac agcagttact agcatactga

10140

gtctatctcc gaatcagcta ttttgtgata gtgctataca ctatagcaga aatgaagaag

10200

aagtagggat cattgcagac aacataacac ctgtttatcc tcacggattg agagtgctct

10260

atgaatcact accttttcat aaggctgaaa aggttgtcaa tatgatatca ggtacaaagt

10320

ctataactaa cctattgcag agaacatctg ctatcaatgg tgaagatatt gatagagcag

10380

tgtctatgat gttagagaac ttagggttgt tatctaggat attgtcagta ataattaata

10440

gtatagaaat accaattaag tccaatggca gattgatatg ctgtcaaatt tctaagactt

10500

tgagagaaaa atcatggaac aatatggaaa tagtaggagt gacatctcca agtattgtaa

10560

catgtatgga tgttgtgtat gcgactagtt ctcatttaaa aggaataatt attgaaaaat

10620

tcagtactga caagaccaca agaggtcaga ggggaccaaa aagcccttgg gtaggatcaa

10680

gcactcaaga gaaaaaatta gttcctgttt ataacagaca aattctttca aaacaacaaa

10740

aagagcaact ggaagcaata ggaaaaatga ggtgggtgta taaaggaact ccagggctaa

10800

gaagattgct caataagatt tgcataggaa gtttaggtat tagctataaa tgtgtaaaac

10860

ctctattacc aagatttatg agtgtaaact tcttacatag gttatctgtt agtagcagac

10920

ccatggaatt cccagcttct gttccagctt ataggacaac aaattaccac tttgacacta

10980

gtccaatcaa ccaagcatta agtgagaggt tcgggaacga agacattaat ctagtgttcc

11040

aaaatgcaat cagctgcgga attagtataa tgagtgttgt agaacagtta actggtagaa

11100

gcccaaaaca attagtctta atcccccaat tagaagagat agatattatg ccccctcctg

11160

tatttcaagg aaaattcaat tataaactag ttgataaaat aacctccgat caacacatct

11220

tcagtcctga caaaatagac atattaacac tagggaagat gcttatgcct actataaaag

11280

gtcaaaaaac tgatcagttc ttaaataaga gagaaaacta tttccatgga aataatttaa

11340

ttgaatcttt atctgcagca cttgcatgcc attggtgtgg aatattaaca gaacagtgtg

11400

tagaaaacaa tatctttagg aaagactggg gtgatgggtt catatcagat catgccttca

11460

tggatttcaa gatatttcta tgtgtattta aaaccaaact tttatgtagt tggggatccc

11520

aagggaaaaa tgtaaaagat gaagatataa tagatgaatc cattgacaaa ttattaagaa

11580

ttgacaacac tttttggaga atgttcagca aagtcatgtt tgaatcaaag gtcaaaaaaa

11640

gaataatgtt atatgatgta aaattcctat cattagtagg ttatatagga tttaaaaact

11700

ggtttataga gcagttaaga gtagtagaat tgcatgaagt accctggatt gtcaatgctg

11760

aaggggagct agttgaaatt aaaccaatca aaatttattt gcagttaata gaacaaagtc

11820

tatctttaag aataactgtt ttgaattata cagacatggc acatgctctt acacgattaa

11880

ttaggaagaa attgatgtgt gataatgcac tctttaatcc aagttcatca ccaatgttta

11940

gtctaactca agttattgat cctacaacac agctagacta ttttcctaag gtaatatttg

12000

aaaggttaaa aagttatgac accagttcag actacaacaa agggaagtta acaagaaatt

12060

acatgacatt attaccatgg cagcacgtaa acaggtataa ttttgtcttt agttcaacag

12120

gatgtaaaat cagcttgaag acatgcatcg ggaaattgat aaaggactta aaccctaagg

12180

ttctttactt tattggagaa ggagcaggta actggatggc aagaacagca tgtgagtatc

12240

ctgacataaa atttgtatat aggagtttaa aggatgatct tgatcaccat tacccattag

12300

aatatcaaag ggtaataggt gatttaaata gagtaataga tggtggtgaa ggattatcaa

12360

tggagaccac agatgcaact caaaagactc attgggactt gatacacaga ataagtaaag

12420

atgctttatt gataacattg tgtgatgcag aattcaaaaa cagagatgat ttctttaaaa

12480

tggtaattct ttggagaaaa catgtattat catgtagaat ctgtacagct tatggaacag

12540

atctttactt atttgcaaag tatcatgcga cggactgcaa tataaagtta ccattttttg

12600

taaggtctgt agctactttt attatgcaag gaagcaaatt gtcaggatca gaatgttaca

12660

tacttttaac attaggtcat cacaataatc tgccatgtca cggagaaata caaaattcca

12720

aaatgagaat agcagtgtgt aatgatttcc atgcctcaaa aaaactagac aacaaatcaa

12780

ttgaagcaaa ctgcaaatct cttctatcag gattaagaat accaataaac aaaaaagagt

12840

taaatagaca aaagaaactg ttaacactac aaagcaatca ttcttccata gcaacagttg

12900

gcggaagtaa gattatagaa tccaaatggt taaagaataa agcaagtaca ataattgatt

12960

ggttagagca tatcttgaat tctccaagag gtgaattaaa ctatgatttc tttgaagcat

13020

tagagaacac atatcccaat atgatcaagc ttatagataa cctgggaaat gcagagataa

13080

aaaaactaat caaagttacc gggtatatgc ttgtgagtga gaagtaataa taataataat

13140

aatcaaccat aatctcacac aactgagaaa atgatcatct aacagtttaa ttgaccatta

13200

gttaattaaa aattataaat tagtaactaa ttgataaaaa ataagaaatt gaaattgaat

13260

gtatacggtt tttttgccgt

13280

<210> 8

<211> 14028

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ген GFP вставлен между положениями 41 и 785

