ПРИМЕНЕНИЕ РАСТВОРОВ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В БАКТЕРИЦИДНЫХ ЦЕЛЯХ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ТУШЕК ПТИЦ Российский патент 2023 года по МПК A23L3/3463 A01N43/06 A01N33/02 A01P15/00 

Заявленное изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к ветеринарной санитарии, дезинфекции ветеринарных объектов.

Из уровня техники известно применение перекиси водорода для получения бактерицидного эффекта (особенно в отношении грамотрицательной микрофлоры) за счет выделения молекулярного кислорода при контакте с органическими тканями [1]. Однако стоит отметить, что данный метод требует экспозиции в течение 2 часов, а также высокое содержание перекиси может привести к снижению пищевой безопасности конечного продукта.

Известен способ обеззараживания поверхности тушек птицы путем обработки их водным раствором "ТМ-Формодез" с концентрацией 0,013% по действующему веществу в течение 25-40 мин. [2]. Недостатками этого способа является то, что у тушек после их обработки в рекомендуемых концентрациях указанным средством изменяются органолептические показатели, такие как цвет, посторонний запах мяса тушки, присущий раствору; наличие остаточной надуксусной кислоты в 1 см³ смывов с тушек в течение 4 часов после завершения процесса охлаждения.

Наиболее близким аналогом-прототипом данного способа является опыт, описанный в статье [3]. В данном исследовании определялось влияние облучения сверхъяркими светодиодами «холодного» белого света на условно-патогенные бактерии, сенсибилизированные раствором металлокомплексов производных хлорина Е6. Были проведены исследования по сорбции бактериями различных таксономических групп раствора фотосенсибилизатора металлокомплексов производных хлорина Е6. Для выявления фотодинамического эффекта был применен излучатель, выполненный на светодиодах, являющихся источником видимого света в диапазоне 430-680 нм. В работе использовали культуры Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Propionibacterium acnes и Candida albicans. Результаты. Окрашивание клеток фотосенсибилизатором, содержащим металлокомплексы производных хлорина Е6, указывает на сорбцию фотосенсибилизатора клеточной поверхностью микроорганизмов в течение 5-10 мин. На примере S. aureus выявлен факт гибели микробных клеток с использованием фотосенсибилизатора, содержащего металлокомплексы производных хлорина Е6, и прибора, выполненного на сверхъярких диодах, и определены пороговые значения плотности энергетической световой дозы, необходимой для полной гибели бактерий в растворе, что подтверждает теорию о бактериолитическом действии фотосенсибилизаторов для данной методики.

Недостатком данного способа можно считать, что исследования проведены на растворах металлокомплексов производных хлорина Е6, входящих в состав геля «Морион» (сертификат соответствия РОС RU.ПР 73.В 23589) для применения в узких клинических целях. Кроме того, использование данной фармакологической формы экономически не целесообразно и трудновыполнимо на предприятии.

Целью заявленного изобретения является создание способа санации первичной продукции - тушек птицы на предприятиях по промышленной переработке с целью снижения бактериальной обсемененности и повышения качества и безопасности продукции.

Техническим результатом заявленного изобретения является снижение бактериальной обсемененности тушек без органолептических изменений и ограничений по реализации продукции. По производственным опытам контаминация тушек была снижена в 10-100 раз, подтверждение в данных таблицы 3.

Заявленный технический результат достигается за счет того, в бактерицидных целях для обработки тушек птиц применяют растворы фотосенсибилизаторов. Проводят подготовку раствора соли фотосенсибилизатора из расчета 1×10^-4 мг препарата в 1 мл раствора, при этом минимальной подавляющей концентрацией является 500×10^-4 мг препарата в 500 мл раствора, что является наиболее экономически выгодным решением (в проведенных опытах это являлось наибольшим разведением для сохранения бактерицидного эффекта), при этом активацию раствора проводят лазерной установкой мощностью 0,8 Вт, λ≈405 нм экспозицией 5 минут.

В опытах использовались фотосенсибилизаторы второго поколения: «Фотодитазин», действующим веществом которого является димеглюмин хлорин Е6. Поставщиком данных препаратов является организация ООО «РАДА-ФАРМА» (http://www.radapharma.ru/).

