Способ определения специфической сенсибилизации к оболочкам глаза Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно, иммунологии, и касается способа определения специфической сенсибилизации к оболочкам глаза - антигенам увеаретинальной ткани, роговицы и хрусталика. Изобретение может быть использовано для лабораторной диагностики аутоиммунного компонента/процесса при различных нозологических офтальмологических формах, среди которых воспалительные заболевания глаз остаются по-прежнему одной из главных причин значительного, необратимого снижения зрения, нередко завершаясь тяжелыми инвалидизирующими исходами.

В развитии внутриглазного воспаления важную роль играют нарушения органоспецифического иммунитета: накоплены доказательства активации и длительного доминирования системного иммунного ответа против антигенов (АГ) тканей глаза не только при экспериментальном аутоиммунном увейте (ЭАУ), симпатической офтальмии (СО), краевых кератитах и язвах (язве Мурена) - истинно аутоиммунной офтальмопатологии, но и целом ряде заболеваний органа зрения, формируемых при воздействии локальных стрессогенных факторов, а также при снижении резистентности организма, старения и др.

В последнем случае целесообразно говорить об «аутоиммунном компоненте», который нередко становится важнейшим звеном в патогенезе глазных заболеваний, пусковым фактором которых явились возбудители инфекций (напр. некупируемые формы инфекционных язв роговицы с развитием увеальных явлений), а также развитие послеоперационных осложнений (например, отторжение трансплантата при кератопластике и др.), дистрофических процессов в оболочках глаза.

Формирование аутоиммунных реакций может происходить постепенно, в разные сроки после воздействия инициирующих факторов, крайне неблагоприятно влиять на течение заболевания и нуждается в своевременном применении иммуносупрессивных средств.

В связи с этим диагностика и выявление риска органоспецифической аутосенсибилизации представляют большую практическую важность для офтальмологической клиники (Балацкая Н.В., Филатова И.А., Захарова Г.П., Куликова И.Г., Денисюк В.О., Мохаммад И.М. Клиническое значение выявления органоспецифической сенсибилизации у пациентов с продолжительным течением хронического посттравматического увеита. Российский офтальмологический журнал. 2021; 14(1): 15-20).

В развитии ЭАУ, СО, реакции отторжения трансплантата при пересадках роговицы высокого риска ведущая роль принадлежит специфическим реакциям системного клеточного иммунитета к АГ оболочек глаза, развиваемого вследствие нарушения глазной иммунной привилегии (ИП) [Bycker M.D., Adamus G., Rosenbaum J.T. The role of T-cells in autoimmune uveitis // Ocul. Immunol. Inflam., 2000. V. 8, N2, P. 93-100; Архипова Л.Т. Симпатическая офтальмия. M., 2006, с. 84-122].

Существующие на сегодняшний день методы лабораторной диагностики антигенспецифических иммунных реакций клеточного типа включают тесты прямой клеточной цитотоксичности, стимуляцию различными АГ сенсибилизированных лимфоцитов в реакциях бласттрансформации (РБТЛ) и торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1995; А.А.Ярилин,1999; Williams RJ. et al., 2000). Установлена высокая специфичность РБТЛ, выявляющей пролиферацию (трансформацию в бласты) Т-лимфоцитов в присутствии специфических АГ или митогенов, однако постановка данной реакции требует специальных условий и оборудования, а длительность проведения (культивирование клеток от 3 до 7 суток), учет результатов ограничивают ее использование в практической лабораторной иммунологии [Gaines Н., Andersson L., Biberfeld G. A new method for measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry // J Immunol Methods.- 1996 Sep 9; 195(l-2): 63-72].

Метод лазерной проточной цитофлуориметрии (ПЦ), предложенный для стандартизации и облегчения морфологического учета результатов РБТЛ, существенно снижает трудоемкость завершающего этапа постановки, однако требует использования дополнительных реактивов и оборудования, что значительно увеличивает финансовые затраты на выполнение анализа.

