СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО АМПЛИФИКАЦИОННОГО АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6851 G16B99/00 G16B40/10 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к осуществлению и мониторингу колориметрических амплификационных анализов нуклеиновых кислот в реальном времени.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Понимание живых организмов в терминах их молекулярного состава привело к дизайну все более быстрых и точных диагностических тестов, в основном, на основе амплификации и количественного анализа нуклеиновых кислот. Оно также привело к новой тенденции в молекулярной диагностике, состоящей в необходимости наличия конкретного диагностического анализа в центре, в котором образец получают или в котором лечат пациента (тестирование "в месте оказания медицинской помощи"). В случае тестирования в месте оказания медицинской помощи дизайн все более быстрых и точных диагностических анализов, в основном, на основе амплификации и количественного анализа нуклеиновой кислоты в настоящее время является развивающейся областью с обширным использованием в здравоохранении, сельскохозяйственной/пищевой безопасности, исследованиях и т.д. Одним из наиболее широко распространенных анализов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой используют фермент полимеразу, с помощью которого экспоненциально амплифицируют специфическую мишень после нескольких циклов нагревания. Каждый цикл включает три стадии: 1. Нагревание при 92-98°C для денатурации двухцепочечной ДНК 2. Отжиг специфических праймеров при 50-65°C; и 3. Элонгацию цепей с помощью полимеразы при 72°C. Эффективного нагревания, необходимого для быстрого и корректного образования продукта, достигают посредством помещения реакционного сосуда (как правило, пробирки Eppendorf) в нагревательный (металлический) блок, как правило, располагаемый на нагревательном элементе. ПЦР, хотя и является золотым стандартом лабораторной детекции нуклеиновых кислот и подходит для детекции по конечной точке и количественной детекции в реальном времени, неидеальна для использования в месте оказания медицинской помощи или полевых (реальных) условиях. Причиной этого является то, что в случае ПЦР необходимо оборудование для усовершенствованного контроля температуры и оптического (флуоресцентного) мониторинга, являющегося дорогостоящим и/или трудным для перемещения вместе с пользователем. Один из альтернативных способов амплификации ДНК, петлевую изотермическую амплификацию (LAMP), считают идеальным для использования в месте оказания медицинской помощи (POC), т.к. в нем необходима только одна температура для амплификации (65°C), и с помощью него можно достигать визуальной детекции ДНК по изменению цвета (колориметрически). В колориметрических условиях LAMP-амплификации реакционный сосуд помещают внутрь нагревательного блока, схожего с используемым для ПЦР. Существующие форматы колориметрического способа LAMP основаны только на измерении по конечной точке. Однако они имеют два основных недостатка; во-первых, изменение цвета зачастую трудно определить невооруженным взглядом, и, во-вторых, измерения по конечной точке можно использовать в качестве качественных тестов (да или нет), что может не соответствовать многим важным областям использования. В настоящее время, нет доступного решения этих проблем.

Ключевой признак, который, при его разрешении, позволил бы преодолеть указанные препятствия и осуществлять колориметрическую амплификацию нуклеиновой кислоты в реальном времени, относится к изобретению способа мониторинга изменения цвета раствора во время протекания процесса при комбинировании с одновременным эффективным нагреванием реакционной смеси. Все используемые в настоящее времени форматы основаны на помещении реакционного сосуда внутрь нагревательного блока, что делает возможной эффективную амплификацию при необходимой повышенной температуре. Это означает, что визуального мониторинга, такого как осмотр и детекция, можно достигать только для верхней части сосуда. Однако, т.к. в течение реакции амплификации сосуд нагревают, часть жидкого образца преобразуется в пар, что мешает каким-либо образом осуществлять колориметрический мониторинг в реальном времени сверху реакционного сосуда. По этой причине, существующие форматы колориметрического способа LAMP основаны только на измерении по конечной точке после того, как образцу позволяют охладиться до комнатной температуры. Это означает, что при использовании существующих форматов невозможно осуществлять колориметрический мониторинг в реальном времени.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения разработали способ преобразования в ином случае качественных колориметрических амплификационных анализов нуклеиновой кислоты, например, анализов LAMP, в количественные способы и, как правило, способы анализа в реальном времени. Для достижения этого они разработали способ и устройство для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Одним из важных аспектов настоящего изобретения является нагревание жидкого образца без помещения образца в нагревательный блок. Этого достигают посредством приведения дна реакционной пробирки, содержащей образец, в термический контакт с нагревательным элементом. Способ облегчает визуальный мониторинг, т.к. он делает возможной визуализацию содержимого сосуда через боковую стенку реакционной пробирки. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу мониторинга колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот с использованием указанного выше способа нагревания и с использованием визуального мониторинга, например, с использованием фотовидеокамеры.

