СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/175 C12N7/00 C12N5/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к способам получения живых культуральных вакцин против чумы плотоядных, и может использоваться на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения живых культуральных вакцин против чумы плотоядных (ЧП), включающий адаптацию аттенуированных штаммов вируса к первичным культурам клеток из тканей органов плотоядных животных из семейств псовых и куньих, почечной ткани африканской зеленой мартышки и тканей куриных и перепелиных эмбрионов, выращивание в указанных культурах вакционного вируса и его стабилизацию последующей лиофилизацией в подходящей среде (Патенты США кл. 424-89 N 2965544, 1960; N 3080291, 1963; кл. 435-237 N 4224412, 1980. Патенты ФРГ кл. 30h6 N 1138888, 1963; N 1235505, 1967. Автор. св-ва СССР кл. C 12 N 7/08 N 527072, 1977; кл. A 61 K 39/12 N 1287592, 1984).

Известен также способ получения культуральных вирусвакцин против ЧП, отличающийся тем, что в качестве клеточной системы для выращивания вируса используют линии трансформированных, неонкогенных перевиваемых клеток из почетной ткани животных: зеленой мартышки (Vero N 4647), макаки резус (LLC-MK2), собаки и сирийского хомяка (BHK-21S, BHK-21 13S) (Патенты США кл. 424-89 N 3836626, 1974: N 4004974, 1977; N 4351827, 1982; N 5000951, 1991. Патент Англии кл. A 61 K 39/175 N 2053679, 1981. Патент СРР кл. A 61 K 39/175 N 82518, 1983. Грачев В.Л. и др. //Вопр. вирусол. - 1990. - N 1).

Второй способ имеет несомненные преимущества перед первым, так как при производстве вакцины отпадает необходимость в использовании дорогостоящих, нестандартных и небезопасных первичных культур клеток. Основной недостаток второго способа состоит в невысокой иммуногенности получаемых вакцин, их прививочная доза варьирует в пределах от 1 тыс. до 1 млн ТЦД 50 (БОЕ 50). Другим недостатком способа является то, что репродукция вируса ЧП в ряде перевиваемых культур (LLC-MK2, BHK) протекает в течение 3 - 7 (иногда 10) сут и не сопровождается развитием специфического цитопатогенного действия (ЦПД), что с свою очередь затрудняет оценку результатов культивирования, усложняет и удорожает технологический процесс изготовления и контроля вакцины (Патенты США кл. 424-89, N 3836626, 1974; N 4351827, 1982. Патент Англии кл. A 61 K 39/175 N 2053679, 1981).

Наиболее близок к предлагаемому способ получения сухой культуральной вирусвакцины, содержащий аттенуированный штамм ЭПМ вируса ЧП, выращенный в первичной культуре клеток тканей эмбрионов японской перепелки (ЭП), и стабилизаторы высушивания - сорбит и желатозу (Патент США кл. 424-89 N 4224412, 1980).

Выращивание штамма ЭПМ выполняют в роллерной установке при множественности заражения 0,0001 - 0,001 ТЦД 50/клетку взвеси клеток ЭП с посевной концентрацией 0,8 - 1,0 млн на 1 см куб. В качестве ростовой среды применяют 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса или среду 199 с 10% об. сыворотки крови крупного рогатого скотам (КРС), а в качестве среды поддержки - среду 199. Культивирование вируса проводят в течение 11 - 14 сут при температуре 36,5 - 37,5^oC и скорости вращения сосудов 12 - 25 об. в час. Перед лиофилизацией вирус смешивают в объемном соотношении 1:1 с защитной средой, содержащей равные объемы 20%-ного раствора сорбита и 6%-ного раствора желатозы. Титр вакцинного вируса в сухом препарате составляет от 2,8 до 3,8 1g ТЦД 50/см куб (Технические условия ТУ 10.19. 87-89 на вакцину против чумы плотоядных культуральную сухую из штамма ЭПМ. - Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины, ассоциированной против вирусного энтерита, ботулизма, псевдомоноза и чумы плотоядных, утвержденная 08.08.92 г.).

