Нуклеиновая кислота, содержащая синтетическую регуляторную последовательность Российский патент 2025 года по МПК C12N15/113 C12N15/67 

Область техники

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые могут быть использованы при производстве препаратов на основе мРНК.

Уровень техники

Препараты на основе рибонуклеиновой кислоты (мРНК), особенно мРНК-вакцины, широко зарекомендовали себя как многообещающая стратегия лечения в иммунотерапии. Исключительные преимущества мРНК-вакцин, в том числе их высокая эффективность, сниженная частота и тяжесть побочных реакций, а также относительно низкие затраты на производство, объясняют большое количество доклинических и клинических испытаний мРНК-вакцинных препаратов против различных инфекционных заболеваний и онкологических заболеваний. Недавние технологические достижения смягчили некоторые проблемы, которые препятствуют разработке мРНК-вакцины, такие как низкая эффективность, которая существует как при трансляции генов, так и при доставке in vivo. Эффективность вакцины в первую очередь зависит от стабильности и структуры разработанной мРНК.

Существуют различные подходы к решению проблемы повышения стабильности и/или трансляционной активности мРНК. Одним из таких подходов является использование гетерологичных нетранслируемых областей РНК, способных стабилизировать мРНК и/или повышать эффективность трансляции, что, в конечном итоге должно приводить к увеличению количества синтезируемого белка.

Нетранслируемые области (UTR или НТО) представляют собой некодирующие части последовательности мРНК, расположенные выше (5'-НТО) и ниже (3'-НТО) кодирующей области мРНК. Известно, что НТО связаны с процессами трансляции мРНК, и они, взаимодействуя с РНК-связывающими белками, могут влиять на устойчивость мРНК к факторам деградации и на эффективность трансляции [Schlake Т., Thess A., Fotin-Mleczek М. et al. Developing mRNA-vaccine technologies. RNA Biol. 2012 Nov; 9 (11): 1319-30. doi: 10.4161/ma.22269; Linares-Fernández S., Lacroix C., Exposito J.Y. et al. Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response. Trends Mol Med. 2020 Mar; 26 (3): 311-323. doi: 10.1016/j.molmed.2019.10.002; Xu S., Yang K., Li R., Zhang L. mRNA Vaccine Era-Mechanisms, Drug Platform and Clinical Prospection. Int J Mol Sci. 2020 Sep 9; 21 (18): 6582. doi: 10.3390/ijms21186582; Kim S.C., Sekhon S.S., Shin W.R. et al. Modifications of mRNA vaccine structural elements for improving mRNA stability and translation efficiency. Mol Cell Toxicol. 2022; 18 (l): l-8. doi: 10.1007/sl3273-021-00171-4].

Некоторые регуляторные элементы могут усиливать экспрессию белка на уровне инициации трансляции и на посттранскрипционном уровне [Kaufman R.J. Identification of the components necessary for adenovirus translational control and their utilization in cDNA expression vectors. Proc Natl Acad Sci USA. 1985 Feb; 82 (3): 689-93. doi: 10.1073/pnas.82.3.689. PMID: 2983309; PMCID: РМС397111].

Среди наиболее известных нетранслируемых последовательностей, которые приводят к высокой трансляционной эффективности, можно выделить последовательности глобиновых генов. В частности, для повышения трансляционной эффективности гетерологичных мРНК используются последовательности человеческого α и β-глобина [Babendure J.R., Babendure J.L., Ding J.H. et al. Control of mammalian translation by mRNA structure near caps. RNA. 2006 May; 12(5):851-61. doi: 10.1261/rna.2309906; Kozak M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mRNAs that affect translational efficiency. J Mol Biol. 1994 Jan 7; 235 (l): 95-110. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80019-1] и кроличьего β-глобина [Annweiler A., Hipskind R.A., Wirth T. A strategy for efficient in vitro translation of cDNAs using the rabbit beta-globin leader sequence. Nucleic Acids Res. 1991 Jul 11; 19 (13): 3750. doi: 10.1093/nar/19.13.3750]. Считается, что 5'-HTO кроличьего β-глобина обеспечивает эффективную зависимую от кэпа трансляцию и не содержит каких-либо вторичных структур или элементов последовательности, которые могут негативно влиять на трансляцию [Kozak М. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mRNAs that affect translational efficiency. J Mol Biol. 1994 Jan 7; 235 (1): 95-110. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80019-1]. Регуляторные последовательности глобиновых генов человека также используются в качестве 3'-НТО и обеспечивают высокую стабильность и трансляционную активность мРНК [Leppek К., Byeon G.W., Kladwang W. et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022 Mar 22; 13 (1): 1536. doi: 10.1038/s41467-022-28776-w].