Кроме того, настоящее изобретение относится к устройству для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показаны разные части реакционной пробирки и след дна реакционной пробирки.

На фигуре 2 показана схема устройства по настоящему изобретению.

На фигуре 3 показан вариант осуществления устройства по настоящему изобретению.

На фигуре 4 показано расположение реакционных пробирок в устройстве по настоящему изобретению.

На фигуре 5 показаны экспериментальные данные анализа LAMP, осуществленного по настоящему изобретению, с использованием фенолового красного и гидроксинафтол синего (HNB) в качестве цветных веществ-индикаторов.

На фигуре 6 показаны экспериментальные данные анализа LAMP, осуществленного по настоящему изобретению, с использованием фенолового красного в качестве цветного вещества-индикатора под разным давлением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В амплификационных анализах нуклеиновых кислот, жидкий образец, как правило, содержится в реакционной пробирке, зачастую названной пробиркой Eppendorf. Как правило, такую пробирку получают из полимерного материала, такого как полипропелен, и она имеет объем от 10 мл до 200 мл. Реакционные пробирки, схожие с коммерчески доступными пробирками Eppendorf, можно производить с использованием оптически прозрачных/полупрозрачных материалов и 3D-печати.

В системах на предшествующем уровне техники для нагревания жидкой фазы до необходимой температуры пробирку помещают в нагревательный блок.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что помещение сосуда внутрь нагревательного блока не является обязательным для эффективной амплификации, и что жидкую фазу можно нагревать посредством приведения дна пробирки, содержащей жидкую фазу, в термический контакт с нагревательным элементом.

В рамках изобретения "верх пробирки" или "верх реакционной пробирки" представляет собой отверстие, через которое жидкий образец помещают в пробирку. "Дно пробирки" или "дно реакционной пробирки" является частью пробирки, противоположной верху пробирки. На фигуре 1a показан верх (1), дно (2) и боковая стенка (3) реакционной пробирки.

В рамках изобретения реакционную пробирку можно располагать непосредственно на поверхности нагревательного элемента. Кроме того, нагревательный элемент может содержать поверхность, полученную из теплопроводного материала, на котором можно располагать реакционную пробирку. Нагревательный элемент, как правило, представляет собой резистивный нагреватель или элемент Пельтье.

Предпочтительно, при помещении на нагревательный элемент продольная ось пробирки образует угол с нагревательным элементом, составляющий от 60 до 120 градусов. Более предпочтительно, угол, предпочтительно является прямым углом.

Для эффективного амплификационного анализа нуклеиновых кислот эффективное нагревание жидкой фазы является одним из наиболее важным условий. На существующем уровне техники известно, что для эффективного нагревания жидкой фазы большая площадь реакционной пробирки должна находиться в термическом контакте с нагреваемым корпусом. По этой причине реакционную пробирку необходимо помещать в металлический блок, окружающий почти всю пробирку, и она находится в термическом контакте с дном и боковой стенкой пробирки. Это означает, что на предшествующем уровне техники известно, что для эффективного нагревания почти вся поверхность пробирки должна находиться в термическом контакте с нагреваемым корпусом. Теперь неожиданно обнаружено, что эффективного нагревания можно достигать посредством приведения только дна пробирки, т.е. очень небольшой части пробирки, в термический контакт с нагревательным элементом.