Радиоизотопные исследования, показавшие свою высокую чувствительность в оценке пролиферации Т-лимфоцитов (по включению ³Н-тимидина) или клеточной цитотоксичности (по выделению ⁵¹Cr) (Murali-Krishna K., Altaian J.D., Suresh М., Sourdive D., Zajac A., Ahmed R. In vivo dynamics of anti-viral CD8 T cell responses to different epitopes. An evaluation of bystander activation in primary and secondary responses to viral infection. // Adv Exp Med Biol. - 1998. - Vol. 452. - P. 123-42), также не получили широкого распространения в лабораторной диагностике в связи с высокими требованиями к соблюдению мер безопасности при их проведении (помещениям, оборудованию и т.д).

РТМЛ отражает АГ-специфическую активацию лимфоцитов-эффекторов ГЗТ, которые контролируют спонтанную подвижность и мобилизацию защитных свойств фагоцитов, а также их накопление в зоне воспаления посредством выделения цитокинов и, в отличие от РБТЛ, более широко применяется при оценке лекарственной чувствительности, диагностике сенсибилизации к препаратам крови, антигенам возбудителей инфекций, а также тканеспецифическим АГ.

Существует несколько вариантов постановки этого теста in vitro с использованием стеклянных или пластиковых капилляров, некапиллярные методы (под/по слоем агарозы, из фибринового сгустка), а также модифицированный скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) в 96-луночной планшете [Суслов А.П., Головин В.П., Скворцов В.Т, Коронцвит Т.А. Скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) из микрокультур in vitro // Иммунология,]. Последний успешно используется в общей клинике при инфекционных заболеваниях [Кожушный А.П., Кохановская Н.А., Третьяков О.Ю., Коноплева М.В., Суслов A.П. // Динамика развития ранних клеточных иммунных реакций на инфекционные антигены в культуре мигрирующих лейкоцитов in vitro. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1. - С. 38-40]. При постановке данной реакции используются микроколичества реагентов и биоматериала, что, в целом, позволяет не только существенно снизить финансовые расходы на тест, но и дает возможность выполнения исследования у детей. Преимуществом теста являются менее длительные, чем в РБТЛ, сроки культивирования клеток, 16-20 час, возможен не только морфологический, но и автоматический (с применением сканера и специального программного обеспечения) учет результатов.

В ряде научных работ, выполненных в офтальмологической клинике, приводятся описания способов, используемых для выявления специфической сенсибилизации к АГ тканей глаза.

Так, Галимовой Л.Ф. и соавт. проводилось исследование клеточного иммунитета тканеспецифическим АГ глаза с использованием РБТЛ [Галимова Л.Ф., Курчатова Н.Н., Степанов М.В. и др. Оценка общего иммунного статуса пациентов с посттравматической субатрофией глаза // Вестник ОГУ. - 2013. - №4. - С. 51-54]. Однако недостатками данного способа, как было описано выше, являются длительность проведения анализа (3-7 суток, что отодвигает сроки введения необходимых лечебных мероприятий) и учет результатов реакции, выполненный с помощью проточной цитофлуориметрии, требующей дополнительных реактивов и специализированного оборудования, существенно повышающих финансовые расходы на постановку теста.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является капиллярный способ диагностики сенсибилизации к тканеспецифичным АГ оболочек глаза, достаточно распространенный до 2010 года и описанный в целом ряде научных публикаций (Слепова О.С. Реакция бластгрансформации лимфоцитов и торможения миграции лейкоцитов в патогенезе и дифференциальной диагностике герпетической болезни глаз, Диссертация к.б.н., 1980., С. 41-43., 61-68.)

Недостатки данного способа связаны прежде всего, с отсутствием возможности стандартизации учета результатов, большими обьемами реагентов и биологического материала (крови) для постановки теста, травмированием клеток при обжиге стеклянных капилляров во время исследования.

Изучение возможности использования скринингового метода клеточной миграции для модификации капиллярной РТМЛ проводились Куликовой И.Г. под руководством Слеповой О.С. [Куликова И.Г., Слепова О.С., Илуридзе С.Л. Модификация тестов, направленных на выявление аутоиммунных реакций при заболеваниях глаз // РОЖ, Том 6, №1, 2013, стр. 69-72]. Было показано, что метод РТМЛ в модификации позволяет устранить многие недостатки капиллярного, однако вопросы, касающиеся приготовления антигенных препаратов, подбора их оптимальных рабочих концентраций с отработкой полного технологического цикла реакции, позволяющих ее использовать в клинико-диагностической лаборатории, оставались нерешенными и требовали дальнейшей проработки.

