Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому классу соединений пиридинсульфонамида и к композициям, включающим указанные соединения. Соединения и композиции (такие как фармацевтические композиции) по настоящему изобретению могут использоваться в качестве лекарственных средств при лечении заболеваний, связанных с интерлейкином 1 бета (IL-1β), таких как воспаление и фиброзирующие заболевания.
Уровень техники изобретения
Было показано, что IL-1 вовлечен в широкий спектр патологий человека от аутовоспалительных заболеваний и до ревматоидного артрита; и средства, блокирующие IL-1 (IL-1Ra, анакира; моноклональное антитело против IL-1b [mAb], сканакинумаб; и моноклональное антитело против IL-1a, MABp1), были одобрены для клинического применения или проходят испытания для применения при некоторых из этих расстройств (Dinarello, 2009; Gabay et al., 2010; Garlanda et al., 2013; Udalova et al., 2016).
IL-1 давно ассоциируется с воспалением и врожденным иммунитетом. На сегодняшний день известно, что этот цитокин играет различные роли в формировании и направленности врожденного иммунитета и воспаления в ответ на различные микробиологические возбудители или экологические проблемы. Более того, в последнее десятилетие доклинические исследования роли IL-1 бета (IL-1β) вышли за рамки исследования классического воспаления для выявления его роли в иммунопатологии, фиброзирующем заболевании, дегенеративном заболевании, сердечно-сосудистом заболевании и раке. Кроме того, клинические исследования эффекта блокирования IL-1β (Aaron et al., 2018; Trankle C.R. et al., 2018; Ridker P.M., 2018; Ridker P.M., 2017) показали, что у более чем 10000 пациентов блокирование IL-1 защищало не только от сердечно-сосудистой смерти, вызванной атеросклерозом, но и от ряда заболеваний, включая рак легких, остеоартрит и подагру. Это открытие, выявляющее разнообразие и в то же время общность механизмов развития заболеваний, позволило сделать предположение, что IL-1 представляет собой парадигму воспаления и иммунитета, а также является заслуживающей внимания мишенью воздействия лекарственных средств (Montovani et al., 2019).
Продуцирование и последующая секреция IL-1β зависит главным образом от активации толл-подобного рецептора 4 (TLR4) и инфламмасомы. На первом этапе воспалительные стимулы или инфекция, передаваемые через TLR4 рецептор, запускают продуцирование про-IL-1β; на втором этапе каспартаза-1, активированная инфламмасомами, протеолитически высвобождает IL-1β в кровоток. Этот цитокин, помимо других важных функций, отвечает за активацию Т-клеток, а также за распознавание антигена. Интересно, что продуцирование IL-1β зависит от действия митоген-активируемой протеинкиназы (mitogen-activated protein kinase -MAPK), группы белков внутри сигнального пути TLR4 рецепторов. MAPK, такие как p38, JNK и ERK, активируют ядерные факторы, которые связываются с промоторами генов, задействованных в продуцировании IL-1β. Таким образом, ингибирование MAPK является обоснованным подходом к предотвращению продуцирования IL-1β в контексте развития воспалительных заболеваний и состояний.
Среди воспалительных заболеваний и состояний, вызываемых IL-1β, наиболее важными являются неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ). Эти заболевания являются неудовлетворенными клиническими потребностями, и существует лишь несколько терапевтических подходов, которые сосредоточены в основном на симптоматическом лечении.
Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)
В частности, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является распространенным заболеванием печени с гистологическими признаками жировой болезни печени, возникающими при употреблении алкоголя, у лиц, которые мало употребляют или совсем не употребляют алкоголь (Yeh M. et al., 2007; Marchesini G. et al., 2003). НАЖБП обусловлена аномальным удерживанием липидов внутри клеток (обычно определяемым как стеатоз), которое чаще происходит в печени, поскольку этот орган в первую очередь отвечает за метаболизм липидов. НАЖБП проявляется в различных гистологических формах, включая стеатоз печени и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), который характеризуется воспалением, стеатозом, некрозом и фиброзом печени вследствие разрушения клеток печени.
Для оценки структуры печени и наличия стеатоза используются различные системы визуализации. Тем не менее, золотым стандартом выявления фиброза остается биопсия печени, хотя этот метод анализа не может использоваться в каждом отдельном исследовании вследствие его инвазивности. Для выявления таких заболеваний печени, как НАЖБП и НАСГ, часто используется неинвазивная оценка биохимии и метаболизма печени (Gressner A. et al., 2009, World J. Gastroenterol.; 15: 2433-2440; Vuppalanchi R. and Chalasani N., 2009, Hepatology; 49: 306-317). При использовании плазмы крови помимо параметров содержания глюкозы в сыворотке, а также параметров инсулинорезистентности обычно выявляется высокий уровень таких ферментов, как аланинаминотрансфераза (Alanine aminotransferase - ALAT), аспартатаминотрансфераза (Aspartate aminotransfersase - ASAT), щелочная фосфатаза (Alkaline Phosphatase - AP) и/или гамма-глутамилтраспептидаза (Gamma Glutamyl Transpeptidase - GGT), а также наличие других белков печеночного происхождения (включая гаптоглобин, общий билирубин, альфа-2-микроглобулин, резистин, расщепленный или интактный цитокератин-18).
Средств эффективного лечения фиброзирующих заболеваний печени, в частности НАЖБП и НАСГ, пока недостаточно. Лечение пациентов с НАСГ не разработано, и в клинических испытаниях тестируется несколько вариантов терапевтического лечения (Vuppalanchi R. and Chalasani N., 2009, Hepatology; 49: 306-317; Dowman J.K. et al., 2009, Q.J. Med.; 103: 71-83). Эти испытания включают применение множества различных семейств химических соединений (фибратов, тиазолидиндионов, бигуанидов, статинов, каннабиноидов) и терапевтических мишеней (ядерных рецепторов, рецепторов ангиотензина, каннабиноидных рецепторов, HMG-CoA редуктазы).
Было показано, что c-Jun экспрессия связана определенным образом с прогрессированием заболевания от стеатоза до НАСГ (Schulien et al., 2019, Cell Death & Differentiation; 26; 1688-1699). Также было показано, что мыши с нокаутом гена JNK1 резистентны к алиментарно индуцированному стеатогепатиту и фиброзу печени и что JNK1 вовлечена в развитие фиброза печени, индуцируя хроническое воспаление (Kodama et al., 2009, Gastroenterology; 137(4); 1467-1477).
В качестве доклинических моделей НАСГ в условиях in vivo были разработаны животные модели мышей (Hansen H. et al., 2017, Drug Discovery Today, 22: 1707-1718). Чаще всего используются мыши линии C57BL/6, поскольку они чувствительны к рациону питания с высоким содержанием жиров и показывают развитие симптомов, которые наблюдаются и у людей, страдающих НАСГ. Известно также, что инъекция стрептозотоцина повышает чувствительность мышей-моделей к рациону с высоким содержанием жиров при развитии НАСГ.
Идиопатический фиброз легких (ИФЛ)
Идиопатический фиброз легких (ИФЛ) представляет собой интерстициальное заболевание легких, характеризующееся хроническим воспалением и последующим прогрессирующим рубцеванием легких. Интерстициальные заболевания легких (ИЗЛ) составляют гетерогенную группу паренхимальных заболеваний легких, характеризующихся различной степенью воспаления и фиброза. Некоторые из них могут возникать вторично по отношению к известному обостряющему фактору, такому как лекарственные средства, аутоиммунное заболевание соединительной ткани, гиперчувствительность к вдыхаемым органическим антигенам или саркоидоз, в то время как причины других идиопатических интерстициальных пневмоний (ИИП) не идентифицированы. Идиопатический фиброз легких (ИФЛ) является одной из наиболее агрессивных форм ИИП, характеризующейся хроническим прогрессирующим фиброзом, связанным с неуклонной регрессией функции легких, прогрессирующей дыхательной недостаточностью и высокой смертностью (Shaney et al., 2018).
В последние годы были разработаны два новых противофибротических терапевтических средства - пирфенидон и нинтеданиб, обеспечивающие лечение большого количества пациентов с ИФЛ. К сожалению, их профиль как модификаторов болезни оставляет желать лучшего, и поэтому сохраняется потребность в новых терапевтических средствах.
Как известно, повышенные уровни IL-1β способствуют образованию провоспалительной и профиброзной среды в легких пациентов, страдающих идиопатическим фиброзом легких (ИФЛ) (Barlo et al., 2011). В доклинических исследованиях на животных моделях фиброза легких было показано, что преходящая экспрессия IL-1β вызывает острое повреждение легких и последующее хроническое заживление, которое приводит к их фиброзу (Kolb M., 2001; Gasse P. et al., 2011). Кроме того, модель повреждения легких, индуцированного блеомицином при ИФЛ, убедительно показала роль IL-1β в фиброзе легких (Hoshino et al., 2009; Burgy et al., 2016).
