СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЕНИЛПРОПАНОИДОВ В КОРНЕВИЩАХ И КОРНЯХ ЭЛЕУТЕРОКОККА КОЛЮЧЕГО Российский патент 2023 года по МПК A61K36/254 B01D11/02 G01N21/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа содержания суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего.

Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих селективно определять конкретные БАС.

Элеутерококк колючий - Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim) Maxim., синоним Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim) Harms, семейство Аралиевые (Araliaceae), известный как сибирский женьшень, Ciwujia по-китайски, является одним из наиболее часто используемых адаптогенных растений (1-3). Данное растение впервые введено в научную медицину советскими учеными в виде экстракта элеутерококка жидкого (4, 5). В настоящее время элеутерококк колючий широко применяется во всем мире в качестве адаптогена с целью улучшения физических и умственных способностей для нормального физиологического функционирования человеческого организма в условиях стресса (1-3).

Сообщается о нескольких классах биологически активных соединений, включая фенилпропаноиды, лигнаны, кумарины, флавоноиды, тритерпеновые сапонины (3, 4, 6-8). При этом элеутерозид В (сирингин) и элеутерозиды D и E, считаются наиболее активными компонентами (3, 4, 8).

Существуют разные подходы к количественному определению действующих компонентов в сырье и препаратах элеутерококка колючего. В Европейской Фармакопее Х издания проводят количественное определение содержания суммы элеутерозидов В и Е с использованием в качестве стандарта феруловой кислоты в градиентном режиме элюирования с детекцией при длине волны 220 нм (9). В Российской Федерации в действующей фармакопейной статье «Элеутерококка колючего корневища и корни» раздел «Количественное определение» включает оценку содержания элеутерозида В (сирингина) методом ВЭЖХ и суммы элеутерозидов методом УФ/Вид-спектрофотометрии (10).

В качестве прототипа нами взят фармакопейный способ определения суммы элеутерозидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего (10). Для анализа суммы элеутерозидов извлечение (экстрагент - 70% этанол) упаривают до сухого остатка и растворяют в воде, удаляют липофильные вещества путем многократной обработки водного раствора четыреххлористым углеродом, целевые соединения экстрагируют смесью хлороформ - спирт 96 % в соотношении 5:1 с последующим измерением оптической плотности разведения полученного раствора при длине волны 278 нм и расчетом содержания суммы элеутерозидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин).

Однако, как уже указывалось выше, элеутерозиды представляют собой вещества различной химической природы, во-первых, не для каждого из которых доказана биологическая активность, а, во-вторых, эти вещества имеют различные спектральные характеристики. Следовательно, формулировка «Определение элеутерозидов» является некорректной, так как в условиях фармакопейного метода определяется лишь часть элеутерозидов. В то же время известно, что адаптогенная активность сырья и препаратов элеутерококка колючего обусловлена наличием фенилпропаноидов. Поэтому актуальным является усовершенствование существующих нормативных подходов и требований к качеству корневищ и корней элеутерококка колючего.

Таким образом, целью изобретения является разработка нового способа определения количественного содержания суммы биологически активных в корневищах и корнях элеутерококка колючего - фенилпропаноидов.

Техническим результатом является увеличение выхода биологически активных фенилпропаноидов - элеутерозидов В и D, повышение специфичности и уменьшение продолжительности способа количественного определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин) в корневищах и корнях элеутерококка колючего.

Технический результат достигается тем, что способ осуществляют путем экстракции суммы фенилпропаноидов из корней и корневищ элеутерококка колючего 40% этанолом, очистки полученных извлечений путем фильтрования через слой алюминий оксида, с последующим измерением оптической плотности разведения полученного раствора при длине волны 266 нм и расчетом содержания суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин).

Содержание суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на элеутерозид В (сирингин) и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

m - масса сырья, г;

m_o - масса стандартного образца элеутерозида В (сирингина), г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца элеутерозида В (сирингина)для расчета целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения E стандартного образца при 266 нм, равное 430:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

При анализе известных решений в научной литературе не было обнаружено результатов исследований, по количественной оценке, суммы фенилпропаноидов спектрофотометрическим методом после предварительной очистки суммарного извлечения.

