Способ диагностики ретинобластомы у детей Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкоофтальмологии. и может быть использовано для дифференциальной диагностики ретинсблэстомы от неопухолевых поражений глаза.

Целью изобретения является упрощение способа, снижение осложнений и повышение точности путем дифференциальной диагностики ретиноблэстомы от неопухолевой патологии глзза.

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа проводят In vitro и определяют миграционную способность лейкоцитов периферической крови с использованием водорастворимых антигенов с мол.м. 50-100 кД. полученных из биопсийного материала ткани ретинобластомы.

Способ осуществляют следующим образом.

В тесте торможения миграции лейкоцитов определяют миграционную способность лейкоцитов периферической крови в присутствии антигенного препаоэта из ткани ретинобластомы. Рассчитывают индекс миграции лейкоцитов (ИМ) в процентах. При значениях ИМ ниже 95% ставят диагноз ретинобластома у первичных нелеченых больных. При значениях ИМ равных и выше 95%, ставят диагноз неопуXJ

О

4 О 00 VI

холевая патология (у первичных нелеченых больных).

Антигенный препарат для диагностики получают следующим способом.

Ткань ретинобластомы, полученную в результате энуклеации и хранящуюся при - 20°С( размораживают, взвешивают и гомогенизируют на льду в физиологическом растворе хлористого натрия при рН 4.5-5.0 в весовом соотношении ткань:раствор 1:9. Гомогенат фильтруют через капроновую се-гку. Фильтрат охлаждают до 2-3°С, определяют объем и при рН 4,5-5.0 добавляют хлористый калий, постоянно перемешивая, до конечной его концентрации в фильтрате 3 М. Экстракцию проводят в течение 16ч при условиях постоянного перемешивания на магнитной мешалке. Материал центрифугируют при 20000об/мин 30 мин при 4°С. Из полученного супернатанта на колонке с сефадексом G-75 удаляют хлористый калий и балластные вещества с мол.м. ниже 50000 Д. не обладающие диагностической активностью. На колонку размером 4.0x15 см наносят 4-5 мл образца, элюцию проводят дистиллированной водой. Фракции свободного объема с мол м. свыше 50000 Д объединяют и лиофилизируют. Препарат используют в тесте миграции лейкоцитов в агаровых блоках в концентрации 100-200 мкг/мл по белку.

Тест торможения миграции лейкоцитов проводят следующим способом. Гото- вят 3%-ный агар Дифко в 0,05 М трис-HCI буферном растворе, содержащем 0,9% NaCI. рН 7.3. Один объем 3%-ного агара при смешивают с двумя объемами 199 среды, содержащей 1.5% сыворотки IV группы человека, и заливают в пластиковое чзшки до высоты СЛОР агарг-4 мм. После застывания эгара чашки ставят в эксикатор с влажной атмосферной и 5%-ным содержанием СОг- Эксикатор выдерживают при 4°С не мекее 2 ч. В эгарооых блоках пробойником диаметром 3 мм вырезают лунки (три для контроля без антигена и по три для проб с антигенами). Агаров е блоки до постановки реакции хранят во влажной камере с 5%-ным содержанием СО при 4°С. Венозную кровь берут в пробирки с 0,5 мл 2,7%-ного рзстворэ тригюиэ В по 4-5 мл от каждого больного. После оседания эритроцитов отбирают плазму, обогащенную лейкоцитами, центрифугируют ее при 1200 об/мин 5 мин. Осадок лейкоцитов дважды отмывают раствором Хенксэ, не содержащим ионов кальция и магния, в том . жиме. Доводят концентрацию лейко- . тсб до 2.5 х 10 и вносят суспензию в лунки по 10 мкл. Затем в контрольные лунки

вносят по 10 мкл раствора Хенкса, а в рабочие лунки по 10 мл раствора диагностического знтигенного препарата из ткани ретинобластомы, содержащего 100-200 мкг

белка в 1 мл раствора Хенкса. Чашки с лейкоцитами в агаровых блоках помещают в эксикатор с влажной атмосферой и 5%-ным содержанием С02. Эксикатор помещают в термостат при 37°С на 17ч, После инкубации в чашки с агаром заливают 10%-ный раствор формальдегида на 1 ч для фиксирования клеток. Формалин сливают, агар подсушивают до исчезновения влаги в лунках, затем его удаляют. Проводят оценку результатов реакции. Определяют среднюю ширину зон миграции лейкоцитов в контрольных лунках (Ik) и в лунках с антигеном (1а), как расстояние от границы лунки до края зоны миграции. Рассчитывают индекс миграции

лейкоцитов по формуле

X 100%.