Роль MAPK в ИФЛ также была в центре внимания исследований на животных и людях, в результате чего был сделан вывод о том, что активированные MAPK в гомогенатах легких пациентов с ИФЛ значительно повышены по сравнению с контролем (Yoshida et al., 2002). Кроме того, ингибирование JNK снижает ремоделирование легких и содержание системных маркеров фиброза в животных моделях ИФЛ (Van del Velden J.L. et al., 2016). Результаты исследований ИФЛ указывают на активированные MAPK и последующее продуцирование IL-1β в качестве одного из основных факторов возникновения и развития ИФЛ.
Таким образом, потребность в новых терапевтических вариантах лечения заболеваний печени и других фиброзирующих расстройств, в частности связанных с фиброзом печени и легких, по-прежнему очевидна и актуальна.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к новому классу соединений формулы I и/или формулы Ia, который включает их фармацевтически приемлемые соли. Соединения по настоящему изобретению предназначены для лечения заболеваний, чувствительных к ингибированию IL-1β, таких как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ).
Соединения по настоящему изобретению представляют собой соединения формулы I или их фармацевтически приемлемые соли:
формула I
где
R1 представляет собой ароматическую или гетероароматическую кольцевую систему, необязательно замещенную одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C1-4 алкил-Y1-, C2-4 алкенил-Y1-, C2-4 алкинил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном, таким как фтор, C2-4 алкенил-Y1-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-Y1, замещенного галогеном, HO-C1-4 алкандиил-Y1-, HO-C2-4 алкендиил-Y1-, HO-C2-4 алкиндиил-Y1-, HO-C1-4 алкандиил-, HO-C2-4 алкендиил-, HO-C2-4 алкиндиил-, C1-4 алкил-C2-4 алкенил-, C2-4 алкинил-, C1-4 алкила, замещенного галогеном, C2-4 алкенил-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-, замещенного галогеном, и галогена;
Y1 выбран из группы, состоящей из O, S, NH, C(O), C(O)O, C(O)NH, O(CO) и NHC(O);
X1 представляет собой NH, O или CH2;
n1 представляет собой 0 или 1;
X3 отсутствует или представляет собой NRy;
Rx и Ry независимо представляют собой C1-4 алкил, C2-4 алкенил, C2-4 алкинил или H, в частности CH3 или H;
L представляет собой O, S, S(O), S(O)2, NH, C(O) или CH2;
Z1, Z2 и Z3 независимо выбраны из N и CH;
R3 выбран из группы, состоящей из H, галогена, C(O)NR2aR2b, C(O)OR2a, OR2a, NR2aR2b, OC(O)R2a, NR2aC(O)R2b, C1-4 алкила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогенов, C2-4 алкенила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогенов, и C2-4 алкинила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогенов, где R2a и R2b независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-4 алкила, C2-4 алкенила и C2-4 алкинила.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению для применения в лечении заболеваний, чувствительных к ингибированию IL-1β, таких как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ).
Краткое описание фигур
Фигура 1. Влияние соединения 5 и соединения 7 на балльную оценку тяжести НАЖБП (NAFLD activity score - NAS).
Фигура 2. Уровни содержания в сыворотке AST (ед./л) после 28 дней лечения.
Фигура 3. Влияние соединений 5 и 7 на соотношение массы печени и массы тела.
Фигура 4. Влияние соединения 7 на уровни содержания гидроксипролина в легких при лечении ИФЛ, индуцированного блеомицином.
Фигура 5A. Общее количество клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (bronchoalveolar lavage fluid - BALF).
Фигура 5B. Лейкоцитарная формула BALF.
Фигура 6A. Балльная оценка тяжести болезни с использованием окрашивания гематоксилином и эозином по Ашкрофту (H&E Ashcroft).
Фигура 6B. Площадь доли коллагена (%) (Collagen Proportion Area - CPA).
Подробное описание изобретения
Определения
В контексте настоящего изобретения термин «C1-4 алкил» предназначен для обозначения линейной или разветвленной углеводородной группы, содержащей от 1 до 4 атомов углерода, такой как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил.
Аналогично, термин «C2-4 алкенил» предназначен для обозначения линейных или разветвленных углеводородных групп, содержащих от 2 до 4 атомов углерода и включающих двойную связь. Примерами алкенильных групп являются винил, аллил и бутенил. Предпочтительными примерами алкенила являются винил и аллил, особенно аллил.
В контексте настоящего изобретения термин «C2-4 алкинил» предназначен для обозначения линейной или разветвленной углеводородной группы, содержащей от 2 до 4 атомов углерода и включающей тройную связь. Иллюстративные примеры C2-4 алкинильных групп включают ацетилен, пропинил, бутинил, а также их разветвленные формы. Ненасыщение (тройная связь) может находиться в любом месте углеродной цепи. Ненасыщенными могут быть несколько связей, так что «C2-4 алкинил» представляет собой диин, как известно специалисту в данной области техники.
В настоящем описании термин «гало» или «галоген» включает фтор, хлор, бром и йод, точнее фтор, хлор и бром.
В контексте настоящего изобретения термин «ароматическое кольцо или ароматическая кольцевая система» предназначен для обозначения полностью или частично ароматического карбоциклического кольца или ароматической кольцевой системы, например фенила, нафтила, 1,2,3,4-тетрагидронафтила, антрацила, фенантрацила, пиренила, бензопиренила, флуоренила и ксантенила.
Термин «гетероароматическое кольцо или гетероароматическая кольцевая система» предназначен для обозначения полностью или частично ароматического карбоциклического кольца или ароматической кольцевой системы, в которых один или несколько атомов углерода замещены гетероатомами, например атомами азота (=N- или -NH-), серы и/или кислорода. Примерами таких групп гетероароматического кольца или гетероароматической кольцевой системы являются оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, пирролил, имидазолил, пиразолил, пиридинил, пиримидинил, пиразинил, пиридазинил, триазинил, кумарил, фурил, тиенил, хинолил, бензотиазолил, бензотриазолил, бензодиазолил, бензооксозолил, фталазинил, фталанил, триазолил, тетразолил, изохинолил, акридинил, карбазолил, дибензазепинил, индолил, бензопиразолил, феноксазонил, бензофуранил, дигидробензофуранил и бензодиоксолил.
В контексте настоящего изобретения термин «гетероциклическое кольцо или гетероциклическая кольцевая система» предназначен для обозначения неароматического карбоциклического кольца или неароматической карбоциклической кольцевой системы, в которых один или несколько атомов углерода замещены гетероатомами, например атомами азота (=N- или -NH-), серы и/или кислорода. Примерами таких гетероциклических групп являются имидазолидин, пиперазин, гексагидропиридазин, гексагидропиримидин, диазепан, диазокан, пирролидин, пиперидин, азепан, азокан, азиридин, азирин, азетидин, пиролин, тропан, оксазинан (морфолин), азепин, дигидроазепин, тетрагидроазепин, гексагидроазепин, оксазолан, оксазепан, оксазокан, тиазолан, тиазинан, тиазепан, тиазокан, оксазетан, диазетан, тиазетан, тетрагидрофуран, тетрагидропиран, оксепан, тетрагидротиофен, тетрагидротиопиран, тиепан, дитиан, дитиепан, диоксан, диоксепан, оксатиан и оксатиепан.
В контексте настоящего изобретения термин «необязательно замещенный» предназначен для обозначения того, что рассматриваемая группа может быть замещенной один или несколько раз, предпочтительно 1-2 раза. Кроме того, термин «необязательно замещенный» также может означать, что рассматриваемая группа является незамещенной.
Соединения по настоящему изобретению могут быть в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли. В контексте настоящего изобретения термин «фармацевтически приемлемая соль» означает соль, образованную основанием или кислотой, в которой образованный противоион по существу не добавляет токсичности соединению по настоящему изобретению .
Примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, сульфат, нитрат, фосфат или гидробромид и т.д., соли органических кислот, такие как ацетат, фумарат, оксалат, цитрат, метансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат или малеат и т.д. Кроме того, когда соединение содержит заместитель, такой как карбоксильная группа, может быть указана соль с основанием (например, соль щелочного металла, такая как натриевая соль, калиевая соль и т.д., или соль щелочно-земельного металла, такая как соль кальция и т.д.).
