t500 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят 2,5%-ную взвесь и формалинизиро- ванные эритроциты проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации.
Затем к 2,5%-ной суспензии формали- низированных эритроцитов добавляют равный объем танина в разведения 1:10000, смесь выдерживают в водяной бане при 37°С 30 мин, Затем трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифуги- рования при 1 500 об/мин в течение 10 мин. Танизированные эритроциты проверяют на отсутствие самоагглютинации.
Для приготовления антигена 16-18-часовую культуру шт. СТИ, выращенную на мясопептонном агаре, трижды отмывают от остатков питательной среды стерильным физиологическим раствором при центрифугировании в течение 20 мин при 5000 об/мин, из отмытой культуры готовят взвесь в концентрации 100 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК.
Суспензию бактерий помещают в стерильный стакан ультразвукового дезинтег- ратора микроорганизмов, подвергают воздействию ультразвука в течение 15-20 мин при амплитуде колебаний 16-20 мкм.
Дезинтеграт микробых клеток, содержащий комплекс термолабильных и термо- стабильных антигенов Вас. anthracfs, сливают в колбу и стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтры Вла- дипор для освобождения антигена от единичных неразрушенных бактерий.
Для сенсибилизации эритроцитов амти- ген разводят 0,15 М фосфатным буфером,рН 6,4, до концентрации 1 ±0,05 мг белка в 1 мл.
Для изготовления диагностикума два объема разведенного до нужной концентра- ции антигена смешивают с водным объемом 2,5%-ной суспензии танизированных фор- малинизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в водяной бане при 37±1°С, периодически встряхивая. Затем сенсиби- лизированные эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. После последнего центрифугирования диагностикум подготавливают для лиофилизации.
Для этого из осадка готовят 2,5%-ную суспензию эритроцитов на стабилизаторе.
В качестве стабилизатора используют раствор, содержащий 5±0,5% сахарозы, 3±0,2% пептона, 0,5±0,1 % бычьего сывороточного альбумина, 0,25±0,05% борной кислоты, калия фосфорнокислого однозаме- щенного 1,5±4 г/л, натрия фосфорнокислого двузамещенного 15,5-20 г/л (рН стабилизатора 7,2 ±0,2).
Применение в качестве стабилизаторов других веществ (декстрана, галактозы, желатины, сыворотки и т.д.) не обеспечивало стабильности диагностикума.
Перед лиофилизацией диагностикум суспендируют в среде высушивания (стабилизаторе), разливают в пенициллиновые флаконы или ампулы, замораживают при - (50-60)°С в течение 6-18 ч. После этого материал переносят в сушильный аппарат. Сушку проводят при остаточном давлении 80-90 мкм. При загрузке температура полок должна быть не выше -20°С, температура конденсатора -40°С и ниже. В течение 14-16 ч температуру постепенно повышают до 20-25°С. Когда температура материала и полок становится одинаковой, сушку продолжают еще 4-6 ч, после этого ампулы отпаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Лиофилизация препарата обеспечивает стабильность его при хранении. Сухой диагностикум сохраняет первоначальную активность в течение 2 лет.
Пример 2. Изготовление сибиреязвенного диагностикума.
Формалинизированкые танизирован- ные эритроциты барана сенсибилизируют сибиреязвенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на мясопептонном агаре. Из этой культуры готовят взвесь бактерий в концентрации 95 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 15 мин при амплитуде колебаний 16 мкм. Дезинтеграт микробных клеток стерилизуют лу-. тем мембранной фильтрации через фильтр № 4 МФА-МА типа Владипор. Для сенсибилизации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 0,95 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5%-ной суспензии формалинизированкых танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в водяной бане при 37°С, периодически встряхивая. Затем диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин.
Более низкие концентрации культуры (90 млрд/мл и меньше) не обеспечивают получения активного антигена. При снижении амплитуды ультразвуковых колебаний до 15 мкм и менее активность сибиреязвенного антигена уменьшалась независимо от времени воздействия ультразвука. При
уменьшении времени обработки бактерий ультразвуком до 10 мин отмечали снижение активности антигена. Использование фильтров с меньшим размером пор (№ 2-3) замедляет процесс фильтрации и приводит к снижению активности антигена, Более низкие концентрации белка не обеспечивают изготовления активного диагностикума, поэтому при исследовании положительных проб сыворотки возможно получение отрицательных результатов.