Предпочтительно, площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте, с нагревательным элементом, составляет до 12 мм². Более предпочтительно, площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом, составляет до 6 мм². Даже более предпочтительно, площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом, составляет до 3 мм². Площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом, можно определять посредством установления следа дна пробирки, как показано на фигуре 1 b. Сначала дно пробирки окрашивают, например, маркером, а затем пробиркой давят на кусок бумаги (4) для получения кольцевого следа (5) дна пробирки. Площадь следа является площадью пробирки, находящейся в термическом контакте с нагревательным элементом.

Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что эффективность способа нагревания по настоящему изобретению можно повышать, прилагая давление к пробирке в направлении нагревательного элемента. Например, делая так, значительно уменьшают количество времени, необходимое до начала реакции амплификации. Этот аспект очень важен, особенно при использовании в месте оказания медицинской помощи, где анализ необходимо осуществлять за как можно более короткое время. Предпочтительно, давление, прилагаемое к реакционной пробирке, является таким, что давление, прилагаемое к нагревательному элементу с помощью пробирки, составляет от 0,4 мПа до 15 мПа. Более предпочтительно, давление, прилагаемое к нагревательному элементу с помощью пробирки, составляет от 1 мПа до 10 мПа. Даже более предпочтительно, давление, прилагаемое к нагревательному элементу с помощью пробирки, составляет от 1 мПа до 3 мПа. Давление можно корректировать разными способами, хорошо известными специалисту в этой области. Например, давление можно корректировать, прилагая разные веса к пробирке, или с использованием системы винтов, или с использованием системы магнитов. Давление можно определять способами, хорошо известными специалисту в этой области. Например, давление можно вычислять посредством измерения перпендикулярной силы, прилагаемой к нагревательному элементу с помощью пробирки, затем измеряя площадь пробирки, находящуюся в контакте с нагревательным элементом, как описано выше, и, в конечном итоге, разделяя значение перпендикулярной силы на площадь.

Амплификационный анализ нуклеиновых кислот может являться, например, изотермическим амплификационным анализом, таким как транскрипционно-опосредованная амплификация, амплификация, основанная на последовательности нуклеиновой кислоты, технология сигнал-опосредованной амплификации РНК, амплификация с замещением цепей, амплификация по типу катящегося кольца, LAMP, изотермическая амплификация с множественным замещением, рекомбиназная полимеразная амплификация, хеликаза-завивисмая амплификация, изотермическая амплификация одиночным праймером и хеликаза-зависимая амплификация по типу катящегося кольца. Предпочтительно, анализ является анализом LAMP.

Эффективность способа нагревания по настоящему изобретению является такой же, как у способов на предшествующем уровне техники, в которых пробирку помещают в нагревательный блок. С другой стороны, способ нагревания по настоящему изобретению имеет более высокую эффективность в отношении потребления электроэнергии, т.к. количество энергии, необходимое для нагревания жидкой фазы, является меньшим.

Другое преимущество способа нагревания по настоящему изобретению состоит в том, что, если пробирку получают из полупрозрачного или прозрачного материала, содержимое пробирки является видимым не только сверху пробирки, но, что более важно, через боковую стенку. Это означает, что визуальный мониторинг параметра анализа, такого как изменение цвета в колориметрическом анализе LAMP, становится возможным во время анализа. Это является результатом того, что испарение образца во время реакции амплификации не мешает мониторингу. Таким образом, способ нагревания по настоящему изобретению делает возможным мониторинг анализа в реальном времени.

Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способу осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, где способ включает нагревание жидкой фазы посредством приведения дна пробирки, содержащей жидкую фазу, в термический контакт с нагревательным элементом и использование визуального мониторинга параметра анализа в реальном времени.

Визуальный мониторинг включает мониторинг с помощью зрения пользователя, а также мониторинг с помощью фотовидеокамеры. Предпочтительно, мониторинг осуществляют с помощью фотовидеокамеры.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором использую цифровую цветную фотовидеокамеру для мониторинга изменений цвета жидкого образца в реальном времени из-за образования, реакции или изменения цвета окрашенного вещества.

