C. NOVYI ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2023 года по МПК A61K35/66 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении предлагаются, в частности, способы лечения или ослабления влияния солидной опухоли, присутствующей у человека, циторедукции солидной опухоли, присутствующей у человека, микроскопически точного иссечения опухолевых клеток у человека и уничтожения солидной опухоли, присутствующей у человека. Предоставляются также единицы доз КОЕ C. novyi и наборы.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящее изобретение испрашивает приоритет по предварительной заявке США с регистрационным номером 61/806497, поданной 29 марта 2013 г., полное содержание которой включено в качестве ссылки.

Уровень техники

Стратегии, которые успешно направлены на уничтожение злокачественных новообразований человека, используют различия между нормальными и злокачественными тканями (Dang et al., 2001). Такие различия могут быть найдены на молекулярном уровне, как это наблюдается в случае генетических аберраций, или более глобально в случае физиологических аберраций в опухоли.

Известно, что злокачественные солидные опухоли обычно состоят из некротической центральной массы и жизнеспособной периферической массы. Терапевтические вмешательства на сегодняшний день сосредоточены на хорошо васкуляризированной внешней массе опухоли, но лишь немногие из них направлены на внутреннюю гипоксическую массу (Jain et al., 2001). Внутренняя масса опухоли имеет уникальные характеристики, которые отличают ее от нормальных тканей. Центральная масса имеет плохое кровоснабжение и, следовательно, дефицит питательных веществ и кислорода. В месте активного некроза клеток отсутствие функционирующего кровоснабжения ограничивает клиренс токсичных разрушенных клеток и приводит к низкому рН. Такая среда не подходит для роста большинства клеток человека, но является богатой средой для роста определенных анаэробных бактерий. Более шестидесяти лет назад эта концепция заставила исследователей вводить споры Clostridium histolyticus животным-опухоленосителям (Parker et al., 1947). Примечательно, что бактерии прорастали только в некротической центральной массе опухоли и разжижали опухоли. В 1950-х и 1960-х годах споры Clostridium butyricum вводили больным с различными очень запущенными солидными злокачественными опухолями (Mose, 1967; Mose, 1972). У многих больных наблюдалось существенное прорастание и разрушение значительной части их опухолей, но очень плохое самочувствие этих больных и запущенная стадия заболевания делали трудным их клиническое ведение, и отсутствие полных клинических ответов ослабили дальнейшее преследование этой цели.

Успешное лечение солидных опухолей остается в медицине недостигнутой целью. Таким образом, существует потребность в поиске способов лечения солидных опухолей. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой и других потребностей.

Краткое изложение сущности изобретения

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ лечения или ослабления влияния солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы колониеобразующих единиц (КОЕ) C. novyi, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ циторедукции солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы КОЕ C. novyi, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

Дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ циторедукции солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль в течение от одного до четырех циклов единицы дозы спор C. novyi NT, включающих приблизительно 1×10⁴ спор на цикл, причем каждая единица дозы C. novyi NT суспендирована в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

Дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль в течение от одного до четырех циклов единицы дозы спор C. novyi NT, включающих приблизительно 1×10⁴ спор на цикл, причем каждая единица дозы C. novyi NT суспендирована в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ уничтожения солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы КОЕ C. novyi, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе, где опухоль уничтожается, оставляя края нормальной ткани.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается единица дозы КОЕ C. novyi. Эта единица дозы включает приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе, которые являются эффективными для лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, присутствующей у человека.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается набор для лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, присутствующей у человека. Это набор включает единицу дозы КОЕ C. novyi, включающую приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе, и инструкции по использованию набора.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ микроскопически точного удаления опухолевых клеток у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы колониеобразующих единиц (КОЕ) C. novyi NT, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, которая метастазировала в одно или более мест организма человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы колониеобразующих единиц (КОЕ) C. novyi NT, включающей, по меньшей мере, приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

Краткое описание фигур

На фигурах 1A-B показаны различные изображения остеосарком собак на правом дистальном радиусе/локтевой кости испытуемых индивидуумов «Саши» (фигура 1А) и «Сэмпсона» (фигура 1B) после лучевой терапии и внутривенного (в./в.) введения C. novyi NT.

На фигуре 2A показаны кривые Каплана-Мейера, демонстрирующие выживаемость крыс F433 Fisher после ортотопической имплантации сингенной линии клеток глиомы (F98). Внешняя линия - споры C. novyi-NT вводили в опухоль через 12-15 дней после имплантации опухоли. Внутренняя линия - контроль. На фигуре 2B показана биолюминесценция (система визуализации Xenogen) у трех иллюстративных крыс F433 Fisher после ортотопической имплантации клеточной линии F98 глиомы. Изображения, полученные в 0 день (предварительное лечение - день введения спор С. novyi-NT), в 1 день после IT введения спор C. novyi-NT, и в 2 день после IT введения спор C. novyi-NT. На фигуре 2C показана активность люциферазы (количество в миллионах) в 0 день (предварительное лечение), в 1 день после IT введения спор C. novyi-NT и во 2 день после IT введения спор C. novyi-NT.

На фигурах 3А-В и 4А-B показаны проросшие бактерии C. novyi-NT в пределах микроскопических повреждений опухоли мозга. На этих фигурах окрашивание по Граму выявило вегетативные бактерии C. novyi-NT (белые или черные головки стрелок), локализованные в тканях опухоли (Т) и в звездчатой микроинвазии (S), но не в нормальной ткани головного мозга (Br). Фигура 3А представляет собой увеличение в 100 раз, показывающее границу раздела опухоли и нормального мозга. Фигура 3В представляет собой увеличение в 400 раз, показывающее границу раздела опухоли и нормального мозга. Фигура 4А представляет собой увеличение в 100 раз, показывающее границу раздела нормального мозга, опухоли и звездчатой микроинвазии опухолевой ткани. Фигура 4В представляет собой увеличение в 400 раз, показывающее прорастание C. novyi-NT в звездчатое микроинвазивное поражение.

Фигура 5 представляет собой таблицу сводных данных секвенированных образцов.

Фигура 6 представляет собой таблицу изменений количества копий в саркомах собаки.

На фигуре 7А-F представлены фотографические изображения КТ от собаки 11-R01, показывающие частичный ответ на лечение C. novyi-NT. Изображения охватывают время от предварительного лечения до 70 дня после первой IT дозы спор C. novyi-NT. На фигуре 7А показано изображение опухоли периферической нервной оболочки после предварительного лечения. На фигуре 7B показано формирование абсцесса на 3-й день исследования в объеме, ограничивающемся опухолью. На фигуре 7С показана медицинская санация раны после спонтанного разрыва абсцесса и выделения некротического и гнойного материала, что дает возможность заживления вторичным натяжением. На фигуре 7D показано, что рана зажила полностью на 70 день исследования, и отмечалось снижение самого длинного диаметра опухоли на 77,6%. На фигуре 7E представлено КТ изображение после предварительного лечения, сделанное за 4 дня до первого лечения, которое показывает распространенность опухоли (кружки) на пересечении ушной раковины и черепа. На фигуре 7F представлено КТ изображение после лечения на 10 день исследования, демонстрирующее почти полную циторедукцию опухоли.

Фигуры 8А-D представляют собой фотографические и КТ изображения собаки 04-R03, демонстрирующие полный ответ на лечение C. novyi-NT. Изображения охватывают время от предварительного лечения до 60 дня после первой IT дозы спор C. novyi-NT. На фигуре 8А показано изображение саркомы мягких тканей после предварительного лечения. На фигуре 8В показан абсцесс, локализующийся в опухоли, сформированный на 15-й день исследования, через 1 день после третьей дозы спор C. novyi-NT. На фигуре 8С показано, что циторедукция опухоли была полной на 27 день исследования и была сформирована здоровая грануляционная ткань. На фигуре 8D показано, что рана полностью зажила на 60 день исследования, и никакой остаточной опухоли не замечено (полный ответ). Фигура 8E представляет собой КТ изображение при предварительном лечении, сделанное за 5 дней до первого лечения, демонстрирующее распространенность опухоли (кружки) на предплечье. На фигуре 8F представлено КТ изображение после лечения на 62 день исследования, демонстрирующее полную потерю опухолевой массы.

На фигуре 9 показан размер опухоли собаки 11-R01 от начального IT дозирования спорами C. novyi NT до завершения клинического курса.

На фигуре 10А показано фотографические (верхние панели) и КТ изображения (нижние панели) саркомы мягких тканей собаки у тестируемого испытуемого «Дрейка» (04-R01) после IT дозирования спор C. novyi NT. Области, ограниченные кружками в КТ изображениях, указывают расположение опухоли. На фигуре 10В показан размер опухоли Дрейка от первоначального IT дозирования C. novyi NT, в течение трех последующих доз до завершения клинического курса.

На фигуре 11 показан размер опухоли собаки 04-R03 от первоначального IT дозирования спор C. novyi NT, в течение двух последующих циклов до завершения клинического курса.

На фигуре 12А показан размер опухоли у восьми испытуемых индивидуумов (11-R02, 04-R02, 26-R01, 16-R02, 04-R05, 16-R03, 11-R04 и 04-R06) в течение клинического курса, при котором было проведено четыре цикла IT введения спор C. novyi NT. На фигуре 12B показан размер опухоли у трех испытуемых индивидуумов (04-R08, 01-R02 и 10-R02), для которых были недоступны данные полного клинического курса в связи с необходимой ампутацией или прекращением сбора данных.

На фигуре 13 показана схема введения в опухоли при исследовании с помощью IT лечения, раскрытого в примерах 6 и 7.

На фигурах 14A-D показаны КТ и МРТ изображения больного человека. На фигуре 14A показано КТ изображение с контрастированием на 3 день, демонстриующее доказательства сбора воздуха внутри и вне медуллярной области. На фигуре 14В показано МРТ изображение после предварительного лечения (T1 с контрастированием гадолинием) правой верхней плечевой кости, демонстрирующее массу с повышенной контрастностью, включающую мягкую ткань и, возможно, прилегающую кость. На фигуре 14C показано МРТ изображение на 4 день после лечения, демонстрирующее уменьшение повышенной контрастности в опухолевой массе по сравнению с исходным. На фигуре 14D показано МРТ изображение на 29 день после лечения, демонстрирующие гомогенную массу без повышенной контрастности с возникшим некрозом. Опухоль выделена наконечниками стрелок.

На фигурах 15A-D показан обширный некроз опухоли у больного человека, которого лечили спорами C. novyi-NT. На фигурах 15А и 15В показана биопсия опухоли до лечения, демонстрирующая жизнеспособность опухолевых клеток (лейомиосаркомы), увеличение 40x (A) и 100x (В), соответственно. На фигурах 15С и 15D показана биопсия опухоли после лечения через 4 дня после IT введения спор C. novyi-NT, демонстрирующая обширный некроз опухолевых клеток, увеличение 40x (A) и 100x (В), соответственно.

На фигурах 16A-D показаны различные аспекты процедуры IT введения с использованием трезубой иглы. На фигуре 16А представлена фотография трезубой иглы. На фигурах 16В и 16С показаны изображения компьютерной томографии (КТ) в области направленной инъекции до и после введения иглы. На фигуре 16D показано увеличенное изображение трезубой иглы. На фигуре 16E показано изображение КТ с наложением измерений для определения точек введения иглы.

Подробное описание изобретения

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения или ослабления влияния солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы колониеобразующих единиц (КОЕ) C. novyi, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

При использовании в настоящем документе термины «лечить», «лечение», «терапия» и их грамматические варианты обозначают воздействие на индивидуального субъекта {например, больного человека) с помощью протокола, схемы, процесса или средства, при которых желательно получить физиологический ответ или результат у этого индивидуума, например, у больного. В частности, способы и композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для замедления развития симптомов болезни или задержки начала заболевания или состояния, или прекращения прогрессии развития заболевания. Тем не менее, так как каждый подвергаемый лечению индивидуум может не ответить на конкретные протокол, режим, процесс или средство лечения, лечение не требует того, чтобы желаемый физиологический ответ или результат был достигнут у всех до единого индивидуумов или субъектов, например, у больного, у популяции. Соответственно, данный индивидуум или субъект, например, больной, популяция, может не реагировать или неадекватно реагировать на лечение.

При использовании в настоящем документе термины «улучшить», «улучшение» и их грамматические варианты обозначают снижение тяжести симптомов заболевания у индивидуума.

При использовании в настоящем документе «солидная опухоль» обозначает аномальную массу растущих клеток. Солидные опухоли могут возникать в любой части тела. Солидные опухоли могут быть раковыми (злокачественными) или нераковыми (доброкачественными). Примеры солидных опухолей по настоящему изобретению включают адренокортикальную карциному, анальную опухоль/рак, опухоль/рак мочевого пузыря, опухоли/рак кости (например, остеосаркому), опухоль мозга, опухоль/рак молочной железы, карциноидную опухоль, карциному, опухоль/рак шейки матки, опухоль/рак толстой кишки, опухоль/рак эндометрия, опухоль/рак пищевода, опухоль/рак внепеченочных желчных протоков, семейство опухолей Юинга, опухоль экстракраниальных зародышевых клеток, опухоль/рак глазного яблока, опухоль/рак желчного пузыря, опухоль/рак желудка, опухоль зародышевых клеток, гестационную трофобластную опухоль, опухоль/рак головы и шеи, гипофарингеальную опухоль/рак, карциному островковых клеток, опухоль/рак почки, опухоль/рак гортани, лейомиосаркому, лейкоз, опухоль/рак губы и полости рта, опухоль/рак печени (например, гепатоцеллюлярную карциному), опухоль/рак легких, лимфому, злокачественную мезотелиому, карциному клеток Меркеля, фунгоидный микоз, миелодиспластический синдром, миелопролиферативные заболевания, опухоль/рак носоглотки, нейробластому, опухоль/рак ротовой полости, опухоль/рак ротоглотки, остеосаркому, опухоль/рак эпителия яичников, опухоль зародышевых клеток яичников, опухоль/рак поджелудочной железы, опухоль/рак придаточных пазух и полости носа, опухоль/рак паращитовидной железы, опухоль/рак полового члена, опухоль/рак гипофиза, неоплазму плазматических клеток, опухоль/рак простаты, рабдомиосаркому, опухоль/рак прямой кишки, опухоль/рак почечных клеток, опухоль/рак переходных клеток почечной лоханки и мочеточника, опухоль/рак слюнных желез, синдром Сезари, опухоли кожи (например, кожную Т-клеточную лимфому, саркому Капоши, опухоль тучных клеток, и меланому), опухоль/рак тонкой кишки, саркому мягких тканей, опухоль/рак желудка, опухоль/рак яичек, тимому, опухоль/рак щитовидной железы, опухоль/рак уретры, опухоль/рак матки, опухоль/рак влагалища, опухоль/рак вульвы и опухоль Вильмса. Предпочтительно солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланомы. Более предпочтительно солидная опухоль представляет собой лейомиосаркому, такую как забрюшинная лейомиосаркома.

Используемый в настоящем документе термин «единица дозы» обозначает количество лекарства, вводимого индивидууму, например, человеку, в разовой дозе.

При использовании в настоящем документе «C. novyi» обозначает бактерий, принадлежащих к штамму Clostridium novyi, или бактерий, происходящих от него. Clostridium novyi, которая может быть получена коммерчески, например, от АТСС (#19402), представляет собой грамположительную анаэробную бактерию. Бактерии, происходящие от Clostridium novyi, могут быть получены, например, путем скрининга нативной Clostridium novyi на клоны, которые обладают специфическими характеристиками. Предпочтительными бактериями C. novyi являются бактерии, которые являются нетоксичными или минимально токсичными для индивидуума, такого как млекопитающее, например, человек. Например, предпочтительные C. novyi, C. novyi NT представляют собой бактерии, происходящие от нативной Clostridium novyi, которые потеряли свой ген единственного системного токсина (α-токсина), например, в процессе генетической инженерии или в результате процедуры отбора. C. novyi NT могут быть получены, например, с помощью процедуры, раскрытой в статье Dang et al., 2001 и патенте США No. 7344710. Таким образом, настоящее изобретение включает бактерии C. novyi, а также C. novyi NT.

Фармакокинетические исследования показали, что споры C. novyi NT, если их вводить внутривенно, быстро выводятся из кровотока (более 99% спор выводится в течение 1 часа) и переходят в ретикулоэндотелиальную систему. Долгосрочные исследования распределения показывают, что эти споры в конечном итоге выводятся из всех тканей в течение одного года. Доставляемые в виде спор (в стадии покоя), C. novyi NT прорастают (переходят от споры к вегетативной стадии) при воздействии областей гипоксии опухолей. Таким образом, токсичность C. novyi NT, как ожидается, будет более высокой у опухоленосителей, чем у здоровых индивидуумов.

Здоровые мыши и кролики не показали никаких очевидных клинических признаков (заболеваемости, смертности или клинической картины) токсичности независимо от дозы лечения при внутривенном введении C. novyi NT. Тем не менее, исследование тканей при вскрытии трупов показало как макроскопические, так и микроскопические воспалительные изменения, которые, как предполагается, зависят от дозы лечения. Эти изменения главным образом в печени, селезенке и надпочечниках были выявлены при дозах 5×10⁸ спор/кг или более. Здоровые животные, получавшие более низкие дозы, не характеризовались макроскопическими или микроскопическими отклонениями при вскрытии. У животных, которые получали высокие дозы, разрешение воспаления было очевидно уже на 28-й день, и все признаки воспаления отсутствовали у всех животных через один год после введения. Для определения того, будут ли споры C. novyi NT прорастать в неопухолевой гипоксической ткани, в исследованиях старых мышей с атеросклеротическими бляшками и экспериментальными инфарктами миокарда лечили C. novyi NT. Не обнаружено никаких доказательств локализации или прорастания спор в этих сосудистых повреждениях. В заключение исследования никаких клинических или патологических отклонений (кроме уже существующих сердечнососудистых поражений) не было отмечено у этих мышей. Эти исследования показали, что C. novyi NT не вызывают явной клинической токсичности и вызывают минимальную патологическую токсичность у здоровых животных.

Внутривенное (в./в.) введение спор иммунокомпетентным мышам-опухоленосителям приводит к лизису опухоли и интенсивной воспалительной реакции. У мышей обычно наблюдается один из трех исходов: одна подгруппа мышей (25-35%) излечивается (не наблюдается рецидива опухоли после одного года наблюдения) и вырабатывает долгосрочную устойчивость к исходной опухоли (Agrawal et al., 2004). У другой подгруппы (65-75%) наблюдается полный клинический ответ, но у них происходит рецидив с повторным ростом первичной опухоли. Наконец, у оставшейся подгруппы (от 0 до 20% в зависимости от эксперимента) опухоль подвергается разрушению, но развивается существенная клиническая токсичность через 2-5 дней после начала терапии. Относительно простые меры, такие как гидратация, являются адекватными для снижения этой токсичности, часто полностью устраняя ее признаки. Исследования, проведенные на более крупных животных (кроликах), демонстрируют те же степени излечения и рецидивов при лечении C. novyi NT, но не выявляют угрожающую жизни клиническую токсичность, наблюдаемую в подгруппе мышей. Смерть, связанная с лечением, наблюдалась у мышей-опухоленосителей, но не у кроликов, которых лечили спорами C. novyi NT (Diaz et al., 2005). В этих исследованиях токсичность была связана как с дозой спор, так и с размером опухоли. У умерших мышей не было отмечено никаких конкретных клинико-лабораторных или патологических повреждений органов-мишеней и единственным значимым признаком была гепатоспленомегалия. Излеченные мыши имели редкие остаточные воспалительные изменения в печени и селезенке, но в других отношениях не отличались от животных без лечения. Эти исследования показывают, что токсичность у животных-опухоленосителей может быть выраженной (смерть) у мышей с большими опухолями, но была минимальной у более крупных животных (кроликов), и управляемой у мышей с помощью гидратации или антибиотиков.

Предшествующая работа с использованием спор C. novyi NT, вводимых внутривенно (1×10⁹ спор/м²), в качестве единственного агента у собак-опухоленосителей, не выявила угрожающей жизни токсичности. Собак поддерживали на инфузионной терапии (2-4 мл/кг/час) в течение нескольких дней после лечения, что может уменьшить токсичность. К сожалению, не было никаких измеримых ответов опухолей на лечение.

При применении в настоящем описании «колониеобразующие единицы» («КОЕ») обозначают жизнеспособные формы бактерий, которые создают совокупности клеток (или колонии). Такие жизнеспособные формы включают вегетативные и споровые формы, и в настоящее изобретение включаются обе формы, используемые по отдельности или в сочетании. Анализы колониеобразующих единиц известны в данной области техники. Смотри, например, Breed et al., 1916. Среды для поддержания роста C. novyi коммерчески доступны, например, усиленная клостридиальная среда (RCM) от Difco (BD, Franklin Lakes, NJ). Как изложено выше, единица дозы включает приблизительно 1×10³-1×10⁷, например, приблизительно 1×10³-1×10⁴, приблизительно 1×10⁴-1×10⁵, приблизительно 1×10⁵-1×10⁶ или приблизительно 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ C. novyi.

В одном аспекте этого варианта осуществления единица дозы включает приблизительно 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ C. novyi. В другом аспекте этого варианта осуществления единица дозы включает приблизительно 1×10⁴ КОЕ C. novyi. Удивительно, что дозы, описанные в настоящем документе, для лечения человека неожиданно оказались ниже, чем можно было бы ожидать при простой экстраполяции используемых изобретателями моделей, не являющихся грызунами, при использовании 1/6 от наивысших доз без тяжелой токсичности не у грызунов (HNSTD), как это характерно для исходной терапевтической дозы по онкологическим показаниям. Смотри, например, Senderowicz, A.M., "Information needed to conduct first-in human oncology trials in the United States: a view from a former FDA medical reviewer." Clin. Cane. Res., 2010, 16:1719-25.

Предпочтительно, в настоящем изобретении C. novyi представляет собой C. novyi NT.

В другом аспекте этого варианта осуществления единица дозы включает приблизительно 1×10⁶-1×10⁷ спор C. novyi NT. В еще одном аспекте этого варианта осуществления единица дозы включает приблизительно 1×10⁴ спор C. novyi NT.

В дополнительном аспекте этого варианта осуществления стадия введения включает инъекцию единицы дозы в единственное место в опухоли. В другом аспекте этого варианта осуществления стадия введения включает инъекцию единицы дозы во множественные индивидуальные места, например, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10 уникальных мест в опухоли. Предпочтительно, стадия введения включает инъекцию единицы дозы в 1-5 индивидуальных мест в опухоли, например, в расположении, показанном на фигуре 13. В другом предпочтительном варианте осуществления стадия введения включает инъекцию единицы дозы в 5 или более индивидуальных мест в опухоли. Инъекции во множественные места могут осуществляться, как описано в настоящем документе, предпочтительно с помощью многозубой иглы, такой как Quadra-Fuse® (Rex-Medical, Conshohocken, PA). В настоящем изобретении стадия введения, как отмечалось выше, включает инъекции непосредственно в опухоль, но также рассматриваются и другие способы введения активного агента, такого как C. novyi или C. novyi NT, в опухоль. Такие методы включают имплантацию, чрескожную доставку и доставку через слизистую оболочку.

В другом аспекте этого варианта осуществления способ дополнительно включает введение человеку с множеством циклов лечения, например, с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 20, 25, 30 или более 30 циклами, причем каждый цикл лечения включает инъекцию одной единицы дозы КОЕ C. novyi, например, одной единицы дозы спор C. novyi NT в солидную опухоль. Предпочтительно, введение осуществляют в течение 1-10 циклов лечения. Более предпочтительно, введение осуществляют в течение 2-4 циклов лечения. Интервал между каждым циклом лечения может варьироваться. В одном предпочтительном варианте осуществления интервал между каждым циклом лечения составляет приблизительно 5-100 дней. В другом предпочтительном варианте осуществления интервал между каждым циклом лечения составляет приблизительно 7 дней.

В дополнительном аспекте этого варианта осуществления способ дополнительно включает внутривенное (в./в.) введение жидкости человеку до, во время и/или после каждого введения КОЕ C. novyi, таких как споры C. novyi NT. В./в. жидкости для гидратации больных раскрыты в настоящем документе и хорошо известны в данной области техники. Такие жидкости могут представлять собой жидкости, которые изотоничны крови, такие как, например, 0,9% раствор хлорида натрия или раствор Рингера с лактатом.