Пример 3. Для изготовления диэг- ностикума формалинизироеэнные танизи- рованные эритроциты барана сенсибилизируют сибиреязвенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на мясопептонном агаре. Из этой культуры готовят взвесь бактерий в концентрации 1000 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 17 мин при амплитуде колебаний 18 мкм. Дезинтегратор микробных клеток стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтр № 5 МФА-МА типа Влади- . Для сенсибилизации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 1 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5%-ной суспензии формалини- зированных танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в водяной бане при 38°С, периоидчески встряхивая. Затем ди- агностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин.
Пример 4. Для изготовления диагностикума формалинизированные танизи- рованные эритроциты барана сенсибилизируют сибиреязвенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на мясопептонном агаре. Из этой культуры готовят взвесь бактерий в концентрации 105 млрд. микробных клеток в, 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 20 мин при амплитуде колебаний 20 мкм. Дезинтеграт микробных клеток стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтр № 4 МФА-МА типа Влади- пор. Для сенсибилизации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 1,05 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5%-ной суспензии форма- линизированных танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают в водяной бане при 37°С, периодически встряхивая. Затем
диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. При более высоких концентрациях (110
5 млрд/мл и больше) повышение активности сибиреязвенного антигена не отмечают. Повышение амплитуды колебаний до 22 мкм и более не приводит к увеличению активности антигена. Увеличение времени дезинтегра0 ции клеток до 25 мин и более не приводит к дальнейшему повышению специфической активности.
Использование мембранных фильтров с большим размером пор (Kfe 6-8) не обеспечи5 вает стерилизации материала. Увеличение концентрации антигена нецелесообразно, так как это не приводит к повышению активности диагностикума, но увеличивает расход биологических компонентов. Кроме
0 того, при более высокой концентрации антигена снижается специфичность реакции в результате самоагглютинации сенсибилизированных антигеном эритроцитов.
Пример 5. Диагностикум, приготов5 ленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофи- лизируют.
Для лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивания
-стабилизаторе. В качестве стабилизатора 0 используют раствор, содержащий 4,5% сахарозы, 2,8% пептона, 0,4% бычьего сывороточного альбумина, 0,20% борной кислоты, 1,5 г/л фосфорнокислого одноза- мещенного калия, 15,5 г/л фосфорнокис5 лого двузамещенного натрия, рН стабилизатора 7,0. Лиофилизация диагностикума в данном стабилизаторе обеспечивает стабильность его при хранении.
Примере. Диагностикум, приготов- 0 ленный согласно примерам 2. 3 и 4, лиофи- лизируют.
Для лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивания
-стабилизаторе. В качестве стабилизатора 5 используют раствор, содержащий 5% сахарозы. 3% пептона, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,25% борной кислоты, 3 г/л фосфорнокислого од незамещенного калия, 18 г/л фосфорнокислого двузамещен0 ного натрия, рН стабилизатора 7,2. Диагностикум, лиофилизированный в указанном стабилизаторе, сохраняет активность и специфичность в течение 2 лет. Пример 7. Диагностикум, приготов5 ленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофи- лизируют.
Для лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивают, содержащей 5,5% сахарозы, 3,2% пептона, 0,6% бычьего сывороточного альбумина,
0,30% борной кислоты, 4 г/л фосфорнокислого однозамещенного калия, 20 г/л фосфорнокислого двузамещенного натрия, рН стабилизатора 7,4. При использовании данного стабилизатора диагностикам сохраняет активность и специфичность.
Приготовленный согласно примерам 1- 4 и лиофилизированный с предложенным стабилизатором диагностикум является активным специфичным.
Результаты изучения активности и специфичности разработанного сибиреязвенного диагностикума в сравнении с прототипом представлены в таблице.
Из таблицы видно, что активность предлагаемого диагностикума выше активности известного. Кроме того, предлагаемый диагностикум не взаимодействует с сыворотками здоровых (нормальных) животных и гиперим- мунизированных родственными микроорганизмами B.cereus № 96 и B.anthracoldes № 1312, тогда как известный диагностикум дает положительные реакции как с сыворотками вакцинированных, так и здоровых овец, а так- же с гипериммунными сыворотками к B.cereus № 96 и B.anthracoides № 1312.