Полученные результаты статистически обработаны, подсчитаны средние значения

ИМ в следующих группах обследованных детей: группа 1 - первичные больные с ре- тинобластомой I-IV стадий (8 детей). ИМ - 79 ± 12%, диагноз подтвержден гистологически; группа 2 - больные с рецидивом ретинобластомы на втором глазу после энуклеации худшего глаза, ИГ стадии процесса (12 детей). ИМ - 89 ± 2%, диагноз подтвержден гистологически по удаленному худшему глазу: группа 3 - первичные

больные до операции с клинически установленным диагнозом ретинобластомы с помощью инструментальных методов и офтальмоскопически. I-II стадии (16 детей). ИМ 8 ± 2%, у шести детей в дальнейшем

была проведена энуклеация и диагноз подтвержден гистологически; группа 4 - контрольная группа детей с неопухолевой патологией глаза с подозрением на рети- нобластому, но при положительной динамике диагноз не подтвержден или же не подтвержден гистологически после энуклеации больного глаза (ошибка инструментальной диагностики), среднее значение ИМ 108 ± 7,5%, состав контрольной группы по заключительному диагнозу следующий: хориоритенит (2 детей), ретинит Коатса (2 детей), катаракта и фиброз стекловидного тела, врожденная патология на глазном дне, последствия перенесенного

увеита (8 детей, из них двое с ошибочным диагнозом: ретинобластома, не подтвержденным гистологически после удаления глаза); пятая группа - дети с острой формой увеита (7 человек). ИМ 100 ± 25%.

По критерию Уилкоксгия-Маинз-Уитни значения ИМ - 3 групп отт-чзются от тактовых в 4 и 5 группах с высоким уровнем достоверности. Р ним .о Q.OOV Один из 36 больных 1-3 групп (2.8%) имел ИМ 96%. т.е. на уровне верхней границы диагностически значимого показателя. Один из 23-х контрольных детей (4%) имел ИМ 95% - нижний предел для контрольной группы. У двух из 23-х контрольных детей (ИМ 100%. ИМ 105%, 9% больных) произведена энуклеация на основании данных компьютерной томографии, гистологически ретинобласто- мз не подтвердилась.

П рим е р 1. Больная С.Л., 1980г. рожд. (обследована в 1982 г.) Диагноз - двухсторонняя ретинобластома 1-11 стадии, ОД- MiN0To, OS-M4aN0T0. У отца ребенка - двухсторонняя ретинобластома. в детстве удалены оба глаза. У матери - врожденная катаракта. В возрасте двух лет у ребенка было замечено свечение зрачка левого глаза (OS). При поступлении в клинику передний отрезок правого глаза (ОД) не изменен, в нижнем отделе глазного дна от 5 до 7 ч ткань новообразования беловато-сероватого цвета с незначительной проминенцией в стекловидное тело, периферическая граница не офтэльмоскопируется. Левый глаз - вся полость глазного яблока заполнена новообразованной тканью. По данным ультразвукового обследования нельзя исключить ретинобластому двухстороннюю. 07.08.82 г. проведено обследование предлагаемым способом в тесте миграции лейкоцитов, с использованием антигенного препарата из ткани ретинобластомы. У больной взято 5 мл венозной крови в пробирку с 0,5 мл 2.7%- ноготрилона В. рН 7.3. Кровь отстаивают 40 мин, после оседания эритроцитов отбирают плазму, центрифугируют ее при 1200 об/мин в течение 5 мин осадок клеток ре- суспендируют е растворе Хенкса без кальция и магния рН 7,3, дважды переосаждают в том же режиме центрифугирования. Осадок клеток ресуспен..г-.э/ют в 2 мл раствора Хенкса и с помощью камеры Горяевэ подсчитывают концентрацию и общее количество выделенных лейкоцитов - 7.5x10 . Суспензию центрифугируют в тг.м же режиме, осадок клеток ресуспендируюг в 0.3 мл раствора Хенкса для получения концентрации 2,5x10 . В лунки заранее приготовленных агаровых С-по ОБ с 1%-ным содержанием агарз Дибю и 1 %-ной сывороткой IV группы крови человека в 19 среде вносят по 10 мл суспензии, т.е. 2,5x10 клеток на одну лунку В три контрольные лунки вносят по Ю мкл раствора