В другом аспекте этого варианта осуществления способ дополнительно включает проведение человеку первого курса антибиотиков в течение периода времени и в дозировке, которые являются эффективными для лечения или облегчения неблагоприятного побочного эффекта, вызванного КОЕ C. novyi, такими как споры C. novyi NT. В настоящем изобретении неблагоприятное побочное действие (или неблагоприятное событие, используемое взаимозаменяемо с неблагоприятным побочным эффектом) может включать, но не ограничивается этим, инфекции (такие как вызываемые открытыми ранами), рвоту, кровянистый стул и лихорадку.

В одном предпочтительном варианте осуществления антибиотики вводят в течение двух недель после введения C. novyi. Неограничивающие примеры таких антибиотиков включают амоксициллин, клавуланат, метронидазол и их сочетания.

В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает проведение человеку второго курса антибиотиков в течение периода времени и в дозировке, которые являются эффективными для лечения или облегчения неблагоприятного побочного эффекта, вызванного C. novyi. Второй курс антибиотиков может быть начат после завершения первого курса антибиотиков и осуществляться в течение 1-6 месяцев, например, в течение 3-х месяцев. Предпочтительно, антибиотик, используемый во втором курсе, представляет собой доксициклин, но может быть использован любой антибиотик, одобренный профессиональным врачом.

В еще одном аспекте этого варианта осуществления способ дополнительно включает использование протокола сопутствующего лечения с помощью, например, получения человеком терапевтического средства, выбранного из группы, состоящей из химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии и их сочетания.

C. novyi, например, споры C. novyi NT, и противораковый агент(ы), используемый(ые) в терапии при сопутствующем лечении, можно вводить человеку либо одновременно, либо в различные моменты времени, что врач сочтет наиболее целесообразным. Если C. novyi, например, споры C. novyi NT, и другой противораковый агент(ы) вводят в различные моменты времени, например, путем последовательного введения, то C. novyi, например, споры C. novyi NT, можно вводить человеку перед другим противораковым агентом. В качестве альтернативы, другой противораковый агент(ы) может быть введен человеку до C. novyi, например, спор C. novyi NT.

При применении в настоящем документе «химиотерапия» обозначает любой терапевтический режим, который является совместимым с C. novyi, например, C. novyi NT, с лечением по настоящему изобретению и при котором используются цитотоксические и/или цитостатические агенты против раковых клеток или клеток, которые связаны с раковыми клетками или поддерживают их. В предпочтительном варианте осуществления химиотерапия включает введение человеку агента, выбранного из группы, состоящей из антиметаболита, ингибитора микротрубочек, повреждающего ДНК агента, антибиотика, агента против ангиогенеза, агента, разрушающего сосуды, молекулярно направленного агента и их сочетаний.

При применении в данном описании «антиметаболит» представляет собой вещество, которое снижает или ингибирует использование клетками химического вещества, которое является частью нормального обмена веществ. Неограничивающие примеры антиметаболитных агентов или их аналогов в соответствии с настоящим изобретением включают антифолаты, ингибиторы пуринов, ингибиторы пиримидинов и их сочетания.

При применении в настоящем описании «антифолат» представляет собой вещество, которое изменяет, уменьшает или ингибирует использование фолиевой кислоты (витамин B9) клетками. Неограничивающие примеры антифолатов включают метотрексат (Duramed Pharmaceuticals, Inc.), пеметрексед (Eli Lilly), пралатрексат (Srectrum Pharmaceuticals), аминоптерин (Sigma Aldrich), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Используемый в настоящем документе термин «пурин» представляет собой соединение, которое содержит конденсированные шестичленное и пятичленное азотсодержащие кольца. Неограничивающие примеры пуринов, которые важны для клеточного метаболизма, включают аденин, гуанин, гипоксантин и ксантин. «Ингибитор пуринов» представляет собой вещество, которое изменяет, уменьшает или подавляет образование пурина или использование пурина клеткой. Неограничивающие примеры ингибиторов пуринов включают метотрексат (Duramed Pharmaceuticals, Inc.), пеметрексед (Eli Lilly), гидроксимочевину (Bristol-Myers Squibb), 2-меркаптопурин (Sigma-Aldrich), 6-меркаптопурин (Sigma-Aldrich), флударабин (Ben Venue Laboratories), клофарабин (Genzyme Corp.) неларабин (GlaxoSmithKline), пралатрексат (Srectrum Pharmaceuticals), 6-тиогуанин (Gate Pharmaceuticals), фородезин (BioCryst Pharmaceuticals), пентостатин (Bedford Laboratories), сапацитабин (Cyclacel Pharmaceuticals, Inc.), аминоптерин (Sigma Aldrich), азатиоприн (GlaxoSmithKline), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем документе «пиримидин» представляет собой соединение, которое содержит шестичленное азотсодержащее кольцо. Неограничивающие примеры пиримидинов, которые важны для клеточного метаболизма включают урацил, тимин, цитозин и оротовую кислоту. «Ингибитор пиримидинов» представляет собой вещество, которое изменяет, уменьшает или подавляет образование пиримидина или использование пиримидина клеткой. Неограничивающие примеры ингибиторов пиримидинов включают 5-фторурацил (Tocris Bioscience), тегафур (LGM Pharma), капецитабин (Xeloda) (Roche), кладрибин (LGM Pharma), гемцитабин (Eli Lilly), цитарабин (Bedford Laboratories), децитабин (Eisai Inc.) флоксуридин (Bedford Laboratories), 5- азацитидин (Pharmion Pharmaceuticals), доксифлуридин (Cayman Chemicals), тиарабин (Access Pharmaceuticals), троксацитабин (SGX Pharmaceuticals), ралтитрексед (AstraZeneca), кармофур (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 6-азаурацил (MP Biomedicals, LLC), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения антиметаболитный агент выбран из группы, состоящей из 5-фторурацила (Tocris Bioscience), тегафура (LGM Pharma), капецитабина (Xeloda) (Roche), кладрибина (LGM Pharma), метотрексата (Duramed Pharmaceuticals, Inc.), пеметрекседа (Eli Lilly), гидроксимочевины (Bristol-Myers Squibb), 2-меркаптопурина (Sigma-Aldrich), 6-меркаптопурина (Sigma-Aldrich), флударабина (Ben Venue Laboratories), гемцитабина (Eli Lilly), клофарабина (Genzyme Corp.), цитарабина (Bedford Laboratories), децитабина (Eisai Inc.), флоксуридина (Bedford Laboratories), неларабина (GlaxoSmithKline), пралатрексата (Spectrum Pharmaceuticals), 6-тиогуанина (Gate Pharmaceuticals), 5-азацитидина (Pharmion Pharmaceuticals), доксифлуридина (Cayman chemicals), фородезина (BioCryst Pharmaceuticals), пентостатина (Bedford Laboratories), сапацитабина (Cyclacel Pharmaceuticals, Inc.), тиарабина (Access Pharmaceuticals), троксацитабина (SGX Pharmaceuticals), ралтитрекседа (AstraZeneca), аминоптерина (Sigma Aldrich), кармофура (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), азатиоприна (GlaxoSmithKline), 6-азаурацила (MP Biomedicals, LLC) их фармацевтически приемлемых солей и их сочетаний.

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор микротрубочек» представляет собой вещество, которое нарушает функционирование микротрубочки, например, полимеризацию или деполимеризацию отдельных единиц микротрубочек. В одном аспекте настоящего изобретения ингибитор микротрубочек может быть выбран из группы, состоящей из агента, дестабилизирующего микротрубочки, агента, стабилизирующего микротрубочки, и их сочетаний. Ингибитор микротрубочек по настоящему изобретению может быть также выбран из группы, состоящей из таксана, алкалоида барвинка, эпотилона и их сочетаний. Неограничивающие примеры ингибиторов микротрубочек в соответствии с настоящим изобретением включают BT-062 (Biotest), HMN-214 (D. Western Therapeutics), эрибулина мезилат (Eisai), виндезин (Eli Lilly), EC-1069 (Endocyte), EC-1456 (Endocyte), ЕС-531 (Endocyte), винтафолид (Endocyte), 2-метоксиэстрадиол (EntreMed), GTx-230 (GTx), трастузумаб-эмтансин (Hoffman-La Roche), кролибулин (Immune Pharmaceuticals), конъюгаты D1302A-майтансиноида (ImmunoGen), IMGN-529 (ImmunoGen), лорвотузумаб-мертанзин (ImmunoGen), SAR-3419 (ImmunoGen), SAR-566658 (ImmunoGen), IMP-03138 (Impact Therapeutics), сочетания топотекана/винкристина (LipoCure), BPH-8 (Molecular Discovery Systems), фосбретабулина трометамин (OXiGENE), эстрамустина фосфат натрия (Pfizer), винкристин (Pierre Fabre), винфлунин (Pierre Fabre), винорелбин (Pierre Fabre), RX-21101 (Rexahn), кабазитаксел (Sanofi), STA-9584 (Synta Pharmaceuticals), винбластин, эпотилон А, патупилон (Novartis), иксабепилон (Bristol-Myers Squibb), эпотилон D (Kosan Biosciences), паклитаксел (Bristol-Myers Squibb), доцетаксел (Sanofi-Aventis), HAI абраксан, DJ-927 (Daiichi Sankyo), дискодермолид (CAS No: 127943-53-7), элеутеробин (CAS No.: 174545-76-7), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Повреждающие ДНК агенты по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются этим, алкилирующие агенты, агенты на основе платины, интеркалирующие агенты и ингибиторы репликации ДНК.

При применении в настоящем описании термин «алкилирующий агент» представляет собой вещество, которое добавляет одну или более алкильных групп (C_nH_m, где n и m представляют собой целые числа) к нуклеиновой кислоте. В настоящем изобретении алкилирующий агент выбран из группы, состоящей из азотистых ипритов, производных нитрозомочевины, алкилсульфонатов, триазинов, этилениминов и их сочетаний. Неограничивающие примеры азотистых ипритов включают мехлорэтамин (Lundbeck), хлорамбуцил (GlaxoSnnithKline), циклофосфамид (Mead Johnson Co.), бендамустин (Astellas), ифосфамид (Baxter International), мелфалан (Ligand), мелфалана флуфенамид (Oncopeptides) и их фармацевтически приемлемые соли. Неограничивающие примеры производных нитрозомочевины включают стрептозоцин (Teva), кармустин (Eisai), ломустин (Sanofi) и их фармацевтически приемлемые соли. Неограничивающие примеры алкилсульфонатов включают бусульфан (Jazz Pharmaceuticals) и его фармацевтически приемлемые соли. Неограничивающие примеры триазинов включают дакарбазин (Bayer), темозоломид (Cancer Research Technology) и их фармацевтически приемлемые соли. Неограничивающие примеры этилениминов включают тиотепу (Bedford Laboratories), алтретамин (MGI Pharma) и их фармацевтически приемлемые соли. Другие алкилирующие агенты включают ProLindac (Access), AC-225 BC-8 (Actinium Pharmaceuticals), ALF-2111 (Alfact Innovation), трофосфамид (Baxter International), MDX-1203 (Bristol-Myers Squibb), тиоуреидобутиронитрил (CellCeutix), митобронитол (Chinoin), митолактол (Chinoin), нимустин (Daiichi Sankyo), глуфосфамид (Eleison Pharmaceuticals), сочетания HuMax-TAC ​​и PBD ADC (Genmab), ВР-С1 (Meabco), треосульфан (Medac), нифуртимокс (Metronomx), импросульфана тозилат (Mitsubishi Tanabe Pharma), ранимустин (Mitsubishi Tanabe Pharma), ND-01 (NanoCarrier), HH-1 (Nordic Nanovector), сочетания клеток 22P1G и ифосфамида (Nuvilex), эстрамустина фосфат (Pfizer), преднимустин (Pfizer), лурбинектедин (PharmaMar), трабектедин (PharmaMar), алтритамин (Sanofi), SGN-CD33A (Seattle Genetics), фотемустин (Servier), недаплатин (Shionogi), гептаплатин (Sk Holdings), апазихион (Spectrum Pharmaceuticals), СG-2000 (Spirogen), TLK-58747 (Telik), ларомустин (Vion Pharmaceuticals), прокарбазин (Alkem Laboratories Ltd.) и их фармацевтически приемлемые соли.

Используемый в настоящем документе термин «агент на основе платины» представляет собой противораковое вещество, которое содержит металлическую платину, и аналоги таких веществ. Платина может находиться в любом состоянии окисления. Агенты на основе платины по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются этим, производные 1,2-диаминоциклогексана (DACH), комплексы фенантроимидазола Pt (II), соединения платины IV, би- и три-ядерные соединения платины, деметилкантаридин-интегрированные комплексы платины, соединения, конъюгированные с платиной, наночастицы и полимерные мицеллы цисплатина, стерически затрудненные комплексы платины, оксалиплатин (Debiopharm), сатраплатин (Johnson Matthey), BBR3464 (Novuspharma S.p.А.), ZD0473 (Astra Zeneca), цисплатин (Nippon Kayaku), JM-11 (Johnson Matthey), PAD (цис-дихлорбисциклопентиламин платины (II)), МВА ((транс-1,2-диаминоциклогексан)бисбромацетато платины ( II)), PHM ((1,2-циклогександиамин)малонато платины (II)), SHP ((1,2-циклогександиамин)сульфато платины (II)), нео-PHM ((транс-R,R-1,2-циклогександиамин)малонато платины (II)), нео-SHP ((транс-R,R-1,2-циклогександиамин)сульфато платины (II)), JM-82 (Johnson Matthey), PYP ((1,2-циклогександиамин)биспирувато платины (II)), PHIC ((1,2)-циклогександиамин)изоцитрато платины (II)), TRK-710 ((транс-R,R-1,2-циклогександиамин)[3-ацетил-5-метил-2,4(3Н,5Н)-фурандионато] платины (II)), ВОР ((1,2-циклооктандиамин) бисбромацетато платины (II)), JM-40 (Johnson Matthey), энлоплатин (UnionPharma), зениплатин (LGM Pharma), CI-973 (Parke-Davis), лобаплатин (Zentaris AG/Hainan Tianwang International Pharmaceutical), циклоплатам (LGM Pharma), WA2114R (мибоплатин/лобаплатин) (Chembest Research Laboratories, Ltd.) гептаплатин (SKI2053R) (SK Chemicals), TNO-6 (спироплатин) (Haihang Industry Co., Ltd.), ормаплатин (тетраплатин) (LGM Pharma), JM-9 (ипроплатин) (Johnson Matthey), BBR3610 (Novuspharma S.p.А.), BBR3005 (Novuspharma S.p.A.), BBR3571 (Novuspharma S.p.A.), BBR3537 (Novuspharma S.p.A.), ароплатин (L-NDDP) (BOC Sciences), Pt-ACRAMTU ({[Pt(en) CI(ACRAMTU-S)](NO₃)₂ (en = этан-1, 2-диамин, ACRAMTU = 1-[2-(-акридин-9-ил)этил]-1,3-диметилтиомочевина)}), нагруженные цисплатином липосомы (LiPlasomes), SPI-077 (Alza), липоплатин (Regulon), липоксал (Regulon), карбоплатин (Johnson Matthey), недаплатин (Shionogi Seiyaku), мириплатина гидрат (Dainippon Sumitomo Pharma), ормаплатин (LGM Pharma), энлоплатин (Lederle Laboratories), CI973 (Parke-Davis), ПЭГилированный цисплатин, ПЭГилированный карбоплатин, ПЭГилированный оксалиплатин, трансплатин (транс- диаминодихлорплатина (II); смешанный Z:транс-[PtCl₂{Z-HN=C(OMe)Me}(NH₃)]), CD-37 (гибридная молекула эстрадиол-платина (II)), пикоплатин (Poniard Pharmaceuticals),

AH44 (Komeda et al., 2006; Harris et al., 2005; Qu et al., 2004), триплатин NC (Harris et al., 2005; Qu et al., 2004), ProLindac (Access) их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем описании термин «интеркалирующий агент» включает, но не ограничивается этим, доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, идарубицин, митоксантрон, их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства и их сочетания.

Неограничивающие примеры ингибиторов репликации ДНК включают, но не ограничиваются этим, ингибиторы топоизомеразы. Используемый в настоящем документе термин «ингибитор топоизомеразы» представляет собой вещество, которое уменьшает экспрессию или активность топоизомеразы. Ингибиторы топоизомеразы в соответствии с настоящим изобретением могут ингибировать топоизомеразу I, топоизомеразу II или как топоизомеразу I, так и топоизомеразу II. Неограничивающие примеры ингибиторов топоизомеразы I согласно настоящему изобретению включают иринотекан (Alchemia), АРН-0804 (Aphios), камптотецин (Aphios), козитекан (BioNumerik), топотекан (GlaxoSmithKline), белотекана гидрохлорид (Chon Kun Dang), фиртекан пегол (Enzon), HN-30181A (Hanmi), hRS7-SN-38 (Immunonnedics), лабетузумаб-SN-38 (Immunonnedics), этиринотекан пегол (Nektar Therapeutics), NK-012 (Nippon Kayaku), SER-203 (Serina Therapeutics), пролекарство симмитекана гидрохлорид (Shanghai HaiHe Pharmaceuticals), гиматекан (Sigma-Tau), намитекан (Sigma-Tau), SN-38 (Supratek Pharnna), ТСХ-388 гидрохлорид (Taiwan Liposome Company), ламелларин D (PharmaMar), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Неограничивающие примеры ингибиторов топоизомеразы типа II в соответствии с настоящим изобретением включают ADVA-27a (Advanomics), зоптарелин доксорубицин (Aeterna Zentaris), вальрубицин (Anthra Pharmaceuticals), разоксан (AstraZeneca), доксорубицин (Avena Therapeutics), амсакрин (Bristol-Myers Squibb), этопозида фосфат (Bristol-Myers Squibb), этопозид (Novartis), дексразоксан (Cancer Research Technology), сочетание цитарабина/даунорубицина (Celator Pharmaceuticals), CAP7.1 (CellAct Pharma), альдоксорубицин (CytRx), амрубицина гидрохлорид (Dainippon Sumitomo Pharma), возароксин (Dainippon Sumitomo Pharma), даунорубицин (Gilead Sciences), сочетание милатузумаба/доксорубицина (Immunomedics), акларубицин (Kyowa Hakko Kirin), митоксантрон (Meda), пирарубицин (Meji), эпирубицин (Pfizer), тенипозид (Novartis), F-14512 (Pierre Fabre), эллиптиния ацетат (Sanofi), зорубицин (Sanofi), дексразоксан (TopoTarget), собузоксан (Zenyaku Kogyo), идарубицин (Pfizer), HU-331 (Cayman Chemical), ауринтрикарбоновая кислота (Sigma Aldrich), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Химиотерапевтические антибиотики в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничиваются этим, актиномицин, антрациклины, валрубицин, эпирубицин, блеомицин, пликамицин, митомицин их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства и их сочетания.

При применении в настоящем документе термин «агент против ангиогенеза» обозначает любое соединение, которое предотвращает или задерживает новообразование кровеносных сосудов из существующих сосудов. В настоящем изобретении примеры агентов против ангиогенеза включают, но не ограничиваются этим, пегаптаниб, ранибизумаб, бевацизумаб (авастин), карбоксиамидотриазол, TNP-470, CM101, IFN-α, IL-12, тромбоцитарный фактор 4, сурамин, SU5416, тромбоспондин, антагонисты VEGFR, ангиостатические стероиды и гепарин, ингибирующий ангиогенез фактор, происходящий из хряща, ингибиторы металлопротеиназ матрикса, ангиостатин, эндостатин, 2-метоксиэстрадиол, текогалан, пролактин, α_vβ₃ ингибиторы, линомид, ловушку VEGF, аминостеролы, кортизон, ингибиторы тирозинкиназы, антиангиогенную миРНК, ингибиторы системы комплемента, агенты, разрушающие сосуды, и их сочетания. Предпочтительно, агент против ангиогенеза представляет собой бевацизумаб.

Антагонисты VEGFR по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются этим, пазопаниб, регорафениб, ленватиниб, сорафениб, сунитиниб, акситиниб, вандетаниб, кабозантиниб, ваталаниб, семаксаниб, ZD6474, SU6668, AG-013736, AZD2171, AEE788, MF1/MC-18F1, DC101/IMC-1С11, рамуцирумаб и мотезаниб. Антагонисты VEGFR могут также включать ингибиторы VEGF, такие как бевацизумаб, афлиберцепт, 2С3, r84, ловушку VEGF и ранибизумаб.

Ангиостатические стероиды по настоящему изобретению включают любой стероид, который ингибирует, ослабляет, предотвращает ангиогенез или неоваскуляризацию или вызывает регрессию патологической васкуляризации. Ангиостатические стероиды согласно настоящему изобретению включают стероиды, которые раскрыты в Европейской заявке на патент с серийным No. EP1236471 A2, а также те 20-замещенные стероиды, которые раскрыты в патенте США с серийным No. 4599331, те 21-гидрокси-стероиды, которые раскрыты в патенте США с серийным No. 4771042, те C₁₁-функционализированные стероиды, которые описаны в международной заявке WO 1987/02672, 6α-фтор-17α,21-дигидрокси-16α-метилпрегна-4,9(11)-диен-3,20-диона 21-ацетат, 6α-фтор-17α,21-дигидрокси-16β-метилпрегна-4,9(11)-диен-3,20-дион, 6α-фтор-17α,21-дигидрокси-16β-метилпрегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-21-фосфонокси и их фармацевтически приемлемые соли, гидрокортизон, тетрагидрокортизол, 17α-гидроксипрогестерон, 11α-эпигидрокортизон, кортексолон, кортикостерон, дезоксикортикостерон, дексаметазон, кортизона 21-ацетат, гидрокортизона 21-фосфат, 17α-гидрокси-6α-метилпрегн-4-ен-3,20-диона 17-ацетат, 6α-фтор-17α,21-дигидрокси-16α-метилпрегна-4,9(11)-диен-3,20-дион и Δ9(11)-этиановые сложные эфиры, все они раскрыты в международной заявке с серийным No. WO 1990/015816 A1.

Факторы, ингибирующие ангиогенез, полученные из хряща, включают, но не ограничиваются этим, пептид тропонин и хондромодулин I.

Ингибиторы металлопротеиназ матрикса по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются этим, сукцинилгидроксаматы, такие как маримастат и SC903, сульфонамидгидроксаматы, такие как CGS27023A, фосфинамидгидроксаматы, карбоксилатные ингибиторы, такие как BAY12-9566, тиоловые ингибиторы, такие как соединение B, аналоги аминометилбензимидазола, пептиды, такие как регасепин и тетрациклины, такие как миноциклин.

α_vβ₃ ингибиторы включают, но не ограничиваются этим, IS20I, пептид P11, EMD 85189 и 66203, пептид RGD, миметики RGD, такие как S 36578-2, эхистатин, антитела или фрагменты антител против интегрина α_vβ₃, такие как витаксин, которые направлены на внеклеточный домен димера, циленгитид и пептидомиметики, такие как S247.

Антиангиогенные миРНК включают, но не ограничиваются этим, миРНК, направленные на мРНК, которые положительно регулируются во время ангиогенеза, необязательно ПЭГилированные миРНК, направленные на мРНК VEGF или VEGFR, и миРНК, направленные на UPR (чувствительный элемент неуложенного белка)-IRE1α, XBP-1 и мРНК ATF6. Кроме того, показано, что миРНК, которые имеют как минимум 21 нуклеотид в длину, независимо от направленности последовательности, подавляют неоваскуляризацию (Kleinman et al., 2008) и могут быть включены в антиангиогенные миРНК по настоящему изобретению.