Соединения
Соединения по настоящему изобретению представляют собой соединения формулы I или их фармацевтически приемлемые соли:
формула I
где
R1 представляет собой ароматическую или гетероароматическую кольцевую систему, необязательно замещенную одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C1-4 алкил-Y1-, C2-4 алкенил-Y1-, C2-4 алкинил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном, таким как фтор, C2-4 алкенил-Y1-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-Y1, замещенного галогеном, HO-C1-4 алкандиил-Y1-, HO-C2-4 алкендиил-Y1-, HO-C2- 4алкиндиил-Y1-, HO-C1-4 алкандиил-, HO-C2-4 алкендиил-, HO-C2-4 алкиндиил-, C1-4 алкил- C2-4 алкенил-, C2-4 алкинил-, C1-4 алкила, замещенного галогеном, C2-4 алкенил-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-, замещенного галогеном, и галогена;
Y1 выбран из группы, состоящей из O, S, NH, C(O), C(O)O, C(O)NH, O(CO) и NHC(O);
X1 представляет собой NH, O или CH2;
n1 представляет собой 0 или 1;
X3 отсутствует или представляет собой NRy;
Rx и Ry независимо представляют собой C1-4 алкил, C2-4 алкенил, C2-4 алкинил или H, например CH3 или H;
L представляет собой O, S, S(O), S(O)2, NH, C(O) или CH2;
Z1, Z2 и Z3 независимо выбраны из N и CH;
R3 выбран из группы, состоящей из H, галогена, C(O)NR2aR2b, C(O)OR2a, OR2a, NR2aR2b, OC(O)R2a, NR2aC(O)R2b, C1-4 алкила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогенов, C2-4 алкенила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогенов, и C2-4 алкинила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогенов, где R2a и R2b независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-4 алкила, C2-4 алкенила и C2-4 алкинила.
В одном варианте осуществления соединение формулы I представляет собой соединение формулы Ia:
где
R1 выбран из группы, состоящей из C1-4 алкил-Y1-, C2-4 алкенил-Y1-, C2-4 алкинил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном, таким как фтор, C2-4 алкенил-Y1-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-Y1, замещенного галогеном, HO-C1-4 алкандиил-Y1-, HO-C2-4 алкендиил-Y1-, HO-C2-4 алкиндиил-Y1-, HO-C1-4 алкандиил-, HO-C2-4 алкендиил-, HO-C2-4 алкиндиил-, C1-4 алкил- C2-4 алкенил-, C2-4 алкинил-, C1-4 алкила, замещенного галогеном, C2-4 алкенил-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-, замещенного галогеном, и галогена;
R2 представляет собой водород; или
R1 вместе с R2 образует ароматическое, гетероароматическое, циклическое или гетероциклическое пяти- или шести-членное кольцо, необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C1-4 алкил-Y1-, C2-4 алкенил-Y1-, C2-4 алкинил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном, таким как фтор, C2-4 алкенил-Y1-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-Y1, замещенного галогеном, HO-C1-4 алкандиил-, HO-C2-4 алкендиил-, HO-C2-4 алкиндиил-, C1-4 алкил- C2-4 алкенил-, C2-4 алкинил-, C1-4 алкила, замещенного галогеном, C2-4 алкенил-, замещенного галогеном, C2-4 алкинил-, замещенного галогеном, и галогена; и
X1, n1, Y1, X3, Rx, Ry, L, Z1, Z2, Z3, R3 принимают значения, определенные для соединения формулы I.
В дополнительном варианте осуществления в соединениях формулы I и формулы Ia X3 представляет собой NRy, что приводит к соединениям формулы II и IIa:
формула II
,
формула IIa
где
X1, n1, Y1, Rx, Ry, L, Z1, Z2, Z3, R1, R2, R3 принимают значения, определенные для соединений формулы I и формулы Ia.
В еще одном дополнительном варианте осуществления в соединениях формулы II и формулы IIa R3 находится в пара-положении, что приводит к соединениям формулы III и формулы IIIa:
формула III
формула IIIa
где
X1, n1, Y1, Rx, Ry, L, Z1, Z2, Z3, R1, R2, R3 принимают значения, определенные для соединений формулы I и формулы Ia.
В еще одном дополнительном варианте осуществления в соединениях формулы III и формулы IIIa Z2 представляет собой CH, что приводит к соединениям формулы IV и IVa:
формула IV
формула IVa
где X1, n1, Y1, Rx, Ry, L, Z1, Z3, R1, R2, R3 принимают значения, определенные для соединений формулы I и формулы Ia.
В одном варианте осуществления соединений по настоящему изобретению Y1 выбран из группы, состоящей из O, S, NH, C(O) и C(O)NH. В дополнительном варианте осуществления Y1 выбран из группы, состоящей из O, S и NH. В еще одном дополнительном варианте осуществления Y1 представляет собой O.
В другом варианте осуществления соединений по настоящему изобретению X1 представляет собой NH или O. В еще одном варианте осуществления X1 представляет собой NH или O, и n1 представляет собой 1.
В дополнительном варианте осуществления соединений по настоящему изобретению Rx и Ry независимо представляют собой C1-4 алкил. В еще одном дополнительном варианте осуществления Rx и Ry представляют собой метил.
В одном варианте осуществления соединений по настоящему изобретению L выбран из группы, состоящей из O, S и CH2. В другом варианте осуществления L выбран из группы, состоящей из O и CH2. В еще одном варианте осуществления L представляет собой O.
В дополнительном варианте осуществления соединений по настоящему изобретению Z1 представляет собой CH. В еще одном варианте осуществления Z1 представляет собой CH, и L представляет собой O. В еще одном дополнительном варианте осуществления Z1 представляет собой CH, Z2 представляет собой CH, и L представляет собой O.
В другом варианте осуществления соединений по настоящему изобретению R3 выбран из группы, состоящей из H, галогена и C(O)NH2. В еще одном варианте осуществления R3 выбран из группы, состоящей из галогена и C(O)NH2. В еще одном варианте осуществления R3 выбран из группы, состоящей из Cl и C(O)NH2. В дополнительном варианте осуществления R3 представляет собой Cl.
В одном варианте осуществления соединений по настоящему изобретению в формуле Ia, IIa, IIIa или IVa R2 представляет собой H.
В другом варианте осуществления соединения формулы IVa представляют собой соединения представленной ниже формулы V:
где X1, Y1, Rx, Ry, R1 и R3 принимают значения, определенные для соединений формулы I и формулы Ia. В дополнительном варианте осуществления соединений формулы V X1 представляет собой O, R1 представляет собой C1-4 алкил-O-, R3 представляет собой галоген или C(O)NH2, и Rx и Ry независимо представляют собой C1-4 алкил.
В предпочтительном в настоящее время варианте осуществления соединение по настоящему изобретению выбрано из группы, состоящей из следующих соединений:
.
Фармацевтический препарат
Соединения по настоящему изобретению предназначены для применения в качестве лекарственного средства. Соединения по настоящему изобретению в принципе могут применяться сами по себе, но предпочтительно их вводить в препарат с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой инертный носитель, подходящий для каждого способа введения, и может вводиться в традиционный фармацевтический препарат (таблетки, гранулы, капсулы, порошок, раствор, суспензию, эмульсию, препарат для инъекции, препарат для инфузии и т.д.). В качестве такого носителя можно упомянуть, например, связующее вещество, эксципиент, смазывающее вещество, дезинтегрирующее вещество и т.п., которые являются фармацевтически приемлемыми. Когда соединения по настоящему изобретению используются в виде раствора для инъекций или инфузионного раствора, эти препараты могут приготавливаться с использованием дистиллированной воды для инъекций, физиологического раствора или водного раствора глюкозы.
Способ введения соединений по настоящему изобретению конкретно не ограничен, и может применяться обычный способ перорального или парентерального введения (внутривенный, внутримышечный, подкожный, чрескожный, интраназальный, трансмукозальный, энтеральный и т.д.).
Дозировка производных тетрагидроизохинолина или их фармацевтически приемлемой соли по настоящему изобретению необязательно может быть установлена в диапазоне эффективного количества, достаточного для проявления фармакологического эффекта в соответствии с эффективностью или характеристиками соединения, которое будет использоваться в качестве активного ингредиента. Дозировка может варьироваться в зависимости от способа введения, возраста, массы тела или состояния здоровья пациента.
Фармацевтическое применение
Соединения по настоящему изобретению предназначены для лечения заболеваний, чувствительных к ингибированию IL-1β, таких как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ). Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению или композиции по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к соединению или композиции по настоящему изобретению для применения при лечении заболеваний, чувствительных к ингибированию IL-1β, таких как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ). В одном варианте осуществления заболевание, чувствительное к ингибированию IL-1β, выбрано из группы, состоящей из неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), идиопатического фиброза легких (ИФЛ), аутовоспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, остеоартрита, рака легких и подагры. В еще одном варианте осуществления заболевание представляет собой НАСГ. В еще одном варианте осуществления заболевание представляет собой ИФЛ.