В этом предпочтительном варианте осуществления способ включает использование цифровой цветной фотовидеокамеры для регистрации одного или более изображений жидкого образца, обработку для каждого изображения одного или более из данных по красному каналу, данных по зеленому каналу и данных по синему каналу, полученных из изображения, и, таким образом, получение параметра анализа.

При анализе по конечной точке способ, как правило, включает регистрацию и обработку отдельного изображения. Если способ включает регистрацию и обработку данных, полученных для множества изображений, серия изображений может образовывать видео.

Параметром анализа, например, может являться наличие аналита, или его количество, или эффективность реакции амплификации нуклеиновых кислот, такой как LAMP.

Окрашенное вещество содержит вещество, образующееся, или потребляемое, или изменяющее свой цвет во время анализа. Изменение цвета, например, может происходить в ответ на изменение pH или химическую реакцию. Изменение цвета может включать изменение из одного цвета в другой или из цвета в прозрачное состояние или наоборот.

Примеры цветных веществ, используемых в амплификационных анализах нуклеиновых кислот, включают гидроксинафтол синий (HNB), феноловый красный, кальцеин, кристалл-виолет, SYBR green I, крезоловый красный, нейтральный красный, m-крезоловый фиолетовый, наночастицы золота, липосомы полидиацетилен (PDA) и другие вещества, хорошо известные специалисту в этой области.

Регистрация изображений и/или обработка данных, полученных из изображений, может включать одну или более стадий обработки изображений, такую как одно или более из изменения цветового режима, калибровки изображения и гамма-коррекции.

Как правило, изображение содержит пиксели, и стадия обработки включает извлечение уровня света, например его интенсивности, одного или более из красного, зеленого и синего из пикселей изображения и, таким образом, получая одно или более из данных красного, зеленого и синего канала, соответственно. Регистрируемый уровень (например, интенсивность) света можно представлять в пикселях изображения. Уровень может представлять собой интенсивность, например, интенсивность, регистрируемую по каналам фотовидеокамеры. Уровень может представлять собой значение цвета RGB, например, 8 бит, 16 бит, 24 бит или 32 бит.

Как правило, пиксель изображения, регистрируемый цифровой фотовидеокамерой, содержит элементы, каждый из которых представляет собой разные цветовые компоненты изображения. Цветовые компоненты, как правило, представляют собой красный, зеленый и синий, что соответствует красному, зеленому и синему каналам соответственно, хотя с помощью фотовидеокамеры можно регистрировать и/или изображения можно хранить с использованием данных в соответствии с разными цветовыми режимами, такими как CIECAM02, в которых используют яркость, цветность и цвет в качестве измерений.

Изображения могут являться мультипиксельными изображениями областей жидкой фазы. Изображения могут являться однопиксельными изображениями областями жидкой фазы, которые, например, можно получать с использованием оптического волокна или оптического волокна на цветовой канал. Изображения можно демонстрировать на экране компьютера, например, или любым другим способом, известным специалисту в области отображения изображений.

Стадия обработки по настоящему изобретению может включать вычисление значения из одного или более из данных по красному каналу, данных по зеленому каналу и данных по синему каналу, например, с выполнением математических действий.

Предпочтительно, стадия обработки включает вычисление различий между двумя из трех из данных по красному каналу, данных по зеленому каналу и данных по синему каналу. Более предпочтительно, стадия обработки включает вычисление различий между данными по красному каналу и данными по зеленому каналу или между данными по синему каналу и данными по зеленому каналу.

Можно получать запись видеоизображения жидкой фазы с помощью цифровой фотовидеокамеры. Затем такую запись видеоизображения можно разбивать на изображения-компоненты с использованием, например, аппаратного процессора. Видеоизображение может делать возможным мониторинг анализа жидкой фазы в реальном времени.

Другой аспект настоящего изобретения относится к устройству для осуществления способа по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к устройству для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, где устройство содержит

нагревательный элемент,

реакционную пробирку, полученную из полупрозрачного или прозрачного материала и расположенную таким образом, что дно пробирки находится в термическом контакте с нагревательным элементом,

цифровую цветную фотовидеокамеру, расположенную таким образом, что с помощью нее можно регистрировать изображения через боковую стенку реакционной пробирки, и

обрабатывающий модуль, сконфигурированный для обработки изображения, полученного с помощью цифровой цветной фотовидеокамеры, и обработки одного или более из данных по красному, зеленому и синему каналу изображения, чтобы, таким образом, получить параметр анализа.

