ПИТАТЕЛЬНАЯ БЕССЫВОРОТОЧНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано в вирусологических лабораториях при проведении диагностических исследований, а также на биокомбинатах при производстве биопрепаратов, в том числе вакцин. Предлагается в качестве питательной среды для культивирования клеток животного происхождения и накопления вирусов млекопитающих, в частности, перевиваемой клеточной линии КСТ, 0,25 % раствор гидролизата мышечной ткани норок в растворе Хенкса.

Известны питательные среды для культивирования клеточных культур, содержащие до 10 % сыворотки КРС: минимальная среда Игла MEM, основная среда Игла MEM, среда Игла MEM в модификации Дульбекко, среда 199 (среда Хенкса), среда Хэма, среда Мак-Коя, среда Лейбовица [Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство, 2014 г., М.: Бином. 718 с.]. Известны также импортные питательные среды, не содержащие сыворотку крови: 110, 131, 170, 202, 302, Iscove's, LHC-9. Указанные среды являются коммерчески недоступными из-за высокой стоимости и отсутствия поставок в связи с объявленными санкциями.

Сыворотка крови содержит необходимые для размножения культур клеток вещества, которые отсутствуют или содержатся в недостаточных концентрациях в питательных средах. В зависимости от потребности культивируемых клеток сыворотка крови крупного рогатого скота добавляется в такие питательные среды как Игла MEM, среда 199, среда Хэма, среда Мак-Коя, среда Лейбовица в концентрациях 5-10 % (Патент RU 2804076, приоритет от 11.11.2022 г.).

Однако сыворотка крови может быть контаминирована вирусами и бактериями, в том числе микоплазмами, животных, а также содержать антитела и другие факторы, ингибирующие размножение культивируемых вирусов, и, таким образом, снижать их урожайность. Состав сыворотки варьирует от партии к партии, сильно зависит от времени года и физиологического состояния животных-продуцентов. Имеет значение и её коммерческая стоимость.

Лишены указанных недостатков фетальные сыворотки. Но они производятся в небольших объёмах, в основном зарубежными фирмами, имеют очень высокую себестоимость и поэтому не используются в производственных условиях.

Целью изобретения является разработка эффективной, обладающей невысокой себестоимостью питательной бессывороточной среды для культивирования перевиваемых клеток животного происхождения и накопления вирусов крупного рогатого скота без использования зарубежных компонентов, обладающей невысокой себестоимостью.

Техническим результатом заявленного изобретения является 100 % конфлюенция клеток млекопитающих при их культивировании, высокая чувствительность к вирусам, расширение ассортимента питательных сред.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что бессывороточная питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток животного происхождения и накопления вирусов млекопитающих содержит в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов 0,25 % гидролизата мышечной ткани норок производства ООО «Биопрогресс» с массовой долей содержания аминного азота не менее 6,3 %, в стерильном сбалансированном солевом растворе Хенкса, с рН среды, доведенной до значения 7,3±0,1 с помощью раствора гидроксида натрия в концентрации 0,1 моль/л, с внесеннным перед применением антибиотиком пенициллин-стрептомицин в концентрации 60 ЕД/мл.

Изобретение иллюстрируется на следующем примере.

Экспериментальную питательную бессывороточную среду для культивирования перевиваемых клеток животного происхождения и накопления вирусов млекопитающих получают из маточного раствора. Для получения маточного раствора навеску сухого порошка гидролизата мышечной ткани норок нагревают на водяной бане при температуре 50-60 °С при непрерывном перемешивании до полного растворения гидролизата в стерильном сбалансированном солевом растворе Хенкса до конечной концентрации 10 %.

Полученный 10%-ный маточный раствор автоклавируют.

Режим автоклавирования: давление – 1,5 атмосферы, температура – 121°С, экспозиция – 20 минут.

Полученный концентрат разбавляют стерильным сбалансированным солевым раствором Хенкса до концентрации 0,25 %, добавляют антибиотики пенициллин-стрептомицин в концентрации 60 ЕД/мл.

Уровень рН доводят до значения 7,3±0,1 с помощью раствора гидроксида натрия в концентрации 0,1 моль/л.

Экспериментальную питательную среду применяли для культивирования перевиваемых клеток коронарных сосудов плода коровы КСТ (А.с. № 1835849, 1992 г, авторы Дьяконов Л.П., Куликова И.Л., Жидков С.А.), депонированную в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных ВИЭВ.

Культура клеток КСТ используется на биокомбинатах для накопления вирусов, поражающих крупный рогатый скот, в том числе вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Bovine herpesvirus 1) «Оренбург 1/70».

В опыте использовали среды, содержащие 0,25 %, 0,5 %, 1,25 % гидролизата мышечной ткани норок, с добавлением 5 % сыворотки крупного рогатого скота и без сыворотки. В качестве контрольной применена среда ИГЛА МЕМ с добавлением 5 % сыворотки крупного рогатого скота.

Посевная концентрация составила 800000 клеток в мл.

Скорость образования монослоя клеток КСТ (достижение 100 % конфлюенции клеток), выращенных в бессывороточной среде на основе гидролизата норок, представлена в таблице 1.