Хенкса. а в три другие лунки той же вносят по 10 мкл раствора антигенного препарата в концентрации по белку 100 мкг/мл (в растворе Хенкса). полученного из ткани

0 ретинобластомы указанным способом. Инкубацию проводят при 37°С во влажной камере с 5%-ным содержанием С02 в течение 17 ч. Реакцию останавливают - е каждую чашку диаметром 3.5 см заливают по 2 мл

5 10%-ного раствора формальдегида и фиксируют в течение 1 ч. Формальдегид сливают, агар подсушивают и удаляют. С помощью бинокулярного микроскопа рассчитывают средние значения ширины зон миграции в контроле и с антигеном. Вычисляют ИМ лейкоцитов: ИМ 82%. что указывает на

0 угнетение миграционной активности лейкоцитов, отражающее специфическую реакцию Т-лимфоцитов на антигены ретинобластомы. Диагноз: ретинобластома, в дальнейшем подтвержден гистологи5 чески после энуклеации худшего глаза. Исследование по предлагаемому способу проведено слепым методом. Больная относится к I группе.

П ри м е р2. Больной Я.О., 1976 г.рожд.

0 Диагноз при поступлении: врожденная патология обоих глаз, микрофтальм. помутнение роговиц, изменения на глазном дне, нистагм; подозрение на ретинобластому; роговица с обширными участками помутне5 ния, единичные синехии, радужка этрофич- нэ, хрусталик мутный, стекловидное тело не офтальмоскопируется. рефлекса нет на глазном дне Данные ультразвукового исследования - единичные плавающие ломут0 нения в стекловидном теле, отслойки сетчатки нет. 20 05.82 г. проведено обследование предлагаемым методом. Все процедуры выполняют, аналогично примеру 1. Определяют ИМ, который равен 114%.

5 Миграционная активность лейкоцитов в ответ на антпгенный препарат соответствует норме. В дальнейшем по клинике отрицательной динамики не наблюдалось. Заключительный клинический диагноз: последствия перенесенного внутриутробного увеита. Больной отнесен к контрольной группе - неопухолевая гт тология сетчатки (IV группа).

П р и м е р 3. Больной Шм. На основании исследований методями эхографии и компьютерной томографии поставлен диагноз: односторонняя ретинобластома. 19.11.86 г. Проведено исследование предлагаемым способом, слепым1 методом. Все процедуры выполняют аналогично примеру 1. Определяют ИМ лейкоцитов: ИМ 100%. На основании клинической инструментальной диагностики была произведена энуклеация глаза с подозрением на ретинобластому. Гистологическое исследование не подтвердило диагноз: ре- тиноблэстома, результат соопзл с результатом исследования, проведенного предлагаемым способом, исключающим ретиноблэстому. Заключительный диагноз - последствия перенесенного увеита. Больной отнесен к контрольной группе (IV группа).

П р и м е р 4. Больная Шк. На основании исследований методами эхогрэфии и компьютерной томографии поставлен диагноз ретинобластома. 24,02.88 г. проведено исследование предлагаемым способом, слепым методом. Все процедуры выполняют аналогично примеру 1. Оценивают результат: ИМ - 115%. На основании результатов инструментальной диагностики больной удален глаз. Резуль- тэт гистологического анализа совпал с результатом исследования: ретинобластома не подтверждена. Заключительный диагноз - последствия перенесенного увеитэ. Больная отнесена к контрольной группе (IV группа).