Ингибиторы системы комплемента, включают, но не ограничиваются этим, модифицированные природные компоненты комплемента, такие как растворимый рецептор типа 1 комплемента, растворимый рецептор типа 1 комплемента, лишенный длинного гомологичного повтора-A, растворимый рецептор типа 1-сиалил Lewis^x, комплемента, рецептор типа 2 комплемента, растворимый фактор, ускоряющий распад, растворимый белковый кофактор мембраны, растворимый CD59, гибрид растворимого фактора, ускоряющего распад, и CD59, гибрид мембранного белкового кофактора и растворимого фактора, ускоряющего распад, ингибитор С1 и рецептор C1q, антитела, ингибирующие комплемент, такие как моноклональное антитело против C5 и одноцепочечный Fv против С5, синтетические ингибиторы активации комплемента, такие как антагонистические пептиды и аналоги, направленные на рецептор С5а, и природные соединения, которые блокируют активацию комплемента, такие как гепарин и родственные гликозаминогликановые соединения. Дополнительные ингибиторы системы комплемента раскрыты Makrides (Makrides, 1998).

При применении в настоящем описании термин «агент, разрушающий сосуды» означает любое соединение, которое направлено на существующую сосудистую сеть, например, сосудистую сеть опухоли, повреждает или разрушает указанную сосудистую сеть и/или вызывает некроз центральной массы опухоли. В настоящем изобретении примеры агентов, разрушающих сосуды, включают, но не ограничиваются этим, ABT-751 (Abbott), AVE8062 (Aventis), BCN105 (Bionomics), BMXAA (Antisoma), CA-4-Р (Oxigene), CA-1-P (Oxigene), CYT997 (Cytopia), MPC-6827 (Myriad Pharmaceuticals), MN-029 (MediciNova), NPI-2358 (Nereus), Oxi4503 (Oxigene), TZT-1027 (Daichi Pharmaceuticals), ZD6126 (AstraZeneca и Angiogene), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Используемый в настоящем документе термин «молекулярно направляемый агент» представляет собой вещество, которое вмешивается в функцию одной молекулы или группы молекул, предпочтительно тех, которые вовлечены в рост и прогрессию опухоли, при введении индивидууму. Неограничивающие примеры молекулярно направляемых агентов по настоящему изобретению включают ингибиторы передачи сигнала, модуляторы экспрессии генов и других клеточных функций, модуляторы иммунной системы, конъюгаты антитело-лекарство (ADCs) и их сочетания.

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор передачи сигнала» представляет собой вещество, которое нарушает передачу информации между клетками, например, когда внеклеточная сигнальная молекула активирует рецептор клеточной поверхности. Неограничивающие примеры ингибиторов передачи сигнала по настоящему изобретению включают ингибиторы киназы анапластической лимфомы (ALK), ингибиторы B-Raf, ингибиторы эпидермального фактора роста (EGFRi), ингибиторы ERK, ингибиторы киназы Janus, ингибиторы МЕК, ингибиторы мишени рапамицина млекопитающих (mTor), ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3Ki) и ингибиторы Ras.

При применении в настоящем документе «ингибитор киназы анапластической лимфомы (ALK)» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с ALK, например, путем связывания с ALK и (ii) уменьшает экспрессию или активность ALK. Неограничивающие примеры ингибиторов киназы анапластической лимфомы (ALK) по настоящему изобретению включают кризотиниб (Pfizer, New York, NY), CH5424802 (Chugai Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan), GSK1838705 (GlaxoSmithKline, United Kingdom), Chugai 13d (Chugai Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan), CEP28122 (Teva Pharmaceutical Industries, Ltd., Israel), AP26113 (Ariad Pharmaceuticals, Cambridge, MA), цефалон 30 (Teva Pharmaceutical Industries, Ltd., Israel), Х-396 (Xcovery, Inc. West Palm Beach, FL), Amgen 36 (Amgen Pharmaceuticals, Thousand Oaks, CA), ASP3026 (Astellas Pharma US, Inc., Northbrook, Illinois) и Amgen 49 (Amgen Pharmaceuticals, Thousand Oaks, CA), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем документе «ингибитор B-Raf» по настоящему изобретению представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с B-Raf, например, путем связывания с B-Raf и (ii) уменьшает экспрессию или активность B-Raf. Ингибиторы B-Raf могут быть подразделены на два типа по соответствующему им типу связывания. При применении в настоящем документе ингибиторы B-Raf «типа 1» представляют собой такие ингибиторы, которые направлены на АТФ-связывающие сайты киназы в ее активной конформации. Ингибиторы B-Raf «типа 2» представляют собой такие ингибиторы, которые предпочтительно связываются с киназой в неактивной конформации. Неограничивающие примеры ингибиторов B-Raf типа 1 по настоящему изобретению включают:

Соединение 14 (Id.), дабрафениб (GlaxoSmithKline), GDC-0879 (Genentech), L-779450 B-Raf (Merck), PLX3202 (Plexxikon), PLX4720 (Plexxikon), СО-590885 (GlaxoSmithKline), СО-699393 (GlaxoSmithKline), вемурафениб (Plexxikon), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно, чтобы ингибитор RAF типа 1 представлял собой дабрафениб или его фармацевтически приемлемую соль.

Неограничивающие примеры ингибиторов B-Raf типа 2 по настоящему изобретению включают:

сорафениб (Onyx Pharmaceuticals), ЗМ-336372 (AstraZeneca), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Другие ингибиторы B-Raf включают без ограничения AAL881 (Novartis); AB-024 (Ambit Biosciences), ARQ-736 (ArQule), ARQ-761 (ArQule), AZ628 (Axon Medchem BV), BeiGene-283 (BeiGene), BIIB-024 (MLN 2480) (Sunesis & Takeda), ингибитор b RAF (Sareum), ингибитор BRAF-киназы (Selexagen Therapeutics), миРНК BRAF 313 (tacaccagcaagctagatgca) и 253 (cctatcgttagagtcttcctg) (Liu et al., 2007), CTT239065 (Institute of Cancer Research), DP-4978 (Deciphera Pharmaceuticals), HM-95573 (Hanmi), GW 5074 (Sigma Aldrich), ISIS 5132 (Novartis), LErafAON (NeoPharm, Inc.) LBT613 (Novartis), LGX 818 (Novartis), пазопаниб (GlaxoSmithKline), PLX5568 (Plexxikon), RAF-265 (Novartis), RAF-365 (Novartis), регорафениб (Bayer Pharmaceuticals Healthcare, Inc.) RO 5126766 (Hoffmann-La Roche), ТАК 632 (Takeda), TL-241 (Teligene), XL-281 (Exelixis), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем документе «ингибитор EGFR» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с EGFR, например, путем связывания с EGFR, и (ii) уменьшает экспрессию или активность EGFR. Неограничивающие примеры ингибиторов EGFR в соответствии с настоящим изобретением включают (+)-аэроплизинин-1 (CAS # 28656-91-9), 3-(4-изопаропилбензилиденнил)-индолин-2-он, АВТ-806 (Life Science Pharmaceuticals), АС-480 (Bristol-Myers Squibb), афатиниб (Boehringer Ingelheim), AG 1478 (CAS # 153436-53-4), АG 494 (CAS # 133550-35-3), АG 555 (CAS # 133550-34-2), АG 556 (CAS # 133550-41-1), АG 825 (CAS # 149092-50-2), AG-490 (CAS # 134036-52-5), антрохинонол (Golden Biotechnology), AP-26113 (Ariad), ARRY334543 (CAS # 845272-21-1), AST 1306 (CAS # 897383-62-9), AVL-301 (Celgene), AZD8931 (CAS # 848942-61-0), BIBU 1361 (CAS # 793726-84-8), BIBX 1382 (CAS # 196612-93-8), BMS-690514 (Bristol-Myers Squibb), BPIQ-I (CAS # 174709-30-9), канертиниб (Pfizer), цетуксимаб (Actavis), ципатиниб (Jiangsu Hengrui Medicine), CL-387785 (Santa Cruz Biotech), соединение 56 (CAS # 171745-13-4), CTX-023 (CytomX Therapeutics), CUDC-101 (Curis), дакомитиниб (Pfizer), DAPH (CAS # 145915-58-8), дафнетин (Santa Cruz Biotech), довитиниба лактат (Novartis), ингибитор EGFR (CAS # 879127-07-8), эпитиниб (Hutchison China MediTech), аналог эрбстатина (CAS # 63177-57-1), эрлотиниб (Astellas), гефитиниб (AstraZeneca), GT-MAB 5,2 GEX (Glycotope), GW 583340 (CAS # 388082-81-3), GW2974 (CAS # 202272-68-2), HDS 029 (CAS # 881001-19-0), гиперицин (Santa Cruz Biotech), икотиниба гидрохлорид (Betapharma), JNJ-26483327 (Johnson & Johnson), JNJ-28871063 (Johnson & Johnson), KD-020 (Kadmon Pharmaceuticals), лапатиниба дитозилат (GlaxoSmithKline), лавендустин А (Sigma), лавендустин С (Sigma), LY-3016859 (Eli Lilly), MEHD-7945A (Hoffman-La Roche), ММ-151 (Merrimack), МТ-062 (Medisyn Technologies), нецитумумаб (Eli Lilly), нератиниб (Pfizer), нимотузумаб (Center of Molrcular Immunology), NT-004 (NewGen Therapeutics), пантиумумаб (Amgen), PD 153035 (CAS # 153436-54-5), PD 161570 (CAS # 192705-80-9), PD 168393, PD 174265 (CAS # 216163-53-0), пиротиниб (Sihuan Pharmaceuticals), позиотиниб (Hanmi), PP 3 (CAS # 5334-30-5), PR-610 ( Proacta), пиротиниб (Jiangsu Hengrui Medicine), RG-13022 (CAS # 136831 -48-6), риндопептимут (Celldex Therapeutics), RPI-1 (CAS # 269730-03-2), S-222611 (Shionogi), ТАК 285 (CAS # 871026-44-7), TAS-2913 (Taiho), телиатиниб (Hutchison China MediTech), тирфостин 47 (RG-50864, AG-213) (CAS # 1 18409-60-2), тирфостин 51 (CAS # 122520-90-5), тирфостин AG 1478 (CAS # 175178-82-2), тирфостин AG 183 (CAS # 126433-07-6), тирфостин AG 528 (CAS # 133550-49-9), тирфостин АG 99 (CAS # 18409-59-9 1), тирфостин В42 (Santa Cruz Biotech), тирфостин B44 (Santa Cruz Biotech), тирфостин RG 14620 (CAS # 136831-49-7), вандетаниб (AstraZeneca), варлитиниб (Array BioPharma), ваталаниб (Novartis), WZ 3146 (CAS # 1214265-56-1), WZ 4002 (CAS # 1213269-23-8), WZ8040 (CAS # 1214265-57-2), XL-647 (Exelixis), Z-650 (HEC Pharm), ZM 323881 (CAS # 324077-30-7), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно ингибитор EGFR выбран из группы, состоящей из панитумумаба, эрлотиниба, их фармацевтически приемлемых солей и их сочетаний.

При применении в настоящем описании «ингибитор ERK» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с ERK, включая ERK1 и ERK2, например, путем связывания с ERK, и (ii) уменьшает экспрессию или активность протеинкиназы ERK. Таким образом, ингибиторы, которые действуют выше ERK, такие как ингибиторы МЕК и ингибиторы RAF, не являются ингибиторами ERK в соответствии с настоящим изобретением. Неограничивающие примеры ингибиторов ERK по настоящему изобретению включают AEZS-131 (Aeterna Zentaris), AEZS-136 (Aeterna Zentaris), SCH-722984 (Merck & Co.) SCH-772984 (Merck & Co.) SCH-900353 (МК-8353) (Merck & Co.), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор киназы Janus» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с киназой Janus, например, путем связывания с киназой Janus и (ii) уменьшает экспрессию или активность киназы Janus. Киназы Janus по настоящему изобретению включают Tyk2, Jak1, Jak2 и Jak3. Неограничивающие примеры ингибиторов киназы Janus по настоящему изобретению включают руксолитиниб (Incyte Corporation, Wilmington, DE), барицитиниб (Incyte Corporation, Wilmington, DE), тофацитиниб (Pfizer, New York, NY), VX-509 (Vertex Pharmaceuticals, Inc., Boston, MA), GLPG0634 (Galapagos NV, Belgium), CEP-33779 (Teva Pharmaceuticals, Israel), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор МЕК» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с МЕК, например, путем связывания с МЕК, и (ii) уменьшает экспрессию или активность MEK. Таким образом, ингибиторы, которые действуют выше МЕК, такие как ингибиторы RAS и ингибиторы RAF, не являются ингибиторами МЕК согласно настоящему изобретению. Ингибиторы МЕК могут быть подразделены на два типа в зависимости от того, конкурирует ли ингибитор с АТФ. При применении в настоящем документе ингибитор МЕК «типа 1» представляет собой ингибитор, который конкурирует с АТФ за связывание с MEK. Ингибитор МЕК «типа 2» представляет собой ингибитор, который не конкурирует с АТФ за связывание с MEK. Неограничивающие примеры ингибиторов MEK типа 1 в соответствии с настоящим изобретением включают бентамапимод (Merck KGaA), L783277 (Merck), RO092210 (Roche), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно, ингибитор МЕК типа 1 представляет собой RO092210 (Roche) или его фармацевтически приемлемую соль. Неограничивающие примеры ингибиторов MEK типа 2 в соответствии с настоящим изобретением включают токсин сибирской язвы, часть летального фактора токсина сибирской язвы, Arry-142886 (6-(4-бром-2-хлор-фениламино)-7-фтор-3-метил-3H-бензоимидазол-5-карбоновой кислоты (2-гидроксиэтокси)амид) (Array BioPharma), ARRY-438162 (Array BioPharma), AS-1940477 (Astellas), MEK162 (Array BioPharma), PD 098059 (2-(2'-амино-3'-метоксифенил)-оксанафтален-4-он), PD 184352 (CI-1040), PD-0325901 (Pfizer), пимасертиб (Santhera Pharmaceuticals), рефаметиниб (AstraZeneca), целуметиниб (AZD6244) (AstraZeneca), ТАК-733 (Takeda), траметиниб (Japan Tobacco), U0126 (1,4-диамино-2,3-дициано-1,4-бис(2-аминофенилтио)бутадиен) (Sigma), RDEA119 (Ardea Biosciences/Bayer), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно, ингибитор МЕК типа 2 представляет собой траметиниб или его фармацевтически приемлемую соль. Другие ингибиторы МЕК включают без ограничения антрохинонол (Golden Biothechnology), AS-1940477 (Astellas), AS-703988 (Merck KGaA), BI-847325 (Boehringer Ingelheim), Е-6201 (Eisai), GDC-0623 (Hoffmann-La Roche), GDC-0973, RG422, RO4987655, RO5126766, SL327, WX-554 (Wilex), полипептид YopJ, их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем описании «ингибитор mTOR» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с mTOR, например, путем связывания с mTOR, и (ii) уменьшает экспрессию или активность mTOR. Неограничивающие примеры ингибиторов mTOR в соответствии с настоящим изобретением включают зотаролимус (Abbvie), умиролимус (Biosensors), темсиролимус (Pfizer), сиролимус (Pfizer), сиролимус NanoCrystal (Elan Pharmaceutical Technogies), сиролимус TransDerm (TransDerm), сиролимус-PNP (Samyang), эверолимус (Novartis), биолимус А9 (Biosensors), ридафоролимус (Ariad), рапамицин, TCD-10023 (Terumo), DE-109 (MacuSight), МС-R001 (MacuSight), MS-R002 (MacuSight), MS-R003 (MacuSight), персейву (MacuSight), XL-765 (Exelixis), хинакрин (Cleveland BioLabs), PKI-587 (Pfizer), PF-04691502 (Pfizer), GDC-0980 (Genentech and Piramed), дактолисиб (Novartis), СС-223 (Celgene), PWT-33597 (Pathway Therapeutics), Р-7170 (Piramal Life Sciences), LY-3023414 (Eli Lilly), INK-128 (Takeda), GDC-0084 (Genentech), DS-7423 (Daiichi Sankyo), DS-3078 (Daiichi Sankyo), СС-115 (Celgene), CBLC-137 (Cleveland BioLabs), AZD-2014 (AstraZeneca), Х-480 (Xcovery), Х-414 (Xcovery), ЕС-0371 (Endocyte), VS-5584 (Verastem), PQR-401 (Piqur), PQR-316 (Piqur), PQR-311 (Piqur), PQR-309 (Piqur), PF-06465603 (Pfizer), NV-128 (Novogen), nPT-MTOR (Biotica Technology), BC-210 ((Biotica Technology), WAY-600 (Biotica Technology), WYE-354 (Biotica Technology), WYE-687 (Biotica Technology), LOR-220 (Lorus Therapeutics), HMPL-518 (Hutchison China MediTech), GNE-317 (Genentech), ЕС-0565 (Endocyte), СС-214 (Celgene) и ABTL-0812 (Ability Pharmaceuticals).

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор PI3K» представляет собой вещество, которое уменьшает экспрессию или активность фосфатидилинозитол-3-киназ (PI3Ks) или нижележащих белков каскада, таких как Akt. PI3Ks при активации фосфорилируют группу 3'-ОН инозитольного кольца в инозитольных фосфолипидах с получением вторичного посредника фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PI-3,4,5-Р(3)). Акт взаимодействует с фосфолипидом, вызывающим ее транслокацию на внутреннюю мембрану, где она фосфорилируется и активируется. Активированная Akt модулирует функцию многочисленных субстратов, вовлеченных в регуляцию выживания клеток, прогрессию клеточного цикла и рост клеток.

Неограничивающие примеры ингибиторов PI3K в соответствии с настоящим изобретением включают А-674563 (CAS # 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS-041164 (5-бензо[1,3]диоксол-5-илметилен-тиазолидин-2,4-дион), AS-604850 (5-(2,2-дифтор-бензо[1,3]диоксол-5-илметилен)тиазолидин-2,4-дион), AS-605240 (5-хиноксилин-6-метилен-1,3-тиазолидин-2,4-дион), AT7867 (CAS # 857531-00-1), серии бензимидазолов, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (CAS # 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), CAS # 612847-09-3, CAS # 681281-88-9, CAS # 75747-14-7, CAS # 925681-41-0, CAS # 98510-80-6, CCT128930 (CAS # 885499-61-6), CH5132799 (CAS # 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma therapeutics, Ltd., Abingdon, UK), FPA 124 (CAS # 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (CAS # 937174-76-0), Н-89 (CAS # 127243-85-0), хонокиол, IC87114 (Gilead Science) IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, UK), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), КТ 5720 (CAS # 108068-98-0), милтефозин, МК-2206 дигидрохлорид (CAS # 1032350-13-2), ML-9 (CAS # 105637-50-1), нальтриндола гидрохлорид, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), перифозин, РНТ-427 (CAS # 1 1191951-57-1), ингибитор PI3-киназы дельта, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), ингибиторы PI3-киназы дельта, Genentech (Roche Holdings Inc.), ингибиторы PI3-киназы дельта, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), ингибиторы-2 PI3-киназы дельта, Incozen (Incozen Therepeutics), ингибитор PI3-киназы, Roche-4 (Poche Holdings Inc.), ингибиторы PI3-киназы, Roche (Roche Holdings Inc.), ингибиторы PI3-киназы, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), ингибиторы PI3-киназы альфа/дельта, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), ингибиторы PI3-киназы дельта, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Gemany), ингибиторы PI3-киназы дельта, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), ингибиторы PI3-киназы дельта, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), ингибиторы PI3-киназы дельта, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), ингибиторы PI3-киназы дельта/гамма, Cellzome (Cellzome AG), ингибиторы PI3-киназы дельта/гамма, Cellzome (Cellzome AG), ингибиторы PI3-киназы дельта/гамма, Intellikine (Intellikine Inc.), ингибиторы PI3-киназы дельта/гамма, Intellikine (Intellikine Inc.), ингибиторы PI3-киназы дельта/гамма, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), ингибиторы PI3-киназы дельта/гамма, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), ингибитор PI3-киназы гамма, Evotec (Evotec), ингибитор PI3-киназы гамма, Cellzome (Cellzome AG), ингибиторы PI3-киназы гамма, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), ингибиторы PI3K дельта/гамма, lntellikine-1 (Intellikine Inc.), ингибиторы PI3K дельта/гамма, lntellikine-1 (Intellikine Inc.) пиктилисиб (GDC-0941) (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (CAS # 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, New York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianopolis, IN), SH-5, SH-6, тетрагидрокуркумин, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), трицирибин, Х-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburg, Germany), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно ингибитор пути PI3K/Akt представляет собой пиктилисиб (GDC-0941) или его фармацевтически приемлемую соль.

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор RAS» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с RAS, например, путем связывания с RAS, и (ii) уменьшает экспрессию или активность RAS. Неограничивающие примеры ингибиторов RAS в соответствии с настоящим изобретением включают ингибиторы фарнезилтрансферазы (такие как, например, типифарниб и лонафарниб), небольшие молекулы, содержащие фарнезильные группы (такие как, например, салирасиб и TLN-4601), DCAI, как описано Maurer (Maurer et al., 2012), Kobe0065 и Kobe2602, как описано Shima (Shima, et al., 2013), и HBS 3 (Patgiri, et al., 2011) и AIK-4 (Allinky), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем документе термин «экспрессия гена» представляет собой процесс, посредством которого информация с ДНК используется для образования полипептида. «Модулятор экспрессии генов и других клеточных функций» представляет собой вещество, которое влияет на экспрессию генов и другую активность клетки. Неограничивающие примеры таких модуляторов включают гормоны, ингибиторы гистондеацетилазы (HDACi) и ингибиторы циклинзависимой киназы (CDKi), и ингибиторы поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP).

В настоящем изобретении термин «гормон» представляет собой вещество, секретируемое клетками в одной части тела, которое воздействует на клетки в другой части тела. Неограничивающие примеры гормонов в соответствии с настоящим изобретением включают простагландины, лейкотриены, простациклин, тромбоксан, амилин, антимюллеров гормон, адипонектин, адренокортикотропный гормон, ангиотензиноген, ангиотензин, вазопрессин, атриопептид, мозговой натрийуретический пептид, кальцитонин, холецистокинин, кортикотропин-рилизинг гормон, энцефалин, эндотелин, эритропоэтин, фолликулостимулирующий гормон, галанин, гастрин, грелин, глюкагон, гонадотропин-рилизинг-гормон, рилизинг-гормон гормона роста, хорионический гонадотропин человека, плацентарный лактоген человека, гормон роста, ингибин, инсулин, соматомедин, лептин, липотропин, лютеинизирующий гормон, меланоцитстимулирующий гормон, мотилин, орексин, окситоцин, панкреатический полипептид, паратиреоидный гормон, пролактин, пролактин-рилизинг гормон, релаксин, ренин, секретин, соматостатин, тромбопоэтин, тиреотропный гормон, тестостерон, дегидроэпиандростерон, андростендион, дигидротестостерон, альдостерон, эстрадиол, эстрон, эстриол, кортизол, прогестерон, кальцитриол и кальцидиол.

Некоторые соединения влияют на активность определенных гормонов или останавливают продукцию определенных гормонов. Неограничивающие примеры соединений, влияющих на гормоны, в соответствии с настоящим изобретением включают тамоксифен (Nolvadex®), анастрозол (Arimidex®), летрозол (Femara®), и фулвестрант (Faslodex®). Такие соединения также включаются в обозначение гормон по настоящему изобретению.