<400> 8

acgcgaaaaa aacgcgtata aattaaattc caaacaaaac gggacaaata aaaatggtga

60

gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg

120

taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc

180

tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga

240

ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg

300

acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg

360

acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc

420

gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg

480

agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca

540

aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact

600

accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga

660

gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg

720

agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taagttaatt

780

aaaaaactgg gacaaataaa aatgtctctt caagggattc acctaagtga tctgtcatat

840

aaacatgcta tattaaaaga gtctcaatac acaataaaaa gagatgtagg caccacaact

900

gcagtgacac cttcatcatt gcagcaagag ataacacttt tgtgtggaga gattctttac

960

actaaacata ctgattacaa atatgctgca gagataggga tacaatatat ttgcacggct

1020

ctaggatcag aaagagtaca acagatttta agaaattcag gcagtgaagt tcaggtggtt

1080

ctaaccaaga catactcttt agggaaaggt aaaaatagta aaggggaaga gttgcaaatg

1140

ttagatatac atggagtgga aaagagttgg gtagaagaaa tagacaaaga ggcaagaaaa

1200

acaatggtga ctttgctaaa ggaatcatca ggtaacatcc cacaaaacca gaggccttca

1260

gcaccagaca caccaataat tttattatgt gtaggtgctt taatattcac taaactagca

1320

tcaacaatag aagttggact agagactaca gttagaagag ctaacagagt gctaagtgat

1380

gcgctcaaaa gataccctag ggtagatata ccgaagattg ctagatcttt ctatgaacta

1440

tttgagcaga aagtgtatta caggagtcta ttcattgagt atgggaaagc tttaggctca

1500

tcttcaacag gaagcaaagc agaaagtttg tttgtaaata tatttatgca agcttatgga

1560

gccggtcaaa caatgctaag gtggggtgtc attgccagat catctaacaa cataatgcta

1620

ggacatgtgt ctgtgcaagc tgaattgaag caagttacag aggtttatga tttggtgaga

1680

gaaatgggtc ctgaatctgg gcttttacat ctaagacaaa gtccaaaggc aggactgtta

1740

tcgttggcca attgccccaa ttttgctagt gttgttcttg gtaatgcttc aggtctaggt

1800

ataatcggaa tgtacagagg aagagtgcca aacacagagc tattttctgc agcagaaagt

1860

tatgccagaa gcttaaaaga aagcaacaaa atcaacttct cctcattagg gctcacagac

1920

gaagaaaaag aagctgcaga acacttctta aacatgagtg atgacaatca agatgattat

1980

gagtaattaa aaaactggga caagtcaaaa tgtcattccc tgaaggaaaa gatatcctgt

2040

tcatgggtaa tgaagcagca aaaatagcag aagctttcca gaaatcacta aaaagatcag

2100

gtcacaaaag aacccagtct attgtagggg aaaaagtaaa cactatatca gaaactctag

2160

agctacctac catcagcaaa cctgcacgat catctacact gctagagcca aaattggcat

2220

gggcagacag cagcagagcc accaaaacca cagaaaaaca aacaaccaaa acaacagatc

2280

ctgttgaaga agaggaactc aatgaaaaga agatatcacc ttccagtgat gggaagactc

2340

ccgcagagaa aaaatcaaaa tctccaacca atgtaaaaaa gaaagtttcc ttcacatcaa

2400

atgaaccagg gaaatatacc aaactagaaa aagatgccct agatttgctc tcagacaatg

2460

aggaagaaga cgcagagtcc tcaatcttaa cctttgaaga gagagacaca tcatcactaa

2520