Получение соединений, в которых X1 представляет собой NRy
Замещенные пиридин-сульфонамиды формулы II и IIa по настоящему изобретению обычно синтезируют через промежуточное соединение C, которое получают в соответствии со схемой 1:
Схема 1
На первой стадии 5,6-дихлорпиридин-3-сульфонамид A подвергается алкилированию с получением промежуточного соединения B, которое затем подвергается превращению в соединение С с помощью реакции Бухвальда с соответствующим бициклическим амином при микроволновом облучении.
В зависимости от значений переменных Rx, Ry и R3, для получения промежуточного соединения C помимо превращений, представленных на схеме 1, могут потребоваться дополнительные синтетические превращения, такие как реакции введения/удаления защиты.
В зависимости от наличия и/или значения X1 соединения по настоящему изобретению могут быть получены в соответствии со схемами 2b, 2c или 2d.
Схема 2b - Синтез соединения типа IIb
Pd-катализируемая реакции Бухвальда промежуточного соединения C с подходящей бороновой кислотой при 150°C при микроволновом облучении приводит к получению соединений типа IIb (таких как соединение 1; методика синтеза представлена в публикации Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21(10), 3152-3158).
Схема 2c - Синтез соединения типа IIc
Pd-катализируемая реакция Бухвальда промежуточного соединения C с замещенными анилинами при 40°C в присутствии сильного основания приводит к получению соединений типа IIc (таких как соединения 2, 3, 4, 6; методика синтеза представлена в публикации Org. Lett. 2011, 13(8), 1984-1987).
Схема 2d - Синтез соединения типа IId
Соединения типа IId (такие как соединения 5, 7, 8, 9, 10, 12) получают в соответствии с реакцией Ульмана (Ullman) промежуточного соединения C с соответствующим фенолом в присутствии гидрида натрия и карбоната цезия при 150ºC с использованием микроволнового облучения (методика синтеза представлена в публикации в J. Am. Chem. Soc. 2013, 135(24), 9213-9219).
Получение соединений, в которых X3 отсутствует
Замещенные пиридинсульфонамиды формулы I и Ia по настоящему изобретению, где X3 отсутствует, обычно синтезируют через промежуточное соединение E, которое получают в соответствии со схемой 3:
Схема 3 - Методика синтеза соединения E
Синтез конечного соединения 11 проводится в соответствии с методикой, аналогичной методике получения соединения C, но с использованием в качестве исходного вещества соединения D, например 2,3-дихлор-5-(метилсульфонил)пиридина.
Примеры
Пример 1 - Синтез промежуточного соединения B, где Rx и Ry представляют собой метил: N,N-диметил-5,6-дихлорпиридин-3-сульфонамид
К суспензии коммерчески доступного 5,6-дихлорпиридин-3-сульфонамида A (1 экв.) и K2CO3 (2 экв.) в безводном ДМФА (1 мл/экв.) добавляют йодметан (2 экв.) в ДМФА (5 мл/ммоль) и перемешивают полученную смесь при комнатной температуре до завершения реакции (в течение ночи, ТСХ контроль). После этого растворитель удаляют испарением и добавляют этилацетат. Органическую смесь дважды промывают водой и сушат органический слой над сульфатом магния. После испарения растворителя полученный сырой продукт является достаточно чистым для использования в примере 2 без дополнительной очистки (твердое вещество желтого цвета, выход 95%).
Пример 2 - Синтез промежуточного соединения C, где Rx и Ry представляют собой метил, Z1, Z2, Z3 представляют собой CH, L представляет собой O, и R3 представляет собой Cl в пара- положении: N,N-диметил-5-хлор-6-(4-(4-хлорфенокси)-N-пиперидинил)пиридин-3-сульфонамид
Смесь соединения, полученного в примере 1 (1 экв.), коммерчески доступного гидрохлорида 4-(4-хлорфенокси)пиперидина (1,2 экв.) и TEA (2,2 экв.) в EtOH (4,8 мл/ммоль) нагревают сначала до 80ºC и выдерживают в течение 5 минут и затем до 120°С и выдерживают в течение 30 минут при микроволновом облучении (200 Вт) (ВЭЖХ контроль). Затем растворитель удаляют испарением и к остатку добавляют этилацетат; органическую смесь дважды промывают водой и объединенные органические слои сушат над сульфатом магния. После удаления растворителя испарением полученный сырой продукт является достаточно чистым для применения в последующих примерах без дополнительной очистки (твердое прозрачное вещество коричневого цвета, выход 91%).
Пример 3 - Синтез промежуточного соединения C, где Rx и Ry представляют собой метил, Z1, Z3 представляют собой CH, Z2 представляет собой N, L представляет собой O, и R3 представляет собой C(O)NH2 в пара- положении: N,N-диметил-5-хлор-6-[4-(5-[2-карбоксамидопиридин]илокси)-N’-пиперидинил]пиридин-3-сульфонамид
Смесь соединения, полученного в примере 1 (1 экв.), коммерчески доступного 4-(пиперидин-4-илокси)пиридин-2-карбоксамида (1,2 экв.) и TEA (2,2 экв.) в EtOH (4,8 мл/ммоль) нагревают сначала до 80°C и выдерживают в течение 5 минут, затем до 120°C и выдерживают в течение 30 минут при микроволновом облучении (200 Вт) (ВЭЖХ контроль). Затем растворитель удаляют испарением и к остатку добавляют этилацетат; органическую смесь промывают два раза водой и объединенные органические слои сушат над сульфатом магния. После удаления растворителя испарением полученный сырой продукт является достаточно чистым для применения в следующей стадии без дополнительной очистки (твердое белое прозрачное вещество, выход 93%).
Пример 4 - Синтез соединения 1
Раствор промежуточного соединения, полученного в примере 2 (1 экв.), бензо[b]фуран-5-бороновой кислоты (1,1 экв.), карбоната калия (1,4 экв.) и Pd(PhPh3)4 (0,1 экв.) в DME (5 мл/ммоль) нагревают до 150°C при микроволновом облучении (200 Вт) и выдерживают в указанных условиях в течение 1 часа (или в течение ночи при 150ºC). Затем сырую смесь разбавляют EtOAc, фильтруют через слой целита (Celite), промывают EtOAc и MeOH и растворитель удаляют выпариванием. Полученный сырой продукт очищают с использованием системы Isolera Biotage (C18, ацетонитрил/вода) с получением чистого продукта (белая пена, общий выход 45%, ВЭЖХ чистота 98%).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,51 (д, 1H), 7,68 (д, 1H), 7,33 (с, 1H), 7,27 (с, 1H), 7,22 (д, 2H), 6,86-6,81 (м, 3H), 4,64 (т, 2H), 4,42-4,38 (м, 2H), 3,61-3,55 (м, 2H), 3,27 (т, 2H), 3,19-3,18 (м, 2H), 2,76 (с, 6H), 1,94-1,89 (м, 2H), 1,76-1,70 (м, 2H); C26H29ClN3O4S.
МС (электроспрей): m/z=514,1583 (M+1).
Пример 5 - Синтез соединения 2
В пробирку с завинчивающейся крышкой, снабженную магнитной мешалкой, загружают предкатализатор BrettPhos (4% моль), 2,3-дигидробензо[b]фуран-5-амин (1 экв.) и промежуточное соединение, полученное в примере 2 (1 экв.). Пробирку герметично закрывают тефлоновой завинчивающейся крышкой, в пробирке создают вакуум и затем снова заполняют ее азотом; эту процедуру повторяют еще два раза. Затем добавляют LiHMDS (1M в ТГФ, 2,5 экв.). Реакционную смесь перемешивают при 40°C до завершения реакции (2,5 часа). Раствору дают возможность охладиться до комнатной температуры, реакцию гасят добавлением насыщенного водного раствора NH4Cl (5 мл) и затем разбавляют EtOAc. Органическую фазу отделяют и водную фазу экстрагируют еще один раз EtOAc. Объединенные органические фазы промывают насыщенным раствором соли и сушат над MgSO4. Растворитель удаляют при пониженном давлении и сырой продукт очищают с помощью системы Isolera Biotage (C18, ацетонитрил/вода) с получением содержащего примеси продукта (115,7 мг), который снова очищают с использованием указанной системы с получением продукта (твердое вещество коричневого цвета, общий выход 6%, ВЭЖХ чистота 96% (254 нм)).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,34 (с, 1H), 7,96 (уш.с, 1H), 7,24 (дд, 2H), 7,03 (с, 1H), 6,96 (дд, 1H), 6,85-6,79 (м, 3H), 5,88 (с, 1H), 4,63 (т, 2H), 4,48 (м, 1H), 3,76-3,73 (м, 2H), 3,45 (м, 2H), 3,23 (т, 2H), 2,80 (с, 6H), 1,99-1,94 (м, 2H), 1,82 (м, 2H); C26H30ClN4O4S.