При применении в настоящем описании «ингибитор HDAC» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с HDAC, например, путем связывания с HDAC, и (ii) уменьшает экспрессию или активность HDAC. Неограничивающие примеры ингибиторов HDAC в соответствии с настоящим изобретением, включают 4SC-201 (4SC AG) 4SC-202 (Takeda), абексиностат (Celera), AN-1 (Titan Pharmaceuticals, Inc.), апицидин (Merck & Co., Inc.) АР-42 (Arno Therapeutics), ARQ-700RP (ArQule), авуган (TopoTarget АС), азелаиновая кислота-1-гидроксамат-9-анилид (AAHA), белиностат (TopoTarget), бутират (Enzo Life Sciences, Inc.), CG-1255 (Errant Gene Therapeutics, LLC), CG-1521 (Errant Gene Therapeutics, LLC), CG-200745 (CrystalGenomics, Inc.), хидамид (Shanzhen Chipscreen Biosciences), CHR-3996 (Chroma Therapeutics), CRA-024781 (Pharmacyclics), CS-3158 (Shanzhen Chipscreen Biosciences), CU-903 (Curis), DAC-60 (Genextra), энтиностат (Bayer), сложный эфир гиалуроновой кислоты и масляной кислоты (HA-But), IKH-02 (IkerChem), IKH-35 (IkerChem), ITF-2357 (Italfarmaco), ITF-А (Italfarmaco), JNJ-16241199 (Johnson & Johnson), KA-001 (Karus Therapeutics), KAR-3000 (Karus Therapeutics), KD-5150 (Kalypsys), KD-5170 (Kalypsys), KLYP-278 (Kalypsys), KLYP-298 (Kalypsys), KLYP-319 (Kalypsys), KLYP-722 (Kalypsys), бис-гидроксамид м-карбоксициннамовой кислоты (CBHA), MG-2856 (MethylGene), МG-3290 (MethylGene), MG-4230 (MethylGene), МG-4915 (MethylGene), МG-5026 (MethylGene), MGCD-0103 (MethylGene Inc.) мосетиностат (MethylGene), MS-27-275 (Schering AG), NBM-HD-1 (NatureWise), NVP-LAQ824 (Novartis), OCID-4681-S-01 (Orchid Pharmaceuticals), оксамфлатин ((2Е)-5-[3-[(фенилсульфонил)аминофенил]пент-2-ен-4-иногидроксамовая кислота), панобиностат (Novartis), PCI-34051 (Pharmacyclics), фенилбутират (Enzo Life Sciences, Inc.), пивалоилоксиметилбутират (АН-9, Titan Pharmaceuticals, Inc.), пиванекс (Titan Pharmaceuticals, Inc.), прациностат (SBIO), PX-117794 (TopoTarget АС), PXD-118490 (LEO-80140) (TopoTarget АС), пироксамид (субероил-3-аминопиридинамид гидроксамовой кислоты), резминостат (Takeda), RG-2833 (Repligen), риколиностат (Acetylon), ромидепсин (Astellas), СО-1304 (S^*BIO), SB-1354 (S^*BIO), SB-623 (Merrion Research I Limited), SB-624 (Merrion Research I Limited), SB-639 (Merrion Research I Limited), SB-939 (S^*BIO), скриптаид (N-гидрокси-1,3-диоксо-1Н-бенз[де]изохинолин-2(3Н)-гексанамид), SK-7041 (In2Gen/SK Chemical Co.), SK-7068 (In2Gen/SK Chemical Co.), субероиланилид гидроксамовой кислоты (SAHA), сульфонамид гидроксамовой кислоты, трибутирин (Sigma Aldrich), трихостатин A (TSA) (Sigma Aldrich), вальпроевую кислоту (VPA) (Sigma Aldrich), вориностат (Zolinza), WF-27082B (Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd.), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно ингибитор HDAC представляет собой ромидепсин, его фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

При применении в настоящем документе, «CDK» представляет собой семейство протеинкиназ, которые регулируют клеточный цикл. Известные CDKs включают cdkl, cdk2, cdk3, cdk4, cdk5, cdk6, cdk7, cdk8, cdk9, cdk10 и cdk11. «Ингибитор CDK» представляет собой вещество, которое (i) непосредственно взаимодействует с CDK, например, путем связывания с CDK, и (ii) уменьшает экспрессию или активность CDK. Неограничивающие примеры ингибиторов CDK в соответствии с настоящим изобретением включают 2-гироксибогемин, 3-ATA, 5-йод-индирубин-3'-моноксим, 9-цианопауллон, алоисин A, алстерпауллон 2-цианоэтил, алвоцидиб (Sanofi), AM-5992 (Amgen), аминопурваланол А, арцириафлавин А, АТ-7519 (Astex Pharmaceuticals), AZD 5438 (CAS # 602306-29-6), BMS-265246 (CAS # 582315-72-8), BS-181 (CAS # 1092443-52-1), бутиролактон I (CAS # 87414-49-1), ингибитор Cdk/Crk (CAS # 784211-09-2), ингибитор Cdk1/5 (CAS # 40254-90-8), ингибитор II Cdk2 (CAS # 222035-13-4), ингибитор IV Cdk2, NU6140 (CAS # 444723-13-1), ингибитор Cdk4 (CAS # 546102-60-7), ингибитор III Cdk4 (CAS # 265312-55-8), ингибитор IV Cdk4/6 (CAS # 359886-84-3), ингибитор II Cdk9 (CAS # 140651-18-9), CGP 74514A, CR8, CYC-065 (Cyclacel), динацислиб (Ligand), (R)-DRF053 дигидрохлорид (CAS # 1056016-06-8), фаскаплизин, флавопиридол, гигролидин, индирубин, Lee-011 (Astex Pharmaceuticals), LY-2835219 (Eli Lilly), милциклиба малеат (Nerviano Medical Sciences), ММ-D37K (Maxwell Biotech), N9- изопропилоломоуцин, NSC 625987 (CAS # 141992-47-4), NU2058 (CAS # 161058-83-9), NU6102 (CAS # 444722-95-6), оломоуцин, ON-108600 (Onconova), ON-123300 (Onconova), оксиндол I, P-1446-05 (Piramal), P-276-00 (Piramal), палбоциклиб (Pfizer), PHA-767491 (CAS # 845714-00-3), PHA-793887 (CAS # 718630-59-2), PHA-848125 (CAS # 802539-81-7), пурваланол А, пурваланол B, R547 (CAS # 741713-40-6), RO-3306 (CAS # 872573-93-8), росковитин, SB-1317 (SBIO), SCH 900776 (CAS # 891494-63-6), SEL-120 (Selvita), селициклиб (Cyclacel), SNS-032 (CAS # 345627-80-7) , SU9516 (CAS # 377090-84-1), WHI-P180 (CAS # 211555-08-7), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания. Предпочтительно ингибитор CDK выбран из группы, состоящей из динациклиба, палбоциклиба, их фармацевтически приемлемых солей и их сочетаний.

Используемый в настоящем документе термин «ингибитор поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP)» представляет собой вещество, которое уменьшает экспрессию или активность поли(АДФ-рибоза)полимераз (PARPs) или нижележащих белков. Неограничивающие примеры ингибиторов поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP) по настоящему изобретению включают PF01367338 (Pfizer, New York, NY), олапариб (AstraZeneca, United Kingdom), инипариб (Sanofi-Aventis, Paris, France), велипариб (Abbott Laboratories, Abbot Park, IL), МК 4827 (Merck, White House Station, NJ), CEP 9722 (Teva Pharmaceuticals, Israel), LT-673 (Biomarin, San Rafael, CA) и BSI 401 (Sanofi-Aventis, Paris, France), их фармацевтически приемлемые соли и их сочетания.

В предпочтительном варианте осуществления химиотерапия включает введение человеку агента, выбранного из группы, состоящей из гемцитабина, таксола, адриамицина, ифосфамида, трабектедина, пазопаниба, абраксана, авастина, эверолимуса и их сочетаний.

При применении в настоящем документе «лучевая терапия» обозначает любой терапевтический режим, который совместим с C. novyi, например, C. novyi NT, с лечением по настоящему изобретению и при котором индивидуума, например, человека, облучают для лечение рака. Лучевая терапия может быть осуществлена, например, у человека с помощью, например, внешнего для организма аппарата (дистанционная лучевая терапии) или радиоактивного материала, введенного в организм (брахитерапия, системная лучевая терапия).

Дистанционная лучевая терапия включает, но не ограничивается этим, 3-мерную конформную лучевую терапию, лучевую терапию с модулированной интенсивностью, лучевую терапию, руководствующуюся визуализацией, томотерапию, стереотаксическую радиохирургию, стереотаксическую лучевую терапию организма, протонную терапию и другую терапию с помощью пучка заряженных частиц, такую как электронно-лучевая терапия. Дистанционная лучевая терапия широко используются при лечении рака и хорошо известна специалистам в данной области техники.

Брахитерапия обозначает лучевую терапию, доставляемую при имплантации в организм или при размещении на теле индивидуума. Брахитерапия включает, но не ограничивается этим, интерстициальную брахитерапию, внутриполостную брахитерапию и эписклеральную брахитерапию. Методы брахитерапии также широко используются при лечении рака и хорошо известны специалистам в данной области техники.

Системная лучевая терапия обозначает лучевую терапию, доставляемую путем инъекций или путем приема индивидуумом. Одним из примеров системной лучевой терапии является терапия радиоактивным йодом. Радиоактивный йод представляет собой молекулу радиоактивного изотопа йода, которая является безопасной и эффективным для использования у индивидуума, такого как, например, человек. Неограничивающие примеры радиоактивного йода в соответствии с настоящим изобретением могут быть выбраны из группы, состоящей из ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I и их сочетания. Предпочтительно, радиоактивный йод представляет собой ¹³¹I.

При применении в настоящем документе термин «иммунотерапия» обозначает любой противораковый терапевтический режим, который является совместимым с C. novyi, например, C. novyi NT, с лечением по настоящему изобретению и который использует вещество, которое изменяет иммунный ответ, увеличивая или уменьшая способность иммунной системы продуцировать антитела или сенсибилизированные клетки, которые распознают антиген, инициирующий их продукцию, и взаимодействуют с ним. Иммунотерапия может осуществляться рекомбинантными, синтетическими или природными препаратами, включая цитокины, кортикостероиды, цитотоксические агенты, тимозин и иммуноглобулины. Некоторые агенты иммунотерапии естественным образом присутствуют в организме, а некоторые из них имеются в фармакологических препаратах. Примеры агентов иммунотерапии включают, но не ограничиваются этим, гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерфероны, имиквимод и фракции клеточных мембран из бактерий, IL-2, IL-7, IL-12, CCL3, CCL26, CXCL7 и синтетические цитозин фосфат-гуанозин (CpG).

В одном предпочтительном варианте осуществления иммунотерапия включает введение человеку ингибитора иммунной контрольной точки. При применении в настоящем описании «ингибитор иммунной контрольной точки» обозначает вещество, которое блокирует активность молекул, участвующих в ослаблении иммунного ответа. Такие молекулы включают, например, антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4), и белок 1 программируемой гибели клеток (PD-1). Ингибиторы иммунной контрольной точки по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются этим, ипилимумаб (Bristol-Myers Squibb), тремелимумаб (Pfizer), MDX-1106 (Medarex, Inc.), MK3475 (Merck), CT-011 (CureTech , Ltd), AMP-224 (Amplmmune), MDX-1105 (Medarex, Inc.), IMP321 (Immutep S.A.) и MGA271 (MacroGenics).

В дополнительном аспекте этого варианта осуществления терапия по настоящему изобретению с помощью C. novyi, например, C. novyi НТ, является эффективной против, например, солидных опухолей, которые устойчивы к терапии, выбранной из группы, состоящей из химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии и их сочетания.

В другом аспекте этого варианта осуществления солидная опухоль невосприимчива к стандартной терапии или солидная опухоль не доступна для стандартной терапии, однако терапия C. novyi, например, C. novyi НТ, по настоящему изобретению является эффективной против такой опухоли.

При применении в настоящем документе термины «устойчивая» и «невосприимчивая» используются взаимозаменяемо. Являющаяся «невосприимчивой» к терапии означает, что предшествующая терапия или варианты терапии имела/имели низкую эффективность, например, при лечении рака или уничтожении раковых клеток, по сравнению с тем же индивидуумом до возникновения устойчивости к терапии.

При применении в настоящем документе, термин «стандартная терапия» обозначает те методы лечения, которые общеприняты специалистами в области медицины как подходящие для лечения конкретного типа рака, предпочтительно конкретной солидной опухоли. Стандартные методы лечения могут быть одинаковыми или различными для различных типов опухолей. Стандартные методы лечения, как правило, утверждаются различными регулирующими структурами, такими как, например, управление по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами США.

В другом аспекте этого варианта осуществления способ вызывает сильный локализованный воспалительный ответ и адаптивный иммунный ответ у человека.

При применении в настоящем документе «воспалительная реакция» представляет собой местный ответ на повреждение клеток, патогены или раздражители, который может включать, но не ограничивается этим, дилатацию капилляров, инфильтрацию лейкоцитами, отек, покраснение, жар, зуд, боль, утрату функции и их сочетания.

При применении в настоящем описании «адаптивный иммунный ответ» вовлекает В- и Т-клетки иммунной системы индивидуума. Под воздействием патогенного вещества, например, раковой клетки, В-клетки могут продуцировать антитела против патогенных антигенов в патогенном веществе, а Т-клетки могут приобрести способность направленно действовать на патогены для их возможного разрушения. Некоторые популяции В- и Т-клеток, специфичные для данного антигена, сохраняются иммунной системой и призываются в случае последующего воздействия патогенного антигена. Адаптивный иммунный ответ, таким образом, является стойким и обеспечивает иммунную систему индивидуума-хозяина постоянной возможностью узнавания и разрушения данного патогенного антигенпрезентирующего патогена.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ циторедукции солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку внутрь опухоли единицы дозы КОЕ C. novyi, предпочтительно C. novyi NT, содержащей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе.

При применении в настоящем документе «циторедукция» солидной опухоли означает уменьшение размера или количества раковых клеток в солидной опухоли. Такая процедура является паллиативной и может быть использована для повышения эффективности терапии, включая лучевую терапию, химиотерапию или ампутацию. В этом варианте осуществления солидные опухоли представляют собой изложенное выше. Предпочтительно солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланомы. Более предпочтительно солидная опухоль представляет собой лейомиосаркому, такую как забрюшинная лейомиосаркома.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ циторедукции солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль в течение от одного до четырех циклов единицы дозы спор C. novyi NT, включающей приблизительно 1×10⁴ спор на цикл, причем каждая единица дозы C. novyi NT суспендируется в фармацевтически приемлемом носителе или растворе. В этом варианте осуществления типы солидных опухолей представляют собой изложенное выше. Предпочтительно солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланомы.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку в течение от одного до четырех циклов единицы дозы спор C. novyi NT, включающей приблизительно 1×10⁴ спор на цикл, причем каждая единица дозы спор C. novyi NT суспендируется в фармацевтически приемлемом носителе или растворе. Различные типы солидных опухолей представляют собой изложенное выше. Предпочтительно солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланомы.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ уничтожения солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот способ включает введение человеку внутрь опухоли единицы дозы КОЕ C. novyi, предпочтительно C. novyi NT, содержащей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или растворе, где опухоль уничтожается, оставляя края нормальной ткани.

При применении в настоящем документе «уничтожение» солидной опухоли означает, что при данном способе удаляется вся солидная опухоль. В этом способе после проведения лечения край нормальной ткани остается вокруг области, где была опухоль. В этом варианте осуществления типы солидных опухолей представляют собой изложенное выше. Предпочтительно солидная опухоль представляет собой саркому. Более предпочтительно солидная опухоль представляет собой лейомиосаркому, такую как забрюшинная лейомиосаркома.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается единица дозы КОЕ C. novyi. Эта единица дозы включает приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ в фармацевтически приемлемом носителе или в растворе, которые являются эффективными для лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, присутствующей у человека. Как изложено выше, КОЕ C. novyi могут быть в вегетативной форме и форме спор.

В одном аспекте этого варианта осуществления C. novyi представляют собой C. novyi NT. Предпочтительно единица дозы включает приблизительно 1×10⁴-1×10⁷ спор C. novyi NT, например, приблизительно 1×10⁶-1×10⁷ спор C. novyi NT в фармацевтически приемлемом носителе или растворе. Предпочтительно единица дозы включает приблизительно 1×10⁴ спор C. novyi NT в фармацевтически приемлемом носителе или растворе.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается набор для лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, присутствующей у человека. Этот набор включает единицу дозы КОЕ C. novyi, включающую приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ в фармацевтически приемлемом носителе или растворе и инструкции по применению набора. Набор может быть разделен на один или более отсеков, и может иметь один или более контейнеров с различными реагентами. Набор может быть дополнительно адаптирован для обеспечения хранения и транспортировки каждого компонента.

В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения набор дополнительно включает один или более антибиотиков, которые эффективны для лечения или облегчения неблагоприятного побочного эффекта, вызванного КОЕ C. novyi. КОЕ могут быть в вегетативной форме и форме спор. Подходящие антибиотики представляют собой изложенное выше. Предпочтительно набор дополнительно включает 1-4 единицы дозы C. novyi для проведения 1-4 циклов лечения.

В другом аспекте этого варианта осуществления C. novyi представляют собой C. novyi NT. Предпочтительно единица дозы включает приблизительно 1×10⁴-1×10⁷ спор C. novyi NT, например, приблизительно 1×10⁶-1×10⁷ спор C. novyi NT или приблизительно 1×10⁴ спор C. novyi NT в фармацевтически приемлемом носителе или растворе. Также предпочтительно, чтобы набор дополнительно включал 1-4 единицы дозы спор C. novyi NT для проведения 1-4 циклов лечения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ микроскопически точного удаления опухолевых клеток у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы колониеобразующих единиц (КОЕ) C. novyi NT, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или растворе.

При применении в настоящем документе «микроскопически точное удаление» обозначает удаление ткани-мишени у индивидуума, например, патогенной ткани, причем указанное удаление является особенно специфичным на клеточном уровне для патогенной ткани, при этом, не оказывая вреда или вызывая минимальный вред у близлежащей «здоровой» ткани. Удаление ткани-мишени может представлять собой, но не ограничивается этим, апоптоз, некроз и лизис клеток. Этот вариант осуществления может быть достигнут с помощью точной доставки, например, спор C. novyi NT по изобретению с помощью руководствующегося КТ введения в опухоль с использованием, например, многозубого устройства доставки, такого как многозубая игла.

В настоящем изобретении споры C. novyi, такие как споры C. novyi NT, доставляются индивидууму, например больному человеку, внутрь опухоли с помощью любого терапевтически подходящего способа. Например, споры C. novyi NT могут быть доставлены с помощью единственной иглы, используемой в одном или более местах опухоли. Альтернативно, многозубый носитель для доставки, такой как многозубая игла, может быть использован для доставки, например, спор C. novyi NT к опухоли. Доставка, например, спор может осуществляться на одну и ту же или разную глубину в одно или более мест опухоли. Выбранными средствами доставки можно пользоваться вручную или контролировать с помощью электронного управления. Носители для доставки могут располагаться и/или перемещаться на поверхности или внутри опухоли вручную или через устройство с дистанционным управлением, и изображение места инъекции может быть увеличено с помощью различных методов визуализации, известных в данной области техники, таких как КТ. Многозубые устройства доставки, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают устройства, раскрытые, например, в McGuckin, Jr. et al., патентах США Nos. 6905480 и 7331947, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения или ослабления эффекта солидной опухоли, которая характеризуется метастазами в одном или более мест у человека. Этот способ включает введение человеку в опухоль единицы дозы колониеобразующих единиц (КОЕ) C. novyi NT, включающей, по меньшей мере, приблизительно 1×10³-1×10⁷ КОЕ, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе или растворе. Предпочтительно чтобы, по меньшей мере, одно место метастазирования находилось отдаленно от исходной солидной опухоли.

При применении в настоящем документе «метастаз» и его грамматические варианты обозначает распространение патогенных клеток, т.е. опухолевых клеток, из исходной, первичной области тела, к вторичной области тела. Метастазы могут быть местными или удаленными в зависимости от расстояния от места исходной первичной опухоли. Являются ли метастазы местными или отдаленными, может быть определено лечащим врачом. Например, клетки рака молочной железы, которые распространились в мозг, представляют собой отдаленный метастаз, в то время как распространение клеток рака молочной железы в подмышечные лимфатические узлы является местным метастазом.

В настоящем изобретении «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» соединения или композиции, раскрытых в данном документе, представляет собой количество такого соединения или композиции, которое является достаточным для осуществления лечебных или желаемых результатов при введении индивидууму, как описано в настоящем документе. Эффективные единицы лекарственных форм, пути введения и величина дозирования соответствуют описанному в настоящем документе или модифицируются медицинским работником. Специалистам в данной области техники очевидно, что величина дозирования будет варьироваться в зависимости от способа введения, скорости выведения, продолжительности лечения, идентичности любых других вводимых лекарств, возраста и размеров больного и тому подобных факторов, хорошо известных в области медицины. В целом подходящая доза композиции в соответствии с изобретением будет представлять собой такое количество композиции, которое является наименьшей дозой, эффективной для получения желаемого эффекта. Эффективная доза композиции по настоящему изобретению описана выше. Кроме того, композицию по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с другими вариантами лечения.

Композиции по изобретению включают один или более активных ингредиентов в смеси с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с одним или более другими соединениями, лекарствами, ингредиентами и/или веществами. Независимо от выбранного пути введения агенты/соединения по настоящему изобретению составляют в виде фармацевтически приемлемых единиц лекарственных форм традиционными способами, известными специалистам в данной области техники. Смотри, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21^st Edition, Loppincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.).

Фармацевтически приемлемые носители или растворы хорошо известны в данной области техники (смотри, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21^st Edition, Loppincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.) и Национальном формуляре (American Pharmaceutical Association)) и включают сахара (например, лактозу, сахарозу, маннит и сорбит), крахмалы, препараты целлюлозы, фосфаты кальция (например, дикальцийфосфат, трикальцийфосфат и вторичный кислый фосфат кальция), цитрат натрия, воду, водные растворы (например, физиологический раствор, хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций), спирты (например, этиловый спирт, пропиловый спирт и бензиловый спирт), многоатомные спирты (например, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль), органические сложные эфиры (например, этилолеат и триглицериды), биоразлагаемые полимеры (например, полилактид-полигликолид, поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды)), эластомерные матриксы, липосомы, микросферы, масла (например, кукурузное масло, масло зародышей пшеницы, оливковое, касторовое, кунжутное, хлопковое и арахисовое масло), масло какао, воск (например, воск для суппозиториев), парафины, силиконы, тальк, силицилат и т.д. Каждый фармацевтически приемлемый носитель или раствор, используемый в единице дозы в соответствии с настоящим изобретением, должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не вредным для индивидуума. Носители или растворы, пригодные для выбранной единицы лекарственной формы и способа введения, например, IT, хорошо известны в данной области техники, и приемлемые носители или растворы для выбранной единицы лекарственной формы и способа введения могут быть определены специалистом в данной области техники.

Единицы дозы по изобретению могут необязательно содержать дополнительные ингредиенты и/или вещества, обычно используемые в фармацевтических композициях. Эти ингредиенты и вещества хорошо известны в данной области техники и включают (1) наполнители или разбавители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза, сахароза и гуммиарабик; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты, крахмалгликолят натрия, поперечно сшитая натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и карбонат натрия; (5) замедляющие растворение агенты, такие как парафин; (6) ускорители всасывания, такие как четвертичные аммониевые соединения; (7) смачивающие агенты, такие как цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающие агенты, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли и лаурилсульфат натрия; (10) суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант; (11) забуферивающие агенты; (12) наполнители, такие как лактоза, молочные сахара, полиэтиленгликоли, животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, масло какао, крахмалы, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоль, силиконы, бентониты, кремниевая кислота, тальк, салицилат, оксид цинка, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок; (13) инертные разбавители, такие как вода или другие растворители; (14) консерванты; (15) поверхностно-активные вещества; (16) диспергирующие агенты; (17) агенты, контролирующие высвобождение, или агенты, замедляющие всасывание, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, другие полимерные матриксы, биоразлагаемые полимеры, липосомы, микросферы, моностеарат алюминия, желатин и воски; (18) замутнители; (19) адъюванты; (20) смачивающие агенты; (21) эмульгирующие и суспендирующие агенты; (22), солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана; (23) пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан; (24) антиоксиданты; (25) агенты, которые придают составу изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, такие как сахара и хлорид натрия; (26) загустители; (27) покрывающие агенты, такие как лецитин; и (28) подсластители, ароматизаторы, красители, отдушки и консерванты. Каждый такой ингредиент или вещество должно быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не вредным для индивидуума. Ингредиенты и вещества, пригодные для выбранной единицы лекарственной формы и предназначенного способа введения, хорошо известны в данной области техники, и приемлемые ингредиенты и вещества для выбранной единицы лекарственной формы и способа введения могут быть определены специалистом в данной области техники.

Жидкие единицы лекарственных форм включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы и суспензии. Жидкие единицы лекарственных форм могут содержать подходящие инертные разбавители, обычно используемые в данной области техники. Кроме инертных разбавителей пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, красители и консерванты. Суспензии могут содержать суспендирующие агенты.