gcattgaggc tagactagaa tcaatagaag agaagctaag catgatatta ggactgcttc

2580

gtacacttaa cattgcaaca gcaggaccaa cggctgcaag agatggaatc agagatgcaa

2640

tgattggtat aagagaagaa ctaatagcag aaataataaa agaagcaaag ggaaaagcag

2700

ctgaaatgat ggaagaggaa atgaatcaaa ggtcaaaaat aggtaatggc agtgtaaaac

2760

taaccgagaa ggcaaaagaa cttaataaaa ttgttgaaga cgagagcaca agcggtgaat

2820

cagaagaaga agaagaacca aaagaaactc aggataacaa tcaaggagaa gatatttacc

2880

agttaatcat gtagtttaat aaaaataaac aatgggacaa gtcaagatgg agtcctatct

2940

agtggacact tatcaaggca ttccctacac agctgctgtt caagttgatc tggtagaaaa

3000

agacttacta ccagcaagtt tgacaatatg gtttcctcta ttccaagcca acacaccacc

3060

agcggttttg ctcgatcagc taaagacctt gacaataaca actctgtatg ctgcatcaca

3120

gaatggtcca atactcaagg taaatgcatc agctcagggt gctgctatgt ctgtacttcc

3180

caaaaaattc gaagtaaatg caactgtggc acttgatgaa tacagcaaac ttgactttga

3240

caagttaacg gtttgcgatg ttaaaacagt ttatttgaca accatgaaac catatgggat

3300

ggtgtcaaaa tttgtgagtt cagccaaatc agttggcaac aagacacatg atctaattgc

3360

actgtgtgac ttcatggacc tagagaaaaa tatacctgtg acaataccag cattcataaa

3420

gtcagtttca atcaaagaga gtgagtcagc cactgttgaa gctgcaataa gcagtgaggc

3480

cgaccaagca ttaacacaag ccaaaattgc accctatgca ggactaatca tgatcatgac

3540

catgaacaat ccaaaaggta tattcaagaa actaggagct ggaacacaag tgatagtaga

3600

gctaggggca tatgttcaag ccgagagcat cagcaggatc tgcaagagct ggagtcacca

3660

aggaacaaga tatgtactaa aatccagata aaaataactg tcctaatcaa taattgctta

3720

tataatctta aagatcaatg agcttattat tatagttata taaaaaaatt tagaactagg

3780

aaggtattaa tagaaagcgg gacaagtaaa aatgtcttgg aaagtgatga ttatcatttc

3840

gttactcata acacctcagc acggactaaa ggaaagttat ttagaagaat catgtagtac

3900

tataactgaa ggatatctca gtgttttaag aacaggttgg tacaccaatg tctttacatt

3960

agaagttggt gatgttgaaa atcttacatg tactgatgga cctagcttaa tcaaaacaga

4020

acttgaccta accaaaagtg ctctaagaga actcaaaaca gtttctgctg atcagttagc

4080

gagagaagaa caaattgaaa atcccagaca atcaaggttt gtcctaggtg caatagctct

4140

tggtgttgcc acagcagcag cagtcacagc aggcattgcg atagccaaaa ccataaggct

4200

tgagagtgaa gtgaatgcaa tcaaaggtgc tctcaaaaca accaatgagg cagtatccac

4260

actaggaaat ggagtgcgag tcctagccac cgcagtaaga gagctgaaag aatttgtgag

4320

caaaaacctg actagtgcaa ttaacaagaa caaatgtgac attgctgatc tgaagatggc

4380

tgtcagcttc agtcaattca acagaagatt cctaaatgtt gtgcggcagt tttcagacaa

4440

tgcagggata acaccagcaa tatcattgga cctaatgact gatgctgagc tggccagagc

4500

tgtatcatac atgccaacat ctgcaggaca gataaaacta atgttagaga accgtgcaat

4560

ggtgaggaga aaaggatttg gaatcttgat aggggtctac ggaagctccg tgatttacat

4620

ggtccagctg ccgatctttg gtgtcataga tacaccttgt tggataatca aggcagctcc

4680

ctcttgttca gaaaaagatg gaaactatgc ttgcctccta agagaggatc aagggtggta

4740

ttgtaaaaat gcaggatcca ctgtttacta cccaaatgaa aaagactgcg aaacaagagg

4800

tgatcatgtt ttttgtgaca cagctgcagg gatcaatgtt gctgagcaat caagagaatg

4860

caacatcaac atatctacaa ccaactaccc atgcaaagtc agcacaggaa gacaccctat

4920

cagcatggtt gcactatcac ctctcggtgc tttggtggct tgctacaaag gggttagctg

4980