Основным недостатком ближайшего аналога является использование ЭП в качестве клеточного субстрата при выращивании вируса, которые, как известно, несвободны от посторонних микроорганизмов (эндогенных вирусов и микроплазм). Устранение этого недостатка возможно путем создания специализированных, постоянно контролируемых птицеферм со здоровым поголовьем, но это чрезвычайно повышает расходы на производство живой вакцины и контроль контаминированности перепелиного стада, яиц и биопрепарата. При этом применяемые индикации не могут гарантировать полного отсутствия контаминантов в объектах контроля.

Второй недостаток известного способа состоит в нестандартности применяемого клеточного субстрата, а следовательно, нестандартности вируса и вакцины, что обусловлено невозможностью получить из гомогената тканей ЭП больших партий однородных по своим свойствам клеточных культур и требует дополнительных затрат на контроль пригодности каждого источника ткани. Выход клеток от одного ЭП невысок, обычно составляет не более 40%, что также приводит к большим затратам на получение промышленных серий культуры клеток и повышает себестоимость вакцины.

К другим недостаткам аналога следует отнести длительный процесс культивирования (10 - 14 сут), что усложняет и удорожает производство препарата. Вакцина из штамма ЭПМ создает напряженный и продолжительный иммунитет после введения плотоядным в большом диапазоне доз: норкам, соболям, хорькам - от 120 до 120 ТЦД 50, лисам и песцам - от 240 до 2400 ТЦД 50, собакам - от 630 до 6300 ТЦД 50 вакционного вируса
Техническим результатом данного изобретения является получения безвредной, высокоиммуногенной, стабильной при хранении культуральной вакцины против ЧП.

Сущность изобретения состоит в том, что из штаммов вируса ЧП при изготовлении вакцины используют новый аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88", в качестве клеточной системы - высокочувствительную сублинию CV-1 перевиваемых клеток почки африканcкой зеленой мартышки, из сред высушивания - среду соответствующего состава на основе продуктов гидролиза белков.

Предлагаемый способ получения живой культуральной вакцины против ЧП включает в себя: поддержание монослойной культуры клеток сублинии CV-1 серийным пассированием, выращивание вируса в перевиваемой культуре клеток в роллерных условиях, сбор вируссодержащего материала при достижении титра вируса 3,5 - 4,5 1g ТЦД 50/ см куб., смешивание его с защитной средой в объемном соотношении 3:2, коррекцию pH смеси в пределах 6,4 - 6,8 и лиофилизацию.

Новый вакцинный штамм, получивший название "ВНИИВВиМ-88" (регистрационный номер "ВНИИВиМ-88 Деп" в коллекции ВГНКИ), выделен из штамма ЭПМ адаптацией его к сублинии CV-1 посредством серии перемежающих пассажей и последующим клонированием методом предельных разведений. Новый штамм характеризуется следующими свойствами:
1) Штамм обладает морфологическими свойствами, характерными для вируса ЧП рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae.

2) Штамм размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с развитием ярко выраженного ЦПД в виде симпластов и последующей деструкцией клеток, титр вируса в указанной культуре достигает 3,5 - 4,5 1g ТЦД 50/см куб. Без адаптации вирус размножается в культуре клеток из тканей куриных и перепелиных эмбрионов, вызывая специфическое ЦПД и накапливаясь в титрах до 3,0 - 4,0 1g ТЦД 50/см куб.

3) Штамм культивируют в монослое перевиваемых клеток сублинии CV-1 в стационарных и роллерных условиях, при оптимальных режимах максимум биологической активности достигается через 44 - 52 час.

4) Нерегулярно образует бляшки на ХАО куриных эмбрионов.

5) Не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

6) Безвреден для лабораторных и восприимчивых животных, неконтагиозен, нереверсибелен; непатогенен для человека.

