СПОСОБ СОЗДАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ СКАФФОЛДОВ Российский патент 2023 года по МПК A61L15/00 A61L15/10 

Область техники

Изобретение относится к области медицинских биотехнологий и предназначено, как для использования в качестве основы при создании многоклеточных тканевых эквивалентов, так и в качестве ранозаживляющих повязок при обширных повреждениях кожных покровов.

Уровень техники

Создание искусственных скаффолдов для тканевой инженерии/ реконструкции, в частности для получения аналогов кожи человека, продолжает интенсивно развиваться, на основе новых современных биополимеров.

Общее сравнение биосовместимых скаффолдов с точки зрения их биологической безопасности и эффективности показывает, что список композитных материалов на основе биополимеров неживотного происхождения таких, как полисахариды (альгинаты, карбоксиметилцеллюлозы, хитозаны), белки (фиброин насекомых, коллаген рыб) для восстановления и биоинженерии кожных покровов, продолжает стремительно увеличиваться.

В случае значительных повреждений, восстановление кожных покровов, при которых рубцевание и повышенный риск инфицирования являются серьезными осложнениями, разработка новых биосовместимых и легко получаемых в лабораторных условиях материалах, представляет несомненный интерес.

Изобретение относится к области регенеративной медицины, тканевой инженерии и медицинских биотехнологий и касается разработки нового способа получения биосовместимых самоорганизующихся природных скаффолдов на основе мицелия грибов класса Basidiomicetes и их использования для восстановления поврежденных органов и тканей. Составляющие мицелий грибов клетки обладают способностью неограниченного апикального роста, позволяющего формировать длинные ветвящиеся гифы, которые переплетаясь между собой, образуют скаффолды(маты), подобно нетканым материалам, получаемым методом электроспиннинга.

Способы создания нетканых материалов, предназначенных для тканевой инженерии, в частности кожи, из различных био и особенно сополимеров, постоянно развиваются, оптимизируются и совершенствуются.

Так, способы создания нетканых высокостойких комбинированных материалов из растворов желатина и фибриногена с добавлением хитозана, для применения в различных медицинских целях, включая регенерацию тканей после ожогов и травм, представлены в патентах [KR 20130091825 (A), [WO 2012089222 (А2)].

Нетканый материал, с параметрами воздухопроницаемости, обеспечивающими предотвращение бактериальной контаминации ран, где в качестве биосовместимых, предполагается использование, как синтетических, так и натуральных полимеров (поливиниловый спирт, полиэтиленоксид, полиэтиленгликоль, PLA, PGA, коллаген, желатин, альгинат, альгиновая кислота, хитозан) в сочетании с антиоксидантом ацетил-L-цистеином, описан в патенте [KR 100791039 (B1)].

Оригинальный метод электроформования материалов из белковых и смешанных растворов белка и небелкового полимера, с одновременной сшивкой получаемого материала, решающий проблемы уменьшения удельной площади из-за взаимного влияния компонентов, представлен в патенте [CN 104250861 (A)].

Возможность получения методом электроформования нетканых материалов из различных смесей фиброина - нерастворимого природного белка, присутствующего в шелке членистоногих насекомых и, в отличие от других белков, являющимся неимуногенным описана в патентах [JP 2010270426 (А), WO 2004001103 (А2), KR 20160034564 (A)].

Способ получения нановолокон и каркасов методом электроформования из водных и водно-этанольных растворов полисахаридов и их смесей с поливиниловым спиртом в присутствии поверхностно-активных веществ показан в патентах [WO 2008128484 (А2), US 5197945 А].

Нетканые матриксы, изготовленные методом электроспиннинга из синтетического биоразлагаемого сополимера молочно-гликолевой кислоты (PLGA) и природных белков (желатин, эластин), представлены в патенте [US 8048446 B2].

Способы получения композитных нетканых материалов методом электроформования, представленные в современных патентах, демонстрируют возможность создания биосовместимых скаффолдов практически из любого биополимера. Полученные таким образом материалы, применимы для использования в различных областях биотехнологии и биомедицины, в частности, при восстановлении кожных покровов. Однако ряд существенных недостатков метода, среди которых и дорогостоящее оборудование, и высокая технологичность процесса, и стоимость биополимеров, диктуют необходимость поиска новых способов создания природоподобных материалов для использования в биомедицинских целях.