ttcaattggc agtaatcggg ttggaataat caaacaacta cctaaaggct gctcatacat

5040

aactaaccag gacgcagaca ctgtaacaat tgacaacact gtgtatcaac taagcaaagt

5100

tgagggtgaa cagcatgtaa taaaagggag accagtttca agcagtttcg atccaatcaa

5160

gtttcctgag gatcagttca atgttgcgct tgatcaagtc tttgaaagca ttgaaaacag

5220

tcaagcacta gtggaccagt caaacaaaat tctgaacagt gcagaaaaag gaaacactgg

5280

cttcattatt gtaataattt tgattgctgt tcttgggtta accatgattt cagtgagcat

5340

catcatcata atcaaaaaaa caaggaaacc cacaggggca cctccagagc tgaatggtgt

5400

taccaacggc ggttttatac cgcatagtta gttaattaaa aaatgggaca aatcatcatg

5460

tctcgtaaag ctccatgcaa atatgaagta cggggcaagt gcaacagggg aagtgagtgc

5520

agattcaacc acaattactg gagttggcct gataggtatt tattgttaag atcaaattat

5580

ctcttgaatc agcttttaag aaacactgat aaggctgatg gtttgtcaat aatatcagga

5640

gcaggtagag aagacaggac tcaagacttt gttcttggtt ctactaatgt ggttcaaggg

5700

tacattgatg acaatcaagg aataacaaag gctgcagctt gctatagtct acataacata

5760

ataaaacagc tacaagaaat agaagtaaga caggccagag ataataagct ttctgacagc

5820

aaacatgtgg cacttcacaa cttgatatta tcctatatgg agatgagcaa aactcctgca

5880

tccctgatta ataacctaaa gaaactacca agagaaaaac tgaaaaaatt agcgaaatta

5940

ataattgatt tatcagcagg aactgataat gactcttcat atgccttgca agacagtgaa

6000

agcactaatc aagtgcagta agcatggtcc caaattcatt accatagagg cagatgatat

6060

gatatggaca cacaaagaat taaaagagac actgtctgat gggatagtaa aatcacacac

6120

caatatttac agttgttatt tagaaaatat agaaataata tatgttaaag cttacttaag

6180

ttagtaaaaa ataaatagaa tgggataaat gacaatgaaa acattagatg tcataaaaag

6240

tgacggatcc tcagaaacat gtaatcaact caaaaaaata ataaaaaaac actcaggtaa

6300

attgcttatt gcattaaaac tgatattggc cttattgacg tttttcacag taacaattac

6360

tgttaactat ataaaagtag aaaataattt gcaggcatgt caattaaaaa atgaatcaga

6420

caaaaaggac acaaagctaa ataccacatc aacaacaatc agacccattc ctgatctaaa

6480

tgcagtacag tacttgaaaa ggctgattca gaaacacacc aactttgtca taaaagacag

6540

agatacctgt tggagaatac acacgaatca atgcacaaat ataaaaatat ataagttctt

6600

atgttttggg tctatgaatt caacaaatac agactgtgaa gaactaacag ttttatgcga

6660

caaaaagtca aaaaccatga cagaaaaaca taggaaagca gagtgtcact gtctacatac

6720

aaccgagtgg tggtgttatt atctttaaga gaaaactcag ttttcaacat taaaatcaga

6780

acaaatcata tctagatcta ttaatataat agtttagtta tttaaaaact ctaaatattg

6840

tctagacttc acaacacttt gcggtcatat gcaataatca atggtcaaac cactgttgca

6900

aactcaccta taatataatc actgagtaat acaaaacaag aaaatgggac aagtggccat

6960

ggaagtaaga gtggagaaca ttcgggcaat agacatgttc aaagcaaaga tgaaaaaccg

7020

tataagaagt agcaagtgct atagaaatgc tacactgatc cttattggat caacagcact

7080

aagtatggca ctcaatattt ttttaatcat tgattatgca acatcaaaaa acatgaccaa

7140

agtggaacac tgtgtcaata tgccgccggt agaaccaagc aagaagaccc caatgacctc

7200

tgcagtagac ccaaacacca aacccaatcc acagcaggca acacagctga ccacagagga

7260

ttcaacatct ctagcagcaa ccctagagga ccatctacac acagggacaa ctccaacacc

7320

agatgcaaca gtctctcagc aaaccacaga cgagcacaca acactgctga gatcaaccaa

7380

cagacagacc acccaaacaa ccgcagagaa aaagccaacc agagcaacaa ccaaaaaaga