Помимо регуляторных элементов глобиновых генов человека, в качестве гетерологичных НТО также используют последовательности 5'-НТО белка теплового шока 70 (БТШ70 или HSP70) и гистона Н3 [Rubtsova M.P., Sizova D.V., Dmitriev S.E. et al. Distinctive properties of the 5'-untranslated region of human hsp70 mRNA. J Biol Chem. 2003 Jun 20; 278 (25): 22350-6. doi: 10.1074/jbc.M303213200, Morris T., Marashi F., Weber L. et al. Involvement of the 5'-leader sequence in coupling the stability of a human H3 histone mRNA with DNA replication. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Feb; 83 (4): 981-5. doi: 10.1073/pnas.83.4.981]. Способность 5'-HTO БТШ70 обеспечивать высокий уровень трансляции гетерологичной мРНК, вероятно, связана с наличием IRES-подобных элементов и оптимальным GC составом [Schlake Т., Thess А., Fotin-Mleczek М. et al. Developing mRNA-vaccine technologies. RNA Biol. 2012 Nov; 9 (11): 1319-30. doi: 10.4161/rna.22269, Rubtsova M.P., Sizova D.V., Dmitriev S.E. et al. Distinctive properties of the 5'-untranslated region of human hsp70 mRNA. J Biol Chem. 2003 Jun 20; 278 (25): 22350-6. doi: 10.1074/jbc.M303213200]. Эффект 5'-НТО БТШ70 наблюдался в нескольких различных клеточных линиях [10.1046/j.1432-1327.2001.02064.x], показывая, что воздействие 5'-НТО, вероятно, не является специфичным для типа клеток. Известна последовательность 5'-НТО кроличьего β-глобина [GenBank: V00882.1, 224-276 позиции].

Суммируя данные по природным 5'-НТО, можно сделать вывод, что для усиления трансляционной эффективности гетерологичных мРНК часто используются регуляторные элементы конститутивно (постоянно) экспрессирующихся генов. Помимо применения природных регуляторных элементов, в настоящее время проводится интенсивный поиск оптимальной искусственной, не встречающейся в природе, последовательности 5'-НТО [Cao J., Novoa E.M., Zhang Z. et al. High-throughput 5' UTR engineering for enhanced protein production in non-viral gene therapies. Nat Commun. 2021 Jul 6; 12 (1): 4138. doi: 10.1038/s41467-021-24436-7].

Развитие высокопроизводительных полногеномных методик секвенирования позволило накопить большой пласт данных по регуляторным последовательностям мРНК у различных организмов. Системный анализ таких данных с помощью биоинформатических инструментов позволяет выявить общие закономерности, характерные для наиболее эффективных регуляторных последовательностей.

В настоящее время в мире известны мРНК-вакцины, дошедшие до стадии коммерческого использования, двух производителей: ModeRNA и BioNTech.

В мРНК-вакцинах компании ModeRNA используют 5'-НТО с последовательностью Seq Id №: 2 [источники: US 10881730 B2, Seq Id No.: 181; Jeong D.-E., McCoy M., Artiles K. et al. Assembhes-of-Putative-SARS-CoV2-Spike-Encoding-mRNA-Sequences-for-Vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273, доступна онлайн по адресу: https://virological.org/t/assemblies-of-putative-sars-cov2-spike-encoding-mrna-sequences-for-vaccines-bnt-162b2-and-mrna-1273/663, дата обращения 02.07.2024; Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and ModeRNA mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3; 9 (7): 734. doi: 10.3390/vaccmes9070734].