На фиг. 1 представлены электронные спектры поглощения водно-спиртового извлечения из корневищ и корней элеутерококка колючего (кривая 1), раствора хлорогеновой кислоты (кривая 2) и раствора изофраксидина 7-О-глюкозида (кривая 3), которые демонстрируют определяющий вклад этих соединений в общую кривую поглощения суммарного экстракта.

После фильтрования через слой алюминия оксида значение максимума поглощения смещается в сторону максимумов поглощения элеутерозидов В и D (с 288±2 нм до 280±2 нм), увеличивается соотношение длины волны максимума поглощения и длины волны плеча, наблюдаемых в спектре исходного раствора (А₂₈₆/А₃₂₆ = 0,93±0,10 в исходном извлечении и 1,44±0,18 в извлечении после очистки), как представлено на фиг. 2 (обозначения: кривая 1 - электронный спектр поглощения суммарного водно-спиртового извлечения из корней и корневищ элеутерококка колючего; кривая 2 - электронный спектр поглощения раствора после фильтрования через слой алюминия оксида; кривая 3 - электронный спектр поглощения раствора государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина); кривая 4 - электронный спектр поглощения раствора элеутерозида D).

Следует также отметить, что спектры поглощения хлороформно-спиртового извлечения, полученного в соответствии с методикой определения суммы элеутерозидов в разделе «Количественное определение» в ФС.2.5.0053.15 «Элеутерококка колючего корневища и корни» ГФ РФ XIV издания имеет максимум при длине волны 284±2 нм, что отличается от указанного в фармакопейной методике значения 278 нм. С учетом разнообразия структуры элеутерозидов, международного опыта стандартизации сырья и препаратов элеутерококка колючего, физико-химических свойств элеутерозида В (сирингина), на наш взгляд, нецелесообразно использование этой методики при осуществлении контроля качества сырья и препараты элеутерококка колючего.

С учетом указанных выше обстоятельств, представляется возможным новый способ определения суммы биологически активных фенилпропаноидов методом прямой спектрофотометрии в пересчете на элеутерозид В (сирингин) после очистки путем фильтрования через слой алюминия оксида с регистрацией оптической плотности при длине волны, соответствующей максимуму поглощения элеутерозида В (266 нм).

Изучения влияния экстракционной способности различных водно-этанольных смесей, что наиболее оптимальным экстрагентом в отношении извлечения суммы фенилпропанидов является 40 % этанол (табл. 1).

Способ осуществляют следующим образом. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% этанола. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).

2 мл извлечения наносили на слой алюминия оксида высотой около 5 мм в стеклянном фильтре диаметром 1,5-2 см и промывали, используя в качестве растворителя 95 % этанол (не более 20 мл). Фильтрат собирали в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем в мерной колбе доводили этанолом 95 % до метки и перемешивали.

Проводят УФ-детектирование при длине волны 266 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений.

Содержание суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на элеутерозид В (сирингин) и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

m - масса сырья, г;

m_o - масса стандартного образца элеутерозида В (сирингина), г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца элеутерозида В (сирингина) для расчета целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения E стандартного образца при 266 нм, равное 430:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Примечание: Приготовление раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина). Около 0,025 г (точная навеска) государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина) (содержание основного вещества 95 %) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом количестве 95% этанола при нагревании на водяной бане, доводят 95% этанолом до метки, перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А элеутерозида В (сирингина) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 95% этанолом до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 266 нм. В качестве раствора сравнения используют 95% этанол.

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по примерному соответствию максимумов поглощения в спектрах поглощения извлечения после очистки и государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина). Линейность методики определяли для серии растворов элеутерозида В (сирингина) (с концентрациями в диапазоне от 0,002072 до 0,02191 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,99994.

Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора выделенного вещества с известной концентрацией (25 %, 50 % и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %.