Единицы лекарственных форм для введения в опухоль включают растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, или стерильные порошки. Активный(ые) агент(ы)/соединение(я) могут быть смешаны в стерильных условиях с подходящим фармацевтически приемлемым носителем.

Единицы дозы в соответствии с настоящим изобретением могут альтернативно включать один или более активных агентов, например, КОЕ C. novyi или споры C. novyi NT в сочетании со стерильными порошками, которые могут быть восстановлены в стерильные инъекционные растворы или дисперсии непосредственно перед использованием, которые могут содержать подходящие антиоксиданты, буферы, растворенные вещества, придающие композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие агенты, или загустители. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрывающих материалов, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ. Эти композиции могут также содержать подходящие адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Может быть также желательным включение изотонических агентов. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть вызвано включением агентов, которые замедляют всасывание.

Депо-формы, вводимые в опухоль, могут быть получены с помощью формирования микроинкапсулированных матриксов активного ингредиента в биоразлагаемых полимерах. Скорость высвобождения активного ингредиента может контролироваться в зависимости от отношения активного ингредиента к полимеру и от природы конкретного используемого полимера. Инъецируемые депо-формы также получают путем заключения активного агента в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.

Как отмечено выше, композиции могут быть представлены в единичной дозе или во множественных дозах в герметичных контейнерах, например, ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Инъекционные растворы, приготовленные для немедленного приема, и суспензии могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток вышеописанного типа.

Следующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации способов по настоящему изобретению. Эти примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения каким-либо образом.

Примеры

Пример 1

Сочетание внутривенного (в./в.) дозирования C. novyi NT с облучением

Проведено исследование влияния однократной в./в. дозы спор C. novyi NT на собак со спонтанными опухолями после лечения наружной дистанционной лучевой терапией.

Получение и конечное составление спор C. novyi NT проводили в Johns Hopkins Development laboratory в соответствии со следующим способом. Споры C. novyi NT, генерированные по Dang et al., 2001, инокулировали в обогащенную среду для спорообразования и инкубировали в анаэробной камере в течение 17-19 дней при 37°С. Споры очищали путем последовательного непрерывного центрифугирования в градиенте перколла с последующей интенсивной отмывкой физиологическим раствором, забуференным фосфатом. Споры хранили при 2-8°С. Споры получали перед транспортировкой, суспендировали в стерильном физиологическом растворе, забуференном фосфатом, и разводили в 50 мл 0,9% хлорида натрия.

Споры C. novyi NT восстанавливали в мешке с 50 мл физиологического раствора и доставляли в течение ночи к месту тестирования. Доза облучения составляла приблизительно 54 Гр и доставлялась как более 20 фракций: 11 до в./в. введения C. novyi NT и 9 после введения. Споры C. novyi NT вводили в виде одной инъекции в дозе 1×10⁹ спор/м² на основании площади поверхности тела. Перенос спор в шприц осуществляли на абсорбирующей прокладке с непроницаемой подложкой. В мешок вставляли иглу 22 калибра с прикрепленным 3-ходовым запорным краном. Штыревой конец замкнутой системы химиотерапии (OnGuard™, TEVA Medical Ltd.) присоединяли к порту на кране. Содержание мешка полностью опорожнялось в шприц на 60 кубических сантиметров (см³), к которому прикрепляли навертываемый конец замкнутой системы. Споры вводили каждому индивидууму в течение 15 минут через в./в. катетер, к которому присоединяли штыревой конец замкнутой системы химиотерапии. За инфузией следовало пропускание 10 см³ физиологического раствора. За индивидуумом пристально следили в течение 6 часов после инфузии следующим образом: отслеживали жизненно важные признаки, кровяное давление и насыщение кислородом при мониторинге каждые 15 минут в течение первых 60 минут, затем с помощью мониторинга каждые 30 минут в течение следующих 60 минут, затем каждые 60 минут для следующих 120 минут. Последующие проверки проводили через каждые 60 минут в общей сложности 6 часов.

Испытуемые были госпитализированы в первые 3 недели лечения: 2 недели для лучевой терапии и 1 неделю после в./в. лечения C. novyi NT. Последующие визиты для проверки происходили до 6 месяцев после лечения на 1, 2, 3 и 6 месяц. Смотри таблицы 1 и 2 для образца схем лечения.

Таблица 1
Расписание проверок при введении спор Скри-нинг (перед нача-лом луче-вой тера-пии) 1 день 2 день 3 день 4 день 5 день 8 день ±2 дня 15 день ±2 дня 1 месяц ±3 дня 2 месяца ±3 дня 3 месяца ±14 дня 6 месяцев ±14 дней Мони-торинг больно-го в течение 6 часов после инфу-зии Информированное согласие × История болезни × Физикальное обследование × × × × × × × × × × × × Жизненно важные признаки × × × × × × × × × × × × Рентген грудной клетки × ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ Тонкоигольная аспирационная биопсия (FNA) для культивирования × × × × × Ультразвук брюшной полости × ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ Рентгеновское облучение конечности (если показано) × ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ ×¹ Полный анализ форменных элементов крови (CBC), протромбиновое время/частичное тромбопластиновое время (PT/PTT), химический анализ крови, анализ мочи × × × × × × × × × × Исследовательс-кий анализ крови² × × × × × × × × × × × × Измерения и фотографии опухоли × × × × × × × × × Инфузия спор C. novyi NT × Ответ × × × × × × Неблагоприятные события (AEs) × × × × × × × × × Сопутствующее медикаментозное лечение × × × × × × × × × × ¹Рентген грудной клетки и дополнительная визуализация по клиническим показаниям
²Исследовательский анализ крови включает сбор плазмы, сыворотки, сгустка крови и мононуклеарных клеток периферической крови (клетки от сбора плазмы)

Таблица 2
Календарь сочетанного лечения облучением и C. novyi NT (дни) Понедельник Вторник Среда Четверг Пятница Суббота Воскресенье Облучение, 1 день Облуч., 2 день Облуч., 3 день Облуч., 4 день Облуч., 5 день Облуч., 6 день Облуч., 7 день Облуч., 8 день Облуч., 9 день Облуч., 10 день Споры, 1 деньХ инфузияХ Облуч., 11 день
Споры, 2 день AY Облуч., 12 день
Споры, 3 день Х Облуч., 13 день
Споры, 4 день Y Облуч., 14 день
Споры, 5 день Х Споры, 6 день Споры, 7 день Облуч., 15 день
споры, 8 день X, Y Облуч., 16 день
Споры, 9 день Облуч., 18 день B
Споры, 10 день Облуч., 19 день B
Споры, 11 день Облуч., 20 день B
Споры, 12 день Споры, 13 день Споры, 14 день Споры, 15 день X, Y Споры, 30 день X, Y Повторная оценка опухоли с помощью КТ через 60 дней после облуч. Споры, 90 день X, Y Споры, 180 день X, Z A Облучение может быть прервано более чем на один день, но на 11 день облучение будет возобновлено B Облучение должно быть завершено в один из этих дней. X = CBC, хим. профиль, AST, PT/PT, образцы для исследовательского анализа крови, неблагоприятные события (AEs), сопутствующее лечение, измерения опухоли, фотографии Y= образцы для исследовательского анализа крови Z= проверка на метастазы в грудной клетке и дополнительная визуализация по показаниям, включая ультразвук брюшной полости

По состоянию на 10 сентябрь 2012 г. пять собак лечили таким образом. Из пяти у 2 развился абсцесс, у 1 поддерживалось стабильное заболевание, и 2 погибли или были забиты. У двух испытуемых, у которых развивался абсцесс, получены фотографии во время лечения, как показано на фигурах 1A и 1В.

На фигуре 1A показана остеосаркома собаки, локализованная на правом дистальном радиусе/локтевой кости в течение курса лечения. У испытуемого индивидуума «Саши» выявлена лихорадка и припухлость на 3 день и разрыв абсцесса на 6-й день. Антибиотики были начаты на 8 день из-за открытой раны, и затем некротические ткань и кость были удалены. У Саши было завершено 12 из 19 циклов лучевой терапии и по состоянию на 10 сентября 2012 г. наблюдалось заживление со стабильным заболеванием.

На фигуре 1В также изображена остеосаркома собаки, расположенная на правом дистальном радиусе/локтевой кости в течение курса лечения. У испытуемого индивидуума Сэмпсона выявлена лихорадка и припухлость на 5 день. На 6 день абсцесс вскрылся и были начаты антибиотики. У Сэмпсона было завершено 14 из 20 циклов лучевой терапии и по состоянию на 10 сентября 2012 г. наблюдалось заживление со стабильным заболеванием.

У других индивидуумов - Чиппера, Бейли и Раскина получены различные результаты. У Чиппера была сквамозноклеточная карцинома нижней челюсти слева. В течение курса лечения у Чиппера наблюдалась припухлость в месте опухоли, и он получил 20 из 20 курсов лучевой терапии. По состоянию на 10 сентября 2012 г. у Чиппера наблюдалось стабильное заболевание.

У другого индивидуума, Бейли, была саркома мягких тканей левой подмышечной области. Во время лечения Бейли умер, испытав сепсис, острую почечную недостаточность, скрытое диссеминированное внутрисосудистое свертывание и остановку сердца. Однако вскрытие показало, что вся ткань внутри опухоли мертва с отсутствием опухолевых клеток.

У оставшегося индивидуума, Раскина, представлена остеосаркома проксимальной части правой плечевой кости. Во время лечения у Раскина наблюдалась припухлость в месте опухоли, и он завершил полные 20/20 курсов лучевой терапии. Однако на 30-й день в месте опухоли наблюдалась продукция больших количеств гнойной материала и у Раскина наблюдалась почечная недостаточность. Владелец решил усыпить его, когда почечный статус не улучшился. По состоянию на 10 сентябрь 2012 г. результаты вскрытия еще не завершены.

Пример 2

Введение IT спор C. novyi-NT, специфически направленных на опухолевую ткань, и продолжительность выживаемости крыс - Методы

Клеточные линии и тканевая культура

Клетки линии F98 глиомы крысы трансфицировали конструктом люциферазы с помощью лентивируса, поддерживали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% сывороткой плодов телят (FBS) и 1% пенициллином и стрептомицином.

Эксперименты на крысах

6-недельных самок крыс F344 Fisher (масса 100-150 г) приобретали у Национального института рака. Для процедуры имплантации самок крыс F344 Fisher анестезировали с помощью внутрибрюшинного (в./б.) введения кетамина гидрохлорида (75 мг/кг; 100 мг/мл кетамина HCl; Abbot Laboratories), ксилазина (7,5 мг/кг; 100 мг/мл Xyla-ject; Phoenix Pharmaceutical, Burlingame, CA), и этанола (14,25%) в стерильном растворе NaCl (0,9%). Клетки глиомы F98 (2×10⁴) стереотаксически имплантировали через трепанационное отверстие в правой лобной доле, расположенное на 3 мм латеральнее брегмы и на 2 мм кпереди от нее, как описано ранее (Bai, et al., 2011). Размер опухоли оценивали с помощью инструмента Xenogen при в./б. введении 8 мг/крыса калиевой соли D-люциферина на 12-й день после имплантации опухолевых клеток. Затем 3 миллиона спор C. novyi-NT, полученных как описано ранее (Dang, et al., 2001, Bettegowda, et al., 2006), стереотаксически вводили во внутричерепную опухоль с использованием тех же координат, что и описанные выше, и крысы получали в./б. 10 мг/кг/день дексаметазона в течение первых 2 дней. За животными наблюдали ежедневно относительно каких-либо признаков ухудшения, вялости, нейротоксичности или боли в соответствии с руководством по уходу и использованию животных Джонса Хопкинса. Если присутствовали симптомы дистресса, начинали поддерживающую терапию гидратацией и доксициклином (нагрузочная доза 15 мг/кг в./б., затем 10 мг/кг каждые 12 часов в качестве поддерживающей дозы) и продолжали ее в течение 7-дневного периода. Если симптомы сохранялись и/или приводили к истощению, умирающих животных подвергали эвтаназии. Эффективность IT введения спор C. novyi-NT оценивали по кривым выживаемости Каплана-Мейера, а также по оставшейся нагрузке опухолью на срезах головного мозга. Для последнего отбирали мозг после вскрытия, помещали в формальдегид и заключали в парафин для дополнительных патологических исследований. Окрашенные по Граму срезы контрастировали сафранином, и срезы, покрашенные H&E, получали в соответствии со стандартными методами руководств.

Статистический анализ

Получали кривые выживаемости Каплана-Мейера и анализировали с помощью теста Mantel-Cox, используя GraphPad Prism v.5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Пример 3

Введение IT спор C. novyi-NT, специфически направленных на опухолевую ткань, и продолжительность выживаемости крыс - Результаты

Полное хирургическое удаление прогрессирующих глиом почти всегда невозможно, и эти опухоли неотвратимо рецидивируют. Хотя этот тип опухоли обычно не метастазирует, не существует высокоэффективных медицинских методов лечения, доступных для ее излечения. Поэтому глиомы, как предполагается, представляют собой тип опухолей, для которых местное введение спор C. novyi-NT может быть терапевтически полезным. Чтобы оценить эту возможность, клетки глиомы F98 крысы ортотопически имплантировали 6-недельным крысам Fisher F433, что привело к местным инвазивным опухолям, которые быстро становились фатальными (фигура 2А). Инъекция IT спор C. novyi-NT в опухоли этих крыс привела к их прорастанию в течение 24 часов и к быстрому падению активности люциферазы как показателя опухолевой нагрузки в течение 24-48 часов (фигуры 2В и 2С). Прорастание C. novyi-NT доказывалось появлением вегетативных форм бактерий. Поразительно, что C. novyi-NT точно локализовались в опухоли, и умеренно в соседних нормальных клетках только на несколько микрон от нее (фигуры 3A и 3B). Кроме того, эти вегетативные бактерии, как можно видеть, росли в пределах островков микроинвазивных опухолевых клеток и одновременно разрушали эти клетки, расположенные в пределах нормальной паренхимы мозга (фигуры 4А и 4В). Эта бактериальная биохирургия привела к значительному преимуществу в выживании у этой чрезвычайно агрессивной мышиной модели (фигура 2А, величина Р <0,0001).

Пример 4

Саркомы мягких тканей собак, похожие на опухоли человека - Методы

Выделение геномной ДНК для секвенирования

Геномную ДНК собак, участвующих в сравнительном исследовании IT введения спор C. novyi-NT, экстрагировали из лимфоцитов периферической крови (PBLs) и фиксированной формалином, заключенной в парафин опухолевой ткани с использованием мининабора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) согласно протоколу производителя.

Секвенирование и анализ с помощью биоинформатики

Очистку геномной ДНК, конструирование библиотеки, захват экзома, секвенирование следующего поколения и анализ опухоли и нормальных образцов с помощью биоинформатики осуществляли в Personal Genome Diagnostics (PGDx, Baltimore, MD). Вкратце, геномную ДНК из опухолевых и нормальных образцов фрагментировали и использовали для создания библиотеки lllumina TruSeq (lllumina, San Diego, CA). Области экзонов захватывали в раствор с использованием набора Agilent Canine All Exon kit в соответствии с инструкциями производителя (Agilent, Santa Clara, CA). Секвенирование парных концов, приводящее в результате к 100 основаниям от каждого конца фрагментов, осуществляли с использованием HiSeq 2000 Genome Analyzer (lllumina, San Diego, CA). Теги были выровнены с эталонной последовательностью собак (CanFam2.0), используя алгоритм Eland программного обеспечения CASAVA 1.7 (lllumina, San Diego, CA). Фильтр чистоты программного обеспечения BaseCall Illumina использовали для чтения выбранных последовательностей для последующего анализа. Алгоритм Eland программного обеспечения CASAVA 1.7 (lllumina, San Diego, CA) затем применяли для идентификации точечных мутаций и небольших вставок и делеций. Известные полиморфизмы, записанные в dbSNP131 (CanFam2.0), исключали из анализа. Потенциальные соматические мутации отфильтровывали и визуально инспектировали, как описано ранее (Jones, et al., 2010).

Пример 5

Саркомы мягких тканей собак, похожие на опухоли человека - Результаты

Доклинические исследования противораковых агентов на животных часто не воспроизводят наблюдаемых эффектов у людей. У собак, однако, клиническое применение терапевтических агентов вызывает токсичность и эффекты, аналогичные наблюдаемым у людей (Paoloni, et al., 2008). Разработка исследовательских методов лечения у собак может представлять собой ключевой переход между доклиническими исследованиями на животных и клиническими исследованиями на человеке. В частности, саркомы мягких тканей собак представляют собой прекрасную модель, поскольку они распространены у многих пород собак и имеют клинические и гистопатологические особенности очень близкие к саркомам мягких тканей человека (Paoloni, et al., 2008, Vail, et al., 2000). Тем не менее, в то время как последние достижения в области геномики значительно расширили наши знания о генетике рака у людей, сравнительно мало известно о генетической картине типов рака собак. Следовательно, чтобы определить, являются ли опухоли собак генетически сходными с опухолями людей, секвенировали экзом опухоли и соответствующую нормальную ДНК от 11 собак, участвующих в сравнительном исследовании (фигура 5). Этот анализ включал запрос о 30194 номинальных генов, включающих 32,9 мегабаз (Мб) ДНК. У десяти собак присутствовали саркомы мягких тканей (шесть опухолей оболочек периферических нервов), и у одной была хондробластная остеосаркома. В среднем 15,7 гигабаз (Гб) (диапазон: 8,1-23,3 Гб) генерированной последовательности были сопоставлены с геномом, и 92,1% оснований в областях-мишенях покрывались, по меньшей мере, 10 уникальными считываниями в опухолевой ДНК. Аналогичным образом, в среднем 16,3 Гб (диапазон: 14,6-19,7 Гб) последовательности были сопоставлены с геномом в нормальной ДНК, и 93,6% оснований-мишеней, покрывались, по меньшей мере, десятью уникальными считываниями. Среднее покрытие каждого основания-мишени в опухоли было 153-кратным (диапазон: 73-227-кратное), и оно было 152-кратным в соответствующих нормальных образцах (диапазон: 130-178-кратное).

При использовании критериев строгого анализа идентифицировано 156 соматических мутаций и 28 соматических изменений количества копий среди 10 сарком мягких тканей (таблица 3 и Фигура 6). Диапазон соматических мутаций от 0 до 95, в среднем 14 на опухоль. Распространенность мутаций в саркомах мягких тканей была низкой, в среднем 0,47 на Мб (диапазон: 0,00-2,89 на Мб). За исключением выброса одного образца с 95 соматическими изменениями, где наблюдалась средняя распространенность 0,21 мутаций на Мб (диапазон: 0,00-0,61 на Мб) (фигура 5), сходно с определением скорости мутаций в педиатрических рабдоидных опухолях человека (Lee, et al., 2012) и других саркомах мягких тканей (Joseph, et al., 2013). Наиболее распространенным типом соматического изменения была миссенс-мутация с преобладанием транзиции C на T (45,5%) и G на А (34,0%; таблицы 4a и 4b).

Таблица 4а
Типы соматических изменений, наблюдаемых при саркомах мягких тканей собак Тип Подтип Число изменений Процент изменений (%) Замены Антисмысловой 11 6 Бессмысленный (Несинонимичный) 135 73 Акцептор сайта сплайсинга 1 1 Донор сайта сплайсинга 4 2 Промежуточный 151 82 INDELs Делеция 4 2 Вставка 1 1 Промежуточный 5 3 CNAs Делеция 0 0 Амплификация 28 15 Промежуточный 28 15 Суммарный 184 100 INDELs - вставки и делеции; CNAs – изменения количества копий

Таблица 4b
Типы соматических мутаций в саркомах мягких тканей собак Тип соматического изменения Количество Процент Делеция 1 п.о. 3 1,9 Делеция 3 п.о. 1 0,6 Делеция 1 п.о. 1 0,6 3 1,9 4 2,6 3 1,9 4 2,6 2 1,3 71 45,5 53 34,0 3 1,9 4 2,6 1 0,6 1 0,6 2 1,3 Всего 156 100

Амплификации и делеции были менее распространены, в среднем по три на опухоль (диапазон: 0-17) (фигура 5). Семь из 10 сарком мягких тканей не несли амплификаций или делеций. Экзом хондробластной остеосаркомы был сходен с экзомами сарком мягких тканей с 14 соматическими мутациями и четырьмя амплификациями (таблица 3 и фигура 6).

Единичные замены оснований идентифицированы в четырех генах-супрессорах опухолей, которые часто мутируют в опухолях человека {NF1, MLL3, TP53 и PTCH1). Кроме того, MDM4, онкоген, который, как показано, подвергается амплификации, но не точечным мутациям в раковых заболеваниях человека, как установлено, амплифицировался (но не подвергался точечным мутациям) в одной опухоли собаки (Lee, et al., 2012 г., Barretina, et al., 2010, Chmielecki, et al., 2013, Vogelstein, et al., 2013). Единственные гены, мутировавшие более чем в одной опухоли, представляли собой ATP7B (миссенс-мутации в двух опухолях) и AIG1 (амплификация в двух опухолях). Интересно, что мутации в ATP7B также найдены в липосаркомах человека (Joseph et al., 2013). Двадцать две из 184 соматических мутаций в опухолях собак возникли в генах, которые, как показано ранее, мутировали в саркомах мягких тканей человека (таблица 5).

Требуются более масштабные исследования сарком мягких тканей у обоих видов для определения того, являются ли эти представленные драйверные мутации показателями важных, консервативных онкогенных путей. Независимо от этого генетические ландшафты опухолей собак аналогичны им у людей с точки зрения количества генетических изменений и спектра мутаций. В частности, они исключают возможность того, что опухоли собак имеют очень большое количество мутаций, которые могли бы заставить их с большей вероятностью вызывать иммунный ответ, чем аналогичные типы опухолей у человека.

Пример 6

Внутриопухолевое (IT) введение C. novyi NT - Исследование 1. Методы

Для исследования безопасности и эффективности способа по настоящему изобретению проводили сравнительное исследование на 16 собаках со спонтанно возникшими солидными опухолями (таблица 6).

Собак включали в исследование во многих организациях, участвующих в сети онкологических клинических исследований на животных (ACI, Washington, DC), и письменное информированное согласие было получено от владельца(ев) до включения. Лечение, содержание и оценки результатов исследования контролировались как удовлетворяющие требованиям ветеринарных врачей-онкологов с профессиональной сертификацией. Включение предлагалось принадлежащим клиентам-владельцам собакам со спонтанными солидными опухолями с предпочтением саркомы мягких тканей, у которых стандартная терапия не действовала или, владелец(цы) которых отклонили такую терапию. Участие было ограничено собаками-опухоленосителями с узлом-мишенью, имеющим самый большой диаметр от 1 до 7 сантиметров. Собак с опухолями, расположенными в областях, в которых развитие абсцесса будет иметь катастрофические последствия (например, назальные опухоли, которые распространяются в мозг, или запущенное метастатическое легочное заболевание) исключали из исследования.

Собаки с признаками активной бактериальной инфекции, требующей системной терапии антибиотиками в течение семи дней или терапии рака (химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии) в течение 21 дня, не имели права на лечение спорами C. novyi-NT. Собаки должны были иметь оценку активности 0 или 1 (таблица 7) и быть доступными для регистрации в течение всего периода исследования. Совместное использование противораковых агентов и участие в других клинических испытаниях запрещалось. Собак, которые были беременны или могут забеременеть, не включали в исследование. Кроме того, не включали в исследование собак, которые могут быть недоступны в течение всей продолжительности исследования, и собак, которые рассматривались как непригодные для включения в исследование исследователем или главврачом.

Таблица 7
Оценка уровня активности Балл Описание 0 Нормальная активность 1 Ограниченная активность: активность, пониженная относительно активности до заболевания 2 Нарушенная: только в амбулаторных условиях, способны к последовательной дефекации и мочеиспусканию в допустимых местах 3 Инвалидизированная: необходимость насильного кормления и/или неспособность ограничивать мочеиспускание и дефекацию допустимыми местами 4 Смерть

Во время скринингового визита каждой собаке присваивали уникальный идентификационный исследовательский номер, состоящий из 5-значного цифрового кода (который может не совпадать с последовательным порядковым номером скрининга собак). Первые 2 цифры указывали на место исследования (от 01 до 99), средняя цифра указывала исследование «R», и последние 2 цифры описывали исследовательский номер собаки в месте исследования (от 01 до 99). Например, 11-ой собаке, включенной в исследование в месте 9, присваивали исследовательский номер собаки 09-R11. Исследовательские номера присваивали собакам в хронологическом порядке, в котором собак включали в данное место исследования. Собака рассматривалась как включенная в исследование, когда она удовлетворяла критериям включения и исключения.