Таблица 1

Концентрация клеток КСТ в зависимости от времени культивации и концентрации гидролизата из мышечной ткани норок (Часы – часы культивирования, ГМТН – гидролизат из мышечной ткани норок, S – сыворотка КРС)

Часы Концентрация клеток, кл/мл Контроль, среда ИГЛА МЕМ + 5 % S Среда с 0,25 % ГМТН Среда с 0,25 % ГМТН + 5 % S Среда с 0,5 % ГМТН Среда с 0,5 % ГМТН + 5 % S Среда с 1,25 % ГМТН Среда с 1,25 % ГМТН + 5 % S 0 800000 800000 800000 800000 800000 800000 800000 4 950000 800000 800000 800000 900000 800000 800000 20 1900000 800000 1400000 1400000 1600000 600000 1800000 28 2400000 1400000 1600000 1600000 1700000 500000 2400000 44 3200000 1600000 2600000 1500000 3200000 400000 2400000 70 3650000 2600000 3400000 1400000 3400000 400000 2800000 94 3400000 3400000 3250000 1300000 3400000 200000 1600000

Установлено, что при культивировании культуры клеток КСТ целесообразно использование гидролизата мышечной ткани норок в концентрации 0,25 % без добавления сыворотки КРС или с добавлением 5 % сыворотки КРС.

Оценку токсичности и ростовых свойств сравниваемых питательных сред проводили в монослойной культуре перевиваемых клеток КСТ методом последовательных пересевов в течение пяти пассажей при посевной концентрации 700±10 тысяч клеток/мл.

Установлено, что питательная среда для культивирования клеток млекопитающих, содержащая сухой гидролизат мышечной ткани норок, может служить поддерживающей средой при культивировании вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Bovine herpesvirus 1) «Оренбург 1/70». Результаты опыта приведены в таблице 2.

Таблица 2

Накопление вакцинного вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Bovine herpesvirus 1) «Оренбург 1/70» на клетках КСТ, выращенных в среде для культивирования клеток млекопитающих, содержащей сухой гидролизат мышечной ткани норок в концентрации 0,25 %, и среде Игла MEM с добавлением 5 % сыворотки КРС

ГМТН - гидролизат из мышечной ткани норок, S – сыворотка КРС

Культура клеток № пассажа Цитотоксическое действие Время культивирования, ч Титр вируса, lg ТЦД₅₀/см³ Среда с 0,25 % ГМТН 1 ++ 48-54 5,65±0,11 2 +++ 48-54 5,99±0,28 3 ++++ 48-54 6,63±0,17 4 ++++ 48-54 7,27±0,33 5 ++++ 48-54 7,33±0,11 Среда с 0,25 % ГМТН + 5 % S 1 ++ 48-54 5,44±0,27 2 ++ 48-54 5,58±0,23 3 +++ 48-54 6,01±0,21 4 ++++ 60-72 7,33±0,14 5 ++++ 60-72 7,34±0,16 Контроль, среда ИГЛА МЕМ + 5 % S 1 +++ 48-54 6,36±0,10 2 +++ 48-54 6,29±0,27 3 +++ 48-54 6,64±0,26 4 ++++ 60-72 7,48±0,23 5 ++++ 60-72 7,35±0,24

Культура клеток КСТ, выращенная на питательной среде для культивирования клеток млекопитающих, содержащая сухой гидролизат мышечной ткани норок в концентрации 0,25 %, оказалась чувствительной к вирусу ИРТ.

Показатели уровня накопления вакцинного вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Bovine herpesvirus 1) «Оренбург 1/70» на клетках КСТ, выращенных в бессывороточной среде для культивирования клеток животного происхождения, содержащей сухой гидролизат мышечной ткани норок в концентрации 0,25 %, и среде Игла MEM с добавлением 5 % сыворотки КРС, оцененные по цитотоксическому действию, сопоставимы друг с другом, что свидетельствует о возможности применения заявленной питательной среды с гидролизатом мышечной ткани норок в концентрации 0,25 % для накопления вируса ИРТ в культуре перевиваемых клеток.

Таким образом, заявляемая питательная бессывороточная среда для культивирования перевиваемых клеточных линий животного происхождения расширяет ассортимент питательных сред и обеспечивает рациональную утилизацию отходов, образующихся при пушном звероводстве. Экономический эффект использования изобретения состоит в снижении стоимости питательных сред при сохранении эффективности наращивания биологического материала и отсутствии иммунных компонентов.

Список литературы

1. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство, 2014 г., М.: Бином. 718 с.

2. Дьяконов Л.П. Живая клетка в культуре. Москва: Спутник, 2009. – 656 с.

3. Патент РФ № 2804076 С2, МПК С 12N 1/00. Питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток: № 2022129367 от 11.11.2022; опубл. 26.09.2023 / Денисенко В.Н., Гнездилова Л.А., Албулов А.И. [и др.].

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена бессывороточная питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток животного происхождения и накопления вирусов млекопитающих, содержащая в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов 0,25 % гидролизат мышечной ткани норок производства ООО «Биопрогресс» с массовой долей содержания аминного азота не менее 6,3 % в стерильном сбалансированном солевом растворе Хенкса, с рН среды, доведенной до значения 7,3±0,1 с помощью раствора гидроксида натрия в концентрации 0,1 моль/л, с внесеннным перед применением антибиотиком пенициллин-стрептомицин в концентрации 60 ЕД/мл. Изобретение обеспечивает расширение арсенала бессывороточных питательных сред и повышение конфлюенции клеток млекопитающих при их культивировании на данной среде. 2 табл.

Бессывороточная питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток животного происхождения и накопления вирусов млекопитающих, содержащая в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов 0,25 % гидролизат мышечной ткани норок производства ООО «Биопрогресс» с массовой долей содержания аминного азота не менее 6,3 % в стерильном сбалансированном солевом растворе Хенкса, с рН среды, доведенной до значения 7,3±0,1 с помощью раствора гидроксида натрия в концентрации 0,1 моль/л, с внесеннным перед применением антибиотиком пенициллин-стрептомицин в концентрации 60 ЕД/мл.