Задачей предлагаемого изобретения является дальнейшая разработка скринингового метода клеточной миграции для модификации капиллярной РТМЛ.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка простого, доступного, экономичного способа диагностики органоспецифической аутоиммунизации при заболеваниях глаз легко воспроизводимого в клинико-диагностических лабораториях с последующим использованием результатов в клинической практике.

Технический результат достигается за счет приготовления антигенных препаратов, полученных из оболочек глаза, обеспечивающих полноценную характеристику специфической иммунологической реактивности и определения оптимального количества реагентов без потери эффективности реакции: рабочих концентраций приготовленных антигенных препаратов и диапазона лейкоцитарной взвеси, установки патологических границ миграции клеток.

Способ осуществляют следующим образом

Проводят скрининговый тест клеточной миграции. В качестве антигенных препаратов используют водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 3,0-5,0 мг/мл общего белка. Добавляют в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл с последующей инкубацией при 37°С в течение 18-20 часов с культурой лейкоцитов в количестве 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Учет результатов реакции проводят на основании определения площадей среднего диаметра для параллельных микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.). Рассчитывают индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=S oп / S контр. При значении ИМ менее 0,8 расчетных единиц или значении ИМ более 1,2 расчетных единиц определяют наличие специфической сенсибилизации к оболочкам глаза.

Способ реализуется через следующие этапы:

А. Получение антигенных препаратов - водно-солевых экстрактов увеальной ткани, хрусталика, роговицы из бычьих глаз 1) Препарируют глазное яблоко: из наружной фиброзной оболочки глаза стерильными инструментами (скальпелем, ножницами, пинцетом) вырезают роговицу, выделяют хрусталик, которые помещают в отдельные (для каждого отпрепарированного фрагмента) стерильные емкости. Фиброзную капсулу (склеру) надрезают ножницами, выворачивают внутренней стороной и аккуратно снимают пинцетом одновременно среднюю и внутреннюю оболочки, переносят их совместно в стерильную емкость.

2) Каждую ткань последовательно, соблюдая условия стерильности (помещение, оборудование, реагенты) тщательно гомогенизируют растиранием в фарфоровой ступке, постепенно добавляя 0,9% физиологический раствор NaCl в соотношении 1:2 (измельченная ткань: 0,9% физ. раствор). При гомогенизации роговицы добавляют измельченное стерильное стекло из расчета 100 г роговицы: 10 г стекла. Можно использовать гомогенизатор.

3) Полученные гомогенаты центрифугируют при RCF (относительное центробежное ускорение) 2520-645 lg в течение 40-60 мин при охлаждении t=2-4°С.

4) Надосадочную жидкость отбирают стерильной пипеткой в стерильные емкости, параллельно измеряют количество общего белка в экстракте и доводят его концентрацию до 3.0-5.0 мг/мл добавляя 0,9% физиологического раствора NaCl. В нашем случае контроль количества полученного белка (антигена) осуществлялся при помощи спектрофотометра, длине волны 280/260 нм в мультирежимном имиджере марки Cytation 5 imaging reder (Biotek).

Антигенные препараты аликвотируются и могут храниться без потери активности в камере глубокой заморозки при температуре -70°С в течение 12 месяцев, при температуре -18°С в течении 3 месяцев.

Б. Подготовка пробы для постановки реакции. Выделение лейкоцитарной взвеси из периферической крови. Периферическую кровь (обьем 9 мл) из локтевой вены берут в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette® с антикоагулянтом КЗЭДТА или гепарином.

1) В пробирку с кровью добавляют 0,5 мл ампулированного 10% раствора желатина и тщательно пипетируют 5-6 раз.

2) Для отстаивания плазмы пробирку с кровью переносят в термостат при 37°С и оставляют на 40 мин. в наклонном положении под углом 45° и на 10-15 минут- вертикально.

3) Плазму отбирают стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, которую непосредственно перед использованием помещают помещают в емкость со льдом.