7440

aaccacaact cgaaccacaa gcacagctgc aacccaaaca ctcaacacca ccaaccaaac

7500

tagcaatgga agagaggcaa ccacaacatc tgccagatcc agaaacaatg ccacaactca

7560

aagcagcgat caaacaaccc aggcagcaga cccaagctcc caatcacaac atacacagaa

7620

aagcacaaca acaacacaca acacagacac atcttctcca agtagttaac aaaaaaacta

7680

taaaataacc atgaaaacca aaaaactaga aaagttaatt tgaactcaga aaagaacaca

7740

aacactatat gaattgtttg agcgtatata ctaatgaaat agcatctgtt tgtgcatcaa

7800

taataccatc attatttaag aaataagaag aagctaaaat tcaagggaca aataacaatg

7860

gatccgtttt gtgaatccac tgtcaatgtc tatcttcctg attcatatct caaaggagta

7920

atatctttca gtgaaaccaa tgcaattggc tcatgccttt tgaaaagacc ctatcttaaa

7980

aaagataaca ctgctaaagt tgctgtagaa aaccctgttg ttgaacatgt cagacttaga

8040

aatgcagtca tgaccaaaat gaagatatca gattataaag tggttgaacc aattaatatg

8100

cagcatgaaa taatgaaaaa tatacacagt tgtgagctca cattattaaa acaattctta

8160

acaagaagta aaaacattag ctccctaaaa ttaagtatga tatgtgattg gttacagtta

8220

aaatccacct cagataacac atcaattctt aattttatag atgtggagtt tatacccgtt

8280

tgggtgagca attggtttag taactggtat aatctcaata aattaatctt agagtttaga

8340

agagaggaag taataagaac tggttcaatt ttatgcagat cactaggcaa gttagttttc

8400

attgtatcat cttatgggtg tgtagtaaaa agcaacaaaa gtaaaagagt aagttttttc

8460

acatataacc aactgttaac atggaaagat gtgatgttaa gtaggttcaa tgcaaacttt

8520

tgtatatggg taagtaacaa cctgaacaaa aatcaagaag gactaggatt tagaagtaat

8580

ctacaaggta tgttaactaa taaattatat gaaactgttg attatatgtt aagtctatgt

8640

agcaatgaag ggttctcact agtgaaagag ttcgaaggct ttattatgag tgaaattctt

8700

aaaattactg agcatgctca attcagtact aggtttagga atactttatt aaatgggttg

8760

actgaacaat tatcaatgtt gaaagctaaa aacagatcta gagttcttgg cactatatta

8820

gaaaacaatg attaccccat gtatgaagta gtacttaaat tattagggga cactttgaaa

8880

agtataaaat tattaattaa caagaattta gaaaatgctg cagaattata ttatatattc

8940

agaatttttg gacaccctat ggtagatgag agggaagcaa tggatgctgt taaattaaat

9000

aatgagatta caaaaattct taaactggag agcttaacag aactaagagg agcatttata

9060

ctaagaatta taaaagggtt tgtagataat aataaaagat ggcctaaaat taagaattta

9120

aaagtgctca gtaaaagatg ggttatgtat ttcaaagcta aaagttaccc tagccaactt

9180

gagctaagtg tacaagattt tttagaactt gctgcagtac aattcgaaca ggaattttct

9240

gtccctgaaa aaaccaatct tgagatggta ttaaatgata aagcaatatc tccaccaaaa

9300

aagttaatat ggtcggtata tccaaaaaat tatctacctg aaattataaa aaatcaatat

9360

ttagaagagg tcttcaatgc aagtgacagt caaagaacga ggagagtctt agaattttac

9420

ttaaaagatt gcaaatttga tcaaaaagac ctcaaacgtt atgtaactaa acaagagtat

9480

ctaaatgaca aagaccacat tgtctcatta actgggaaag aaagagaatt aagtgtaggc

9540

aggatgtttg caatgcaacc tggcaaacaa agacaaatac agatactagc cgagaaactt

9600

ttagctgata atattgtacc ctttttccca gaaactttaa caaagtatgg tgacttggat

9660

ctccaaagaa ttatggaaat gaaatcagaa ctttcttcca ttaaaactag gaagaatgat

9720

agttacaaca attatattgc aagagcctcc atagtaacag acctaagtaa attcaatcaa

9780

gcctttagat atgaaaccac agctatctgc gcagacgtag cagatgagtt acatggcacg

9840

caaagcttat tttgttggtt acatcttatt gttcccatga ccacaatgat atgtgcatac

