УНИВЕРСАЛЬНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА ТУШЕК НОРОК Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к бактериологии и может быть использовано при выделении возбудителей бактериальных инфекций от больных животных, изучении их культуральных свойств и производстве вакцин и диагностикумов.

Разные роды бактерий имеют различную потребность в питательных веществах и ростовых факторах. В связи с этим питательные среды разделяют на среды общего назначения, предназначенные для культивирования неприхотливых микроорганизмов, и специальные обогащенные, предназначенные для культивирования микроорганизмов, имеющих повышенную потребность в разнообразных метаболитах.

В России научные разработки по созданию питательных сред начали проводить с 1980 года. Панкреатический гидролизат рыбной муки, как полноценный пептон, был положен в основу питательных сред в России. До настоящего времени панкреатический гидролизат рыбной муки является основой более половины питательных сред промышленного отечественного производства [5]. Наиболее часто используются среды, приготовленные на натуральных природных субстратах, так как они имеют все необходимые компоненты. Поэтому на них хорошо растет большинство микроорганизмов, включая самые требовательные. Эти среды используют с диагностической целью.

Питательные среды по целевому назначению разделяют на среды общего назначения, предназначенные для культивирования большой группы неприхотливых организмов, и специальные, используемые для разных целей. Среди специальных сред различают обогащенные, элективные (избирательные), дифференциально-диагностические (индикаторные), транспортные и консервирующие [6]. Анализ рынка существующих в настоящее время питательных сред показал несколько возможных аналогов, таких как:

Питательная среда для культивирования микроорганизмов (Патент РФ № 2410424, опубл. 27.01.2011), которая содержит ферментативный гидролизат из биомассы калифорнийских червей, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, сульфит натрия, агар микробиологический, дистиллированную воду. Недостатком данной питательной среды является использование дополнительных объемов производства и трудозатрат для выращивания биомассы червей.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов (Патент РФ № 2800127, опубл. 18.07.2023). Данная питательная среда служит для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, содержит кислотный гидролизат казеина, мясной экстракт, бактериологический агар, хлорид натрия, соль двухвалентного магния, в качестве которой используют сульфат магния при заданном соотношении компонентов соотношении. Недостатком этой питательной среды является использование ценного белкового соединения - казеина, который применяется в создании вспомогательной белковой добавки для людей и животных и является самостоятельным продуктом переработки цельного молока.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является Питательная среда для культивирования бактерий (Патент РФ № 2384613, опубл. 02.03.2010), которая содержит отвар из молок лососевых рыб, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, глюкозу, микробиологический агар и дистиллированную воду. Сравнительный анализ показал, что себестоимость данной среды значительно выше предложенной нами питательной среды, и для приготовления требуется большее количество компонентов.

Целью настоящего изобретения является разработка универсальной питательной среды для культивирования максимального количества видов бактерий, имеющих значение в патологии животных. При этом предлагается использовать недорогие отечественные компоненты, что исключает негативное влияние санкционных ограничений на поставку в нашу страну биологических материалов.

Поставленная задача решается тем, что в качестве источника питательных и ростовых факторов используется гидролизат тушек норок, являющийся отходами пушного звероводства (Патент № 101202). Гидролизат содержит 10 незаменимых и 8 заменимых аминокислот, а так же 6 макро- и 18 микроэлементов.

Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение хорошего роста разных видов микроорганизмов за счет использования питательной среды общего назначения, изготовленной на снове отходов пушного звероводства (тушки норок), которые обычно утилизируют. Белковый гидролизат, получаемый из мяса тушек норок, сказывается на ростовых показателях культур микроорганизмов, а именно позволяет проявлять обильный рост широкого спектра микроорганизмов, в том числе требовательных к составу среды, и увеличить скорость появления признаков роста при культивировании в аэробных условиях через 24 часа.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что универсальная питательная среда для культивирования бактерий приготовлена на основе гидролизата тушек норок, содержащей белковую основу, натрия хлорид, агар-агар и в качестве белковой основы - сухой порошок гидролизата тушек норок в следующем соотношении, г/л: сухой порошок гидролизата тушек норок 30,0; натрия хлорид 5,5; агар-агар 30,0; дистиллированная вода - остальное.

На базе кафедры вирусологии и микробиологии ФГБОУ ВО «МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина» осуществлено приготовление экспериментальной питательной среды. Для приготовления использовали навески следующих ингредиентов: сухой порошок гидролизата тушек норок 30,0 г/л, натрия хлорида 5,5 г/л и агар-агара 30,0 г/л. Далее полученные навески размешивали в 1 л дистиллированной воды, с помощью гидрокарбоната натрия выравнивали рН до 7,2±0,2. Смесь нагревали до расплавления агар-агара и разливали по флаконам, после стерилизовали автоклавированием при давлении 1,5 атмосферы в течение 30 минут. Остужали среду до 45°С и разливали в стерильные чашки Петри в объеме по 15 мл. Оставляли чашки в закрытом виде при комнатной температуре до полного застывания среды.

В качестве контрольных сред использовали среду общего назначения - мясо-пептонный агар (МПА) и обогащенную питательную среду - кровяной мясо-пептонный агар.

В качестве тест-культур микроорганизмов использовали культуры бактерий, рекомендованные для исследования ростовых свойств питательных сред: Escherichia coli В-11419, Staphylococcus aureus В-8172, Enterococcus faecium В-8551.

Для посева готовили суспензию из суточных культур микроорганизмов в стерильном физиологическом растворе. Приготовление взвеси тест-культур и определение концентрации микроорганизмов проводили по стандарту мутности ОСО МУТНОСТИ ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России - ОСО 42-28-85-2015 (10 МЕ) и ОСО 42-28-86-2015 (5 МЕ).