МС (электроспрей): m/z= 529,1677 (M+1).
Пример 6 - Синтез соединения 5
2,3-Дигидро-5-гидроксибензо[b]фуран (1,1 экв.) и карбонат цезия (1,2 экв.) переносят в безводный ДМФА (1,2 мл/ммоль) и обрабатывают чистым гидридом натрия (1,1 экв.). После прекращения выделения водорода добавляют промежуточное соединение, полученное в примере 2 (1 экв.), и перемешивают реакционную смесь при 150°C до прекращения дальнейшего развития реакции в герметичной толстостенной пробирке (в течение ночи) или при микроволновом облучении (200 Вт) (2 часа). Затем растворитель удаляют в вакууме, сырой продукт разбавляют этилацетатом (6 мл/ммоль) и водой (6 мл/ммоль). Водный слой трижды экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают 2N раствором NaOH, сушат и концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью системы Isolera Biotage (C18, элюирование с градиентом: ацетонитрил-вода) с получением сырого продукта, который очищают препаративной хроматографией (диоксид кремния, гксан/этилацетат 4:1) с получением чистого продукта (прозрачное масло, общий выход 12%, ВЭЖХ чистота 100% (254 нм)).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,30 (дд, 1H), 7,247-7,22 (м, 3H), 6,86-6,81 (м, 3H), 6,75-6,70 (м, 2H), 4,61 (т, 2H), 4,50-4,47 (м, 1H), 4,00-3,97 (м, 2H), 3,66-3,63 (м, 2H), 3,21 (т, 2H), 2,67 (с, 6H), 2,06-1,99 (м, 2H), 1,90-1,84 (м, 2H); C26H28ClN3O5S.
МС (электроспрей): m/z=530,1550 (M+1).
Пример 7 - Синтез соединения 7
4-Этоксифенол (1,1 экв.) и карбонат цезия (1,2 экв.) переносят в безводный ДМФА (1,2 мл/ммоль) и обрабатывают чистым гидридом натрия (1,1 экв.). После окончания выделения водорода добавляют промежуточное соединение, полученное в примере 2 (1 экв.), и перемешивают реакционную смесь при 150ºC до прекращения дальнейшего развития реакции в герметичной толстостенной пробирке (в течение ночи) или при микроволновом облучении (200 Вт, 2 часа). Затем растворитель удаляют в вакууме, сырой продукт разбавляют этилацетатом (6 мл/ммоль) и водой (6 мл/ммоль). Водный слой трижды экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают 2N раствором NaOH, сушат и концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью системы Isolera Biotage (C18, элюирование с градиентом: ацетонитрил-вода), разделяя непрореагировавшие исходные вещества и чистый продукт (твердое прозрачное вещество коричневого цвета, выход 41%, ВЭЖХ чистота 100% (254 нм)).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,31 (д, 1H), 7,26-7,23 (м, 4H), 6,88-6,84 (м, 5H), 4,51-4,46 (1H, м), 4,05-4,00 (м, 4H), 3,66-3,59 (м, 2H), 2,67 (с, 6H), 2,00-1,86 (м, 2H), 1,86-1,83 (м, 2H), 1,43 (т, 3H); C26H30ClO5S.
МС (электроспрей): m/z= 532,1680 (M+1).
Пример 8 - Синтез соединения 8
4-Этоксифенол (1,1 экв.) и карбонат цезия (1,2 экв.) переносят в безводный ДМФА (1,2 мл/ммоль) и обрабатывают чистым гидридом натрия (1,1 экв.). После прекращения выделения водорода добавляют промежуточное соединение, полученное в примере 3 (1 экв.), и перемешивают реакционную смесь при 150°C до прекращения дальнейшего развития реакции в герметичной толстостенной пробирке (в течение ночи) или при микроволновом облучении (200 Вт) (3 часа). Растворитель удаляют в вакууме и сырой продукт разбавляют этилацетатом (6 мл/ммоль) и водой (6 мл/ммоль). Водный слой трижды экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают 2N раствором NaOH, сушат и концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью системы Isolera Biotage (C18, элюирование с градиентом: ацетонитрил-вода), разделяя непрореагировавшие исходные вещества и чистый продукт (твердое прозрачное вещество коричневого цвета, выход 16%, ВЭЖХ чистота 100% (254 нм)).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,38 (д, 1H), 8,34 (с, 1H), 6,98-6,97 (м, 1H), 6,89 (с, 1H), 5,59 (уш.с, 1H), 4,79-4,75 (м, 1H), 4,06-3,63 (м, 4H), 3,69-3,63 (м, 2H), 2,68 (с, 6H), 2,10-2,06 (м, 2H), 1,92-1,88 (м, 2H), 1,44 (т, 3H); C26H31N5O6S.
МС (электроспрей): m/z= 542,2084 (M+1).
Пример 9 - Синтез соединения 12
2,3-Дигидро-5-гидроксибензо[b]фуран (1,1 экв.) и карбонат цезия (1,2 экв.) переносят в безводный ДМФА (1,2 мл/ммоль) и обрабатывают чистым гидридом натрия (1,1 экв.). После прекращения выделения водорода добавляют промежуточное соединение, полученное в примере 3 (1 экв.), и перемешивают реакционную смесь при 150°C до прекращения дальнейшего развития реакции в герметичной толстостенной пробирке (в течение ночи) или при микроволновом облучении (200 Вт) (2,5 часа). Затем растворитель удаляют в вакууме и сырой продукт разбавляют этилацетатом (6 мл/ммоль) и водой (6 мл/ммоль). Водный слой трижды экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают 2N раствором NaOH, сушат и концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью системы Isolera Biotage (C18, элюирование с градиентом: ацетонитрил-вода), разделяя непрореагировавшие исходные вещества и чистый продукт (белая пена, выход 13%, ВЭЖХ чистота 98% (254 нм)).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,38 (д, 1H), 8,31 (д, 1H), 7,24 (д, 1H), 6,97-6,96 (м, 1H), 6,82 (д, 1H), 6,76-6,69 (м, 2H), 5,63 (уш.с, 1H), 4,79-4,76 (м, 2H), 4,62 (т, 2H), 4,02-4,00 (м, 2H), 3,68-3,63 (м, 2H), 3,22 (т, 2H), 2,68 (с, 6H), 2,12-2,08 (м, 2H), 1,93-1,89 (м, 2H); C26H29N5O6S.
МС (электроспрей): m/z= 540,1944 (M+1).
Пример 10 - Синтез промежуточного соединения E, в котором Rx представляет собой метил, Z1, Z2, Z3 представляют собой CH, L представляет собой O, и R3 представляет собой Cl в пара -положении: 3-хлор-2-[4-(4-хлорфенокси)-N-пиперидинил]-5-метилсульфонилпиридин
Указанное в заголовке соединение (твердое белое вещество, общий выход 96%) получают в соответствии с методикой получения промежуточного соединения, описанной в примере 2, но используя коммерчески доступный 2,3-дихлор-5-(метилсульфонил)пиридин в качестве исходного вещества.
Пример 11 - Синтез соединения 11
Соединение получают (6 часов; прозрачное масло, общий выход 16%, ВЭЖХ чистота 95% (254 нм)) в соответствии с методикой синтеза соединений 5, 7, 8 и 12 примеров 6-9, но с использованием промежуточного соединения, полученного в примере 10, в качестве исходного вещества.
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ (м.д.) = 8,45 (c, 1H), 7,35 (д, 1H), 7,26 (дд, 2H), 6,85 (д, 2H), 4,52-4,48 (м, 1H), 4,04-4,00 (м, 4H), 3,72-3,66 (м, 2H), 3,01 (с, 3H), 2,05-1,99 (м, 2H), 1,90-1,84 (м, 2H), 1,43 (т, 3H); C25H28ClN2O5S.
МС (электроспрей): m/z=503,1398 (M+1).
Пример 12 - Ингибирование IL-1β in vitro в первичных макрофагах человека, стимулированных липополисахаридами (ЛПС)
Материалы
Получение ростовой среды RPMI 1640
Базальную среду RPMI 1640 получают в соответствии с инструкциями производителя на листке технических данных. Проверку стерильности проводят, используя 5 мл среды в течение 48 часов при 37°C в инкубаторе с постоянной подачей 5% CO2. После проверки стерильности базальную среду делают полной, добавляя FBS и антибиотик пеницилин/стрептомицин. Среду хранят при 4°C до дальнейшего использования.