Предпочтительно, устройство дополнительно содержит средства для приложения давления к реакционной пробирке в направлении нагревательного элемента.

Схема устройства по настоящему изобретению приведена на фигуре 2. Амплификацию нуклеиновых кислот осуществляют в реакционных пробирках (18), расположенных на нагревательном элементе (10) таким образом, что только дно пробирки находится в термическом контакте с нагревательным элементом. Фотовидеокамеру (13) располагают таким образом, что с помощью нее можно регистрировать изображения через боковую стенку реакционных пробирок. Выходной сигнал фотовидеокамеры (13) проходит через обрабатывающий модуль (22), такой как компьютер, имеющий процессор (23), устройство памяти (24) для хранения данных об изображениях и компьютерную программу, выполняемую процессором. Обрабатывающий модуль (22) может являться отдельным модулем, как показано на фигуре 2, или может являться интегральным компонентом фотовидеокамеры или другого устройства, включающего фотовидеокамеру.

На фигуре 3 показан вариант осуществления устройства по настоящему изобретению, которое можно использовать для осуществления и мониторинга амплификационного анализа нуклеиновых кислот, такого как колориметрический анализ LAMP.

Устройство содержит главный корпус (6), содержащий главный переключатель (8) и гнездо питания (9). Он дополнительно содержит нагревательный элемент (10), прикрепленный к главному корпусу (6) через держатель нагревательного элемента (11). Главный корпус (6) дополнительно содержит держатель фотовидеокамеры (12) для удержания модуля фотовидеокамеры (13) и светодиодные лампы (14) для подсвечивания содержимого реакционной пробирки. Главный корпус (6) дополнительно содержит микропроцессор и электронную плату (не показана) для обработки изображений, регистрируемых фотовидеокамерой.

Устройство дополнительно содержит кожух (7), содержащий четыре крупных магнита (15), взаимодействующие с соответствующими крупными магнитами (16) главного корпуса (6) и удерживающие кожух (7) в заданном положении при его размещении на главном корпусе (6).

Устройство дополнительно содержит держатель реакционной пробирки (17), содержащий слоты для удержания реакционных пробирок (18). Реакционные пробирки (18) получают из полупрозрачного материала. Держатель реакционной пробирки (17) дополнительно содержит фоновую стенку (19), имеющую белый цвет на стороне, обращенной к пробиркам (18), что облегчает мониторинг изменения цвета во время анализа.

Для осуществления анализа жидкий образец добавляют в реакционные пробирки (18), помещаемые в соответствующие слоты. Держатель реакционной пробирки (17) помещают на нагревательный элемент (10) (фигура 4a) таким образом, что дно реакционных пробирок (18) приводят в термический контакт с нагревательным элементом (10). Это позволяет с помощью фотовидеокамеры видеть жидкую фазу через боковую стенку пробирок (фигура 4b). Кожух (7) закрепляют в его положении посредством сцепления крупных магнитов (15) кожуха с крупными каналами (16) главного корпуса (6). Таким образом, держатель реакционной пробирки (17) закрепляют в его положении с помощью небольших магнитов (20), сцепляющихся с соответствующими небольшими магнитами (21) кожуха (7). Давление, прилагаемое с помощью дна пробирки (18) к нагревательному элементу (10), можно корректировать посредством модификации размера и/или количества крупных магнитов (15) и (16) на кожухе (7) и главном корпусе (6).

Во время анализа с помощью цифровой фотовидеокамеры регистрируют изображения, передаваемые в обрабатывающий модуль. Обрабатывающий модуль сконфигурирован для вычисления различий между красным и зеленым или синим и зеленым каналами. Изменения этих значений со временем обрабатывают для вычисления изменения цвета жидкой фазы.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Бактериальные клетки, ресуспендированные в буфере PBS, лизировали в течение 1 мин при 95°C. Ген инвазии invA Salmonella являлся мишенью для набора из шести праймеров, двух внешних (F3 и B3), двух внутренних (FIP и BIP) и двух петлевых (петля-F и петля-B).