П р и м е р 5. Больная Ш.И.. 1986 г.рожд. Диагноз: двухсторонняя ретинобластома I-II стадии. При поступлении ОД (правый глаз) - степень проминенции 4,5 мм, пло- щадь поражения до 50%, OS (левый глаз) - степень проминенции 3.0 мм, площадь поражения 50%. По данным ультразвукового обследования нельзя исключить ретинобластому. 20.04.88 г. проведено обследование предлагаемым методом в тесте миграции лейкоцитов с использованием антигенного препарата из ткани ретиноблэстомы. Все процедуры выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что концентрацию лейкоцитов доводят до 5,Ox 107 и лейкоциты вносят в дозе 5,0x10° на лукку, а концентрация антигенного препарата ретинобласто- мы 200 мкг в мл. ИМ равен 90-%. Повторное иммунологическое обследование проведе- но 12.10.88 г. ИМ 85%. Третье иммунологическое тестирование проведено 23.11.88 г.. ИМ 82,5%. Проведено обследование перед операцией: на худшем глазу (ОД) степень проминенции 9.0 мм, площадь поражения 80-90%. Результат иммунологического тестирования: ИМ 85-89%. Больней Ш. был удален правый глаз. Гистологическое исследование подтвердило диагноз: ретинобластома.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность досперзцион- ной диагностики ранних (|-И)и поздних (- IV) стадий развития ретинобластомы у

первичных нелеченых больных, обнаружить развитие опухоли на втором глазу после удаления худшего глаза по поводу ретинобластомы. Способ отличается высокой специфичностью, так как основан на специфической реакции Т-лимфоцитов к ан- тигенгм ретинобластомы, специфичность реакции показана в известном способе при использовании кожного теста. Способ не требует дорогостоящей аппаратуры, отличается простотой, высокой воспроизводимостью.

Для оценки специфичности антигенных препаратов, получаемых из ткани ретинобластомы, были обследованы предлагаемым способом дети той же возрастной категории с лимфопролиферативными заболеваниями: злокачественными -лимфогранулематоз, лимфолейкоз, миелолейкоз, лимфосаркома, а также с доброкачественными лимфопролиферэциями - лимфадениты, тонзилит - и практически здоровые дети. В обследованных контрольных группах индивидуальные значения ИМ были в пределах или выше 100% (ошибка оценки ИМ 2-4%). Значения ИМ в контрольных группах, как индивидуальные, так и средние, достоверно отличаются от таковых в группе дегей с ретинобластомой (Р ниже 0,001) по критерию Уилкоксона-Манна-Уитни. Данные подтверждают высокую специфичность антигенных препаратов ретинобластомы, применяемых для диагностики предлагаемым способом.

Формула изобретения

Способ диагностики ретинобластомы у детей путем клинического исследования и постановки иммунологической реакции на антигенные препараты ретинобластомы. отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, снижения осложнений и повышения точности путем дифференциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевой патологии глаза, в качестве иммунологической реакции проводят у первичных больных определение миграционной способности лейкоцитов периферической крови в присутствии антигенных препаратов в оиде водорастворимых пол- ипептидов из опухолевой ткани ретинобластомы с мол.м. 50-100 кД в концентрации 100-200 мкг 1 мл по белку на 2.5x10 лейкоцитов, при этом индекс миграции рас- счит заютчерез 17чот начала постановки реакции и при его значении ниже 95% диагностируют ретинобластому, а при значении, равном и выше 95% - неопухолевую патологию глаза.

Изобретение относится к онкоофтзль- мологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики ретиноб- ластомы. Целью изобретения является упрощение способа, снижение осложнений и повышение за счет дифференциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевой патологии глаза. Цель достигается тем, что включают иммунологическое исследование больного по реакции гиперчувствительности замедленного типа с помощью водно-солевого экстракта из клеток ретиноблзстомы. Новым в способе являются постановка теста In vitro и определение миграционной способности лейкоцитов периферической крови с использованием водорастворимых антигенных препаратов из биопсийного материала ткани ретинобластомы, содержащих пол- ипептиды с мол.м. 50-100 кД в концентрации 100-200 мкг в мл в интервале 16-22 ч от начала реакции миграции. Способ позволяет повысить точность дооперационной диагностики как поздних, так и ранних стадий развития ретинобластомы у первичных больных, обнаружить развитие опухоли сетчатки другого глаза после удаления худшего глаза по поводу ретинобластомы. снизить травматичность и возможность осложнений. (Л С