9900

agacatgcac caccagaaac aaagggggag tatgatatag acaaaataga agagcaaagt

9960

gggctataca gataccatat gggagggatt gaagggtggt gtcagaagtt atggacaatg

10020

gaggcgatat ccttgttaga tgtagtatct gttaagactc gttgtcagat gacctctcta

10080

ttaaacggag acaatcaatc aatagatgtc agtaaaccag taaaattgtc tgaaggtata

10140

gatgaagtaa aagcagatta tagcttagca attaaaatgc ttaaagagat aagagatgcc

10200

tataaaaaca ttggccataa actcaaagaa ggtgaaacat atatatcaag agatcttcaa

10260

tttataagta aggtgattca atctgagggg gtcatgcatc ctacccccat aaaaaagata

10320

ttaagggtag gtccctggat aaatacaata ctagatgaca ttaaaactag tgcagaatca

10380

atagggagtc tgtgtcaaga actagagttc agaggagaaa gtatactagt tagcttgata

10440

ttaaggaatt tctggctgta taacttatac atgcatgagt caaaacagca tccgttagct

10500

ggaaaacaac tgtttaaaca attgaacaaa acactaacat ctgtgcaaag attttttgag

10560

ctgaagaaag aaaatgatgt ggttgaccta tggatgaata taccaatgca gtttggaggg

10620

ggagacccag tagtttttta cagatctttt tacagaagga ctcctgattt cttgactgaa

10680

gcaatcagcc atgtggattt actgttaaaa gtttcaaaca atattaaaaa tgagactaag

10740

atacgattct ttaaagcctt attatctata gaaaagaatg aacgtgctac attaacaaca

10800

ctaatgagag acccccaggc ggtaggatcg gaaagacaag ctaaggtaac aagtgatata

10860

aatagaacag cagttactag catactgagt ctatctccga atcagctatt ttgtgatagt

10920

gctatacact atagcagaaa tgaagaagaa gtagggatca ttgcagacaa cataacacct

10980

gtttatcctc acggattgag agtgctctat gaatcactac cttttcataa ggctgaaaag

11040

gttgtcaata tgatatcagg tacaaagtct ataactaacc tattgcagag aacatctgct

11100

atcaatggtg aagatattga tagagcagtg tctatgatgt tagagaactt agggttgtta

11160

tctaggatat tgtcagtaat aattaatagt atagaaatac caattaagtc caatggcaga

11220

ttgatatgct gtcaaatttc taagactttg agagaaaaat catggaacaa tatggaaata

11280

gtaggagtga catctccaag tattgtaaca tgtatggatg ttgtgtatgc gactagttct

11340

catttaaaag gaataattat tgaaaaattc agtactgaca agaccacaag aggtcagagg

11400

ggaccaaaaa gcccttgggt aggatcaagc actcaagaga aaaaattagt tcctgtttat

11460

aacagacaaa ttctttcaaa acaacaaaaa gagcaactgg aagcaatagg aaaaatgagg

11520

tgggtgtata aaggaactcc agggctaaga agattgctca ataagatttg cataggaagt

11580

ttaggtatta gctataaatg tgtaaaacct ctattaccaa gatttatgag tgtaaacttc

11640

ttacataggt tatctgttag tagcagaccc atggaattcc cagcttctgt tccagcttat

11700

aggacaacaa attaccactt tgacactagt ccaatcaacc aagcattaag tgagaggttc

11760

gggaacgaag acattaatct agtgttccaa aatgcaatca gctgcggaat tagtataatg

11820

agtgttgtag aacagttaac tggtagaagc ccaaaacaat tagtcttaat cccccaatta

11880

gaagagatag atattatgcc ccctcctgta tttcaaggaa aattcaatta taaactagtt

11940

gataaaataa cctccgatca acacatcttc agtcctgaca aaatagacat attaacacta

12000

gggaagatgc ttatgcctac tataaaaggt caaaaaactg atcagttctt aaataagaga

12060

gaaaactatt tccatggaaa taatttaatt gaatctttat ctgcagcact tgcatgccat

12120

tggtgtggaa tattaacaga acagtgtgta gaaaacaata tctttaggaa agactggggt

12180

gatgggttca tatcagatca tgccttcatg gatttcaaga tatttctatg tgtatttaaa

12240

accaaacttt tatgtagttg gggatcccaa gggaaaaatg taaaagatga agatataata

12300