Созданию скаффолдов из мицелия грибов ксилотрофов класса Basidiomicetes, в настоящее время, посвящено только одно исследование, в котором представлена биосовместимость мицелиального скаффолда, полученного из лабораторного штамма Pleurotus ostreatus [Antinori М, Contardi М, Suarato G, Armirotti A, Bertorelli R, Mancini G, Debellis D, Athanassiou A, Advanced mycelium materials as potential self-growing biomedical scaffolds Sci Rep 2021 16 11(1) 12630].

Отличием предлагаемого изобретения является разработанная нами инновационная технология получения биосовместимых самоорганизующихся скаффолдов из природных мицелиев грибов класса Basidiomicetes, культивируемых в лабораторных условиях, и представление возможности их использования для восстановления поврежденных органов и тканей, в частности кожи человека, а также в виде ранозаживляющих повязок.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является совершенствование технологии, использующей мицелий грибов для производства биосовместимых самоорганизующихся скаффолдов, обладающих подобной внеклеточному матриксу структурой, способной поддерживать клеточную жизнеспособность и функцию.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является получение в лабораторных условиях биосовместимых самоорганизующихся скаффолдов(матов) из природных саморазрастающихся взаимосвязанных клеток мицелиев грибов класса Basidiomicetes и возможность их использования для восстановления поврежденных органов и тканей, в частности кожи человека, а также ранозаживляющих повязок.

Для достижения технического результата предложен способ создания мицелиальных скаффолдов, включающий перемещение геминофора со спорами грибов класса Basidiomycetes из природной среды обитания в лабораторную, на стерильную агаризованную питательную среду, для первоначального мицелиального роста и хранения мицелия с последующим перемещением части мицелия в жидкую питательную среду для формирования мата мицелиального скаффолда, инактивацию роста базидиального макромицета растворителями или кислотами, удаление инактивирующего агента, длительное хранение мицелиального скаффолда в этаноле или лиофилизованном виде.

Для достижения технического результата предложен способ применения мицелиальных скаффолдов, включающий перенос мицелиального скаффолда необходимого размера из спиртового раствора в стерильный физиологический на 15-20 мин, наложение его на поврежденные кожные покровы таким образом, чтобы погружной слой скаффолда располагался на воздухе, а воздушный - внутри поврежденного слоя кожного покрова с последующей фиксацией легкой повязкой.

Формирующиеся самостоятельно, полученные из вегетативно размножающихся грибов класса Basidiomycetes скаффолды, представляют собой новое поколение природных, механически прочных и биоразлагаемых материалов для биомедицинского применения.

Краткое описание чертежей

На фигуре представлена схема заявленного способа получения мицелиального скаффолда, где:

1 - культивируемые грибы класса Basidiomycetes;

2 - часть гриба с гименофором и спорами;

3 - агаризованная среда для выращивания грибов класса Basidiomycetes;

4 - культуральная чашка;

5 - мицелий грибов класса Basidiomycetes, полученный в чистой культуре на агаризованной питательной среде;

6 - закрываемая емкость для получения скаффолда на жидкой питательной среде;

7 - жидкая питательная среда;

8 - готовый мицелиальный скаффолд (мат), полученный на жидкой питательной среде;

9 - готовый к использованию, инактивированный в растворителях или кислотах, отмытый мицелиальный скаффолд разной толщины;

10 - лиофильная сушка.

Осуществление изобретения

Создание мицелиальных скаффолдов - инновационная технология, использующая мицелий грибов для производства биополимерных материалов, обладающих подобной внеклеточному матриксу структурой, способной

поддерживать клеточную жизнеспособность и функцию. Технология создания основана на способности грибов к вегетативному размножению, при подборе оптимальной среды культивирования в лабораторных условиях.

Данное изобретение позволяет получать нетканоподобные скаффолды, на основе мицелия базидиальных грибов класса Basidiomicete, в лабораторных условиях, на жидких питальных средах, при минимальных экономических затратах. Составляющие мицелиальные скаффолды гифы формируются клетками гименофора, обладающими способностью неограниченного апикального роста. При культивировании в лабораторной питательной среде они способны формировать многослойный матрикс, занимающий весь объем культуральной среды. При формировании мицелиального скаффолда(мата), формируется клеточная стенка, состоящая из полисахаридов (маннанов, глюканов, целлюлозы и хитина), белков и липидов, а цтоплозматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды, эргостеролы и гликоген. В процессе формирования возможен контроль физико-химических показателей, биосовместимости и биодеградации мицелиальных скаффолдов, за счет регулирования условий развития базидиомицетов и инактивации мицелиального мата. Способность базидиомицетов синтезировать витамины, биологически активные и антибактериальные вещества, является одним из преимуществ использования мицелиальных скафолдов базидиомицетов для регенеративной медицины.