Исследования макроскопической патологии и гистологии были выполнены в соответствии с руководством CVM для отрасли 185 Управления по контролю за продуктами и лекарствами. При вскрытии следующие ткани (таблица 8) оценивали на макроскопическую патологию и гистопатологию и описывали в сообщении о вскрытии. Для микробиологии собирали образцы мозга, сердца, легких, печени, селезенки, почек, мышц, костей, тонкой кишки, толстой кишки и любой ткани с обширной аномалией.

Таблица 8
Перечень тканей, полученных для проверки макроскопической патологии и гистопатологии Гипофиз Мозг Кость и костный мозг Щитовидная железа Спинной мозг Мазок спинного мозга Паращитовидная железа Глаза Селезенка Надпочечник Легкое Желудок Поджелудочная железа Мышца Двенадцатиперстная кишка Яичники Молочная железа Тощая кишка Матка Печень Подвздошная кишка Семенники Желчный пузырь Толстая кишка Простата Почки Слепая кишка Эпидидимис Мочевой пузырь Тимус Сердце Лимфатические узлы Место введения Желудочки Кожа Любые аномальные ткани

Все собаки госпитализировались с 0 (D0) до 4 дня (D4), а затем необязательно (по усмотрению исследователя) в течение от 24 до 48 часов после каждого последующего цикла лечения для клинического наблюдения. Жидкости вводили всем собакам, включенным в исследование, во время госпитализации после лечения C. novyi NT. В дни дозирования всем собакам вводили внутривенно (в./в.), кристаллоиды 4 мл/кг/час в течение 2 часов. За собаками внимательно следили в течение шести часов после каждой IT инъекции спор C. novyi-NT. При следующем визите (через 4 дня) всем собакам вводили подкожно кристаллоиды (SQ) 20 мл/кг. Если собака была госпитализирована и получала в./в. кристаллоиды в тот день, когда должны были быть введены кристаллоиды SQ, отпадала необходимость давать дозу SQ.

Исследовательские визиты и события приведены в таблице 9, в качестве примера дана схема лечения 4 дозами. Интервал дозирования, как предполагалось, являлся еженедельным интервалом, если собака не рассматривалась как подвергаемая лечению повторяющимися дозами. Отсрочка лечения при повторном дозировании возникала в ходе исследования из-за неблагоприятных событий или решения исследователя.

Таблица 9
Краткое изложение оценок исследования Скрининг перед лечением^a 0 день^b 4 день 7 день^b 11 день 14 день^b 18 день 21 день^b 25 день 60 день 90 день Информированное согласие х История болезни & персональные данные х Физический осмотр х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Масса & показатели жизнедеятельности х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Оценка активности х Критерии включения & исключения х Лабораторные показатели^с х Х Х Х (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) Визуализация^D х (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) (Х) Биопсия х Исследование х Исследование крови Измерения & фотографии опухоли х Х Х Х Х Х Х Номер, присвоенный собаке в исследовании х Включение х IT C. novyi-NT Х Х Х Х Х Терапия в./в. жидкостью^e Х Х Х Х Х Терапия жидкостью SQ^f Х Х Х Х Окончание исследования^g Х ^aОценки при скрининге проводили за 1-14 дней до начала исследования. ^bЗа пациентом следили в течение 6 часов после лечения. Оценку производили каждые 15 минут в течение 1-го часа после лечения, каждые 30 минут в течение 2-го часа после лечения и через каждые 60 минут в течение 3-6 часов после лечения. ^сЛабораторные показатели включают: общий анализ крови, биохимическую панель сыворотки, протромбиновое время, тромбопластиновое время и анализ мочи. (Х) - по усмотрению следователя. ^dДиагностическая визуализация, включающая: рентгенограммы, ультразвуковое исследование или компьютерную томографию. ^eКристаллоид в дозе 4 мл/кг/час в течение двух часов. ^fКристаллоид в дозе 20 мл/кг. ^gПосле завершения исследования и если требовались системные антибиотики для лечения неблагоприятных событий, рекомендовалось вводить собакам доксициклин 5-10 мг/кг, перорально два раза в день (PO BID) в течение 3 месяцев.

Шестнадцать собак, 9 стерилизованных кобелей, 1 здоровый (интактный) кобель и 6 стерилизованных сук были включены в исследование. (Таблица 6). Их персональные характеристики и характеристики опухоли приведены в таблице 6. Включенные в исследование особи представляли собой особи разных пород, массы и возраста. У особей были ранее диагностированы спонтанно возникшие типа рака различного гистологического происхождения: у 13 собак был диагноз саркомы мягких тканей (81%) у 1-ой остеосаркома (6,3%), у 1-ой меланома (6,3%) и у 1-ой опухоль тучных клеток (6,3%). Из 13 сарком мягких тканей, гистологический подтип был доступен у 11-ти и включал: 4 гемангиоперицитомы (30,8%), 3 опухоли оболочки периферических нервов (23,1%), 1 саркому синовиальных клеток (7,7%), 1 миксосаркому (7,7%), 1 рабдосаркому (7,7%) и 1 фибросаркому (7,7%). Средняя масса собак, включенных в исследование, составляла 29,4 кг (диапазон 8,1-44,3 кг) и их средний возраст составлял 10,9 лет (диапазон: 7,2-14,3 года). Тринадцать собак имело диагноз саркомы мягких тканей и по одной имели диагноз остеосаркомы, злокачественной меланомы и опухоли тучных клеток. Из 13 сарком мягких тканей, шесть были доступны для иммуногистохимии (IHC). Все шесть были позитивными в отношении S100 и негативными в отношении актина гладких мышц, предполагая диагноз саркомы подтипа, называемого опухолью оболочки периферических нервов. Семь опухолей характеризовались стадией I, пять стадией II и четыре стадией III. У восьми собак ранее проводилось хирургическое лечение рака.

Получение спор C. novyi-NT и IT введение в спонтанные опухоли собак

Споры C. novyi-NT для использования в сравнительном исследовании собак получали, как описано ранее (Dang et al., 2001, Bettegowda et al., 2006). Вкратце, бактерии культивировали в среде для споруляции, по меньшей мере, в течение двух недель для обеспечения максимального выхода зрелых спор. Зрелые споры очищали с помощью двух последовательных, непрерывных градиентов и ресуспендирования в PBS. Тестирование стерильности конечного продукта осуществлялось с помощью культивирования продукта в

соево-казеиновой среде и тиогликолятной среде в соответствии с руководством FDA 21CFR610.12 (Nelson Laboratories, Salt Lake City, UT). Анализы эффективности прорастания проводили в анаэробных условиях на агаре для культивирования бруцелл с 5% кровью лошади для обеспечения уверенности в том, что споры соответствуют заданным критериям жизнеспособности. Споры упаковывали в стерильные 1,8 мл криопробирки с герметичными винтовыми колпачками с уплотнительным кольцом (Simport, Beloeil, Canada) в объеме 1000 мкл и концентрации 1×10⁹ спор/мл. Криопробирки с C. novyi-NT хранили при температуре 2-8°С. Для дозирования аликвоту 0,4 мл маточного раствора спор упаковывали в 0,5 мл криопробирки. После введения дозы криопробирки и неиспользованные споры C. novyi-NT утилизировали в соответствии с действующими правилами утилизации для уровня 2 биобезопасности материала. Перед IT введением споры ресуспендировали с помощью вортекса, смешивая при максимальной скорости в течение 10 секунд в общей сложности три раза, перед отсасыванием в 1 мл шприц. Место инъекции готовили в асептических условиях. Если было возможно, для идентификации некротической области опухоли использовали ультразвуковое исследование или компьютерную томографию (КТ). Если некротические области не выявлялись, инъекция была направлена к центру опухоли. Иглу вставляли один раз в заранее определенное место, и 100 мкл суспензии спор (1×10⁸ спор C. novyi-NT) дозировали с равномерным давлением. Инъекционную иглу удаляли медленно, и место инъекции стерилизовали. Все собаки получили, по меньшей мере, 1 цикл IT дозы 1×10⁸ спор в 100 мкл физиологического раствора (для биохирургии): 3 собаки получили один цикл лечения, 13 собак получали более 1 цикла, до 4 циклов лечения. Собаки могли получать до 4 циклов биохирургии с интервалом в одну неделю между циклами. После лечения за собаками наблюдали в течение, по меньшей мере, 90 дней после первой IT инъекции. Более длительное наблюдение за прогрессией заболевания и выживаемостью было оправданным в случае доступности. Досрочное исключение из исследования было возможным из-за токсичности или прогрессии заболевания.

Оценка исследования проводилась, как описано в таблице 9. Оценки при предварительном наблюдении осуществлялись с 1 по 14 день перед первым циклом биохирургии. Собак в ходе исследования периодически обследовали как на основе стационара, так и на амбулаторной основе. Лабораторные образцы брали, как представлено в таблице 9, и включалось исследование полного анализа крови, биохимии сыворотки, протромбинового времени, частичного тромбопластинового времени и анализ мочи. Визуализацию проводили при скрининге, и она включала местную КТ, рентген грудной клетки и ультразвуковое исследование брюшной полости. Дополнительная визуализация могла быть проведена в ходе исследования по усмотрению исследователя.

Неблагоприятные события оценивали, когда это возможно, с использованием общих терминологических критериев для неблагоприятных событий ветеринарной кооперативной группы онкологов (VCOG-CTCAE) v1,0 (Veterinary Co-operative Oncology Group, 2004) с терминологией из ветеринарного словаря для информации о вопросах, связанных с лекарствами (VeDDRA) Rev.4 (European Medcines Agency, 2012). Терминология для неблагоприятных событий, связанных с прорастанием C. novyi-NT (реакций целевого узла), определена в таблице 10. Клинические наблюдения без надлежащего VeDDRA или терминологии реакции целевого узла классифицировались отдельно как незакодированные признаки (таблица 11). Отношение к лечению C. novyi-NT определялось отчитывающимся исследователем.

Таблица 10
Кодированные термины для описания опухолевых неблагоприятных событий, связанных с активностью C. novyi-NT Термин по классификации поражения органов и систем органов (SOC) Групповой термин высокого уровня (HLT) Предпочтительный термин (PT) Групповой термин низкого уровня (LLT) Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Абсцесс опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Закрытая рана опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Опухолевый неприятный запах Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Некроз опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Открытая рана опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Потеря опухолевой ткани Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Отторгшаяся ткань опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Абсцесс опухоли Изъязвление опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Изменение консистенции опухоли Изменение консистенции опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Изменение консистенции опухоли Плотность опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Изменение консистенции опухоли Мягкость опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Выделение из опухоли Опухолевое кровотечение Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Выделение из опухоли Кровяное выделение из опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Выделение из опухоли Выделение из опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Выделение из опухоли Гнойное выделение из опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Выделение из опухоли Серозное выделение из опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Повышенная температура опухоли Реакция целевого опухолевого узла Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Повышенная теплота опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Отек опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Воспаление опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Воспалительная реакция опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Зуд опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Воспаление опухоли Набухание опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Опухолевая боль Боль в опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Кожное опухолевое нарушение Гематома опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Кожное опухолевое нарушение Изменение цвета опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Кожное опухолевое нарушение Эритема опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Кожное опухолевое нарушение Точечное кровоизлияние в опухоли Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Другое опухолевое нарушение Другое опухолевое нарушение Реакция целевого опухолевого узла Воспаление опухоли Опухолевая боль Дискомфорт опухоли

Таблица 11
Признаки, которые не относятся к VeDDRA, лежащие в основе нозологической формы или реакции целевого опухолевого узла, связанных с C. novyi-NT Неблагоприятное событие (предпочтительный термин) G-I G-II G-III G-IV # собак (с наступлением, по меньшей мере, одного AE) Суммарно Незакодированный признак 15 2 1^а 5 18 ^аСтадия IV, снижение в крови эозинофилов, сообщаемое исследователем.

Измерения самого длинного диаметра опухоли целевого опухолевого узла (предназначенного для введения) делали на 0 день, 7 день, 14 день, 21 день, 60 день и 90 день после лечения (таблица 9). Нецелевые и новые узлы фиксировали, но не измеряли. Наилучший суммарный ответ мишени оценивали на 21 день или после 21-го дня исследовательского визита: полный ответ (CR) определялся как полное исчезновение целевого узла; частичный ответ (PR) определялся как, по меньшей мере, 30% уменьшение наибольшего диаметра целевого узла; и прогрессия целевого заболевания (PD) определялась как, по меньшей мере, 20% увеличение в наибольшем диаметре целевого узла или появление новых нецелевых узлов. Стабильное заболевание (SD) определялось как недостаточное снижение или увеличение наибольшего диаметра целевого узла для классификации его как CR, PR или PD. В случае абсцессов, связанных C. novyi-NT, медицинская или хирургическая обработка некротических тканей предоставлялась на усмотрение исследователя.

Оценку хирургических образцов и вскрытия проводили с помощью департамента сертифицированных ветеринарных патологов. Образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и заключали в парафин. Получали срезы, окрашенные H&E и/или окрашенные по Граму, для оценки в соответствии с принципами стандартных руководств. Для иммуногистохимии (IHC) получали срезы 5 мкм фиксированной в формалине, заключенной в парафин опухолевой ткани, депарафинизировали в ксилоле и регидратировали проводкой через батарею спиртов. Демаскирование антигена осуществляли с использованием демаскирующего раствора (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Первичные антитела к S100 (DAKO, Carpinteria, CA) и антитела против актина гладких мышц (DAKO, Carpinteria, CA) использовали в разведении 1:100. Вторичные антитела (Vector Laboratories, Burlingame, CA), меченные DAB, использовали в разведении 1:500. Срезы инкубировали с реагентом ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и подкрашивали гематоксилином. Степень злокачественности опухоли оценивали для каждой опухоли на основе опубликованных критериев (Dennis, et al., 2011, Patnaik, et al., 1984, Smedley, et al., 2011, Sabattini, et al., 2014).

Пример 7

Внутриопухолевое (IT) введение C. novyi-NT - Исследование 1. Результаты

Все собаки получали, по меньшей мере, один цикл биохирургии, с 53 циклами, полученными максимально из 64 запланированных. Большинство собак, 10 из 16, получили предназначенные четыре цикла. Циклы биохирургии составляли по отдельности одну неделю. Не использовали никакого контроля плацебо или маскирующего контроля.

У собак, демонстрирующих ранние ответы опухоли, токсичность или прогрессию заболевания после первого цикла, последующие циклы прекращались. Наиболее общие неблагоприятные события указывали на местную инфекцию в месте инъекции спор C. novyi-NT, включая: лихорадку (17 случаев), воспаление опухоли (12 случаев), абсцесс опухоли (10 случаев), анорексию (девять инцидентов) и вялость (шесть случаев) (таблица 12). Клинические признаки воспалительной реакции в месте введения в целевой опухолевый узел наблюдались у 14 собак из 16 (87,5%), включая: воспаление опухоли (12/14), абсцесс опухоли (7/14), боли в опухоли (5/14) и выделения из опухоли (4/14) (таблица 13).

Таблица 12
Краткое изложение неблагоприятных событий, наблюдаемых во время исследования Неблагоприятное событие (предпочтительный термин) G-I G-II G-III G-IV # собак (с наступлением, по меньшей мере, одного AE) Суммарно Гипертермия 14 3 10 17 Воспаление опухоли 7 4 1 12 12 Абсцесс опухоли 6 3 1 8 10 Анорексия 7 2 8 9 Вялость 3 2 1 6 6 Хромота 5 1 6 6 Отек 5 1 5 6 Гипертензия 6 4 6 Нейтрофилия 6 6 6 Выделения из опухоли 6 4 6 Анемия 4 1 5 5 Диарея 3 1 2 4 Боль в опухоли 3 1 4 4 Лейкоцитоз 4 3 4 Лимфаденит 4 4 4 Изменение консистенции опухоли 3 3 3 Лейкопения 1 1 1 2 Тромбоцитопения 1 1 2 2 Локализованная боль 1 1 2 2 Лимфопения 1 1 2 2 Изменение белков крови 1 1 2 2 Рвота 1 1 2 2 Жидкость в брюшной полости 1 1 1 2 Генерализованная боль 1 1 2 2 Нарушение электролитного баланса 2 2 2 Нарушенное сознание 2 2 2 Нарушение кожи опухоли 2 2 2 Нейтропения 1 1 1 Беспокойство 1 1 1 Мышечная слабость 1 1 1 Лежачее состояние 1 1 1 Панникулит 1 1 1 Геморрагия пищеварительного тракта 1 1 1 Инфекция кожи и тканей 1 1 1 Аритмия 1 1 1 Нарушение костей и суставов 1 1 1 Гипертрофия сердца 1 1 1 Нарушение пищеварительного тракта 1 1 1 Эозинофилия 1 1 1 Эритема 1 1 1 Гепатомегалия 1 1 1 Гепатопатия 1 1 1 Зуд в месте введения 1 1 1 Лимфоцитоз 1 1 1 Шум 1 1 1 Тошнота 1 1 1 Пальпируемая масса 1 1 1 Легочное нарушение 1 1 1 Геморрагия кожи 1 1 1 Аномалии мочи 1 1 1 Суммарно 153

Таблица 13
Краткое изложение клинического доказательства прорастания и ответа на терапию C. novyi-NT ID случая Клиническое доказательство прорастания^а Клинический ответ^b Воспаление опухоли, кожное нарушение и выделение Воспаление опухоли и боль Воспаление опухоли и абсцесс Воспаление опухоли, изменение консистенции, выделение и боль в опухоли Воспаление опухоли и боль Воспаление опухоли, изменение консистенции, нарушение кожи и боль Воспаление опухоли, абсцесс и выделение Абсцесс опухоли и выделение - Воспаление опухоли, абсцесс и боль Воспаление опухоли и абсцесс Воспаление опухоли Абсцесс опухоли и изменение консистенции Воспаление опухоли Воспаление опухоли и абсцесс ^аКлиническое свидетельство прорастания C. novyi-NT на 0 день или после 0 дня исследования, и оно включает реакции целевого опухолевого узла (фигура 5). ^bЛучший ответ целевого опухолевого узла, как это определено протоколом исследования, после 21 дня исследования: CR - полный ответ; PR - частичный ответ; SD - стабильное заболевание; PD - прогрессирующее заболевание; NE – не поддающееся анализу на ответ на 21 день или после 21 дня исследования.

Неблагоприятные события с ранним наступлением

Неблагоприятные события с ранним наступлением относятся к событиям, происходящим в течение первых 7 дней после первого цикла лечения (13 собак) или единственного цикла лечения (3 собаки). Разнообразные данные о неблагоприятных (AE) событиях отмечались во многих случаях. Неблагоприятные события с ранним наступлением, которые произошли в течение 7 дней либо после первого цикла лечения (13 собак, получавших несколько циклов), либо после единственного цикла лечения (3 собаки, получавшие только один цикл), приведены в таблице 14.

Таблица 14
Краткое изложение неблагоприятных событий с ранним наступлением^а любой степени в течение первого цикла лечения Неблагоприятное событие Тип Количество собак^b (N=16) Заболеваемость (%) Воспаление опухоли Реакция целевого опухолевого узла 9 56,3% Анорексия Общие признаки или симптомы 4 25,0% Отек Общие признаки или симптомы 4 25,0% Лихорадка Общие признаки или симптомы 4 25,0% Повышенные лейкоциты Кровь и лимфатическая система 2 12,5% Гипертензия Циркуляторные нарушения 2 12,5% Вялость Общие признаки или симптомы 2 12,5% Боль Общие признаки или симптомы 2 12,5% Абсцесс опухоли Реакция целевого опухолевого узла 2 12,5% Пониженный Hb Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Пониженный MCV Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Повышенные нейтрофилы Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Пониженные эритроциты Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Пониженные лейкоциты Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Кровь в кале Нарушения пищеварительного тракта 1 6,3% Диарея Нарушения пищеварительного тракта 1 6,3% Тошнота Нарушения пищеварительного тракта 1 6,3% Срыгивание Нарушения пищеварительного тракта 1 6,3% Рвота Нарушения пищеварительного тракта 1 6,3% Зуд в месте введения Реакции в месте введения 1 6,3% Опухолевое кровотечение Реакция целевого опухолевого узла 1 6,3% Опухолевая эритема Реакция целевого опухолевого узла 1 6,3% ^а До 7 дней и менее, чем через 7 дней после первого цикла лечения. ^bКоличество собак, по меньшей мере, с одним неблагоприятным событием любой степени

Общие данные о неблагоприятных событиях с ранним наступлением включали: реакции целевого опухолевого узла, изменения общих признаков и симптомов и аномалии показателей крови и лимфатической системы. Большинство неблагоприятных событий с ранним наступлением было от легких до умеренных (степень I-II), причем воспаление опухоли, анорексия, отек опухоли и лихорадки являлись наиболее часто наблюдаемыми событиями. Абсцесс опухоли III степени и воспаление опухоли III степени отмечались в двух случаях (10-R02 и R03-16). Данные о неблагоприятных событиях с ранним наступлением представляются соответствующими ожидаемым воспалительным реакциям опухоли, происходящим в результате механизма действия терапевтических C. novyi-NT.

Неблагоприятные события с поздним наступлением

Подгруппа из 3 собак получала только один цикл лечения (по состоянию на 2 декабря 2012 г.). Неблагоприятные события с поздним наступлением относятся к событиям, происходящим после 7 дней, следующих за единственным циклом лечения, и они суммированы в таблице 15 для 3 собак (04-R04, 10-R02 и 11-R01). Большинство неблагоприятных событий с поздним наступлением было от легких до умеренных (степень I-II), и 11 из 12 данных о неблагоприятных событиях с поздним наступлением были отмечены у единственного индивидуума 04-R04. У этой собаки была представлена хондробластная остеосаркома правой передней лапы с исходным измерением LD 94,5 мм (измерение с помощью КТ было не доступно). Ампутация рассматривалась через 20 дней после введения спор C. novyi-NT из-за прогрессии болезни. Два других индивидуума хорошо переносили единственный цикл лечения. Их AE с поздним наступлением ограничивалось исключительно легкой лихорадкой (степень I).

Таблица 15
Краткое изложение неблагоприятных событий с поздним наступлением^а любой степени после первого цикла лечения Неблагоприятное событие Тип Коли-чество собак^b (N=3) Заболева-емость (%) Дни до исследо-вания^с Лихорадка Общие признаки или симптомы 1 33,3% 9 Боль Общие признаки или симптомы 1 33,3% 20 Нарушение в месте хирургии Системные нарушение NOS 1 33,3% 24 Повышенные нейтрофилы Кровь и лимфатическая система 1 33,3% 34 Пониженные эритроциты Кровь и лимфатическая система 1 33,3% 34 Повышенные эозинофилы Кровь и лимфатическая система 1 33,3% 61 Повышенные лейкоциты Кровь и лимфатическая система 1 33,3% 61 Новая масса опухоли Неоплазия 1 33,3% 82 Лимфоаденопатия Нарушения лимфатических узлов 1 33,3% 82 Пониженные тромбоциты Кровь и лимфатическая система 1 33,3% 93 ^аПосле 7 дней, следующих за первым циклом лечения. ^bКоличество собак, по меньшей мере, с одним неблагоприятным событием любой степени. ^сСо дня первого лечения.

Таким образом, профиль безопасности, наблюдаемый после одного цикла лечения IT введением 1×10⁸ спор C. novyi-NT, предполагал подходящую переносимость. Неблагоприятные события с ранним наступлением и поздним наступлением соответствовали ожидаемым опухолевым воспалительным реакциям, происходящим в результате механизма действия C. novyi-NT. Неблагоприятные события отслеживались и эффективно контролировались, как описано в настоящем документе.

Неблагоприятные события, отмечаемые у собак при получении множественных циклов лечения IT введением C. novyi-NT, приведены в таблице 9 для неблагоприятных событий (AEs) любой степени и в таблице 10 для AEs степени III и выше.