4) Производится подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева: отбирают 10 мкл суспензии клеток и разводят в 0,2 мл 3% уксусной кислоты, взвесью клеток (1:20) заполняют камеру Горяева, подсчитывают их количество в 25 больших квадратов, сумму делят на 5. Полученное значение соответствует количеству лейкоцитов в 1 мл суспензии. Также для этих целей могут быть использованы автоматические счетчики клеток.

5) Пробирку с плазмой (см. п. 3) центрифугируют при RCF (относительное центробежное ускорение) 184g в течение 10 мин.

6) Надосадочную жидкость сливают, к осадку лейкоцитов добавляют сначала 5 мл 0,35% раствора NaCl, пипетируют 3-4 раза, а затем 1 мл 5% раствора NaCl, пипетируют 3-4 раза и центрифугируют при RCF (относительное центробежное ускорение) 184 g в течение 10 мин.

7) Надосадочную жидкость сливают, к клеткам добавляют 5 мл питательной среды RPMI 1640 («Sigma»), пипетируют и центрифугируют RCF (относительное центробежное ускорение) 184 g в течение 10 мин. Если в пробе остаются эритроциты, процедуру отмывки пп. 6, 7 повторяют до получения однородной, белого цвета, лейкоцитарной массы (пробирки до использования помещают в емкость со льдом).

8) К выделенным отмытым лейкоцитам постепенно добавляют питательную среду RPMI 1640 («Sigma») (100-500 мкл), вортексируя до однородной клеточной суспензии, получают рабочее разведение клеток в концентрации 2-4×10⁶ кл/мл, пробирки до постановки реакции помещают в емкость со льдом.

В. Постановка реакции. 1) В отдельные пробирки с культуральной средой, содержащей среда RPMI-1640 с 2 мМ L-глютамина, 5-10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, HEPES - 10 мМ, добавляют антигенные препараты (экстракты) достигая следующих рабочих (конечных) концентраций в среде уверетинальной ткани - 50 мкл/мл, роговицы - 45 мкл/мл, хрусталика - 45 мкл/мл, митогена ФГА (фитогемагглютинин; используется как - положительный контроль/контроль функциональной активности клеток)) - 10-25 мкл/мл.

2) Каждую пробу от одного пациента тестируют в 4 параллельных лунках 96-луночного планшета. Для этого в лунки планшета вносят отдельно по 100 мкл культуральной среды, содержащей исследуемый антиген или ФГА. В качестве отрицательного контроля используют культуральную среду без добавления антигенов и ФГА

3) Заполненные планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат с атмосферой 5% СО₂ (допустимо использовать эксикатор с горящей свечой до начала постановки анализа).

4) Готовят лейкоцитарную взвесь (см. п Б).

5) На предварительно заполненный культуральной средой с антигенами/митогенами 96-луночный планшет устанавливают систему «Мигроскрин» (NIARMEDIK, Россия), закрепляя опоры штатива в крайних угловых лунках.

6) Суспензию лейкоцитов в объеме 5 мкл набирают автоматической пипеткой в наконечники 1-200 мкл фирмы «Costar» (США). Наконечники ополаскивают от избытка клеточной суспензии однократным опусканием в культуральную среду.

7) Наконечники с клеточной суспензией помещают в отверстия системы «Микроскрин» и проводят инкубацию при комнатной температуре (18-20)°С в течение 30-40 минут.

8) Аккуратно снимают «Мигроскрин» вместе с наконечниками, а планшет с микрокультурой закрывают крышкой и переносят в термостат с 5% СО₂, где культивируют при 37°С в течение 18-20 ч.

Г. Учет результатов. Учет результатов реакции после инкубации проводят на инвертированном микроскопе Биолам П-1 (ЛОМО), при увеличении окуляра 1,5*15 и объектива 2,5*0,08, визуально определяя размер колонии по шкале внутри окуляра.

1) Диаметр круга, образованного микрокультурой, измеряют по «сетчатому» краю, образованному уплотненными клетками.

2) Вычисляют средний диаметр (в 4 параллельных лунках)

3) Рассчитывают площадь миграции, и индекс миграции (ИМ):

ИМ=S on / S контр., где S оп - площадь среднего диаметра для параллельных опытных микрокультур, S контр. - площадь среднего диаметра для контрольных микрокультур.