Несмотря на интенсивный поиск регуляторных элементов для использования в составе гетерологичных рекомбинантных РНК, уровень трансляции белка на матрице мРНК с наилучшими регуляторными элементами, драматически снижается уже через 24 часа после введения препарата мРНК [патенты РФ № 2720934 и 2783165]. Поэтому поиск оптимальных последовательностей 5'- и 3'-НТО, которые будут более эффективны по сравнению с существующими аналогами, является приоритетной задачей. Причем, по всей видимости, 5'- НТО играет ключевую роль в эффективности трансляции [Reshetnikov V., Terenin I., Shepelkova G. et al. Untranslated Region Sequences and the Efficacy of mRNA Vaccines against Tuberculosis. Int J Mol Sci. 2024; 25 (2): 888. Published 2024 Jan 10. doi:10.3390/ijms25020888], поэтому мы решили сфокусироваться на оптимизации именно 5'- НТО.

Раскрытие сущности изобретения

Одной из возможных технических задач, на решение которой направлено настоящее изобретение, являлось создание рекомбинантной РНК, обладающей повышенной стабильностью и/или эффективностью трансляции, а также средств для получения такой РНК.

Недостаточная трансляционная эффективность молекул матричной РНК, приводит к низкому уровню экспрессии целевого белка. За эффективность трансляции отвечают регуляторные элементы РНК, в частности, 5'-нетранслируемая область (НТО).

Технический результат, достигаемый при осуществлении настоящего изобретения, состоит в статистически достоверном увеличении количества белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты, содержащей Seq Id №: 1 в составе 5'-НТО, по сравнению с количеством белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты, содержащей 5'-НТО, используемой в составе мРНК-вакцин RNA-1273 производства компании ModeRNA, как минимум на протяжении первых 72 часов после введения в клетки.

Задача может решаться созданием молекулы РНК, содержащей уникальную последовательность 5'-НТО, активную в отношении эффективности трансляции и/или стабильности нуклеиновой кислоты.

Задача может решаться тем, что создана нуклеиновая кислота, предназначенная для транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, содержащая, в направлении транскрипции 5'→3':

(а) промотор;

(б) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (а), кодирует 5'-нетранслируемую область транскрипта;

(в) транскрибируемую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или белок;

(г) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (а), кодирует 3'-нетранслируемую область транскрипта,

причем упомянутая 5'-нетранслируемая область содержит последовательность Seq Id №: 1,

где последовательности нуклеиновой кислоты (б)-(г) под контролем промотора (а) могут быть транскрибированы с образованием общего транскрипта, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированные с последовательностей нуклеиновой кислоты (б) и (г), являются активными в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированной с транскрибируемой последовательности нуклеиновой кислоты (в).

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается РНК с повышенной стабильностью, предназначенная для трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, получаемая в результате транскрипции с применением любого варианта молекулы нуклеиновой кислоты, описанного выше.

В одном из вариантов осуществления изобретения РНК с повышенной стабильностью, предназначенная для трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, содержит в направлении 5'→3':

(а) 5'-нетранслируемую область;

(б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или белок;

(в) 3'-нетранслируемую область,

причем упомянутая 5'-нетранслируемая область содержит последовательность Seq Id №: 1,

где последовательности нуклеиновой кислоты (а) и (в) являются активными в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть использована для in vitro синтеза РНК, которая в дальнейшем может быть капсулирована в липидные наночастицы для получения РНК-вакцины.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлены результаты оценки относительной биолюминесценции люциферазы, синтезированной с матричных РНК с различными вариантами 5'- НТО в клеточной линии DC2.4.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Статистически достоверные различия обозначены:

мРНК ModeRNA * - p-values<0,05; *** -p-values<0,001

Условные обозначения: 1 Synth - РНК, содержащая последовательность Seq Id No.: 1 в качестве 5'-НТО; Moderna - РНК, содержащая последовательность Seq Id No.: 2 в качестве 5'-НТО.