Получение фосфатно-буферного раствора (PBS)
Один пакетик с сухим PBS растворяют в литре Milli-Q воды. PBS фильтруют через фильтровальную мембрану 0,22 мкм и хранят при 4°C до дальнейшего использования.
Получение мононуклеарных клеток периферической крови (peripheral blood mononuclear cells - PBMC)
5 мл RPMI среды без сыворотки (1:1) добавляют к образцу 5 мл цельной крови человека в ЭДТК или цитрате натрия и тщательно смешивают переворачиванием. В коническую пробирку объемом 15 мл центрифуги добавляют 3 мл Histopaque-1077 и выдерживают до достижения комнатной температуры. С помощью пипетки для переноса материала 10 мл смеси кровь-RPMI осторожно наслаивают на Histopaque-1077 и центрифугируют при 400×g в течение ровно 30 минут при комнатной температуре.
После центрифугирования верхний слой в пределах 0,5 см от непрозрачной границы раздела, содержащей мононуклеарные клетки, аспирируют с помощью пипетки Пастера. Верхний слой удаляют. С помощью пипетки Пастера непрозрачную границу раздела осторожно переносят в чистую коническую пробирку центрифуги. В пробирку добавляют 5 мл RPMI и смешивают переворачиванием с последующим центрифугированием при 250×g строго в течение 10 минут. Супернатант аспирируют и удаляют.
Пеллет лейкоцитов снова суспендируют в 5 мл RPMI, осторожно смешивают с использованием пипетки Пастера с последующим центрифугированием при 250×g строго в течение 10 минут.
Пеллет промывают 3 раза PBS и снова суспендируют в RPMI среде.
Подсчитывают количество жизнеспособных PBMC/мл.
Подсчет количества PBMC
10 мкл суспензии PBMC разбавляют 90 мкл PBS среды (разбавление 1:10). 20 мкл клеточной суспензии добавляют к 20 мкл раствора триптанового синего (соотношение 1:1) и осторожно смешивают для предотвращения образования аэрозоля. В гемоцитометр загружают смесь клеточных культур до тех пор, пока область под покровным стеклом не заполнится в достаточной степени. Перед подсчетом суспензии дают возможность осадиться в гемоцитометре в течение по меньшей мере 10 секунд.
В четырех квадратах с прямыми углами размером 1 мм одной камеры подсчитывают количество жизнеспособных клеток, а также количество мертвых клеток. Жизнеспособные клетки прозрачны; нежизнеспособные клетки окрашены в синий цвет. При расчете учитывают клетки, которые касаются верхней линии или вертикальной линии периметра любого прямоугольного квадрата. Клетки, которые касаются нижней или правой вертикальной линии периметра любого прямоугольного квадрата, не учитывают.
Расчет количества клеток
Расчет количества жизнеспособных PBMC/мл:
PBMC/мл=PBMC во всех четырех квадратах × 10 × 2 × 104/4
104=Коэффициент пересчета объема до 1 мл;
10=коэффициент разбавления клеточной суспензии;
2=коэффициент разбавления триптанового синего.
Общее количество клеток=PBMC/мл × общий объем (мл) суспензии PBMC
% жизнеспособности клеток = (Подсчитанное количество жизнеспособных клеток/общее количество клеток (жизнеспособные+мертвые)) × 100.
Посев, дифференцировка и лечение клеток
2×105 PBMC при общем объеме 200 мкл/лунка помещают в 96-луночный микропланшет и инкубируют в инкубаторе в течение 4 часов при 37°C в атмосфере СO2 для осаждения моноцитов, оставляя лимфоциты в суспензии. После инкубации из каждой лунки аспирируют по 100 мкл для гарантированного удаления популяции лимфоцитов.
Моноциты дифференцируют в макрофаги добавлением 200 нг/мл рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ (4 мг/мл - исходный раствор) и инкубируют смесь при 37°C/5% CO2 в течение 6 часов. Среду меняют каждые два дня, удаляя половину объема среды в лунке и повторно дополняя свежей полной средой RPMI и рекомбинантным человеческим ГМ-КСФ.
После дифференцировки клетки обрабатывают в дубликатах соединением по настоящему изобретению в общем объеме 50 мкл, поддерживая конечный ДМСО процентиль 0,5%. Планшет переносят в инкубатор при 37°C/5% CO2 и выдерживают в течение 2 часов. Клетки стимулируют 100 нг/мл ЛПС (4×) (1 мг/мл - исходный раствор) в общем объеме 50 мкл.
Планшет переносят в инкубатор при 37°C/5% CO2 и выдерживают в течение 16 часов.
Оценка цитокинов с помощью метода твердофазного ИФА
1. Каждую лунку предварительно покрытого планшета для ИФА аспирируют и промывают промывным буфером (0,05% Tween 20 в PBS; pH 7,2-7,4) заполнением каждой лунки промывным буфером (300 мкл). Процесс повторяют два раза, выполняя всего три промывки. Жидкость полностью удаляют на каждой стадии. После последней промывки весь оставшийся буфер удаляют.
2. Планшеты блокируют добавлением 300 мкл блокирующего буфера (1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в PBS) в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
3. Стадию аспирации/промывки, как на 1 стадии, повторяют.
4. Добавляют 100 мкл образца или стандарта, приготовленные в разбавителе реагентов (0,1% BSA, 0,05% Tween 20 в PBS, pH 7,2-7,4). Лунки покрывают липкой лентой и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре.
5. Аспирацию/промывку, как на стадии 1, повторяют.
6. В каждую лунку добавляют по 100 мкл детекторного антитела, разбавленного разбавителем реагентов. Лунки покрывают новой липкой лентой и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре.
7. Аспирацию/промывку, как на стадии 1, повторяют.
8. В каждую лунку добавляют 100 мкл рабочего разбавления (1:200 от исходного раствора) и стрептавидин-HRP. Планшет покрывают и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре.
9. В каждую лунку добавляют 100 мкл субстратного раствора (1:1 смесь H2O2 и тетраметилбензидина) и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре.
10. В каждую лунку добавляют 50 мкл стоп-реагента (2N H2SO4). По планшету осторожно постукивают для обеспечения тщательного перемешивания.
11. Оптическую плотность каждой лунки сразу определяют с использованием микропланшет-ридера (Spectramax Plus), установленного на 450 нм.
Оценка жизнеспособности цитокинов
В планшеты для анализа добавляют люминисцентный реагент CellTiter-Glo® в объеме 100 мкл/лунка и инкубируют планшеты при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере для планшетов. После инкубирования в каждой лунке определяют величину люминисцентного сигнала с использованием микропланшет-ридера (Perkin Elmer ENVISION 2104).
Данные анализа
%Ингибирования тестируемыми соединениями определяют с использованием следующей формулы:
%Ингибирования=100-(100*(Среднее количество с использованием тестируемых соединений - Среднее количество, полученное с использованием отрицательного контроля)/(Среднее количество, полученное с использованием положительного контроля - Среднее количество, полученное с использованием отрицательного контроля))
Все «вычисленные значения» в данной формуле получают из «значений оптической плотности», определенных как описано выше с использованием микропланшет-ридера (стадия 11).
Цитотоксичность тестируемых соединений определяют с использованием следующей формулы:
%Цитотоксичности=100-(100*(Среднее количество, полученное с использованием теституемых соединений - Среднее количество, полученное с использованием отрицательного контроля)/(Среднее количество, полученное с использованием положительного контроля - Среднее количество, полученное с использованием отрицательного контроля))
Все «количества», указанные в этой формуле, получены из «люминисцентного сигнала», определенного как описано в разделе оценки жизнеспособности цитокинов.
Результаты
(ингибирование IL-1β)
Пример 13 - Связывание in vitro JNK1 (MAPK8)
Рекомбинантные человеческие MAPK8, растворенные в воде в различных концентрациях, вручную печатают на оголенном чипе, покрытом золотом (плотность 47 нм) PlexArray Nanocapture Sensor (Plexera Bioscience, Seattle, WA, US) при 40% влажности. Каждую концентрацию печатают в двух экземплярах, и каждое пятно содержит 0,2 мкл раствора белка. Чип инкубируют при 80% влажности и 4°C в течение ночи и промывают 10 × фосфатно-солевым буфером с твином (PBST) в течение 10 минут, 1 × PBST в течение 10 минут и дважды деионизованной водой в течение 10 минут. После этого чип блокируют 5% (масс./об.) обезжиренным молоком в воде в течение ночи, затем промывают 10 × PBST в течение 10 минут, 1 × PBST в течение 10 минут и деионизованной водой два раза в течение 10 минут, после чего сушат в потоке азота перед использованием.