gatgaatcca ttgacaaatt attaagaatt gacaacactt tttggagaat gttcagcaaa

12360

gtcatgtttg aatcaaaggt caaaaaaaga ataatgttat atgatgtaaa attcctatca

12420

ttagtaggtt atataggatt taaaaactgg tttatagagc agttaagagt agtagaattg

12480

catgaagtac cctggattgt caatgctgaa ggggagctag ttgaaattaa accaatcaaa

12540

atttatttgc agttaataga acaaagtcta tctttaagaa taactgtttt gaattataca

12600

gacatggcac atgctcttac acgattaatt aggaagaaat tgatgtgtga taatgcactc

12660

tttaatccaa gttcatcacc aatgtttagt ctaactcaag ttattgatcc tacaacacag

12720

ctagactatt ttcctaaggt aatatttgaa aggttaaaaa gttatgacac cagttcagac

12780

tacaacaaag ggaagttaac aagaaattac atgacattat taccatggca gcacgtaaac

12840

aggtataatt ttgtctttag ttcaacagga tgtaaaatca gcttgaagac atgcatcggg

12900

aaattgataa aggacttaaa ccctaaggtt ctttacttta ttggagaagg agcaggtaac

12960

tggatggcaa gaacagcatg tgagtatcct gacataaaat ttgtatatag gagtttaaag

13020

gatgatcttg atcaccatta cccattagaa tatcaaaggg taataggtga tttaaataga

13080

gtaatagatg gtggtgaagg attatcaatg gagaccacag atgcaactca aaagactcat

13140

tgggacttga tacacagaat aagtaaagat gctttattga taacattgtg tgatgcagaa

13200

ttcaaaaaca gagatgattt ctttaaaatg gtaattcttt ggagaaaaca tgtattatca

13260

tgtagaatct gtacagctta tggaacagat ctttacttat ttgcaaagta tcatgcgacg

13320

gactgcaata taaagttacc attttttgta aggtctgtag ctacttttat tatgcaagga

13380

agcaaattgt caggatcaga atgttacata cttttaacat taggtcatca caataatctg

13440

ccatgtcacg gagaaataca aaattccaaa atgagaatag cagtgtgtaa tgatttccat

13500

gcctcaaaaa aactagacaa caaatcaatt gaagcaaact gcaaatctct tctatcagga

13560

ttaagaatac caataaacaa aaaagagtta aatagacaaa agaaactgtt aacactacaa

13620

agcaatcatt cttccatagc aacagttggc ggaagtaaga ttatagaatc caaatggtta

13680

aagaataaag caagtacaat aattgattgg ttagagcata tcttgaattc tccaaaaggt

13740

gaattaaact atgatttctt tgaagcatta gagaacacat atcccaatat gatcaagctt

13800

atagataacc tgggaaatgc agagataaaa aaactaatca aagttaccgg gtatatgctt

13860

gtgagtgaga agtaataata ataataataa tcaaccataa tctcacacaa ctgagaaaat

13920

gatcatctaa cagtttaatt gaccattagt taattaaaaa ttataaatta gtaactaatt

13980

gataaaaaat aagaaattga aattgaatgt atacggtttt tttgccgt

14028

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, содержащий генетические модификации последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющие вирулентность указанного штамма. Модификации заключаются в инактивации гена, кодирующего белок SH, инактивации гена, кодирующего белок G, или инактивации этих двух генов - кодирующих белок G и белок SH. Предложено применение in vitro указанного ослабленного штамма метапневмовируса человека в качестве экспрессионного вектора по меньшей мере одного экзогенного гена в клетках-мишенях метапневмовируса человека. Предложена вакцинная композиция для профилактики или лечения инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae, содержащая в фармацевтически приемлемом носителе по меньшей мере один указанный ослабленный штамм метапневмовируса человека. Вакцина безопасна и эффективна для уменьшения тяжести поражения дыхательных путей в отношении вакцинации групп населения, особенно подвергающихся воздействию hMPV, представляющих собой младенцев, маленьких детей и пожилых. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 табл., 33 ил., 10 пр.

1. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, содержащий генетические модификации последовательности SEQ ID NO. 1, ослабляющие вирулентность указанного штамма, для профилактики или лечения инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae, отличающийся тем, что генетические модификации последовательности SEQ ID NO. 1 заключаются в инактивации гена, кодирующего белок SH, инактивации гена, кодирующего белок G, или инактивации этих двух генов, кодирующих белок G и белок SH.

2. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по п. 1, отличающийся тем, что указанный штамм содержит последовательность SEQ ID NO. 2.

3. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по п. 1, отличающийся тем, что указанный штамм содержит последовательность SEQ ID NO. 3.

4. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по одному из пп. 1-3, последовательность которого содержит по меньшей мере один экзогенный ген.

5. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по п. 4, где экзогенный ген кодирует вирусный антиген.

6. Применение in vitro ослабленного штамма метапневмовируса человека, происходящего из штамма rC-85473, по п. 4 или 5 в качестве экспрессионного вектора по меньшей мере одного экзогенного гена в клетках-мишенях метапневмовируса человека.

7. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по одному из пп. 1-5 для применения в качестве лекарственного средства в предупреждении и/или лечении инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae.

8. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, для применения по п. 7, для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых метапневмовирусами человека.

9. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, для применения по п. 7, для предупреждения и/или лечения инфекций, вызываемых ортопневмовирусами, такими как респираторно-синцитиальный вирус человека.

10. Ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по п. 4 или 5 для применения в предупреждении и/или лечении инфекций, вызываемых вирусами, чей по меньшей мере один вирусный антиген экспрессируется указанным ослабленным штаммом вируса.

11. Вакцинная композиция для профилактики или лечения инфекций, вызываемых вирусами семейства Pneumoviridae, содержащая, в фармацевтически приемлемом носителе, по меньшей мере один ослабленный штамм метапневмовируса человека, происходящий из штамма rC-85473, по одному из пп. 1-5 в эффективном количестве.

12. Вакцинная композиция по п. 11, дополнительно содержащая адъювант.

13. Вакцинная композиция по п. 11 или 12, отличающаяся тем, что указанная композиция находится в фармацевтической форме, выбранной из порошка, водной суспензии капель или раствора, находящегося под давлением.