В работе in vitro использовали: лазерный аппарат «АСТ» (ООО «Панков-медикал») мощностью 0,8 Вт, λ≈405 нм; музейные штаммы Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Salmonella; питательная среда для выращивания хемоорганотрофных бактерий - мясопептонный бульон; растворы «Фотодитазина» с различной концентрацией. К 0,5 мл бактериальных культур добавляли 0,5 мл облученного раствора каждого фотосенсибилизатора с последующим посевом на специальные среды. Облучение проводили в стеклянной кювете 1,0 мл диаметром 1 см² с расстояния 5 см в течение 5 мин (240 Дж/см²), что показано данными из опыта таблицы 6.

Наблюдения в проведенных опытах показали, что фотосенсибилизаторы проявляют бактерицидные свойства.

Заключение об отсутствии роста в исследованиях ставилось при отсутствии роста на мясопептонном агаре при пересеве из подопытных суспензий исследуемых растворов фотосенсибилизаторов с соответствующими бактериальными культурами, таким образом подтверждалось наличие лизиса вегетативных форм использованных микроорганизмов, кроме того это косвенно указывало на отсутствие L-трансформации.

В проведенных опытах бактерицидный эффект «Фотодитазина» сохранялся до концентрации 1×10^-5 мг препарата в 1 мл раствора (табл. 1).

По данным из таблицы 1 можно сделать вывод о том, что грамотрицательные бактерии (Salmonella enteritidis) более резистентны к фотосенсибилизаторам, чем грамположительные кокковые микроорганизмы, использованные в опытах. Минимальная подавляющая концентрация «Фотодитазина» составляет 1х10^-4 мг препарата в 1 мл раствора соответственно. Результаты исследований подтверждают возможность использования продуктов фотолиза фотосенсибилизаторов в практических целях.

Была проведена серия опытов по санации продукции птицеводства-тушек птиц раствором фотосенсибилизатора.

Для постановки опыта использовались куриные грудки с кожей, от которых предварительно взяли 25 г навески с целью подтверждения отсутствия в них бактерий рода Salmonella, для дальнейшей контаминации их суточной культуральной суспензией музейного штамма Salmonella enteritidis. Предварительно провели последовательные разведения фотосенснбилизатора от 1х10⁰ до 1х10^-5 в объеме по 500 мл раствора каждой концентрации в стерильных контейнерах с закрывающимися крышками. Подопытные тушки погружали в растворы в асептических условиях ламинарного бокса так, чтобы в одном контейнере с определенной концентрацией «Фотодитазина» находилось по одной подопытной куриной грудке. Через 1 минуту погружения подопытные образцы были извлечены из контейнеров и помещены в стерильные пакеты для дальнейшего инкубирования в термостате в течение 3 суток при 30°С. По прошествии инкубирования с площади не менее 100 см каждой грудки были взяты смывы пятью стерильными свабами, кроме того, от каждой грудки была взята навеска 25 г мяса, затем каждый сваб и каждую навеску помещали в пробирки с 10 мл забуференной пептонной воды для дальнейшей инкубации в течение суток при 37°С. По истечению периода культивирования из каждой подопытной пробирки выполняли посев в соответствующие пробирки с селективной средой- RVS бульон (среда Раппапорта-Вассилиадиса). Посевы инкубировали в течение суток при 41°С, после чего посевы визуально просматривали на наличие явных признаков роста бактерий рода Salmonella, при наличии таковых из соответствующих пробирок проводили рассев на плотные дифференциально-диагностические питательные среды- Эндо и агар Рамбах. Затем через сутки инкубирования колонии, выросшие из рассевов с перечисленных плотных питательных сред проанализировали на масс-спектрометре MALDI Biotyper, что окончательно подтвердило принадлежность выделенных бактерий к роду Salmonella. Для контроля куриную грудку контаминировали аналогично подопытным и помещали в термостат с режимом 30°С на 3 суток, после чего подтверждали наличие в ней бактерии рода Salmonella. Результаты представлены в таблице 2.

В контрольной группе, заведомо обсемененных тушек, средняя концентрация обсемененности бактериями рода Salmonella составила 0,8х10⁵ КОЕ/мл, что соответствует 0,5 стандарту мутности МакФарланда.

Так же погружение в растворы с той же экспозицией тушек, не обсемененных бактериями, дало следующие средние результаты, представленные в таблице 3:

Из чего можно сделать вывод, что данная методика приводит к снижению обсемененности продукции.