Измерения с использованием поверхностной плазмонно-резонансной томографии (Surface Plasmon Resonance Imaging - SPRi) выполняют с помощью PlexAray HT (Plexera Bioscience, Seattle, WA, US). Колимированный свет (660 нм) проходит через связывающую призму, отражается от SPR-активной золотой поверхности и воспринимается CCD камерой. Буферы и образцы впрыскивают с помощью непульсивного поршневого насоса в проточную ячейку с потоком 30 мкл, установленную на связывающей призме. Каждый цикл измерения состоит из четырех стадий: промывка проточным буфером PBST при постоянной скорости 2 мкл/с для получения стабильного исходного уровня, инъекция образца со скоростью 5 мкл/с для связывания, промывка поверхности PBST при 2 мкл/с в течение 300 секунд и регенерация 0,5% (об./об.) H3PO4 при 2 мкл/с в течение 300 секунд. Все измерения проводят при 4°C.
Изменения сигнала после связывания и промывки записывают в AU в качестве значения анализа. Выбранные области с привитым белком анализируют на снимках SPR, и значения средних изменений отражательной способности выбранных областей используют для построения графика как функции времени. Сигналы связывания в реальном времени записывают и анализируют с помощью Data Analysis Module (DAM, Plexera Bioscience, Seattle, WA, US). Кинетический анализ проводят с использованием программного обеспечения BIAevaluation 4.1 (Biacore, Inc.).
Равновесная константа диссоциации (значение KD), определенная для соединения 7, составляет 3,41×10-8 M. (Ka= 2,29×104 M-1·с-1, Kd=7,82×10-4 с-1).
Пример 14 - Связывание p38 MAPK в условиях in vitro
р38 MAPK, растворенный в воде в различных концентрациях, вручную печатают на оголенном чипе, покрытом золотом (плотностью 47 нм) PlexArray Nanocapture Sensor (Plexera Bioscience, Seattle, WA, US) при 40% влажности. Каждую концентрацию печатают в двух экземплярах, и каждое пятно содержит 0,2 мкл раствора белка. Чип инкубируют при 80% влажности и 4°C в течение ночи и промывают 10 × PBST в течение 10 минут, 1 × PBST в течение 10 минут и дважды деионизованной водой в течение 10 минут. После этого чип блокируют 5% (масс./об.) обезжиренным молоком в воде в течение ночи и промывают 10×PBST в течение 10 минут, 1×PBST в течение 10 минут и деионизованной водой два раза в течение 10 минут, затем сушат в потоке азота перед использованием.
Измерения с использованием поверхностной плазмонно-резонансной томографии (SPRi) выполняют с помощью PlexAray HT (Plexera Bioscience, Seattle, WA, US). Колимированный свет (660 нм) проходит через связывающую призму, отражается от SPR-активной поверхности золота и воспринимается CCD камерой. Буферы и образцы впрыскивают с помощью непульсивного поршневого насоса в проточную ячейку с потоком 30 мкл, установленную на связывающей призме. Каждый цикл измерения состоит из четырех стадий: промывка проточным буфером PBST при постоянной скорости 2 мкл/с для получения стабильного исходного уровня, инъекция образца при 5 мкл/с для связывания, промывка поверхности PBST при 2 мкл/с в течение 300 секунд и регенерация с помощью 0,5% (об./об.) H3PO4 при 2 мкл/с в течение 300 секунд. Все измерения проводят при 4°C.
Изменения сигнала после связывания и промывки (в AU) записывают в качестве результата анализа. Выбранные области с привитым белком анализируют на снимках SPR и на основании полученных значений строят график средних изменений отражательной способности выбранных областей как функцию времени. Сигналы связывания в реальном времени записывают и анализируют с помощью Data Analysis Module (DAM, Plexera Bioscience, Seattle, WA, US). Кинетический анализ проводят с использованием программного обеспечения BIAevaluation 4.1 (Biacore, Inc.).
Равновесная константа диссоциации (значение KD), определенная для соединения 7, составляет 1,19×10-8 M. (Ka= 2,08×104 M-1·с-1, Kd=2,48×10-4с1).
Пример 15: Действие соединения 5 и 7 при лечении неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) у самцов мышей линии C57BL/6
Индуцирование развития НАСГ
Для исследования отбирают мышей с известным сроком беременности (n=30). Новорожденным мышам на 2-й день после рождения (post-natal day 2 - PND-2) подкожно вводят 2200 мкг стрептозотоцина и оставляют их с матерью до достижения ими возраста отъема от вскармливания молоком матери. После отъема отбирают мышей-самцов и кормят их с использованием рациона питания с содержанием жиров 60% ккал (исследовательская диета-D12492) в течение следующих 2 недель. Всех животных обследуют дважды в день для обнаружения клинических симптом.
Методика исследования
Мышам вводят носитель, исследуемые соединения и контрольное соединение (элафибранор) дважды в день - утром (9,00 AM) и вечером перед началом цикла темноты (6:00 PM) в дни от 0 до 28.
Измерение массы тела животных проводят ежедневно в течение всего эксперимента.
Испытываемые и контрольные соединения вводят животным в течение 28 дней (с 6 по 10 неделю).
Содержание глюкозы в крови оценивают перед началом лечения и в конце - на 28 день. Уровни содержания в сыворотке аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) измеряют в плазме перед началом лечения и на 28-й день.
Гистопатологический анализ ткани печени включает окрашивание гематоксилином и эозином (hematoxylin & eosin - H&E), трихомное окрашивание по Массону и окрашивание масляно-красным-О (Oil-Red-O - ORO).
Анализ образцов
Балльная оценка тяжести неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП): H&E окрашивание
Все окрашенные H&E тканевые срезы исследуют с помощью оптической микроскопии. В соответствии с приведенной ниже системой балльной оценки (Kleiner et al., 2005) с использованием объектива с линзами 200×, балльную оценку НАЖБП проводят, оценивая стеатоз, лобулярное воспаление и баллонирование печени.
Измерение площади доли коллагена (Collagen Proportion Area - %CPA): трихомное окрашивание по Мейссону
Все срезы тканей, трихомно окрашенных по Мейссону, исследуют с помощью оптической микроскопии с использованием объектива с линзами 100×. На произвольно выбранных пяти областях (приблизительно 684,85 мкм × 917,11 мкм на область) из каждой печени измеряют площадь доли коллагена с использованием программного обеспечения Image Pro Premier 9.1. Процент, который составляет площадь доли коллагена, вычисляют делением площади доли коллагена на общую площадь среза ткани.
Измерение процента окрашенной площади: масляно-красное О-окрашивание
Все срезы тканей, окрашенных масляно-красным О-красителем, исследуют с помощью оптической микроскопии с использованием объектива с линзами 100×. В случайно выбранных пяти областях (приблизительно 688,33 мкм × 922,45 мкм на область) из каждой печени измеряют окрашенную область с использованием программного обеспечения Image Pro Premier 9.1. Процент, который составляет окрашенная площадь, вычисляют делением площади окрашенной липидной ткани на общую площадь ткани.
Влияние соединения 5 и соединения 7 на балльную оценку активности (НАЖБП activity score - NAS) представлено на фигуре 1.
Исследование четко показывает, что соединение 7 в дозе 3 мг/кг значительно снижает стеатоз и лобулярное воспаление в печени и показывает лучшую NAS по сравнению с элафибранором.
Соединение 5 в дозе 3 мг/кг значительно снижает лобулярное воспаление и показывает тенденцию снижения стеатоза и баллонной дистрофии печени, значительно снижая NAS по сравнению с контролем.
Соединения 5 и 7 проявляют значительное снижение уровней AST после 28 дней лечения, как показано на фигуре 2.
В отличие от эталонного соединения (элафибранора), оба исследуемых соединения (соединения 5 и 7) не вызывают гепатомегалии и увеличения соотношения массы печени и массы тела, как показано на фигуре 3.
В заключение, испытанные соединения приводят к значительному улучшению химического состава печени и гистологической активности НАСГ. Терапевтический профиль соединений 5 и 7 позволяет предположить, что они обладают потенциалом для лечения НАСГ у людей. У всех обработанных животных имеет место повышение массы тела и не наблюдается никаких клинических признаков токсичности или побочных эффектов.
Пример 16: Действие соединения 7 в лечении идиопатического фиброза легких (ИФЛ), вызванного блеомицином
Индукция ИФЛ
Для исследования отбирают мышей с известным сроком беременности (n=30). Новорожденным мышам на 2-й день после рождения (PND-2) подкожно вводят 1,5 ед./кг блеомицина (интратрахеально) и оставляют их с матерью до достижения ими возраста отъема от вскармливания молоком матери. После отъема от от вскармливания молоком матери отбирают мышей-самцов и кормят их с использованием рациона питания с содержанием жиров 60% ккал (исследовательская диета-D12492) в течение следующей недели. Всех животных обследуют два раза в день для обнаружения клинических симптом.