Разнообразие и количество данных о неблагоприятных событиях после множественных циклов лечения было очень сходно с наблюдаемыми после одного цикла лечения. Кроме того, наступление событий, как оказалось, в значительной степени согласуется с наблюдаемым после однократного цикла лечения: из 169 данных для всех случаев, только у 30 оно отмечалось более чем через семь дней после предшествующей дозы. Аналогично, воспаление опухоли, анорексия и лихорадка были наиболее часто наблюдаемыми событиями. Неблагоприятные события, которые произошли более чем в одном случае, включали: реакции целевого опухолевого узла, изменения общих признаков и симптомов, аномалии крови и лимфатической системы, хромоту, гипертензию, лимфаденопатию, диарею и новые массы. Большинство (приблизительно 95%) данных свидетельствовало об интенсивности от легкой до умеренной (степени от I до II).

Тяжелые неблагоприятные события

Тяжелые неблагоприятные события (степени III и более) были отмечены в 5 случаях (таблица 16). Индивидуум 04-R05 испытывал увеличение нейтрофилов III степени. Индивидуум 10-R01 испытывал анемию, вялость, мышечную слабость, миозит, боль III степени и находился в лежачем положении. Обширное метастатическое заболевание при отсутствии его выявления в исходный момент было диагностировано после вскрытия индивидуума 10-R01 на 60 день; прогрессия заболевания могла иметь влияние на данные о неблагоприятных событиях в этом случае. Индивидуум 10-R02 испытывал абсцесс опухоли III степени. Индивидуум 11-R01 испытывал снижение количества тромбоцитов IV степени через 93 дня после первого цикла лечения, которое разрешилось самопроизвольно. Симптомы исчезли через 21 день после визита на 93 день без какого-либо медицинского лечения. Примечательно, что этот индивидуум характеризовался также симптомами тромбоцитопении I степени и II степени при скрининге и исходно, соответственно. Индивидуум 16-R03 испытывал диарею III степени, хромоту и воспаление опухоли, которые исчезали в течение одной недели.

Таблица 16
Краткое изложение неблагоприятных событий, более сильных или равных III степени для всех циклов лечения Неблагоприятное событие Тип Количество собак^а (N=16) Заболеваемость (%) Хромота Нарушения опорно-двигательного аппарата 3 18,8% Боль Общие признаки или симптомы 2 12,5% Анемия Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Пониженные нейтрофилы Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Пониженные тромбоциты Кровь и лимфатическая система 1 6,3% Диарея Нарушения пищеварительного тракта 1 6,3% Вялость Общие признаки или симптомы 1 6,3% Панникулит Общие признаки или симптомы 1 6,3% Миозит Нарушения опорно-двигательного аппарата 1 6,3% Абсцесс опухоли Реакция целевого опухолевого узла 1 6,3% Воспаление опухоли Реакция целевого опухолевого узла 1 6,3% ^аКоличество собак, по меньшей мере, с одним неблагоприятным событием любой степени.

У двух собак были задокументированы новые массы в ходе исследования. Ректальная масса выявлена у индивидуума 04-R04 на 82 день и литическое поражение позвоночника стадии T1 у индивидуума 10-R01 на 9 день. Эти данные могут отражать наличие метастаза или второй отдельной патологии. В обоих случаях, связь с терапией C. novyi-NT была неясной.

Ответ на лечение C. novyi-NT

Таким образом, лечение C. novyi-NT собак-компаньонов в дозе 1x10⁸ спор на цикл терапии в течение до 4 циклов хорошо переносится. Большинство неблагоприятных событий, возможно или вероятно связанных с лекарством, которые характеризовались более чем III степенью, разрешались в течение одной недели. Ожидаемые неблагоприятные события во многом были связаны с местными воспалительными изменениями после внутриопухолевой терапии и обычно разрешались в течение одной недели. Неблагоприятные события и тяжелые неблагоприятные события отслеживались и эффективно управлялись, как описано в настоящем документе.

Учитывая, что введение C. novyi-NT сопровождалось широким доказательством биологической активности, проведена предварительная оценка ответа первичной опухоли с использованием RECIST 1.1, и она обобщена в таблице 17 ниже.

Таблица 17
Краткое изложение клинических признаков прорастания C. novyi-NT и ответа на терапию C. novyi-NT ID случая Клинический признак прорастания^а Клинический ответ^b Воспаление опухоли, нарушение кожи и нарушение Воспаление опухоли и боль Воспаление опухоли и абсцесс Воспаление опухоли, изменение консистенции, выделение и боль в опухоли Воспаление опухоли и боль Воспаление опухоли, изменение консистенции, нарушение кожи и боль Воспаление опухоли, абсцесс и выделение Абсцесс опухоли и выделение - Воспаление опухоли, абсцесс и боль Воспаление опухоли и абсцесс Воспаление опухоли Абсцесс опухоли и изменение консистенции Воспаление опухоли Воспаление опухоли и абсцесс -

Проводили оценку на лучший ответ собак на 21 день или после 21 дня исследования. У трех наблюдался полный ответ (CR) на терапию, у трех наблюдались частичные ответы (PR), у пяти наблюдалось стабильное заболевание (SD), у трех наблюдалось прогрессирующее заболевание (PD), и у двух собак (04-R04 и 04-R08) ответ не оценивался из-за того, что опухоль, в которую осуществлялось введение, удалили хирургическим путем до 21 дня. Степень объективного ответа на биохирургию составляла 37,5% (6 из 16 собак, 95-процентный доверительный интервал: 15,2–64,6%). Опухолевые абсцессы и ответы наступали после от одного до четырех циклов биохирургии. Собака 11-R01 испытывала PR после единственного цикла, 04-R03 характеризовалась CR после трех циклов, собаки 04-R02 и 04-R05 характеризовались PRs после четырех циклов, в то время как 04-R01 и 04-R06 характеризовались CRs после четырех циклов. На фигурах 7А-F и фигурах 8А-F представлены репрезентативные изменения у собак с частичным (11-R01) и полным (04-R03) ответами, соответственно. Разрешение абсцессов происходило с санацией, и заживление ран завершалось через от 2 до 4 недель. Тем не менее, явное формирование абсцесса перед объективным ответом наблюдалось не всегда. Собаки 04-R01 и 04-R06 получали 4 цикла биохирургии с воспалением опухоли, но без образования абсцесса при наблюдении до 21 дня исследовательского визита. Тем не менее, полные ответы у этих двух собак отмечались на 42 день (незапланированного визита) и на 60 день исследовательских визитов, соответственно.

Более подробные данные об индивидуальных собаках обсуждаются ниже:

Энди (11-R01, фигуры 7А-F), 10-летний, стерилизованный кобель, мальтийская болонка, имел саркому мягких тканей II степени зокачественности на левой ушной раковине. Его история болезни включала операцию до включения. Он получал единственную дозу спор C. novyi-NT 18 июня 2012 г. Энди испытывал набухание опухоли I степени на 1 день (19 июня 2012 г.). Формирование абсцесса привело к изъязвлению опухоли и выделению гнойного, некротического материала. В результате рана зажила без осложнения. Во время расширенного периода наблюдения наблюдалась тромбоцитопения IV степени на 93 день (19 сентября 2012 г.), которая разрешилась к обычному последующему визиту несколько недель спустя. Утолщенная область кожи приблизительно в 8 мм оставалась после заживления раны (смотри фигуру 9, демонстрирующую временную зависимость измерений опухоли в течение цикла исследования). Это, возможно, представляло собой рубцовую ткань или остаточную опухоль.

Молли (11-R02), 12-летняя, стерилизованная сука, лабрадор-ретривер, имела саркому мягких тканей II степени зокачественности на левом заднем коленном суставе. Она не имела никакой истории болезни до включения. Она получила 3 IT цикла спор C. novyi-NT с последующей 1 в./в. дозой 1×10⁸ спор C. novyi-NT через 7 дней после 3-ей IT дозы. Она получала 1-ую, 2-ую и 3-ю IT дозы 11 июля 2012 г., 18 июля 2012 г. и 25 июля 2012 г., соответственно. Разовую в./в. дозу спор С. novyi-NT давали 1 августа 2012 г. из-за отсутствия выявления биологической активности предшествующих IT доз. Единственное отмеченное неблагоприятное событие представляло собой гипертензию I степени после 3-ей IT дозы. Гипертензия была временной и самоограниченной, разрешающейся в течение 1 часа. Опухоль Молли была удалена хирургическим путем на 30 день (10 августа 2012 г.) для гистологического анализа. Опухолевое образование подтверждено как являющееся саркомой мягких тканей с участками некроза и воспаления. Бактерии не присутствовали при окрашивании по Граму, подтверждая отсутствие биологической активности в этом случае.

Рики (10-R01), 13-летний стерилизованный кобель, золотистый ретривер, имел пероральную меланому. Его история болезни включала операцию до включения. Он получал 2 IT курса спор C. novyi-NT. IT введение C. novyi-NT проводили при лечении 2 августа 2012 г. и 9 августа 2012 г. На 9 день (11 августа 2012 г.), у Рикки внезапно через 2 дня после 2-го цикла лечения начала развиваться боль в шейном отделе и неврологический дефицит задней ноги. Отмечалась также анемия III степени. Была выполнена МРТ, и она выявила вероятный панникулит шейного отдела и компрессию шейного отдела спинного мозга. Вводились кортикостероиды и агенты, защищающие желудочно-кишечный тракт, и Рикки восстановился через 3 дня. Не отмечалось никаких изменений в пероральной меланоме, и никакого дополнительного лечения C. novyi-NT не осуществляли. На 21 день (23 августа 2012 г.), была выполнена МРТ, и она показала улучшение описанного ранее панникулита; однако, при КТ грудной клетки выявлялись метастатические легочные узлы. Проводили оперативное удаление пероральной меланомы. Лечение тирозиназной вакциной против меланомы человека было начато 30 августа 2012 г. На 42 день (13 сентября 2012 г.) у Рикки началась рецидивирующая боль шейного отдела и боль в передних конечностях (через 2 недели после прекращения введения кортикостероидов) и через 2 недели после получения вакцины против меланомы. Медицинское вмешательство с обезболивающим не привело к улучшению через 4 дня, поэтому введение кортикостероидов было возобновлено. На 46 день отмечались анемия III степени и повышение АМК. Предполагаемое желудочно-кишечное кровотечение лечили агентами, защищающими желудочно-кишечный тракт. На 60 день у Рики развился коллапс и кровавая рвота. Была проведена гуманная эвтаназия. Вскрытие показало диссеминированную метастатическую меланому, включая подчелюстной лимфатический узел, лимфатический узел средостения, брыжеечный лимфатический узел, почку и периспинальную жировую ткань в области шейного отдела позвоночника. Никаких доказательств наличия язвы желудка или кишечника не было найдено. Предполагаемой причиной двух эпизодов боли в позвоночнике является метастатическая меланома. Отношение к C. novyi-NT осталось неопределенным.

Финнеган (04-R02), 11-летний интактный кобель, золотистый ретривер, имел саркому мягких тканей (гемангиоперицитому) на правой боковой пясти. Его история болезни включала операцию до включения. Он получил 4 IT цикла спор C. novyi-NT. Неблагоприятные события были умеренными и хорошо переносились. Полное уничтожение опухоли наступило после 4 циклов лечения с оставлением краев нормальной ткани по окружности места опухоли. Финнеган получил 1-й, 2-й, 3-й и 4-й циклы лечения 3 августа 2012 г., 10 августа 2012 г., 17 августа 2012 г. и 24 августа 2012 г., соответственно. Введение C. novyi-NT было связано с неблагоприятными событиями только I степени после 1-го, 2-го и 3-го циклов. Неблагоприятные события I и II степени отмечались через 48 часов после 4-й дозы. Инфицирование опухоли отмечалось и состояло из лихорадки, лейкоцитоза, нейтрофилии и связанной с опухолью болью и образованием абсцесса. Инфицирование прогрессировало до формирования абсцесса и уничтожения всей опухоли с минимальной санацией раны, происходящими через 96 часов после 4-ой дозы. Измерения опухоли при этом визите записывали утром перед полным удалением всей опухолевой массы в тот же день позднее. Ампутацию конечности проводили вместо лечения открытой раны на 25 день (28 августа 2012 г.) и давали антибиотики. Финнеган восстановился от операции без побочных эффектов и оставался свободным от опухолевой массы 94 дня (05 ноября 2012 г.) после первого цикла его лечения.

Дрейк (04-R01, фигура 10А), 7-летний стерилизованный кобель, золотистый ретривер, имел саркому мягких тканей (фибросаркому) в области середины верхней челюсти справа. Он не имел никакой истории болезни до включения. Он получил 4 IT цикла спор С novyi-NT. Неблагоприятные события были умеренными и хорошо переносились. Полное уничтожение опухоли произошло после 4 циклов с оставлением краев нормальной ткани вокруг места опухоли. Дрейк получал 1-й, 2-й, 3-й и 4-й цикл лечения 13 августа 2012 г., 20 августа 2012 г., 27 августа 2012 г. и 4 сентября 2012 г., соответственно. Интервалы между 1-ой, 2-ой и 3-ей дозами составляли 7 дней; в то время как интервал между 3-ей и 4-ой дозами составлял 8 дней для соблюдения национального праздника. Введение C. novyi-NT было связано с умеренными неблагоприятными событиями, включая вялость и отсутствие аппетита I степени, и рвоту и кровянистый стул II степени, отмеченные через 24-48 часов после 1-го цикла. Эти AEs успешно излечивались с помощью противорвотного средства и антибиотика. AEs отмечались в течение 24 часов после 4-й дозы, включая боль в опухоли и набухание I степени. Не наблюдалось дополнительного доказательства инфицирования опухоли и формирования абсцесса. Уничтожение массы опухоли было очевидно на 60 день (12 октября 2012 г.), и опухоль не поддавалась измерению (смотри фигуру 10В, представляющую измерения опухоли в зависимости от времени на протяжении исследования). Область была плотной и оставалась слегка набухшей, и выполняли КТ. Дрейк оставался свободным от опухоли на 86 день (7 ноября 2012 г.) после 1-й дозы.

Бакстер (04-R03, фигура 8А-F), 9-летний, стерилизованный кобель, боксер, имел саркому мягких тканей II степени злокачественности на левом медиальном предплечье. Он не имел никакой истории болезни до включения. Он получил три IT цикла спор C. novyi-NT. Неблагоприятные события были умеренными и хорошо переносились. Полное уничтожение опухоли произошло после трех инъекций с оставлением краев нормальной ткани вокруг места опухоли. Бакстер получил свои 1-ую, 2-ую и 3-юю дозы спор C. novyi-NT 17 августа 2012 г., 24 августа 2012 г. и 31 августа 2012 г., соответственно. Введение C. novyi-NT хорошо переносилось, причем не сообщалось о токсичности, связанной с действием исследуемого агента, после 1-ой или 2-ой дозы. Связанные с исследованием неблагоприятные события отмечались через 24 часа после 3-ей дозы. Эти неблагоприятные события были связаны с инфицированием опухоли и состояли из лихорадки, анорексии, вялости и связанной с опухолью болью, отеком и кровотечением. Неблагоприятные события были умеренными (II степени или ниже) и их лечили с помощью поддерживающей терапии и анальгетиков. Опухолевая инфекция, связанная с C. novyi-NT, прогрессировала с вовлечением всей опухоли и формированием абсцесса. Хирургическая санация опухоли 2 сентября 2012 г. привела к быстрому разрешению AEs. Заживление раны прошло без осложнений и завершилось к 16 октября 2012 г. Бакстер остается свободным от опухолевой массы на 94 день (19 ноября 2012 г.) после его первого цикла лечения (смотри фигуру 11, представляющую измерения опухоли в зависимости от времени на протяжении исследования).

Харли (26-R01), 7-летний, стерилизованный кобель, лабрадор-ретривер, имел саркому мягких тканей (гемангиоперицитому) II степени злокачественности на правой лапе. Он не имел никакой истории болезни до включения. Он получил 4 IT цикла спор С. novyi-NT. 1-ую, 2-ую, 3-юю и 4-ую дозы вводили 20 августа 2012 г., 27 августа 2012 г., 4 сентября 2012 г. и 10 сентября 2012 г. Интервал между дозами составлял 6-8 дней. Повышение температуры относительно базальной отмечалось во время 1-й и 2-й доз. IT лечение спорами C. novyi-NT хорошо переносилось без сообщений о каких-либо неблагоприятных событиях. Ответа на лечение не наблюдалось.

Урсула (04-R-04), 11-летняя, стерилизованная сука, метис сенбернара, имела хондробластную остеосаркому правой передней конечности. Ее история болезни включала операцию до включения. Она получила одну IT дозу спор C. novyi-NT. Никакого метастатического заболевания не наблюдалось на момент включения. После первого цикла лечения 31 августа 2012 г. наблюдалось формирование абсцесса опухоли и воспаление вокруг опухоли в течение первых 24 часов и это лечили терапевтически с помощью обезболивающего, теплых компрессов и внутривенных кристаллоидов. После отсутствия улучшения опухоль/абсцесс вскрыли на 2 день (2 сентября 2012 г.). Умеренно присутствовала серозно-геморрагическая жидкость. В анаэробной культуре выделены C. novyi. Антибиотики вводили, начиная с 4 дня (4 сентября 2012 г.). Место иссечения лечили как открытую рану до 20 дня (20 сентября 2012 г.), на который выполнили ампутацию из-за прогрессии заболевания. Гистопатология показала тяжелый некроз и кровоизлияние вместе с сохраняющейся хондробластной остеосаркомой. После ампутации отмечалась инфекция в месте иссечения. Культивирование не выявило C. novyi. Никакой адъювантной терапии не проводили после ампутации. На 81 день (21 ноября 2012 г.) у Урсулы присутствовал ректальный пролапс и было установлено, что у нее есть ректальные полипы. Рентгеновские снимки грудной клетки, выполненные во время этой оценки, показали наличие легочных метастазов.

Габриэль (16-R02), 9-летний, стерилизованный кобель, лабрадор-ретривер, имел саркому мягких тканей I степени злокачественности на левой боковой стороне бедра. Его история болезни включала операцию до включения. Он получил 4 IT цикла спор C. novyi-NT. IT введение спор C. novyi-NT в целом хорошо переносилось с задержкой в 1 неделю между 1-й и 2-й дозой в связи с диареей II степени, которая являлась ответом на медицинское вмешательство. Габриэль получил 1-ю, 2-ю, 3-ю и 4-ю дозы 12 сентября 2012 г., 26 сентября 2012 г, 3 октября 2012 г. и 10 октября 2012 г., соответственно. Токсичность была умеренной и состояла в основном из диареи и конституциональных симптомов. Диарея II степени отмечалась после каждой дозы и хорошо реагировала на медицинское вмешательство. После 1-й дозы осуществлялась задержка введения дозы на 1 неделю, приводя в результате к 14-дневному интервалу между 1-й и 2-й дозой. Задержки введения дозы из-за диареи II степени не осуществлялись при введении последующих доз. Кроме того, набухание опухоли II степени наблюдалось на 4 день (16 сентября 2012 г.). Размер опухоли оставался стабильным с D0 (12 сентября, 201 г.2) до D63 (14 ноября 2012 г.), дня самого последнего исследовательского визита.

Бадди (04-R05), 13-летний, стерилизованный кобель, шелти, имел саркому мягких тканей (рабдомиосаркому) на правом предплечье. Его история болезни включала хирургическое вмешательство, химиотерапию, и предшествующее клиническое испытание C. novyi-NT перед включением. Никакого метастатического заболевания не наблюдалось на момент включения в исследование. Он получил 4 IT цикла спор C. novyi-NT. Клинически значимые неблагоприятные события, совпадающие по времени с введением C. novyi-NT, выделялись как нейтропения III степени и лихорадка после 3-го цикла терапии. Это событие разрешалось в течение 48 часов медицинского вмешательства с помощью внутривенных антибиотиков и инфузионной терапии. Бадди получил 1-й, 2-й, 3-й и 4-й курсы лечения 20 сентября 2012 г., 27 сентября 2012 г., 5 октября 2012 г. и 12 октября 2012 г. Умеренное воспаление опухоли (эритема, жар, набухание) отмечалось как связанное с 2 из 4 циклов. Временное уменьшение размера опухоли отмечалось на 4 день (24 сентября 2012 г.). Новый нецелевой узел отмечался рядом с первичным местом опухоли на 21 день (12 октября 2012 г.). Первичная опухоль была стабильной на 61 день.

Амбра (16-R03), 10-летняя, стерилизованная сука, овчарка, имела саркому мягких тканей I степени злокачественности на ладонной и дорзальной поверхностях левой лапы. Ее история болезни включала операцию до включения. Она получила 4 IT цикла спор C. novyi-NT. 1-ю, 2-ю, 3-ю и 4-ю дозы вводили 26 сентября 2012 г., 3 октября 2012 г., 15 октября 2012 г. и 24 октября 2012 г. Интервал между дозами составлял 7-12 дней. Амбра испытывала отек опухоли II степени и боль после 1-ой и 2-ой доз. I степень потери аппетита отмечалась на 2-й день (28 сентября 2012г.). На 8-й день (4 октября 2012 г., через 1 день после 2-й дозы) отмечалась лихорадка I степени, жар в опухоли II степени и хромота III степени. Ее опухоль вскрыли, и ей давали анальгетики. Диарея III степени отмечалась на 11 День (7 октября 2012 г.), и ее лечили с помощью медицинского вмешательства. Из-за связанных с опухолью неблагоприятный событий и диареи 3-ю дозу отложили до 19 дня (15 октября 2012 г.). Набухание опухоли II степени снова наблюдалось на 19 день, после 3-ей дозы C. novyi-NT, и его лечили анальгетиками. Неблагоприятных событий не отмечалось после 4-й дозы.

Секст (11-R04), 9-летний, стерилизованный кобель, хаски, имел саркому мягких тканей I степени злокачественности на правой лапе. Он не имел истории болезни до включения. Он получил 4 IT цикла спор C. novyi-NT. Секст получал 1-ю, 2-ю, 3-ю и 4-ю дозы 1 октября 2012 г., 8 октября 2012 г., 15 октября 2012 г. и 22 октября 2012 г., соответственно. Введение спор C. novyi-NT хорошо переносилось только с умеренными наблюдаемыми неблагоприятными событиями. После 1-й дозы отмечалась гипертензия I степени и лихорадка. Лихорадка и гипертензия были самоограничивающимися и разрешались в пределах 1 и 2 часов после введения дозы, соответственно. На 4-й день (5 октября 2012 г.) опухоль была субъективно мягче, и наблюдалась небольшая область изъязвления (I степени) в месте предыдущей биопсии. Изъязвление продолжалось до 31 дня (1 ноября 2012 г.), самого последнего текущего исследовательского визита. Это изъязвление может быть связано либо с исследуемым агентом, либо с осложнением биопсии, необходимой для включения в исследование.

Белла (04-R06), 11-летняя, стерилизованная сука, лабрадор-ретривер, имела опухоль тучных клеток (первоначально определенную при аспирировании как саркома мягких тканей) на 3 пальце правой задней ноги с метастазами в подколенном лимфатическом узле. Она не имела истории болезни до включения. Она получила 4 IT цикла спор C. novyi-NT. Неблагоприятные события были умеренными и ограничивались лихорадкой I степени и воспалением опухоли I степени. Белла получала 1-й, 2-й, 3-й и 4-й циклы лечения 19 октября 2012 г., 26 октября 2012 г., 2 ноября 2012 г. и 9 ноября 2012 г. Лихорадка I степени совпадала по времени с лечением C. novyi-NT и воспалением опухоли. Лихорадка и воспаление самопроизвольно разрешались без необходимости медицинского вмешательства, отличного от протокола, требующего подкожное введение жидкостей по схеме исследовательских визитов. Изъязвление опухоли отмечалось на 21-й день (9 ноября 2012 г.). Фотографии опухоли, посланные исследователю владельцем собаки, показали разрешение язв и существенный регресс опухолевой массы. Незапланированный визит проводился на 46 день (4 декабря 2012 г.) для того, чтобы захватить и оценить отклик опухоли. Была отмечена полная регрессия опухоли.