7) Индуцирует формирование напряженного и продолжительного иммунитета против чумы у вакцинированных пушных зверей (норок, тхорзофреток, песцов, лис, енотов) и собак.

8) Вызывает образование вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 - 1:32 и выше; гемагглютинирующими свойствами не обладает.

9) Генетически стабилен в течение 10 последовательных пассажей в культуре клеток сублинии CV-1.

В отличие от известного способа вирус выращивают в перевиваемой культуре клеточной сублинии, полученной во ВНИИВВиМ из исходной культуры перевиваемых клеток CV-1 из почки африканской зеленой мартышки (номер 43.2 в каталоге клеточной коллекции ВНИИВВиМ). В данном случае из технологического процесса изготовления вакцины исключается дорогостоящая, нестандартная, малотехнологичная и контаминированная посторонними микроорганизмами первичная культура клеток ЭП.

Для виращивания вируса используют монослойную культуру клеток сублинии CV-1, полученную серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:3 - 1:5 в пределах 50 последовательных пассажей. Для обеспечения стандартности производства вакцины создан криобанк рабочих клеток сублинии CV-1, содержащий клетки 17 пассажа в количестве 165 млн, охарактеризованные по стабильности морфологических, ростовых и кариологических показателей на отсутствие туморогенности и контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Новый штамм и используемые перевиваемые клетки легко культивируются в роллерных условиях на недефицитной питательной среде Игла-МЕМ с сывороткой крови КРС (соответственно по 4 - 5 и 9 - 10% об.), не теряют своих свойств после низкотемпературного хранения и "освежения" - восстановления. При температуре 36,5 - 37,5^oC время формирования монослоя клеток сублинии CV-1 и продолжительность культивирования вируса составляют по 44 - 52 час (каждый), что чрезвычайно выгодно для производства.

Применение быстроразмножающегося штамма и высокопродуктивной клеточной линии позволяет повысить технологичность и производительность производства, уменьшить экономические затраты и снизить себестоимость новой вакцины, а следовательно, обеспечивает ее коммерческое преимущество.

Безвредность, ареактогенность, высокая антигенная и иммуногенная активность вакцины, изготовленной по новому способу, гарантируются условиями адаптации и поддержания штамма "ВНИИВВиМ-88", при которых достигается стабильность его аттенуированных свойств, генетических и иммунобиологических признаков. В повышенных дозах (до 2000 ТЦД 50/см куб.) вакцина из штамма "ВНИИВВиМ-88" безвредна и не вызывает у иммунизированных плодоядных каких-либо отклонений от физиологической нормы в поведении и приеме пищи, признаков заболевания чумой и гибели.

Прививочная доза вакцины из штамма "ВНИИВВиМ-88" содержит: для норок и тхорзофреток - не менее 100 ТЦД 50/см куб., для лис, песцов и енотов - не менее 200 ТЦД 50/см куб., для собак - не менее 500 ТЦД 50/см куб. При внутримышечном введении в прививочной дозе новая вакцина не вызывает поствакцинальных реакций и осложнений. Иммунитет у пушных зверей наступает на 14 - 21-е сут после однократной вакцинации, у взрослых собак - на 10 - 14-е сут после однократного введения, а у щенков собак - после второй вакцинации в те же сроки. Ревакцинацию взрослых плотоядных проводят ежегодно в тех же дозах.

Вакцина из штамма "ВНИИВВиМ-88" создает 100%-ную защиту от чумы среди пушных зверей и собак, привитых начиная с двухмесячного возраста. У вакцинированных животных выявляют вируснейтрализующие (ВН) антитела к вирусу ЧП: у собак и тхорзофреток - в титрах 1:16 - 1:128, песцов, лис и енотов - 1:8 - 1:32. Продолжительность иммунитета у плотоядных составляет не менее 12 мес.