Для подтверждения отсутствия влияния фотосенсибилизатора Фотодитазина на качество тушек птиц были проведены органолептические и биохимические исследования проб мяса. Проводились органолептические исследования мяса птицы в соответствии с ГОСТ Р 53747-2009 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы». Физико-химические исследования мяса: бензидиновая проба на пероксидазу с целью выяснить влияет ли «Фотодитазин» на созревание мяса и реакция с сернокислой медью с целью обнаружения продуктов неглубокого распада белка в соответствии с ГОСТ 31470-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы органолептических и физико-химических исследований».

Результаты органолептического исследования мяса цыплят из опытных групп приведены в таблице 4.

Как видно из таблицы, органолептические показатели проб мяса цыплят из опытных групп не отличаются по качеству. Вкус, цвет и запах были одинаковыми, консистенция мяса цыплят всех групп были идентичными, без потери упругости. Проба варкой показала, что бульон получился с единичными хлопьями с мелкими каплями жира во всех опытных группах, что соответствует нормам.

Результаты биохимических исследований мяса цыплят-бройлеров представлены в таблице 5.

В биохимических исследованиях мяса во всех пробах сохранялась активность пероксидазы в бензидиновом тесте, а так же при проведении пробы с сернокислой медью не обнаруживались следы первичного распада белка.

Для подтверждения эффективности выбранной экспозиции по активации лазерной установкой «ACT» ООО «Панков-медикал» (или любой другой аналоговой) мощностью 0,8 Вт, λ≈405, с расстояния 5 см в течение 5 минут был проведен опыт по определению эффективных параметров, результаты представлены в таблице 6:

Из результатов опыта можно сделать вывод, что использование лазерной установки мощностью 0,8 Вт, λ≈405, с расстояния 5 см в течение 5 минут является оптимальным, так как увеличение расстояния снижает возможность активации препарата, а увеличение времени экспозиции не актуально в условиях производства.

Активация возможна перед применением фотосенсибилизатора или его раствора, а также возможно производить активацию препаратов непосредственно после нанесения на необходимую область дезинфекции с расстояния 5 см (240 Дж/см²). Возможно, как нанесение растворов на поверхность тушек, так и погружение тушек в раствор активированного препарата с произвольной экспозицией. Данные методики прописаны в фармакодинамике Фотодитазина для проведения фотодинамической терапии, кроме того эффективность данной методики подтверждено результатами опытов из таблиц 2 и 3.

Литература:

1. Дрововозова Т.И., Паненко Н.Н., Кулакова Е.С. «Исследование бактерицидной активности пероксида водорода в сточных водах» // Международный научно-исследовательский журнал. - 2016. - №7-4 (49). - С. 18-21.

2. Патент РФ №2501500, опубликовано: 20.12.2013 Бюл. №35.

3. Бондаренко В.М., Николаева Е.В., Кузиков А.Н., Коновалова Г.Н., Лихачева Е.В. Эффект фотодинамического воздействия металлокомплексов производных хлорина Е6 на условно-патогенные бактерии с использованием сверхъярких светодиодов «холодного» белого света // Лазерная медицина. - 2008. - №12. - С. 26-30.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к ветеринарной санитарии, дезинфекции ветеринарных объектов. Применение раствора фотосенсибилизаторов в бактерицидных целях для обработки тушек заключается в обработке тушек птиц раствором соли фотосенсибилизатора Фотодитазина в концентрации из расчета 1×10^-4 мг соли на 1 мл раствора. Активацию раствора проводят лазерной установкой мощностью 0,8 Вт, λ≈405 нм экспозицией 5 минут с расстояния 5 см. Применение раствора соли фотосенсибилизатора Фотодитазина обеспечивает эффективное снижение бактериальной обсемененности тушек без снижения качества и органолептических изменений продукции. 6 табл.

Применение раствора фотосенсибилизаторов в бактерицидных целях для обработки тушек птиц, характеризующееся тем, что обработку тушек птиц проводят раствором фотосенсибилизатора Фотодитазина в концентрации из расчета 1x10^-4 мг на 1 мл раствора, активацию раствора проводят лазерной установкой мощностью 0,8 Вт, λ≈405 нм экспозицией 5 минут с расстояния 5 см.