Метрологические характеристики прямой спектрофотометрической методики определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (с очисткой через слой алюминия оксида) свидетельствуют о том, что относительная ошибка среднего результата количественного определения в корневищах и корнях элеутерококка колючего с доверительной вероятностью 95 % составляет +4,20 %.

Нами было также изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 - фиг. 3 представлено влияние различных параметров экстракции на выход биологически активных соединений из корневищ с корнями элеутерококка колючего. В результате эксперимента было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение водно-этанольными смесями с концентрацией спирта этилового 40% на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1 (с использованием стандартного образца).

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% этанола. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).

2 мл извлечения наносят на слой алюминия оксида высотой около 5 мм в стеклянном фильтре диаметром 1,5-2 см и промывали, используя в качестве растворителя 95 % этанол (не более 20 мл). Фильтрат собирали в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем в мерной колбе доводили этанолом 95 % до метки и перемешивали.

Проводят УФ-детектирование при длине волны 266 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений.

Примечание: Приготовление раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина). Около 0,025 г (точная навеска) государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина) (содержание основного вещества 95 %) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом количестве 95% этанола при нагревании на водяной бане, доводят 95% этанолом до метки, перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А элеутерозида В (сирингина) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 95% этанолом до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 266 нм. В качестве раствора сравнения используют 95% этанол.

Содержание суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на элеутерозид В (сирингин) и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

,

где D = 0,2552 - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o = 0,857 - оптическая плотность раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

m = 1,0157 - масса сырья, г;

m_o = 0,0249- масса стандартного образца элеутерозида В (сирингина), г;

W = 11 - потеря в массе при высушивании, %.

Испытание проведено в трех повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин) составило 0,41 % ± 0,02 %.

Пример 1 (при отсутствии стандартного образца).

При необходимости определения суммы биологически активных фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего при отсутствии стандартного образца элеутерозида В (сирингина) необходимо провести все действия из примера 1 до этапа приготовления раствора стандартного образца сирингина.

После измерения оптической плотности очищенного извлечения из корневищ и корней элеутерококка колючего при длине волны 266 нм, содержание суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на элеутерозид В (сирингин) и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле, используя рассчитанное значение удельного показателя поглощения E (оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) стандартного образца элеутерозида В (сирингина) при 266 нм - 430.

где:

D = 0,2552 - оптическая плотность испытуемого раствора;

m = 1,0157 - масса сырья, г;

W = 11 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы биологически активных фенилпропаноидов, полученное с использованием удельного показателя поглощения, совпадает со значением, полученным в примере 1.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин) в корневищах и корнях элеутерококка колючего обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 40 % этанол, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (биологически активные фенилпропаноиды).

2. Число стадий разработанного сокращено с 5 в прототипе (получение извлечения, упаривание, жидкость-жидкостная экстракция для удаления липофильных веществ, жидкость-жидкостная экстракция для извлечения целевых веществ и измерение оптической плотности) до 3-х (получение извлечения, фильтрование через слой алюминия оксида с одновременным разведением аликвоты испытуемого раствора, измерение оптической плотности) при существенном сокращении временных затрат и трудоемкости каждой стадии.

3. Расчет содержания суммы фенилпропаноидов ведется на специфической для элеутерозида В (сирингина) длине волны - 266 нм.

4. Ошибка определения среднего результата предлагаемого способа составляет ±4,20%. Это свидетельствует о высокой воспроизводимости методики.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Jia, A. A review of Acanthopanax senticosus (Rupr and Maxim.) Harms: From ethnopharmacological use to modern application / A. Jia, Y. Zhang, H. Gao et al. // J. Ethnopharmacol. - 2021. - Vol. 268. - P. 113586. DOI: 10.1016/j.jep.2020.113586.

2. Huang, L. Acanthopanax senticosus: review of botany, chemistry and pharmacology / L. Huang, H. Zhao, B. Huang, C. Zheng, W. Peng, L. Qin // Pharmazie. - 2011. - Vol. 66, N. 2. - P. 83-97.