Полученное значение ИМ служит для оценки результатов реакции.

Если значение ИМ менее 0,8 расчетных единиц или значении ИМ более 1,2 расчетных единиц реакция считается положительной и свидетельствует о накоплении в крови сенсибилизированных лимфоцитов к одному или нескольким из тканеспецифических антигенов.

Пример 1. Пациент Ф., 1962 года рождения, поступил в отделение травматологии и реконструктивной хирургии НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца. Диагноз при поступлении: OD - васкуляризированное бельмо роговицы 4 категории, OS- васкуляризированное бельмо, дистрофия роговицы. Больному до операции был проведен скрининговый тест клеточной миграции по предложенному способу, В качестве антигенных препарата использовали водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 3,0 мг/мл общего белка. Добавили в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл с последующей инкубацией при 37°С в течение 18-20 часов с культурой лейкоцитов в количестве 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Учет результатов реакции проводили на основании определения площадей среднего диаметра для параллельных микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.). Рассчитали индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=S on / S контр. Значение ИМ к антигену роговицы составило 0,65 расч. ед., что свидетельствовало о наличии сенсибилизации. На основании результатов исследования пациенту назначен курс комплексной терапии, включавший глюкокортикоиды. После проведения лечения ИМ нормализовался и составил 0,9 расч. ед. На этом фоне была произведена субтотальная послойная кератопластика. Послеоперационный период протекал без осложнений. Пациент выписан в удовлетворительном состоянии.

Пример 2. Больной К., 1953 года рождения, госпитализирован в отделение травматологии и реконструктивной хирургии НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца. Диагноз при поступлении: OD - поствоспалительное бельмо 3 категории. До операции проведен скрининговый тест клеточной миграции по предложенному способу. В качестве антигенных препаратов использовали водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 5,0 мг/мл общего белка. Добавили в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл с последующей инкубацией при 37°С в течение 18-20 часов с культурой лейкоцитов в количестве 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Учет результатов реакции проводили на основании определения площадей среднего диаметра для параллельных микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.). Рассчитали индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=S on / S контр. Значение ИМ к антигену роговицы составило 1,32 расч. ед., что свидетельствовало о наличии сенсибилизации. На основании результатов исследования больному назначено комплексное медикаментозное лечение, включающее стероидные препараты. После проведения курса лечения ИМ составил 1,12 расч. ед. Проведена сквозная кератопластика. Осложнений в раннем и отдаленном послеоперационном периоде не отмечено. Больной выписан в удовлетворительном состоянии.

Пример 3. Пациент X., 1968 года рождения, в 2017 г перенес экстренную СКП по поводу перфорации васкулизированного бельма роговицы 3 категории. В послеоперационном периоде отмечался длительно сохранившийся отек трансплантата, персистирующая эрозия. Был проведен скрининговый тест клеточной миграции по предложенному способу. В качестве антигенных препаратов использовали водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 4,0 мг/мл общего белка. Добавили в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл с последующей инкубацией при 37°С в течение 18-20 часов с культурой лейкоцитов в количестве 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Учет результатов реакции проводили на основании определения площадей среднего диаметра для параллельных микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.). Рассчитали индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=S on / S контр. Значение ИМ к антигену роговицы составило 1,28 расч. ед., что свидетельствовало о наличии сенсибилизации. Комплексное консервативное лечение без эффекта. Через 5 месяцев на фоне нарастающей васкуляризации трансплантат помутнел. Через 6 месяцев проведена реСКП и курс комплексной терапии. После проведения лечения ИМ нормализовался и составил 1,09 расч. ед. Пациент выписан в удовлетворительном состоянии.

Пример 4. Пациент К., 1977 года рождения. Диагноз: OS- язва сквозного кератотрансплантата, угроза перфорации, миопия слабой степени. OD-миопия слабой степени. До операции проведен скрининговый тест клеточной миграции по предложенному способу. В качестве антигенных препаратов использовали водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 3,0 мг/мл общего белка. Добавили в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл с последующей инкубацией при 37°С в течение 18-20 часов с культурой лейкоцитов в количестве 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Учет результатов реакции проводили на основании определения площадей среднего диаметра для параллельных микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.). Рассчитали индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=S on / S контр. Значение ИМ к антигену роговицы составило 1.25 расч. ед., что свидетельствовало о наличии сенсибилизации. Больному проведено комплексное медикаментозное лечение.

