Способ получения эндотелиальных клеток человека Российский патент 2023 года по МПК A61B10/00 A61B17/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, эпидемиологии, кардиологии, хирургии, регенеративной медицине, медицинской биотехнологии, генетике эпигенетике соматических клеток и фармакологии, и может применяться в клинической лабораторной (цитологической) диагностике и медицинской биотехнологии.

Известны способы получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, предусматривающие дифференцировку ЭСК человека на подложке и в синтетической среде, способ дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в клетки сосудистого русла, а также способ получения препарата монослоя эндотелиальных клеток из аутопсийного материала. [Киселев С.Л., Лагарькова М.А. // Способ получения эндотелильных клеток // Москва, ООО «Лаборатория клеточных технологий», WO 2009/116893 А1, 2009; Клаус Кристенсен, Мартин Граф, Роберто Яконе, Кристоф Пач, Ева Кристина Тома // «Способ дифференциации плюрипатентных стволовых клеток сосудистого русла», RU 2618871 С2, Санкт-Петербург, 2017; Соловьева Н.А. // Метод получения препарата монослоя эндотелиальных клеток интимы кровеносных сосудов // ПМГУ им. И.М. Мечникова Минздрава России, Москва, 2018].

Недостатками этих способов получение эндотелиоцитов являются необходимость культивирования клеток in vitro или необходимость получения при аутопсии. Способы-аналоги не позволяют оценивать состояние функционирующих in vivo эндотелиоцитов от живых пациентов.

Ближайшим к заявляемому является способ получения клеточных и неклеточных элементов атеросклеротической бляшки путем биопсии от живых пациентов [Пат. РФ №2552314]. Сущность способа состоит в том, что после выполнения баллонной ангиопластики с поверхности баллонного катетера производят смыв клеток и неклеточных элементов, затем полученную суспензию клеток и неклеточных элементов подвергают центрифугированию, удаляют надосадочную жидкость, осуществляют ресуспензирование клеток и неклеточных элементов, затем суспензии клеток и неклеточных элементов помещают в заряженные цитобакеты, которые центрифугируют, после чего полученные препараты используют для дальнейших исследований.

Недостатками способа, выбранного в качестве прототипа, являются высокая инвазивность, сопряженная с большим риском осложнений для пациентов, и сложность технического исполнения.

Другим серьезным недостатком прототипа является то, что он очень малоинформативен (получается 30-50 клеток). Кроме того, при этом способе нет возможности получить жизнеспособные эндотелиоциты.

Задачей настоящего изобретения является возможность получения жизнеспособных эндотелиальных клеток от пациентов в количестве до 500000 одномоментно при исключении инвазивных процедур.

Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе получения эндотелиальных клеток человека, заключающемся в извлечении эндотелиоцитов из биопсийного материала, в качестве биопсийного материала используют удаленный геморроидальный узел, который разделяют на фрагменты, после чего поверхность среза геморроидального узла отпечатывают на предметные стекла.

Удаленный геморроидальный узел является идеальным биопсийныем материалом для получения жизнеспособных эндотелиальных клеток человека, позволяя проводить все виды патоморфологических исследований, а именно, цитологические, иммуногисто- и цитохимические; молекулярно-генетические (гибридизацию in situ); иммунологические.

Обилие, сохранность и легкая доступность эндотелия геморроидального узла позволяет проводить биотехнологические манипуляции для тестирования лекарственных препаратов эндотелиальной таргетности. Из одного геморроидального узла можно сразу получить 100000-500000 жизнеспособных эндотелиоцитов. При этом нет необходимости проникновения в организм пациента.

Способ осуществляется следующим образом. Препараты для цитологических исследований получают методом print-cytology (мазков-отпечатков). Для этого на предметные стекла (фирма) с нанесенным полимерным адгезивом отпечатывают срезанный край геморроидального узла. Срезы разделяют на фрагменты скальпелем, фиксируют пинцетом или зажимом типа «москит», и поверхность среза отпечатывают на предметные стекла. Высушивают на воздухе 10 минут и фиксируют этиловым спиртом 95%. Затем окрашивают АзурII-Эозином по Романовскому. Микроскопирование проводят на световом микроскопе при увеличении 200×, 500×, 1000×.

Пример. Больной К., 34 г. При обследовании в ЗАО «Меди» Санкт-Петербурга 14.10.2021 выявлен хронический комбинированный геморрой II-III ст.Анамнез заболевания около 15 лет. По показаниям выполнено 02.12.2021 г. оперативное вмешательство - лазерная геморроидопластика внутренних геморроидальных узлов аппаратом CERALAS Е15 и иссечение комбинированных геморроидальных узлов электрокоагулятором ERBE. С иссеченных узлов получены мазки-отпечатки (5 стекол с каждого узла). При микроскопии препаратов и обработке цитограммы насчитано от 50 до 300 эндотелиоцитов в каждом препарате, единичные или в пластах, что в пересчете на объем одного геморроидального узла составило 300000-500000 клеток.

Заявляемый способ гарантирует получение жизнеспособных эндотелиоцитов в количестве, достаточном для клинических лабораторных исследований, а также манипуляций ex vivo в медицинской биотехнологии.

Способ позволяет оценивать эндотелий в обширных когортах пациентов и проводить более прецизионные исследования при формировании сердечно-сосудистой патологии в рамках доказательной медицины.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, кардиологии, медицинской биотехнологии, генетике, эпигенетике соматических клеток. В качестве биопсийного материала используют удаленный геморроидальный узел, который разделяют на фрагменты. Поверхность среза геморроидального узла отпечатывают на предметные стекла Способ гарантирует получение жизнеспособных эндотелиоцитов без инвазивного вмешательства в количестве, достаточном для клинических лабораторных исследований, а также манипуляций ex vivo в медицинской биотехнологии, позволяет оценивать эндотелий в обширных когортах пациентов и проводить более прецизионные исследования при формировании сердечно-сосудистой патологии в рамках доказательной медицины. 1 пр.

Способ получения эндотелиальных клеток человека, включающий извлечение эндотелиоцитов из биопсийного материала, отличающийся тем, что в качестве биопсийного материала используют удаленный геморроидальный узел, который разделяют на фрагменты, после чего поверхность среза геморроидального узла отпечатывают на предметные стекла.