Осуществление изобретения

Если не указано иначе, предполагается, что все термины, обозначения и другие научные термины, используемые в данной заявке, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях определения терминов с общепринятыми значениями приведены в данной заявке для ясности и/или для быстрой справки и понимания, и включение таких определений в настоящее описание не должно истолковываться как наличие существенного отличия значения термина от обычно подразумеваемого в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

Изобретение основано на повышении эффективности трансляции на матрице мРНК, содержащей последовательность Seq Id No.: 1 в качестве 5'-нетранслируемой области мРНК. Нуклеотидная последовательность Seq Id No.: 1 была получена при помощи алгоритма Optimus 5-Prime [Sample P.J., Wang В., Reid D.W., Presnyak V., McFadyen I.J., Morris D.R., Seelig G. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nature biotechnology. 2019 Jul; 37 (7): 803-9]. Optimus 5-Prime - метод предсказания средней загруженности транскрипта рибосомами (mean ribosomal loading; MRL), основанный на использовании сверточных нейронных сетей (convolutional neural network). В качестве обучающей выборки авторы модели использовали данные массового параллельного исследования репортерных последовательностей (massive parallel reporter assay; MPRA), позволяющий в одном эксперименте сравнить эффективность трансляции для десятков тысяч различных 5'-НТО. С помощью этого алгоритма была получена последовательность с наибольшим значением MRL=7,9, которая в дальнейшем была оптимизирована для эффективного включения синтетического аналога кэпа в процессе in vitro транскрипции.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается нуклеиновая кислота, предназначенная для транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, содержащая, в направлении транскрипции 5'→3':

(а) промотор;

(б) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (а), кодирует 5'-нетранслируемую область транскрипта;

(в) транскрибируемую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или белок;

(г) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (а), кодирует 3'-нетранслируемую область транскрипта,

причем упомянутая 5'-нетранслируемая область содержит последовательность Seq Id №: 1,

где последовательности нуклеиновой кислоты (б)-(г) под контролем промотора (а) могут быть транскрибированы с образованием общего транскрипта, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированные с последовательностей нуклеиновой кислоты (б) и (г), являются активными в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированной с транскрибируемой последовательности нуклеиновой кислоты (в).

Выражение «промотор» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая распознается РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции.

Выражение «последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной, кодирует 5'-нетранслируемую область транскрипта» относится к последовательности нуклеиновой кислоты антисмысловой цепи, кодирующей упомянутую 5'-нетранслируемую область, что предусматривает наличие у данной нуклеиновой кислоты смысловой цепи, содержащей ту же последовательность, что и у 5'-нетранслируемой области транскрипта, за исключением замены урацила на тимин.

Термин «5'-нетранслируемая область» или «5'-НТО» относится к лидерной последовательности: некодирующему участку мРНК, располагающемуся сразу после промотора, но перед кодирующей областью. Используемый здесь термин «5'-нетранслируемая область» или «5'-НТО» также охватывает последовательность ДНК, которая может быть транскрибирована в последовательность РНК, представляющую собой 5'-нетранслируемую область.

Выражение «нетранслируемая область гена» относится к последовательности НТО как в самом гене, так и в его транскрипте.

Выражение «последовательность lSynth» относится к последовательности нуклеиновой кислоты Seq Id №: 1

которая не встречается среди известных последовательностей и была получена на основе биоинформатического алгоритма.