Таким образом, предлагаемый диагностикум обладает более высокой активностью и специфичностью по сравнению с прототипом.
0
5
0 5
0
Формула изобретения Способ изготовления сибиреязвенного эритроцитарного диагностикума, включающий получение суспензии микробных клеток, выделение антигена, танизацию и сенсибилизацию антигеном эритроцитов барана, отличающийся тем, что, с целью повышения активности, специфичности и стабильности целевого продукта, суспензию получают с концентрацией 95-105 млрд.микроб.кл в 1 мл, выделение антигена проводят путем обработки ультразвуком в течение 15-20 мин при амплитуде ультразвуковых колебаний 16-20 мкм, перед сенсибилизацией антиген подвергают стерилизующей фильтрации и разводят до концентрации 0.95-1,05 мг/мл, а сенсибилизированные эритроциты смешивают со стабилизатором, содержащим следующие компоненты, об.%:
Сахароза4,5-5,5
Пептон2,8-3,2
Бычий сывороточный альбумин0,4-0,6
Борная кислота0,2-0,3
Калий фосфорнокислый однозамещенный
Натрий фосфорнокислый двузамещенный РН и лиофилизируют.
0,15-0,40
1,55-2,0 7,0-7,4
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ПРИ КЛОСТРИДИОЗАХ ЖИВОТНЫХ | 2020 |
|
RU2754465C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ R-БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) | 2008 |
|
RU2411041C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО САПНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО | 2017 |
|
RU2658434C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕННОГО САПНОГО | 2001 |
|
RU2188036C1 |
Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума | 1978 |
|
SU784879A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ КОКСИЕЛЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2009 |
|
RU2410698C1 |
Способ изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) | 2019 |
|
RU2714305C1 |
Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного сухого | 2023 |
|
RU2805871C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПРИНА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ | 1992 |
|
RU2007725C1 |
ДИАГНОСТИКУМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЙ | 2008 |
|
RU2377308C1 |
Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу изготовления сибиреязвенного эритроцитарного диагности- кума, и может быть использовано для диагностики сибирской язвы и дифференциальной диагностики животных, инфицированных Bacillus anthracis. от инфицированных Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу изготовления сибиреязвенного эритроцитарного диагности- кума, и может быть использовано для диагностики сибирской язвы и дифференциальной диагностики животных, инфицированных Bacillus anthracis, от инфицированных микроорганизмами сходной антигенной структуры. Цель изобретения - повышение активности, специфичности, стабильности целемикроорганизмами сходной антигенной структуры. Цель изобретения - повышение активности, специфичности, стабильности целевого продукта и упрощение способа его изготовления. Для сенсибилизации эритроцитов используют сибиреязвенный антиген, выделенный из клеток В.anthracis, в исходной концентрации 100±5 млрд/мл путем дезинтеграции их ультразвуком в течение 15-20 мин при амплитуде ультразвуковых колебаний 16-20 мкм. При этом концентрацию белка в антигене доводят до 1 ±0,05 мг в 1 мл. Стерилизацию антигена осуществляют путем мембранной фильтрации через фильтры МФА-МА № 4-5 типа Владипор. Лиофилизацию диагностикума осуществляют с использованием стабилизатора, содержащего 5±0,5% сахарозы, 3±0,2% пептона, 0,5±0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,25±0,05% борной кислоты, калия фосфорнокислого однозамещенного 1,5-4,0 г/л, натрия фосфорнокислого двузамещенного 15,5-20 г/л. Способ обеспечивает высокую чувствительность, специфичность диагностикума и стабильность при хранении. 1 табл. вого продукта и упрощение способа его изготовления, П р и м е р 1. Изготовление сибиреязвенного диагностикума. Из отмытых эритроцитов барана готовят 12,5%-ную взвесь на физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) и смешивают с равным объемом 5%-ного раствора формалина. Смесь выдерживают 18-20 ч при 37±1°С, затем трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при (Л С Os чэ 00 vj 00 ю
ЛевиМ.И., ЕзепчукЮ.В., НеменоваМ.А | |||
Применение протективного антигена для реакции пассивной гемагглютинации при сибирской язве.-ЖМЭВ, 1968 | |||
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
Способ получения нерастворимых лаков основных красителей в субстанции и на волокнах | 1923 |
|
SU132A1 |
Авторы
Даты
1991-12-15—Публикация
1989-07-11—Подача