Инокуляцию микроорганизмов производили двумя методами: газонным методом с использованием шпателя Дригальского и методом «штриха» с помощью бактериологической петли. Посев каждой культуры осуществляли на экспериментальную питательную среду двумя методами.

Культивирование посевов осуществляли в аэробных условиях, при температуре 37°С в течение 24 часов.

Учет результатов посевов проводили при естественном дневном освещении визуально через 16, 18, 20, 22 и 24 часа культивирования.

Критериями качества роста культур являлось: количество выросших колоний (КОЕ), морфология колоний (соответствие биологическим свойствам данного вида, их типичность), размер колоний, скорость появления признаков роста микроорганизмов на среде (СППР). Посев, культивирование и учет результатов на контрольных средах осуществляли аналогично опытному образцу. Полученные результаты отражены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты учета роста тестовых микроорганизмов на опытных и контрольных питательных средах

Тест-культура Питательные среды КОЕ Типичность морфологии колоний Размеры колоний, мм (min-max) СППР, ч Escherichia coli В-11419 МПА (контроль 1) 4,1×10⁷ Типичные 2-3 18 Кровяной МПА (контроль 2) 2,6×10⁸ Типичные 3-4 18 Экспериментальная среда 4,6×10⁸ Типичные 3-4 16 Staphylococcus aureus В-8172 МПА (контроль 1) 1×10⁴ Нетипичные, мелкие и точечные 0,1-2 24 Кровяной МПА (контроль 2) 2,8×10⁶ Типичные 1,1-2,8 20 Экспериментальная среда 5,3×10⁶ Типичные 1,3-2,6 22 Enterococcus faecium В-8551 МПА (контроль 1) - Рост отсутствует - - Кровяной МПА (контроль 2) 1,9×10⁸ Типичные 0,3-1,4 22 Экспериментальная среда 4×10⁸ Типичные 0,4-1,8 22

Из таблицы 1 видно, что на экспериментальной среде получен рост тест-культур. Наиболее высокие значения критериев качества роста тестируемых микроорганизмов проявляются при посеве на экспериментальную питательную среду.

На мясо-пептонном агаре получен рост Escherichia coli В-11419, но в меньшем количестве колоний (КОЕ), чем на экспериментальной среде. Колонии кишечной палочки имели меньший в сравнении с опытным диаметр.

Количество и размер колоний Staphylococcus aureus В-8172 на мясо-пептонном агаре были меньше в сравнении с результатом, полученным при росте на экспериментальной питательной среде.

Рост Enterococcus faecium В-8551 на мясо-пептонном агаре отсутствовал.

На кровяном мясо-пептонном агаре отмечен рост всех используемых микроорганизмов. Однако количество и размер колоний Enterococcus faecium В-8551 были меньшими, чем на экспериментальной питательной среде.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что экспериментальная питательная среда, содержащая сухого порошка гидролизата тушек норок в заданном количестве, является универсальной и обладает более выраженными ростовыми свойствами в сравнении с кровяным мясо-пептонным агаром.

Данная среда обеспечивает хороший рост разных видов микроорганизмов, в том числе требовательных к составу питательных сред, не имеет сложного состава, проста в приготовлении, экономически выгодна.

Список источников

1. Пат. RU № 101202, приоритет от 15.04.2013. Способ получения белкового гидролизата из мясо-костного сырья тушек норок / Албулов А.И., Денисенко В.Н., Самуйленко А.Я., Рогов Р.В., Абрамов П.Н.

2. Пат. RU № 2384613 C2, МПК C12N 1/20. Питательная среда для культивирования бактерий / Зайцева Е.А., Сомов Г.П., Фатеева Л.Н.; заявитель и патентообладатель ГУ Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (ГУ НИИ ЭМ СО РАМН); заявл. 2008.03.26; опубл. 2010.03.20; начало действия: 2008.03.26 - 1с.

3. Пат. RU № 2800127 C1, МПК C12N 1/20. Питательная среда для культивирования микроорганизмов / Щелкова В.В., Русанова Е.В., Василенко И.А.; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского); заявл. 2022.10.06; опубл. 2023.07.18; начало действия: 2023.07.18. - 1 с.

4. Пат. RU № 2410424 C1, МПК C12N 1/20. Питательная среда для культивирования микроорганизмов / Тимченко Л.Д., Ткаченко И.Н., Катунина Л.С., Вакулин В.Н., Ржепаковский И.В.; заявители и патентообладатели Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университет; заявл. 2009.05.25; опубл. 27.01.2011; начало действия: 2009.05.25. - 1 с.

5. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э., книга «Питательные среды для медицинской микробиологии», Санкт-Петербург, 2002.

6. Шепелин А.П., Дятлов И.А., Марчихина И.И., Миронова Е.Н. Разработка технологии приготовления панкреатического гидролизата рыбной муки - белковой основы бактериологических питательных сред, Клиническая лабораторная диагностика, 2011, 9, 48-49.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для культивирования бактерий, включающую белковую основу, натрия хлорид, дистиллированную воду, при этом в качестве белковой основы используют сухой порошок гидролизата тушек норок, дополнительно среда содержит агар-агар при следующем содержании исходных компонентов, г/л: сухой порошок гидролизата тушек норок 30,0; натрия хлорид 5,5; агар-агар 30,0; дистиллированная вода - остальное. Изобретение позволяет проявить быстрый и обильный рост культур микроорганизмов на 1-е сутки культивирования. 1 табл.

Питательная среда для культивирования бактерий, включающая белковую основу, натрия хлорид, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы используют сухой порошок гидролизата тушек норок, дополнительно среда содержит агар-агар при следующем содержании исходных компонентов, г/л: сухой порошок гидролизата тушек норок 30,0; натрия хлорид 5,5; агар-агар 30,0; дистиллированная вода - остальное.