Методика исследования
Мышам перорально вводят дозу разбавителя, дозу исследуемых соединений или контрольного соединения (пирфенидона) дважды в день: утром (9,00 AM) и вечером перед началом цикла темноты (6:00 PM) в дни от 0 до 14.
Ежедневно на протяжении всего эксперимента измеряют массу тела животных.
Исследуемые соединения и контрольные соединения вводят животным в течение 14 дней.
Уровень содержания гидроксипролина в легких оценивают перед началом лечения и в конце на 14-й день. Общее количество клеток и лейкоцитарную формулу в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (bronchoalveolar lavage fluid - BALF) измеряют перед началом лечения и на 28 день.
Ткани легких подвергают гистопатологическому анализу в соответствии с балльной оценкой окрашивания H&E) по Ашкрофту.
Анализ образцов
Оценка тяжести ИФЛ: H&E окрашивание
Все срезы H&E окрашенных тканей исследуют с помощью оптической микроскопии. Тяжесть ИФЛ оценивают в соответствии с приведенной ниже системой оценки (Kleiner et al., 2005) с использованием объектива с линзами 200×.
Измерение площади доли коллагена (% Collagen Proportion Area - % CPA): трихомное окрашивание по Мейссону
Все срезы ткани, трихомно окрашенные по Мейссону, исследуют с помощью оптической микроскопии с использованием объектива с линзами 100×. На произвольно выбранных пяти областях (приблизительно 684,85 мкм × 917,11 мкм на область) из каждой печени измеряют окрашенную площадь с использованием программного обеспечения Image Pro Premier 9.1. Процент, который составляет площадь доли коллагена, вычисляют делением площади доли коллагена на общую площадь среза ткани.
Влияние соединения 7 на уровни содержания гидроксипролина в легких представлено на фигуре 4.
Уровни содержания гидроксипролина в легких значительно повышаются в блиомициновом контроле по сравнению с контролем без медикаментозного лечения. Исследование четко показывает, что соединение 7 в дозе 15 мг/кг значительно снижает уровни содержания гидроксипролина в легких и что это снижение превосходит снижение, достигаемое при применении 100 мг/кг пирфенидона.
В BALF количество общих и дифференциальных лейкоцитов (макрофагов и лимфоцитов) значительно повышается в группе контроля блеомицином. Количество макрофагов в BALF снижается при лечении соединением 7 (p>0,05) и пирфенидоном (p<0,05) по сравнению с контролем блеомицином, как показано на фигурах 5A и 5B.
Балльная оценка тяжести фиброза и %CPA значительно возрастают в группе блеомицинового контроля в сравнении с контролем без медикаментозного лечения (Naïve контроль). В легких, получавших лечение соединением 7 (p<0,05) и пирфенидоном (p<0,05), образцы показывают значительное снижение балльной оценки тяжести фиброза и %CPA в сравнении с блеомициновым контролем, как показано на фигурах 6A и 6B. Эти данные согласуются с результатами по гидроксипролину.
В заключение необходимо отметить, что тестируемое соединение приводит к значительному улучшению химии легких и гистологической активности ИФЛ. Терапевтический профиль соединения 7 позволяет предположить, что оно обладает потенциалом для лечения ИФЛ человека. Все животные, получавшие лечение, показали прибавку в массе тела по сравнению с группой блеомицинового контроля и не показали клинических проявлений токсичности указанного соединения или побочных эффектов.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ЛЕЧЕНИЕ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ | 2019 |
|
RU2815647C2 |
| ИНГИБИТОРЫ TYK2 И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2813233C2 |
| ПИРАЗОЛОПИРИМИДИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ-ИНГИБИТОРЫ JAK И СПОСОБЫ | 2009 |
|
RU2539568C2 |
| ПИРРОЛОПИРРОЛОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ В КАЧЕСТВЕ АКТИВАТОРОВ ПИРУВАТКИНАЗЫ (PKR) | 2018 |
|
RU2736217C2 |
| НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ БЕНЗИМИДАЗОЛА И ИМИДАЗОПИРИДИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ | 2004 |
|
RU2330023C2 |
| ПИРРОЛОТРИАЗИНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА КИНАЗЫ | 2018 |
|
RU2726632C1 |
| N1-(4-(5-(ЦИКЛОПРОПИЛМЕТИЛ)-1-МЕТИЛ-1H-ПИРАЗОЛ-4-ИЛ)ПИРИДИН-2-ИЛ)ЦИКЛОГЕКСАН-1,4-ДИАМИНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ СK1 И/ИЛИ IRAK1 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА | 2018 |
|
RU2761457C2 |
| ХИРАЛЬНЫЕ ДИАРИЛЬНЫЕ МАКРОЦИКЛЫ В КАЧЕСТВЕ МОДУЛЯТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ | 2016 |
|
RU2732405C2 |
| НЕЙРОАКТИВНЫЕ СТЕРОИДЫ, КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2012 |
|
RU2808165C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ХИНОЛИНА И ИНСЕКТИЦИДЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ИХ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА | 2005 |
|
RU2424232C2 |
Изобретение относится к новым соединениям пиридинсульфонамида формулы I
где R1 представляет собой фенил или 9-членную конденсированную гетероароматическую кольцевую систему, содержащую 1 или 2 гетероатома O, необязательно замещенные одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из C1-4 алкила, C1-4 алкил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном, HO-C1-4 алкандиила; Y1 представляет собой O; X1 представляет собой NH или O; n1 представляет собой 0 или 1; X3 отсутствует или представляет собой NRy; Rx и Ry независимо представляют собой C1-4 алкил; L представляет собой O или CH2; Z1 и Z3 выбраны из N и CH, Z2 представляет собой CH; R3 выбран из группы, состоящей из галогена, C(O)NR2aR2b, где R2a и R2b независимо выбраны из группы, состоящей из H и C1-4 алкила; композициям, включающим указанные соединения, и применению в лечении заболеваний, опосредованных IL-1β. Технический результат: получены новые соединения, которые могут применяться в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний, чувствительных к ингибированию IL-1β, таких как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ). 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 16 пр., 8 ил.
1. Соединение формулы I и его фармацевтически приемлемые соли:
где R1 представляет собой фенил или 9-членную конденсированную гетероароматическую кольцевую систему, содержащую 1 или 2 гетероатома O, необязательно замещенные одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из C1-4 алкила, C1-4 алкил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном, HO-C1-4 алкандиила;
Y1 представляет собой O;
X1 представляет собой NH или O;
n1 представляет собой 0 или 1;
X3 отсутствует или представляет собой NRy;
Rx и Ry независимо представляют собой C1-4 алкил;
L представляет собой O или CH2;
Z1 и Z3 выбраны из N и CH, Z2 представляет собой CH;
R3 выбран из группы, состоящей из галогена, C(O)NR2aR2b, где R2a и R2b независимо выбраны из группы, состоящей из H и C1-4 алкила.
2. Соединение по п.1 формулы Ia
где R1 выбран из группы, состоящей из C1-4 алкил-Y1-, C1-4 алкил-Y1-, замещенного галогеном;
R2 представляет собой водород; или
R1 вместе с R2 образует гетероциклическое пятичленное кольцо, необязательно замещенное одним заместителем, выбранным из HO-C1-4 алкандиила-; и
X1, n1, Y1, X3, Rx, Ry, L, Z1, Z2, Z3, R3 принимают значения, определенные в п.1.
3. Соединение по любому из пп.1 или 2, где X1 представляет собой NH или O и n1 представляет собой 1.
4. Соединение по любому из пп.1-3, где X3 представляет собой NRy.
5. Соединение по любому из пп.1-4, где Rx и Ry представляют собой метил.
6. Соединение по любому из пп.1-5, где L представляет собой O.
7. Соединение по любому из пп.1-6, где R3 выбран из группы, состоящей из галогена и C(O)NH2.
8. Соединение по п.7, где R3 выбран из группы, состоящей из Cl и C(O)NH2.
9. Соединение по п.1, которое выбрано из группы, состоящей из следующих соединений:
10. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении IL-1β, включающая эффективное количество соединения по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель.
11. Применение соединения по любому из пп.1-9 или композиции по п.10 в лечении заболеваний, опосредованных IL-1β, выбранных из неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), идиопатического фиброза легких (ИФЛ), аутовоспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, остеоартрита, рака легких или подагры, предпочтительно для применения в лечении НАСГ или ИФЛ.
| WO 2008091863 A1, 31.07.2008 | |||
| O 2008024284 A2, 8.02.2008 | |||
| З-АМИНОПИРИДИНЫ В КАЧЕСТВЕ АГОНИСТОВ GPBAR1 | 2012 |
|
RU2594886C2 |