FIP: GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG

BIP: CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG

F3: GGCGATATTGGTGTTTATGGGG

B3: AACGATAAACTGGACCACGG

Петля F: GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC

Петля B: GGGCAATTCGTTATTGGCGATAG

Смесь реагентов LAMP в общем объеме 25 мкл содержала 12,5 мкл стандартного или колориметрического 2-кратного мастер-микса WarmStart (New England BioLabs), в котором используют феноловый красный в качестве цветного вещества, 1,8 мМ FIP и BIP, 0,1 мМ F3 и B3, 0,4 мМ петля-F и петля-B и 1 мкл лизированных клеток в PBS. Реакции проводили в реакционных пробирках, помещенных в устройство, как показано на фигурах 3-4. Мониторинг анализа осуществляли посредством регистрации изображений содержимого пробирок с помощью цифровой фотовидеокамеры устройства.

Пример 2

Полученные изображения из примера 1 обрабатывали следующим образом.

Во-первых, получают последовательность изображений жидкой фазы, как описано выше. Исходные красный (R), зеленый (G) и синий (B) каналы от фотовидеокамеры можно подвергать обработке изображений, включая, например, гамма-коррекцию, калибровку цвета и т.д. Во-вторых, данные по красному, зеленому и синему каналам извлекают из одного или более пикселей каждого изображения.

На третьей стадии для каждого из красного, зеленого и синего каналов, для каждого момента времени, исходное значение красного, зеленого и синего канала вычитают для получения данных, начинающихся с нуля. Значение, которое вычитают, может являться значением красного, зеленого или синего, соответственно, в первом моменте времени, хотя, как правило, значения для ряда исходных моментов времени можно усреднять, или можно строить кривую и вычислять и вычитать интерцепт для нуля оси времени.

Затем вычисляют различия между двумя каналами. В случае примера протокола ниже с использованием фенолового красного вычисляют различия между значениями зеленого и синего (т.е. значения синего, полученные на предыдущей стадии, вычисляют из значений зеленого). Это осуществляют для каждого момента времени. В случае HNB вычисляют различия между значениями зеленого и красного.

Затем, необязательно, строят график различий, а затем анализируют для определения одного или более параметров анализа. Время, в котором вычисленное значение различий превышает пороговое значение, можно использовать для определения наличия или количества аналита, например, со ссылкой на контроль (который может представлять собой параллельное измерение одной или более реакций с известными концентрациями аналита и/или предварительно введенными в память данными). Колебания значений различий с течением времени также можно анализировать для определения эффективности реакции амплификации, а также для улучшения оценки количества аналита, например, посредством экстраполяции обратно к начальному времени.

На фиг. 5 показаны результаты сравнения мониторинга амплификации LAMP в реальном времени 2 положительных (инфицированных/присутствует 10 бактерий) образцов с использованием 2 разных цветных веществ; фенолового красного, являющегося индикатором pH, и, HNB, являющегося металл-связывающим индикатором. Изображения жидкой фазы регистрируют и анализируют автоматически как функцию времени с течением анализа. В каждом случае вычисляют различия между зеленым и синим каналами или зеленым и красным каналами. Давление, прилагаемое с помощью реакционных пробирок к нагревательному элементу в течение анализа, составляло 2 мПа.

На фигуре 5 показаны кривые в реальном времени во время амплификации LAMP 10 бактерий с использованием цветовых индикаторов фенолового красного или HNB. Различия между зеленым и синим каналами вычисляют для индикатора фенолового красного, в то время как для HNB используют различия между зелеными и красными пикселями. Из графиков видно, что в обоих случаях положительный сигнал можно наблюдать до 15-ой минуты реакции. Таким образом, можно определять, присутствует или отсутствует аналит (в этом случае - клетки Salmonella), и размер различий в указанный момент времени можно использовать для определения количества аналита, например, по сравнению с одним или более контролями.