После проведения курса лечения ИМ составил 1,01 расч. ед. Больной выписан в удовлетворительном состоянии.

Пример 5. Пациент Б., 1947 года рождения. В анамнезе оперированное васкулизированное бельмо роговицы, сформировавшееся в результате посттравматического кератита, через 3 месяца после проведенной сквозной кератопластики возник рецидив. Проведен скрининговый тест клеточной миграции по предложенному способу. В качестве антигенных препаратов использовали водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 5,0 мг/мл общего белка. Добавили в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл с последующей инкубацией при 37°С в течение 18-20 часов с культурой лейкоцитов в количестве 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Учет результатов реакции проводили на основании определения площадей среднего диаметра для параллельных микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.). Рассчитали индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=S on / S контр. Значение ИМ к антигену роговицы составило 0,78 расч. ед., что свидетельствовало о наличии сенсибилизации. Наблюдаемый рецидив купировался усилением глюкортикоидной и противовирусной терапии. После проведения курса лечения ИМ составил 0,98 расч. ед. Через 10 месяцев трансплантат прозрачный.

Таким образом, простой, доступный, экономичный способ диагностики органоспецифической аутоиммунизации при заболеваниях глаз, легко воспроизводимый в клинико-диагностических лабораториях позволяет выявлять сенсибилизацию к оболочкам глаза и соответствующим образом использовать при выборе тактики лечения.

Изобретение относится к медицине, а именно, иммунологии, и касается способа определения специфической сенсибилизации к антигенам увеоретинальной ткани, роговицы и хрусталика. Способ включает скрининговый тест клеточной миграции. В качестве антигенных препаратов используют водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 3,0-5,0 мг/мл общего белка. Антигенные препараты добавляют в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл, причем к 100 мкл культуральной среды, содержащий исследуемый антиген в рабочей концентрации или контроль без антигена, добавляют 5 мкл суспензии лейкоцитов с концентрацией 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента. Затем проводят инкубацию при 37°С в течение 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят на основании определения площадей миграции по среднему диаметру круга, образованного микрокультурой, для микрокультур в опыте (S оп.) и контроле (S контр.), рассчитывают индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=Sоп./Sконтр. При значении ИМ менее 0,8 расчетных единиц или значении ИМ более 1,2 расчетных единиц определяют наличие специфической сенсибилизации к антигенам увеоретинальной ткани, роговицы и хрусталика. Изобретение обеспечивает простой, доступный, экономичный способ диагностики органоспецифической аутоиммунизации при заболеваниях глаз, легко воспроизводимый в клинико-диагностических лабораториях. 5 пр.

Способ определения специфической сенсибилизации к антигенам увеоретинальной ткани, роговицы и хрусталика, включающий скрининговый тест клеточной миграции, отличающийся тем, что в качестве антигенных препаратов используют водно-солевые экстракты увеоретинальной ткани, хрусталика, роговицы бычьих глаз, исходно содержащие 3,0-5,0 мг/мл общего белка, которые добавляют в питательную среду в рабочих концентрациях: экстракт увеоретинальной ткани - 50 мкл/мл, экстракт роговицы - 45 мкл/мл, экстракт хрусталика - 45 мкл/мл, причем к 100 мкл культуральной среды, содержащей исследуемый антиген в рабочей концентрации или контроль без антигена, добавляют 5 мкл суспензии лейкоцитов с концентрацией 2-4×10⁶ кл/мл, выделенных из периферической крови пациента, затем проводят инкубацию при 37°С в течение 18-20 часов, учет результатов реакции проводят на основании определения площадей миграции по среднему диаметру круга, образованного микрокультурой, для микрокультур в опыте (S оп) и контроле (S контр.), рассчитывают индекс миграции (ИМ) лейкоцитов по формуле ИМ=Sоп/Sконтр, и при значении ИМ менее 0,8 расчетных единиц или значении ИМ более 1,2 расчетных единиц определяют наличие специфической сенсибилизации к антигенам увеоретинальной ткани, роговицы и хрусталика.