В отличие от аналогов для стабилизации физических и иммунобиологических свойств новой вакцины предлагается защитная среда на основе продуктов полного и неполного гидролиза белков, содержащая ферментативный пептон или гидролизат белков молочной сыворотки или ферментативный гидролизат мышечных белков, сорбит или сахарозу, гидролизованный желатин. Положительный эффект достигается при смешивании вируссодержащего материала с титром вакцинного вируса 3,5 - 4,5 1g ТЦД 50/см куб. и защитной среды в объемном соотношении 3:2. Предлагаемая среда гарантировано обеспечивает устойчивую эвтектическую зону препарата в пределах от минус 42 до минус 35^oC, минимальные потери титра вируса при лиофилизации (не более 0,5 lg), высокую сохраняемость вакцины.

Ниже в таблице приведены физические и иммунобиологические свойства 5 серий сухой культуральной вакцины против ЧП, приготовленной по новому способу как из длительно хранившегося (серия 1), так и из свежеполученного вируссодержащего материала (серии 2 и 5), сразу после изготовления и спустя 12 - 13 мес хранения препарата при температуре 4 - 6^oC. Титр вируса в свежеприготовленном препарате составляет 3,0 - 4,2 lg ТЦД 50/см куб. Срок годности вакцины - не менее 12 мес при температуре 4 - 6^oC, при температуре хранения от минус 50 до минус 40^oC он увеличивается до 18 мес.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение сухой культуральной вакцины против ЧП из штамма "ВНИИВВиМ-88", характеризующейся безвредностью, высокой иммуногенностью, отсутствием контаминации посторонними микроорганизмами (бактериями, грибами, микоплазмами и патогенными для плотоядных вирусами), высокой сохраняемостью своих полезных свойств. Новый способ изготовления вакцины прост в исполнении, доступен и может быть реализован в промышленном масштабе.

Для подтверждения преимуществ настоящего изобретения приведены примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Получение вируссодержащего материала.

Для получения вакцины вирус выращивают в монослойной культуре клеток сублинии CV-1 на роллерной установке производительностью 48 дм куб. материала за один цикл. Перевиваемую культуру получают серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:4. В качестве ростовой среды применяют Игла-МЕМ с 9,5% об. сыворотки крови КРС. При температуре инкубирования 37^oC и скорости вращения сосудов 11 об. в час монослой клеток формируется через 48 час.

Выращивание вируса проводят в течение 48 час при температуре 37^oC, регулярно просматривая инфицированную культуру под микроскопом. В качестве поддерживающей среды используют Игла-МЕМ с 4,5% об. сыворотки крови КРС. По завершении процесса проводят контроль вируссодержащего материала на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и по титру вируса в культуре клеток сублинии CV-1. В нашем опыте с одной роллерной установки, несущей 96 роллерных сосудов, получено 48 дм куб. стерильного вируссодержащего материала с титром вируса 4,25 lg ТЦД 50/ см куб., который используется для изготовления сухой культуральной вакцины.

Пример 2. Изготовление вакцины.

Для иммунизации собак и пушных зверей готовят по одной серии вакцины соответственно в ампулах и во флаконах.

Перед лиофилизацией вируссодержащий материал смешивают с защитной средой в объемном соотношении 3:2. С помощью 6%-ного (по массе) водного раствора янтарной кислоты устанавливают pH смеси в уровне 6,6.

Вакцину фасуют по 1 см куб. в стеклянные ампулы, по 5 см куб. - в стеклянные флаконы и высушивают лиофильно. Ампулы с сухой вакциной отпаивают, флаконы - герметично укупоривают.

Полученный препарат контролируют по внешнему виду, цвету, растворимости, содержанию массовой доли влаги, контаминации бактериями, грибами, микроплазмами, биологической активности (титру вируса по ЦПД в культуре клеток сублинии CV-1), безвредности (для тхорзофреток в дозе 3000 ТЦД 50), реактогенности и иммуногенности (в опытах на тхорзофретках). Результаты испытаний вакцины серий 3 и 5, приготовленных соответственно для иммунизации собак и пушных зверей, представленны в таблице.