Пример 3

В этом примере проиллюстрирован второй набор результатов сравнения положительного образца (инфицированного/присутствует Salmonella) и отрицательного образца (неинфицированного/Salmonella отсутствует) способом обработки изображений из примера 2. Цветным веществом, используемым в этом случае, является феноловый красный. Изображения жидкой фазы регистрируют как функцию времени с течением анализа. Вычисляют различия между зеленым и синим каналами.

На фигуре 6a показана колориметрическая детекция LAMP в реальном времени клеток Salmonella (положительный и отрицательный образец), осуществляемая в реакционных пробирках, помещенных в устройство, как показано на фигурах 3-4. Давление, прилагаемое с помощью пробирок к нагревательному элементу, составляло 0,4 мПа. Изменение цвета в случае положительной кривой начиналось на 23-й минуте. Максимальное изменение цвета (единицы цветового индекса), измеренное на минуте 30, составляет 17 единиц.

На фигуре 6b показан пример колориметрической детекции LAMP в реальном времени клеток Salmonella (положительный и отрицательный образец), осуществляемая так же, как описано в предыдущем абзаце. Однако, в этом случае давление, прилагаемое с помощью пробирок к нагревательному элементу, составляло 2 мПа. Изменение цвета в случае положительной кривой начинается на 17-ой минуте. Максимальное изменение цвета (единицы цветового индекса), измеренное на минуте 30, составляет 28 единиц. Детекция на 6 мин раньше в случае анализа экспоненциальной амплификации может приводить к чувствительности, улучшенной на 1-2 порядка величины.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> FOUNDATION FOR RESEARCH AND TECHNOLOGY HELLAS

<120> СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО

АМПЛИФИКАЦИОННОГО АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

<130> 270119

<140> EPPCT/2019/079845

<141> 2019-10-31

<150> EP18203833.1

<151> 2018-10-31

<160> 6

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 42

<212> ДНК

<213> Salmonella

<220>

<223> Внутренний праймер FIP для гена инвазии Salmonella invA

<400> 1

gacgactggt actgatcgat agtttttcaa cgtttcctgc gg 42

<210> 2

<211> 37

<212> ДНК

<213> Salmonella

<220>

<223> Внутренний праймер BIP для гена инвазии Salmonella invA

<400> 2

ccggtgaaat tatcgccaca caaaacccac cgccagg 37

<210> 3

<211> 22

<212> ДНК

<213> Salmonella

<220>

<223> Внешний праймер F3 для гена инвазии Salmonella invA

<400> 3

ggcgatattg gtgtttatgg gg 22

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Salmonella

<220>

<223> Внешний праймер B3 для гена инвазии Salmonella invA

<400> 4

aacgataaac tggaccacgg 20

<210> 5

<211> 23

<212> ДНК

<213> Salmonella

<220>

<223> Праймер петля-F для гена инвазии Salmonella invA

<400> 5

gacgaaagag cgtggtaatt aac 23

<210> 6

<211> 23

<212> ДНК

<213> Salmonella

<220>

<223> Праймер петля-B для гена инвазии Salmonella invA

<400> 6

gggcaattcg ttattggcga tag 23

<---

Группа изобретений относится к осуществлению и мониторингу колориметрических амплификационных анализов нуклеиновых кислот в реальном времени. Способ осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени в жидком образце, содержащемся в реакционной пробирке, включает нагревание жидкого образца посредством приведения дна реакционной пробирки в термический контакт с нагревательным элементом и приложение давления к реакционной пробирке в направлении нагревательного элемента. Устройство содержит нагревательный элемент, реакционную пробирку, полученную из полупрозрачного или прозрачного материала, средства для приложения давления к реакционной пробирке в направлении нагревательного элемента, цифровую цветную фотовидеокамеру, и обрабатывающий модуль, сконфигурированный для обработки изображения, полученного с помощью цифровой цветной фотовидеокамеры. Осуществление группы изобретений позволяет осуществлять мониторинг в реальном времени колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот с обеспечением при этом повышенной эффективности нагревания образца. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Способ осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени в жидком образце, содержащемся в реакционной пробирке (18), полученной из полупрозрачного или прозрачного материала, где способ включает

нагревание жидкого образца посредством приведения дна (2) реакционной пробирки (18) в термический контакт с нагревательным элементом (10) и приложение давления к реакционной пробирке (18) в направлении нагревательного элемента (10), и

визуальный мониторинг параметра анализа через боковую стенку (3) реакционной пробирки (18).