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается РНК с повышенной стабильностью и/или трансляционной эффективностью, предназначенная для трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, получаемая в результате транскрипции с применением любого варианта молекулы нуклеиновой кислоты, описанного выше. РНК по настоящему изобретению может быть получена любым известным из уровня техники способом транскрипции с матрицы нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области известны такие способы, выбор конкретного не является существенным и зависит от целей и задач исследования или личных предпочтений специалиста.

В одном из вариантов осуществления изобретения РНК с повышенной стабильностью, предназначенная для трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, содержит в направлении 5'→3':

(а) 5'-нетранслируемую область;

(б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или белок;

(в) 3'-нетранслируемую область,

причем упомянутая 5'-нетранслируемая область содержит последовательность Seq Id №: 1,

где последовательности нуклеиновой кислоты (а) и (в) являются активными в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть использована для in vitro синтеза РНК, которая в дальнейшем может быть капсулирована в липидные наночастицы для получения РНК-вакцины.

Способы введения РНК по настоящему изобретению в живые клетки, векторы для такого введения, капсулирование в липидные наночастицы и сам состав липидных наночастиц, описываемые в примерах осуществления настоящего изобретения, не являются существенными, не влияют на технический результат изобретения и не ограничивают объем прав настоящего изобретения.

Использование нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, содержащей последовательность Seq Id No.: 1 в качестве 5'-НТО, демонстрирует увеличение экспрессии гена интереса по сравнению с другими вариантами, в том числе коммерчески доступными, по меньшей мере на протяжении первых 72 часов после введения в клетки. В генетической конструкции по настоящему изобретению с геном, кодирующим люциферазу, было показано статистически значимое увеличение биолюминесценции, которая характеризует количество белка люциферазы. Таким образом, использование нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению приводит к статистически значимому увеличению количества белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты, содержащей Seq Id №: 1 в составе 5'-НТО, по сравнению с количеством белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты, содержащей 5'-НТО, используемой в составе мРНК-вакцин RNA-1273 производства компании ModeRNA, как минимум на протяжении первых 72 часов после введения в клетки.

Сущность и промышленная применимость изобретения поясняется следующими примерами осуществления изобретения.

Пример 1. Получение конструкции с последовательностью Seq Id No.: 1 в качестве 5'-НТО

В качестве вектора для вставки была использована плазмида pSmart (Lucigen, США), содержащая последовательность Т7 промотора, гена устойчивости к ампициллину и гена, кодирующего люциферазу светлячка (Photinus pyralis), последовательность 3'-НТО альфа глобина человека и последовательность из 110 аденинов (поли(А)-хвост) после 3'-НТО.

Амплификацию целевой последовательности осуществляли путем сшивки фрагментов ДНК методом ПЦР с перекрывающимися праймерами. Затем методом ПЦР с перекрьшающимися праймерами ампликоны целевых последовательностей, кодирующих 5'-НТО и 3'-НТО, были соединены с последовательностью, кодирующей люциферазу светлячка (Photinus pyralis), которая была амплифицирована с вектора р Smart. В результате был получен ампликон 5'-НТО-люцифераза-3'-НТО. Затем методом ПЦР с фланкирующими праймерами к полученному ампликону были добавлены последовательности сайтов рестрикции EcoRI (G/AATTC) и Bg1II (A/GATCT). Полученный ампликон с введенными сайтами для эндонуклеаз рестрикции ДНК инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и Bg1II, очищали на агарозном геле и лигировали с аналогично подготовленным коммерческим вектором pSmart (Lucigen, США).

Для трансформации использовали штамм Escherichia coli NEB-stable (New England Biolabs, UK). Клоны отбирали методом ПЦР с колоний и подтверждали последовательность вставки секвенированием. Культивирование Е. coli для наработки верифицированной плазмиды проводили на шейкере-инкубаторе при 30°С и 180 оборотах в минуту. Затем с помощью набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen, США) проводили выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Полученный препарат плазмиды линеаризовали по уникальному сайту рестрикции SpeI с последующей визуализацией в агарозном геле.