Кроме того, предлагается стационарное жидкофазное культивирование макробазидиомицетов, на различных питательных средах. Толщину мицелиального мата предлагается регулировать временем культивирования, а адгезивные свойства - видом макромицета и способом инактивации полученных скафолдов.

В изобретении целые волокнистые структуры мицелия представлены как саморазвивающиеся биокомпозиты, имитирующие внеклеточный матрикс тканей человека, подходящие в качестве, как биологических скаффолдов для тканевой инженерии, так и в качестве покровного ранозаживляющего материала.

Система создания мицелиальных скаффолдов включает в себя получение чистой культуры, путем перенесения части плодового тела базидиомицета и/или гименофора со спорами на стерильные питательные агаризованные среды, последующим подтверждением морфологических особенностей базидиомицетов, методом микроскопии и молекулярными методами. Фрагменты базидиальных макромицетов (грибы класса Basidiomicete) которые перемещаются из природной среды обитания - в лабораторную чашку Петри (d=10 cM), на агаризованную питательную среду, для получения и последующего хранения чистой культуры. Для его размножения при комнатной температуре требуется 7-24 дней (в зависимости от вида). После заполнения всей площади чашки 1/10 часть мицелия вместе с агаром переноситься в кругообразную банку (качалочную колбу) с жидкой питательной средой для поверхностно-статического культивирования и последующих посевов грибного инокулята. Сформированный посевной материал ресуспендируется, и переносится в кругообразную банку так, чтобы объем среды превосходил объем грибного инокулята (в зависимости от вида Basidiomicete) в 10 и более раз. Время получения конечного мицелиального скаффолда(мата) регулируется и может составлять 5 и более дней, в зависимости от необходимой толщины и вида гриба. Механическая прочность скаффолда регулируется его толщиной и способом инактивации, которая проводится при помощи растворителей: полярные (в том числе спирты и сульфоксиды) - для дезинтеграции межклеточных взаимодействий, приводящей к усилению рыхлости скаффолда; неполярные - органические и неорганические кислоты. Инактивированный скаффолд отмывается в дистиллированной воде до полного удаления инактивирующего агента. Хранение материала допускает температуру +4 - +15°С и может осуществляться, как во влажном виде, когда готовые скаффолды перемещаются в стерильный раствор (0,9% раствор NaCl, 30-70% этанол, раствор антибиотиков), так и в сухом виде, когда материал подвергается лиофилизации.

Пример осуществления 1

Толщина волокон (гиф), формирующих скаффолд, варьирует от 0,1 до 20 мкм и определяется видовой принадлежностью базидиомицета. Толщина получаемого мата (скаффолда) определяется сроком культивирования и может составлять от 250 мкм до 2,5 мм. Форма и размеры скаффолда регулируются культуральной емкостью таким образом, что существует возможность получения скаффолда любого размера и различной формы. Получение плоского ровного мицелиального скаффолда базидиомицетов вида Trametes hirsuta и Trametes rubius разной толщины в объеме 50 мл глюкозо-пептонной среды с 10 мл мицелиального иннакулята, в зависимости от сроков культивирования, представлено в таблице 1.

Соблюдение технологического регламента обуславливает получение скаффолда необходимой толщины и площади в установленные сроки культивирования, в зависимости от видовой принадлежности базидиомицета.

Таким образом, предлагаемый способ приводит к тому, что: природные мицелии грибов класса Basidiomicetes, культивируемые в лабораторных условиях, формируют биосовместимый многослойный волокнистый мицелиальный скаффолд(мат), который может быть использован, как при создании многоклеточных тканевых эквивалентов, так и в качестве ранозаживляющих повязок при обширных повреждениях кожных покровов.