3. European medicines agency. Assessment report on Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim., radix. EMA/HMPC/680615/2013. 25 March 2014. Accessed October 13, 2021. Available from:: https://www.ema.europa.eu/en/documents/herbal-report/final-assessment-report-eleutherococcus-senticosus-rupr-et-maxim-maxim-radix_en.pdf

4. Дардымов, И.В. Женьщень, элеутерококк (к механизму биологического действия) / И.В Дардымов // М.: Наука, 1976. - 184 с.

5. Государственный реестр лекарственных средств. 2021. [дата обращения: 13.10.2021]. Доступно на: http://www.grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx.

6. Климова, И.Ю. Аналитические и технические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной / Инна Юрьевна Климова // Дисс. на соискание … уч. степени канд. фармац. наук. - Самара, 2005. - 159 с.

7. Авдеева, Е.В. Фитохимические и аналитические исследования по созданию галеновых препаратов на основе лекарственного растительного сырья, содержащего производные коричных спиртов / Е.В. Авдеева // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2007. - № 2. - С. 129-136.

8. Куркин, В.А. Фенольные соединения корней Eleutherococcus senticosus / В.А. Куркин, Р.И. Евстратова, Г.Г. Запесочная // Химия природ. соединений. - 1991 - № 6. - С. 854-856.

9. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) 10th Edition. EDQM - European Directorate for the Quality of Medicines. Accessed October 13, 2021. Available from: https://www.edqm.eu/en/european-pharmacopoeia-ph-eur-10th-edition.

10. ФС.2.5.0053.15 Элеутерококка колючего корневища и корни (Eleutherococci senticosi rhizomata et radices) / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд., Т. IV. - Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2018. URL:http://resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_4/HTML/1467/index.html#zoom=z.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного определения суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего. Способ заключается в предварительном извлечении водно-спиртового экстракта из корневищ и корней элеутерококка колючего путём однократной экстракции 40% этанолом в соотношении «сырье-экстрагент» – 1:50 в течение 60 мин, дальнейшем очищении путём фильтрования через слой алюминия оксида и количественном определении путём измерения оптической плотности при аналитической длине волны 266 нм с последующим расчетом содержания с суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин) и абсолютно сухое сырье в процентах X вычисляют по формуле:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D_o – оптическая плотность раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина); m – масса сырья, г; m_о – масса стандартного образца элеутерозида В (сирингина), г; W – потеря в массе при высушивании, %; в случае отсутствия стандартного образца элеутерозида В (сирингина) для расчета целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения E стандартного образца при 266 нм, равное 430:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; W – потеря в массе при высушивании, %. Вышеописанный способ позволяет увеличить выход биологически активных фенилпропаноидов – элеутерозидов В и D, повысить специфичность и уменьшить продолжительность способа количественного определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин) в корневищах и корнях элеутерококка колючего. 3 ил., 2 пр.

Способ количественного определения суммы фенилпропаноидов в корневищах и корнях элеутерококка колючего, заключающийся в получении извлечения из лекарственного растительного сырья с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом спектрофотометрии, отличающийся тем, что водно-спиртовое извлечение из корневищ и корней элеутерококка колючего получают путем однократной экстракции 40% этанолом в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50 в течение 60 мин, очищают путем фильтрования через слой алюминия оксида, количественное определение проводят путем измерения оптической плотности при аналитической длине волны 266 нм с последующим расчетом содержания с суммы фенилпропаноидов в пересчете на элеутерозид В (сирингин) и абсолютно сухое сырье в процентах X вычисляют по формуле:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o – оптическая плотность раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

m – масса сырья, г;

m_о – масса стандартного образца элеутерозида В (сирингина), г;

W – потеря в массе при высушивании, %;

в случае отсутствия стандартного образца элеутерозида В (сирингина) для расчета целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения E стандартного образца при 266 нм, равное 430:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

m – масса сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании, %.