Пример 2. Транскрипция мРНК in vitro

С матрицы плазмиды, полученной как описано в Примере 1, синтезировали мРНК in vitro.

In vitro транскрипцию проводили в буфере, содержащем 20 мМ дитиотреитола (ДТТ), 2 мМ спермидина, 80 мМ HEPES-KOH рН 7,4, 24 мМ MgCl₂. Реакционная смесь также содержала по 3 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов (Биосан, Новосибирск), 12 мМ аналога кэпа ARCA (Биолабмикс, Новосибирск), а также остальные компоненты реакции транскрипции, из расчета на 100 мкл реакции: 40 единиц ингибитора рибонуклеаз RiboCare (Евроген, Москва), 500 единиц Т7 РНК-полимеразы (Биолабмикс, Новосибирск), 5 мкг линеаризованной плазмиды и 1 мкл смеси ферментов из набора RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega, США) в качестве источника неорганической пирофосфатазы. Реакцию проводили 2 часа при температуре 37°С, после чего в реакцию добавляли еще по 3 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов и дополнительно инкубировали в течение 2 часов. ДНК гидролизовали при помощи нуклеазы RQ1 (Promega, США), РНК осаждали добавлением LiC1 до концентрации 0,32 М и EDTA рН 8,0 до концентрации 20 мМ с последующей инкубацией на льду в течение часа. Далее раствор центрифугировали в течение 15 минут при 25000 g и 4°С. Осадок РНК промывали 70% этанолом, растворяли в ультрачистой воде и переосаждали спиртом по стандартной методике. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) при длине волны 260 нм.

Пример 3. Эффективность трансляции и/или стабильности нуклеиновой кислоты in vitro на антиген-презентующих клетках DC2.4

Эффективность трансляции in vitro оценивали по количеству синтезированного белка (люциферазы светлячка, Photinus pyralis) с мРНК в культуре дендритных клеток мыши DC2.4. Измерение биолюминесценции белка после добавления субстрата проводили через 4, 8, 24 и 72 часа после введения мРНК. В качестве вектора для доставки мРНК в культуры клеток использовали трансфекционный агент липофектамин (Lipofectamine® 3000, Thermo Fisher Scientific).

Клетки DC2.4 выращивали в среде RPMI-1640 (Capricorn), содержащей 10% FBS (HyClone), 50 мкм бета-меркаптоэтанола, аланил-глутамин и витамины. За сутки до трансфекции клетки DC2.4 высевали в лунки 96-луночного планшета, содержащие по 0,1 мл культуральной среды, в количестве 30 тыс.клеток на лунку. Все образцы мРНК разводили до концентрации 100 нг/мкл, аликвотировали, замораживали и хранили при -80°С. Для трансфекции в отдельной пробирке готовили раствор референсной мРНК и экспериментальной мРНК в стерильном фосфатном буфере (рН=7,5) из расчета 25 мкл буфера и 50 нг каждой РНК на одну лунку. Референсная мРНК содержала последовательность люциферазы Nanoluc (Seq Id No.: 3) и использовалась в качестве внутреннего контроля экспрессии люциферазы. Далее в отдельной пробирке приготовляли раствор трансфицирующего реагента липофектамина (Lipofectamine® 3000, Thermo Fisher Scientific) в стерильном фосфатном буфере рН=7,5 из расчета 0,25 мкл реагента и 25 мкл PBS на лунку. В соответствии с протоколом фирмы-производителя реагент инкубировали в PBS при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего смешивали 25 мкл раствора PBS, содержащей экспериментальную и референсную мРНК, с 25 мкл раствора трансфекционного агента, затем инкубировали смесь 15 минут. Далее трансфицирующую смесь в объеме 50 мкл на лунку добавляли по каплям к клеткам и инкубировали клетки 4, 8, 24 или 72 часа. Затем удаляли кондиционированную среду, промывали клетки фосфатным буфером рН 7,5, снимали с субстрата, лизировали при помощи лизирующего буфера Dual Luciferase Assay (Promega, США) и анализировали интенсивность биолюминесценции люциферазы при помощи набора Dual Luciferase Assay (Promega, США). Для сравнения брали мРНК, отличающиеся 5'-НТО: мРНК с НТО от компании ModeRNA содержала последовательность 5'-НТО Seq Id №: 2. мРНК были получены, как описано в Примере 1 и 2. Результаты представлены на Фиг. 1.