Пример осуществления 2

Полученный мицелиальный скаффолд может быть использован для ранозаживления обширного повреждения кожных покровов человека. Для этого мицелиальный скаффолд необходимого размера, переносят из спиртового раствора в стерильный физиологический на 15-20 мин и накладывают на рану так, чтобы погружной слой скаффолда располагался на воздухе, а воздушный - внутри раны, после чего фиксируют легкой повязкой. При высыхании скаффолда возможна его замена или наложение поверх раны нового. Фиксирование мицелиального скаффолда на раневой поверхности (S=10 см²) вырезанной на спине мыши линии С57/В1аск, в качестве временного заместителя кожных покровов, приводит к защите ее от высыхания, инфицирования и способствует полной эпителизации в течение 4-х недельного срока.

Пример осуществления 3

Карбоксильные, сульфатные и гидроксильные группы гликозаминогликанов и мотивы RGD белков (коллаген и фибронектин) внеклеточного матрикса (ЕСМ) являются главными факторами, обеспечивающими клеточную адгезию. Обычно биополимеры, используемые для изготовления скаффолдов, не обладают такими свойствами в отличие от мицелиальных, где клеточная адгезия обеспечивается гидроксильными, карбоксильными и амидными группами полисахаридов, липидов и белков, входящих в состав клеточных мембран мицелиальных клеток. Для получения эпидермального (S=1 см²) эквивалента первичные кератиноциты в количестве 5×10⁵/см² высевают на мицелиальный скаффолд и культивируют в кератиноцитарной питательной среде с содержанием Са²⁺<0,15 mM в течение 48 ч в стандартных условиях, после чего увеличивают содержание кальция в 10 раз и культивируют в течение 7-ми дней так, чтобы кератиноциты находились на границе воздуха и питательной среды для дальнейшей стратификации и восстановления рогового слоя.

Группа изобретений относится к области биотехнологии Представлены способ создания мицелиальных скаффолдов, включающий перемещение геминофора со спорами грибов класса Basidiomycetes из природной среды обитания в лабораторную, на стерильную агаризованную питательную среду, для первоначального мицелиального роста и хранения мицелия с последующим перемещением части мицелия в жидкую питательную среду для формирования мата мицелиального скаффолда, инактивацию роста базидиального макромицета растворителями или кислотами, удаление инактивирующего агента, длительное хранение мицелиального скаффолда в этаноле или в лиофилизованном виде. А также предложен способ применения мицелиальных скаффолдов, включающий перенос мицелиального скаффолда необходимого размера из спиртового раствора в стерильный физиологический на 15-20 мин, наложение его на поврежденные кожные покровы таким образом, чтобы погружной слой скаффолда располагался на воздухе, а воздушный - внутри поврежденного слоя кожного покрова с последующей фиксацией легкой повязкой. Изобретение позволяет получить в лабораторных условиях биосовместимых самоорганизующихся скаффолдов из природных саморазрастающихся взаимосвязанных клеток мицелиев грибов класса Basidiomicetes с последующей возможностью их использования для восстановления поврежденных органов и тканей, в частности кожи человека, а также ранозаживляющих повязок. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Способ создания биосовместимых скаффолдов из природных мицелиев грибов класса Basidiomycetes, включающий перемещение геминофора со спорами из природной среды обитания в лабораторную, на стерильную агаризованную питательную среду, для первоначального мицелиального роста и хранения мицелия с последующим перемещением части мицелия в жидкую питательную среду для формирования мата мицелиального скаффолда, его инактивацию растворителями или кислотами, удаление инактивирующего агента, длительное хранение мицелиального скаффолда в этаноле или лиофилизованном виде.

2. Способ применения мицелиальных скаффолдов из природных мицелиев грибов класса Basidiomycetes для создания многоклеточных тканевых эквивалентов и ранозаживляющих повязок при повреждениях кожных покровов, включающий перемещение геминофора со спорами из природной среды обитания в лабораторную, на стерильную агаризованную питательную среду, для первоначального мицелиального роста и хранения мицелия с последующим перемещением части мицелия в жидкую питательную среду для формирования мата мицелиального скаффолда, его инактивацию растворителями или кислотами, удаление инактивирующего агента, длительное хранение мицелиального скаффолда в этаноле или лиофилизованном виде, перенос мицелиального скаффолда необходимого размера из спиртового раствора в стерильный физиологический на 15-20 мин, наложение его на поврежденные кожные покровы таким образом, чтобы погружной слой скаффолда располагался на воздухе, а воздушный - внутри поврежденного слоя кожного покрова с последующей фиксацией легкой повязкой.