2. Способ по п.1, где давление, прикладываемое с помощью реакционной пробирки (18) к нагревательному элементу (10), составляет от 0,4 мПа до 15 мПа.

3. Способ по п.2, где давление, прикладываемое с помощью реакционной пробирки (18) к нагревательному элементу (10), составляет от 1 мПа до 10 мПа.

4. Способ по п.3, где давление, прикладываемое с помощью реакционной пробирки (18) к нагревательному элементу (10), составляет от 1 мПа до 3 мПа.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где продольная ось реакционной пробирки (18) образует угол от 60 до 120 градусов с нагревательным элементом (10).

6. Способ по п.5, где продольная ось реакционной пробирки (18) образует угол 90 градусов с нагревательным элементом (10).

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где площадь реакционной пробирки (18), находящейся в термическом контакте с нагревательным элементом (10), составляет до 12 мм².

8. Способ по п.7, где площадь реакционной пробирки (18), находящейся в термическом контакте с нагревательным элементом (10), составляет до 6 мм².

9. Способ по п.8, где площадь реакционной пробирки (18), находящейся в термическом контакте с нагревательным элементом (10), составляет до 3 мм².

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где реакционная пробирка (18) получена из прозрачного материала.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где мониторинг осуществляют с помощью цифровой фотовидеокамеры.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где амплификационный анализ нуклеиновых кислот является изотермическим амплификационным анализом нуклеиновых кислот.

13. Способ по п.12, где амплификационный анализ нуклеиновых кислот является анализом петлевой изотермической амплификации.

14. Устройство для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени способом по любому из пп.1-13, где устройство содержит

нагревательный элемент (10),

реакционную пробирку (18), полученную из полупрозрачного или прозрачного материала и расположенную таким образом, что дно (2) пробирки (18) находится в термическом контакте с нагревательным элементом (10),

средства (15, 16) для приложения давления к реакционной пробирке (18) в направлении нагревательного элемента (10),

цифровую цветную фотовидеокамеру, расположенную таким образом, что с помощью нее можно регистрировать изображения через боковую стенку (3) реакционной пробирки (18), и

обрабатывающий модуль, сконфигурированный для обработки изображения, полученного с помощью цифровой цветной фотовидеокамеры, и для обработки одного или более из данных по красному, зеленому и синему каналу изображения, чтобы таким образом получать параметр анализа.

15. Устройство по п.14, где давление, прилагаемое с помощью реакционной пробирки (18) к нагревательному элементу (10), составляет от 0,4 мПа до 15 мПа.

16. Устройство по п.15, где давление, прилагаемое с помощью реакционной пробирки (18) к нагревательному элементу (10), составляет от 1 мПа до 10 мПа.

17. Устройство по п.16, где давление, прилагаемое с помощью реакционной пробирки (18) к нагревательному элементу (10), составляет от 1 мПа до 3 мПа.

18. Устройство по любому из пп.14-17, где реакционную пробирку (18) получают из прозрачного материала.

19. Устройство по любому из пп.14-18, где площадь реакционной пробирки (18), находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом (10), составляет до 12 мм².

20. Устройство по п.19, где площадь реакционной пробирки (18), находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом (10), составляет до 6 мм².

21. Устройство по п.20, где площадь реакционной пробирки (18), находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом (10), составляет до 3 мм².

22. Устройство по любому из пп.14-21, где продольная ось реакционной пробирки (18) образует угол от 60 до 120 градусов с нагревательным элементом (10).

23. Устройство по п.22, где продольная ось реакционной пробирки (18) образует угол 90 градусов с нагревательным элементом (10).