Обе серии приготовленной вакцины отвечают нормативным требованиям и пригодны к применению.

Из 48 дм куб. вируссодержащего материала, полученного только на одной роллерной установке (пример 1), вышеописанным способом может быть изготовлено 80 тыс. доз для собак или 2 млн доз вакцины для иммунизации пушных зверей.

Пример 3. Испытания вакцины в производственных условиях.

Для испытания новой вакцины в производственных условиях проведена иммунизация 580 собак, 18640 норок, 14032 песцов и 628 енотов. Прививочная доза вакцины из штамма "ВНИИВВиМ-88" составила: собакам - от 1000 до 3000 ТЦД 50/см куб., норкам - от 200 до 470 ТЦД 50/см куб., песцам и енотам - от 400 до 940 ТЦД 50/2 см куб. вакцинного вируса. Поствакцинальных реакций и осложнений среди иммунизированных животных не наблюдали.

Через 9 - 12 мес после вакцинации пушных зверей ВН-антитела к вирусу ЧП выявляли в титрах, достаточных для защиты от полевого вируса на уровне 1:8 - 1: 32 в 82% проб и 1:4 - в 13,5% проб сывороток крови. В ходе испытаний вакцины у привитых собак и пушных зверей не было отмечено случаев прорыва иммунитета в течение года наблюдения.

С положительными результатами проведена межведомственная проверка иммунобиологических свойств вакцины, имеется положительное решение Госветбиокомиссии, утверждены технические условия ТУ 9384-005-0000864-96 на опытно-промышленную серию препарата и временное наставление по его применению. Налажено опытно-промышленное производство вакцины по новому способу.

Вакцина из штамма "ВНИИВВиМ-88" может использоваться для профилактической иммунизации домашних и служебных собак, пушных зверей в крупных зверокомплексах и фермерских хозяйствах. Применение вакцины безопасно в ветеринарно-санитарном отношении. Внедрение в производство предлагаемого способа позволит расширить ассортимент профилактических препаратов и повысить эффективность противоэпизоотических мероприятий против чумы плотоядных.

Изобретение предназначено для получения живых культуральных вакцин против чумы плотоядных. Для изготовления вакцины используют новый аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88" (регистрационный номер "ВНИИВВиМ Деп" в коллекции ВГНКИ). В качестве клеточной системы при выращивании вируса применяют высокочувствительную сублинию СV-1 перевиваемых клеток почки африканской зеленой мартышки, а из сред высушивания - среду соответствующего состава на основе продуктов гидролиза белков. Монослойную культуру клеток сублинии СV-1 поддерживают серийным пассированием. Выращивание вируса в перевиваемой культуре клеток осуществляют в роллерных условиях. Сбор вируссодержащего материала проводят при достижении титра вируса до 3,5 - 4,5 lg ТЦД 50/ см³. Смешивают его с защитной средой в объемном соотношении 3 : 2. Корректируют рН смеси в пределах 6,4 - 6,8 и лиофилизируют. Способ получения вакцины производителен, прост в исполнении, доступен и легко реализуем в промышленном масштабе. Вакцина, изготовленная по новому способу, эффективнее аналогов по иммуногенности, безвредна, стабильна при хранении, стандартна, дешева. 1 табл.

Способ получения вакцины против чумы плотоядных, включающий выращивание вируса в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала, смешивание его с защитной средой и лиофилизацию, отличающийся тем, что в качестве вируса используют аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88" вируса чумы плотоядных, из культур клеток - перевиваемую культуру клеток сублинии CV-1 из почки африканской зеленой мартышки, из защитных сред - среду, содержащую ферментативный пептон или гидролизат белков молочной сыворотки или ферментативный гидролизат мышечных белков, сорбит или сахарозу и гидролизованный желатин, при этом сбор вируссодержащего материала проводят при достижении уровня накопления вируса 3,5 - 4,5 lg ТЦД 50/см³ и смешивают его с защитной средой в объемном соотношении 3 : 2.