Результаты in vitro на клеточной линии DC2.4 свидетельствуют о том, что интенсивность биолюминесценции, после трансфекции мРНК с последовательностью Seq Id No.: 1 (1 Synth) в качестве 5'-НТО по настоящему изобретению была статистически достоверно выше во всех временных точках по сравнению с РНК с последовательностью 5'-НТО, содержащейся в вакцине RNA-1273 компании ModeRNA. Интенсивность биолюминесценции отражает количество транслируемого с нуклеиновой кислоты белка, которое в свою очередь характеризует эффективность трансляции и/или стабильность нуклеиновой кислоты, таким образом полученные результаты свидетельствуют о достижении технического результата.

Статистический анализ данных проводили с помощью Т-теста Стьюдента. Статистические расчеты проводили в программе STATISTICA 8.

Приведенные выше примеры, не ограничивая объем прав настоящего изобретения, подтверждают достижение технического результата при осуществлении настоящего изобретения, а именно достижение статистически значимого увеличения количества белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты, содержащей Seq Id №: 1 в составе 5'-НТО, по сравнению с количеством белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты, содержащей 5'-НТО, используемую в составе мРНК-вакцин производства компании ModeRNA, в том числе как минимум на протяжении первых 72 часов после введения в клетки.

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.

Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="1Synth_listing.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-07-29">

<ApplicantFileReference>63-1Synth</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Автономная некоммерческая

образовательная организация высшего образования

&quot;Научно-Технологический Университет

&quot;Сириус&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Sirius University of Science and

Technology</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Нуклеиновая кислота, содержащая

синтетическую регуляторную последовательность</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>101</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..101</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatcggatatccgctaacgtagcttaacggatcgtatacggtaactgtg

tatatagccgccagtgtcgcactgtagaccgaggtctgatctagtaggcaga</INSDSeq_sequence

>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>57</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..57</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggaaataagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagaccccggcg

ccgccacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>513</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..513</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccg

gctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgt

aactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccg

tatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatg

atcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcga

ctatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctg

tggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaacca

tcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложена нуклеиновая кислота, предназначенная для транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует 5'-нетранслируемую область транскрипта, содержащую SEQ ID No: 1. Также предложена РНК, предназначенная для трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок. Изобретения позволяют получить РНК с повышенной стабильностью и/или повысить экспрессию гена интереса и таким образом увеличить количество белка, транслируемого с нуклеиновой кислоты. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 3 пр.

1. Нуклеиновая кислота, предназначенная для транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, содержащая в направлении транскрипции 5'→3':

(а) промотор;

(б) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (a), кодирует 5'-нетранслируемую область транскрипта;

(в) транскрибируемую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или белок;

(г) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (a), кодирует 3'-нетранслируемую область транскрипта,

причем упомянутая 5'-нетранслируемая область содержит последовательность SEQ ID No: 1,

где последовательности нуклеиновой кислоты (б) - (г) под контролем промотора (а) могут быть транскрибированы с образованием общего транскрипта, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированные с последовательностей нуклеиновой кислоты (б) и (г), являются активными в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированной с транскрибируемой последовательности нуклеиновой кислоты (в).

2. РНК, предназначенная для трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок, содержащая в направлении 5'→3':

(а) 5'-нетранслируемую область;

(б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или белок;

(в) 3'-нетранслируемую область,

причем упомянутая 5'-нетранслируемая область содержит последовательность SEQ ID No: 1,

где последовательности нуклеиновой кислоты (а) и (в) являются активными в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или белок.