Фрида (11-R01), 7-летняя, стерилизованная сука, метис немецкой овчарки, имела саркому мягких тканей (гемангиоперицитому) на правой задней лапе с возможными метастазами в лимфатических узлах (по данным КТ). Ее история болезни включала операцию до включения. Ее владелец приехал с ней из Мексики для участия в этом клиническом испытании. Она получила 3 ​​ IT цикла спор С. novyi- NT. Неблагоприятные события были ограничены нарастанием и убыванием лихорадки в течение 48 часов, которая разрешалась с помощью внутривенных жидкостей и НПВП. Фрида получила 1-й, 2-й и 3-й циклы лечения 6 ноября 2012 г., 14 ноября 2012 г., и 21 ноября 2012 г. Единственные значимые неблагоприятные события включали лихорадку I степени, требующую госпитализации и введения жидкостей, начиная с 4 дня (10 ноября 2012 г.), и прогрессирующую до II степени лихорадку на 5 день (11 ноября 2012 г.). Лихорадка разрешалась после 48 часов. Лихорадка I степени отмечалась также после 3-го цикла лечения на 18 день (24 ноября 2012 г.). Прогрессия опухоли сделала необходимой ампутацию на 21-й день (27 ноября 2012 г.).

Мийя (01-R02), 7-летний, стерилизованный кобель, бордер-колли, имел саркому мягких тканей (опухоль оболочки периферических нервов) на левом боку грудной клетки. Он не имел истории болезни до включения. Он получил 3​​ IT цикла спор C. novyi-NT. Неблагоприятные события были умеренными и хорошо переносились. Воспаление опухоли, жар и выделения от серозно-геморрагических до слизисто-гнойных, вероятно, относятся к активности C. novyi-NT. 4-й цикл спор C. novyi-NT планируется. Мийя получил 1-ю, 2-ю и 3-ю дозы 12 ноября 2012 г., 20 ноября 2012 г. и 27 ноября 2012 г., соответственно. Интервал между 1-й и 2-й дозами составлял 8 дней; в то время как интервал между 2-й и 3-й дозами составлял 7 дней. Введение C. novyi-NT было связано с умеренной токсичностью I–II степени. Тошнота и отрыжка I степени были отмечены после 1-й дозы, потеря аппетита и вялость I степени отмечались после 3-й дозы. Токсичность вскоре разрешалась с помощью медицинского вмешательства. Наибольшая токсичность I степени или II степени тяжести была локализована в месте опухоли (жар, воспаление, зуд, выделения, от серозно-геморрагических до слизисто-гнойных, и эритема) и возникала в течение 2 дней после введения C. novyi-NT. Кроме того, вентральный отек I - II степени наблюдался через 2 дня после 1-й и 3-й доз.

Танк (10-R02), 10-летний, стерилизованный кобель, смешанной породы, имел саркому мягких тканей (гемангиоперицитому) на правом боку. Его история болезни включала операцию до включения. Он получил 1 IT цикл спор C. novyi-NT 12 ноября 2012 г. Лихорадка I степени, снижение аппетита, отек II степени вокруг опухоли и абсцесс опухоли III степени отмечались на 4 день (16 ноября 2012 г.) после лечения. Медицинское вмешательство, включающее обезболивающие лекарства, в./в. жидкости и антибиотики широкого спектра действия, было использовано для управления абсцессом. Воспаление опухоли и окружающий отек разрешались на 11 день (23 ноября 2012 г.). Танк получил 2-й цикл лечения на 3 декабря 2012 г. Интервал между циклами составлял 21 день. 2-я доза была отложена из-за периода вымывания антибиотиков.

Зависимость измерений опухоли у восьми собак от времени показана на фигуре 12A. На фигуре 12B показано три кривых зависимости от времени, которые были укорочены из-за ампутации или отсутствия данных.

В целом C. novyi-NT, вводимые с помощью IT инъекции в дозе 1×10⁸ спор за цикл, до 4 циклов лечения проявляют значимую биологическую и противоопухолевую активность и, как считается, хорошо переносятся собаками-компаньонами со спонтанно возникшими солидными опухолями. Ответы опухоли являются быстрыми со значительным некрозом опухоли и с заметной регрессией заболевания, происходящей в течение нескольких дней введения C. novyi-NT. Большинство неблагоприятных событий ограничивается 1 степенью и 2 степенью и находится в соответствии с механизмом опухолевых воспалительных реакций, ожидаемых при лечении C. novyi-NT. Несколько случаев в настоящее время находится в рамках долгосрочного наблюдения для оценки прогрессии и выживаемости.

Пример 8

Внутриопухолевое (IT) введение C. novyi-NT. - Исследование 2 - методы

Проводили исследование для характеристики дозы и объема введения C. novyi-NT с помощью IT инъекции для лечения собак с солидными опухолями (за исключением остеосаркомы или опухоли тучных клеток).

Собак с солидными опухолями (за исключением остеосаркомы или опухоли тучных клеток) любой массы, породы, пола или возраста обследовали для включения. Критерии включения были сходными с представленными в примере 6 за исключением того, что каждая собака имела цитологический или гистологический диагноз любого типа рака за исключением остеосаркомы или опухоли тучных клеток и того, что каждая собака имела, по меньшей мере, 1 измеряемый опухолевый узел с наибольшим диаметром ≥1 см.

В ходе первоначального скринингового визита каждой собаке присваивался уникальный идентификационный номер исследования собаки, состоящий из 5-значного цифрового кода (который может не совпадать с последовательностью номеров скрининга собак). Первые 2 цифры указывали на место проведения исследования (от 01 до 99), средняя цифра указывала на исследование «5», и последние 2 цифры описывали исследовательский номер собаки в месте проведения исследования (от 01 до 99). Например, 11-ой собаке, поступившей в место проведения исследования 9, назначался исследовательский номер собаки 09-511. Исследовательские номера собак назначались в том хронологическом порядке, в котором собаки включались в данное место проведения исследования. Собака рассматривалась как включенная в исследование, когда она удовлетворяла критериям включения и исключения.

Макропатологическое, гистопатологическое исследование и вскрытие проводили, как описано в примере 6.

Споры C. novyi-NT получали, как изложено выше, перед доставкой в ​​концентрации 1×10⁸ спор/мл и суспендировали в стерильном физиологическом растворе в 2 мл криопробирках. Каждый цикл лечения C. novyi состоял из до 5 инъекций 1 мл суспензии спор (1×10⁸ спор) для каждой инъекции в одно место целевого узла. Суспензию спор, содержащую 1×10⁸ спор, упаковывали в отдельные криопробирки для каждой 1 мл инъекции, и сосуд, шприц и иглу утилизировали после каждой инъекции.

Схема проведения инъекции показана на фигуре 13. Пять мест для 1 мл инъекции (представленных квадратами) были распределены по опухоли: центр и четыре (4) равномерно распределенных мест инъекций в пределах опухоли. Место для каждой инъекции в 1 мл дополнительно включало 5 мест перенаправления (как представлено кружками на фигуре 13). В каждое место перенаправления поступало 200 мкл суспензии спор. Иглу сначала направляли ​​в центр места инъекции, а затем равномерно перенаправляли в четыре угла места инъекции без вынимания иглы. После завершения первой 1 мл инъекции иглу вынимали и шприц утилизировали. Глубина каждой инъекции должна быть определена надлежащим образом так, чтобы достигалось наилучшее распределение. Рекомендуемый размер шприца составлял 1 мл для каждой инъекции, рекомендуемая игла между 22 калибром и 25 калибром. Адекватная длина иглы должна быть выбрана, основываясь на глубине опухолевого узла.

Все собаки были госпитализированы от D0 до D2, а затем по усмотрению исследователя от 24 до 48 часов после каждого последующего лечения для клинического наблюдения. Жидкости вводили всем собакам, включенным в исследование, во время госпитализации после лечения C. novyi-NT. В дни получения доз всем собакам в./в. вводили кристаллоиды 4 мл/рт.ст./час в течение 2 часов после лечения C. novyi-NT.

Исследовательские визиты и события суммированы в таблице 18 при схеме лечения из 8 циклов в качестве примера. Интервал дозирования, как предполагалось, составлял один раз в неделю, если целью было лечение собаки множественными циклами терапии.

Таблица 18
Краткое изложение исследовательских визитов и событий Наблюдение Цикл 1* Цикл
D70±7 дней D90±7 дней C D-14 по D0 D0 D__ Информированное согласие Х Персональные данные Х Масса и жизнеспособность Х Х Х Х Х Физикальное обследование Х Х Х Х Х Лабораторные пробы Х Х (Х) (Х) Х Исследовательские пробы крови Х Х Х Х Х Исследовательский образец опухоли Х Диагностическая визуализация Х Х*** Показатель активности Х Включение/исключение Х Включение Х Измерение опухоли Х Х Х Х Х C. novyi-NT* Х* Х Кристаллоиды** Х** Х** Завершение исследования Х *Владельцы доставят свою собаку в клинику с D0 по D2, и кристаллоиды будут вводиться в./в. всем собакам в клинике. При последующих циклах исследователи будут заполнять D в соответствии с количеством дней в исследовании по сравнению с D0.
**Собакам будут вводиться в./в. кристаллоиды.
*** Только рентгенография грудной клетки.
Собаки могут не получить 8 циклов. В этом исследовании решение о продолжении следующего цикла дозирования должно быть принято на индивидуальной основе с помощью консультаций между медицинским директором, исследователем и спонсором.
После завершения исследования и если системные антибиотики требовались для управления неблагоприятными событиями, рекомендуется вводить собакам доксициклин 5-10 мг/кг после операции два раза в день в течение 3 месяцев.

Пример 9

Внутриопухолевое (IT) введение C. novyi-NT. - Исследование 2 - промежуточные результаты

По состоянию на 2 декабря 2012 г. в исследовании лечили двух собак-компаньонов. Оба животных получали уровень дозы 5х10⁸ спор, вводимых в 5 уникальных мест IT инъекцией за цикл лечения.

Первая собака, Бадди (04-503), 9-летний, стерилизованный кобель, бельгийский малинуа, имел саркому мягких тканей в левом запястье с исходно измеренным LD 69 мм (4,4×3,3×0,7 см при определении с помощью КТ). Его история болезни включала операцию до включения. Он получил 2 IT цикла спор C. novyi-NT. Неблагоприятные события были умеренными и ограничивались лихорадкой I степени и воспалением опухоли I степени. Бадди получал 1-й и 2-й циклы лечения 21 ноября 2012 г. и 28 ноября 2012 г. Лихорадка I степени и покраснение опухоли, набухание и усиление боли отмечались в течение 6 часов после первой инъекции. Лихорадка разрешалась в течение 6 часов после лечения НПВП карпрофеном. Умеренное изъязвление опухоли отмечалось на 2 день (23 ноября 2012 г.) после лечения. На 7 день (28 ноября 2012 г.) отмечалось незначительное уменьшение размеров опухолевой массы (-12,0%). Каждый цикл лечения хорошо переносился без неблагоприятных событий выше I степени.

Вторая собака, Гиннесс (04-502), 9-летний, стерилизованный кобель, уитон-терьер, имел плоскоклеточную карциному на левом плече с исходно измеренным LD 122 мм (9,1×9,3×14,5 см по данным КТ), гемангиосаркому низкой степени злокачественности на задней ноге и доказанные легочные метастазы (на основе КТ). Его история болезни включала операцию до включения. Существовавшее ранее заболевание митрального клапана было доказано на основе эхокардиографии, выполненной до включения. Он получил одну IT дозу спор C. novyi-NT на 28 ноября 2012 г. Лихорадка III степени отмечалась в течение 6 часов после лечения, и ее лечили в./в. жидкостями. На 1 день (29 ноября 2012 г.) оценивали абсцесс опухолевой массы, гнойные выделения и нейтрофилию. Продолжали вводить в./в. жидкости и начали давать обезболивающие препараты (включая НПВП). На 2 день (30 ноября 2012 г.), прогрессирующее набухание опухоли и признаки сепсиса (лихорадка, нейтропения, гипогликемия, гипоальбуминемия) послужили толчком для вскрытия и орошения опухоли. Вводили антибиотики широкого спектра действия, гидроксиэтилкрахмал и альбумин человека. На 3 день (1 декабря 2012 г.) отмечалось прогрессирующее снижение статуса в результате дыхательной недостаточности. Вводили эвтаназирующий раствор. Проводили вскрытие. Макроскопические клинически значимые результаты включали вегетативный эндокардит, гнойные узлы в легких и подкожные кровоизлияния, и отек всего тела. Посмертные аэробные культуры различных тканей и органов (легких, печени, сердца, почек, селезенки, ЖКТ, желудка) выявили полимикробный рост бактерий (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, штаммы Streptococcus); анаэробные культуры всех органов и тканей были отрицательными в отношении роста C. novyi-NT за исключением опухолевой ткани и мочевого пузыря. Гистопатология пораженных тканей рассматривается. Септический токсемический шок рассматривается как наиболее вероятная причина смерти, и связь с лечением C. novyi-NT на данный момент не ясна.

Пример 10

Внутриопухолевое (IT) введение C. novyi-NT человеку – методы

Фаза I клинического испытания IT введения спор C. novyi-NT человеку

Фаза I открытого, нерандомизированного, многоцентрового исследования безопасности однократного IT введения спор C. novyi-NT в настоящее время продолжается у больных с солидными опухолями, не поддающимися лечению. Протокол клинического исследования рассмотрен и одобрен наблюдательным советом института (IRB) в случае каждого участвующего института, и все нормативные этапы выполнялись в соответствии с указаниями Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) (номер NCT01924689). От всех больных требовалось подписание формы письменного информированного согласия (ICF) перед включением в исследование.

Основными задачами этой I фазы исследования было определение профиля безопасности, ограничивающего дозу токсичности (DLT), и максимальной переносимой дозы (MTD), вводимых IT C. novyi-NT. Кроме того, исследовали противоопухолевую активность терапевтического агента.

Получение и IT введение спор C. novyi-NT в I фазе испытания

Клинически поставляемые споры C. novyi-NT упаковывали в одноразовые 2 мл стерильные и апирогенные флаконы типа I из боросиликатного стекла с резиновой пробкой и алюминиевым покрытием с физически защищенным колпачком в концентрации 8,52×10⁸ спор/мл, суспендированных в стерильном забуференном фосфатным буфером физиологическом растворе (PBS) в полном объеме 1,0 мл. Флаконы хранили при 2-8°С с контролируемой температурой окружающей среды при постоянном мониторинге температуры. Продукт GMP получали и составляли с помощью Omnia biologics, Inc. (Rockville, MD).

После включения больного в испытание один флакон доставляли к месту проведения исследования. Дальнейшее получение C. novyi-NT было необходимым и происходило в тот же день, что и IT введение. Разбавление концентрированной суспензии спор проводили в назначенном кабинете биологической безопасности с использованием инфузионных мешков со стерильным физиологическим раствором (0,9%), с размером, подходящим для достижения требуемой дозы, основанной на выделенной когорте. Объем для инъекции (3 мл) затем отсасывали из мешка с физиологическим раствором и вводили, руководствуясь рентгенографией. Споры C. novyi-NT вводили многозубой иглой 18 калибра Quadra-Fuse®, Rex-Medical, Conshohocken, PA).

Дизайн и проведение клинического испытания на человеке

Исследование проводили по стандартному дизайну 3+3 эскалации дозы. У больных должен быть поставлен диагноз наличия поздней стадии злокачественной солидной опухоли с целевым опухолевым узлом, который поддается измерению, пальпации или четко идентифицируется под контролем ультразвука или рентгенографии и поддается чрескожной инъекции спор C. novyi-NT. Целевой узел должен иметь наибольший диаметр ≥1 см и поддаваться измерению, как определено критериями RECIST 1.1. Основные критерии включения включали историю не поддающегося лечению злокачественного новообразования; возраст, по меньшей мере, 18 лет; общее состояние ≤2 по параметрам Восточной объединенной онкологической группы (ECOG); способность выносить 45 минут пути движения скорой помощи и наличие сиделки в течение 28 дней после IT инъекции. Основными критериями исключения были беременность; первичная злокачественная опухоль мозга или метастазы в мозг; клинически значимый асцит или клинически доказанная портосистемная гипертензия или цирроз, или история их наличия; шкала ком Глазго (GCS) <15; уровень креатинина сыворотки > в 1,5 раза выше верхнего предела нормальных значений (ULN), хроническая почечная недостаточность, требующая гемодиализа или перитонеального диализа; насыщение кислородом (SPCO₂) <95% (при комнатном воздухе); среднее артериальное давление крови (АД) <70 мм рт. ст.; количество тромбоцитов ≤100000/мм³; гемоглобин <9,0 г/дл; абсолютное количество нейтрофилов (ANC) <1000/мм³; клинически значимый экссудативный плеврит, экссудативный перикардит, циркулярный экссудативный перикардит или любой выпот более 1,0 см с любой локализацией вокруг сердца; необходимость проведения лечения иммуносупрессорным агентом; история трансплантации солидных органов; системная или местная инфекция.

Удовлетворяющих критериям больных допускали и включали в когорты, получающие дозы. Согласно протоколу, больные оставались госпитализированными после введения спор и наблюдались в течение 8 дней, и больные возвращались в место клинического исследования для запланированных по схеме повторных посещений в течение 12 месяцев, в процессе которых проводили оценки безопасности и эффективности в зависимости от времени.

Клинический ответ и прогрессию оценивали с помощью RECIST версии 1.1. Объективные ответы измеряли с помощью серийного КТ или МРТ сканирования опухоли, подвергаемой введению, а также отдаленных метастазов (до 5 целевых узлов). Мониторинг безопасности относительно инфекционных осложнений или других связанных с лечением неблагоприятных событий проводили постоянно в течение 12 месяцев.

Пример 11

Внутриопухолевое (IT) введение C. novyi-NT человеку - Результаты

C. novyi-NT вызывает быстрое локальное разрушение опухоли у первого больного человека

Многообещающие результаты и благоприятные профили риска/преимущества биохирургии в сравнительном исследовании на собаках, в сочетании с результатами, полученными на крысах, дали основание для попытки биохирургии у человека. Соответственно, была начата I фаза исследовательского испытания у больных людей с солидными опухолями, которые были либо резистентны к стандартной терапии, либо не доступны для стандартной терапии (NCT01924689). Первый больной, включенный в это испытание, описан в настоящем документе: 53-летняя женщина с диагнозом забрюшинной лейомиосаркомы в августе 2006 г. Больная перенесла несколько хирургических резекций и получала множественные курсы лечения с помощью химиотерапии и лучевой терапии, включая правую радикальную нефрэктомию и лучевую терапию в марте 2007 г., химиотерапию гемцитабином, таксолом, адриамицином и ифосфамидом, резекцию метастазов в печени в ноябре 2008 г., множественные клиновидные резекции правосторонних легочных метастазов в декабре 2009 г., лечение трабектедином с марта 2010 г. по апрель 2011 г., множественные клиновидные резекции левосторонних легочных метастазов в декабре 2010 г., лечение пазопанибом в апреле 2011 г., левую нижнюю лобэктомию в октябре 2011 г., абраксан HAI, гемцитабин и авастин с февраля 2012 г. по январь 2013 г., эверолимус и пазопаниб с февраля 2013 г. по июль 2013 г. и умеренную артериальную печеночную эмболизацию в августе 2013 г. и сентябре 2013 г. Однако у больной наблюдалась прогрессия с метастатическим заболеванием, присутствующим у нее в печени, легких, брюшине и мягкой ткани правого плеча и прилегающей правой плечевой кости.

Биохирургию проводили с помощью запланированной начальной дозы 1×10⁴ спор C. novyi-NT, вводимых в ее метастатическую опухоль правого плеча многозубой иглой 18 калибра (день 0, 19 ноября 2013 г.).

Внутриопухолевое введение с использованием трезубой иглы под контролем КТ

У больной вызывали умеренный седативный эффект под действием фентанила, и изучали его в течение 35 минут. Устройство 18 калибра Quadra-Fuse (Rex-Medical) (фигура 16А) использовали для инъекции под контролем КТ, вставив 3-зубую иглу (27g) в область-мишень инъекции (фигуры 16B и 16C). Три зубца (каждый из которых имел 2 сквозных отверстия для 4 выходов жидкости) (фигура 16D) были развернуты на 4, 3 и 2 см в каждой локализации (фигура 16E), 1 мл аликвоту раствора спор C. novyi-NT вводили в течение поэтапного процесса ретракции. Устройство удаляли после полной ретракции развернутых зубьев в канюлю иглы, и использовали ручное сжатие для достижения гемостаза.

В 1 день больная испытывала умеренную боль в правом плече, распространяющуюся на лопатку, которая отвечала на трамадол и ацетаминофен. На 2 день ее боль требовала в./в. введения больной контролируемого анальгетика гидроморфона, количество ее лейкоцитов увеличилось до 18300 на мкл, и у нее развилась лихорадка с максимальной температурой 39,2°С. На 3 день боль в правом плече и лопатке больной было трудно контролировать. Ее максимальная температура составляла 37,8°С. КТ сканирование правой верхней конечности показало значительное разрушение опухоли с газом в мягких тканях и с костным компонентом опухоли (фигура 14A). Обсуждался некроз ее плечевой кости. Аспирация ее опухоли под контролем КТ показала рост C. novyi-NT в условиях анаэробного культивирования. Затем больной начали давать антибиотики, и вскоре после этого лихорадка снизилась. На 4 день МРТ правой верхней конечности продемонстрировало заметное уменьшение возвышения, ограниченного опухолевой массой, по сравнению с исходным (фигура 14B и 14C). Биопсия опухоли показала множество грамположительных бактерий и отсутствие жизнеспособных опухолевых клеток. Во время биопсии чрескожный дренаж помещали в абсцесс опухоли для дренирования жидкости и разрушенных клеток. Больная оставалась без температуры, и количество ее лейкоцитов постепенно нормализовалось. Ей продолжали давать антибиотики, и она оставалась в больнице для в./в. введения анальгетиков до 20 дня, когда она перешла на пероральные анальгетики. Она была выписана с назначением пероральных метронидазола и доксициклина в соответствии с протоколом. На 29-й день последующая МРТ продемонстрировала продолжение уменьшения опухолевого возвышения (фигура 14D). На 55 день у больной была локализованная боль в результате усилия больной, спровоцировавшего патологический перелом правой проксимальной плечевой кости. Последующая частичная резекция плечевой кости, санация и внутренняя фиксация с помощью штифта для остеосинтеза и цементной прокладки привели к значительному улучшению в плане боли и увеличению размаха движения. Интраоперационные культуры показали рост C. novyi-NT при анаэробных условиях культивирования. Гистопатология продемонстрировала интенсивный некроз опухоли с мелкими очагами остаточных опухолевых клеток (фигуры 15A-D). Больная продолжает оставаться под наблюдением и имеет статус активности 1 по шкале Восточной объединенной онкологической группы (ECOG) без клинических признаков инфекции.

Документы

Все документы, процитированные в данной заявке, включены в настоящий документ в качестве ссылки, как если бы они излагались в данном документе в полном объеме.

Хотя в настоящем документе описаны иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничивается тем, что описано, и что различные другие изменения или модификации могут быть сделаны специалистом в данной области техники без отхода от объема или сущности изобретения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии и терапии, и предназначено для циторедукции или уничтожения солидной опухоли, присутствующей у человека. Способ циторедукции или уничтожения солидной опухоли включает введение человеку в опухоль от одного до четырех циклов единиц дозы спор C. novyi NT, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁵ спор на цикл. Каждая единица дозы C. novyi NT суспендирована в фармацевтически приемлемом носителе или растворе. При этом C. novyi NT эффективна для циторедукции или уничтожения солидной опухоли без введения дополнительных противораковых агентов. Изобретение обеспечивает циторедукцию или уничтожение солидной опухоли у пациента. 27 з.п. ф-лы, 16 ил., 18 табл., 11 пр.

1. Способ циторедукции или уничтожения солидной опухоли, присутствующей у человека, включающий введение человеку в опухоль от одного до четырех циклов единиц дозы спор C. novyi NT, включающей приблизительно 1×10³-1×10⁵ спор на цикл, причем каждая единица дозы C. novyi NT суспендирована в фармацевтически приемлемом носителе или растворе, при этом C. novyi NT эффективна для циторедукции или уничтожения солидной опухоли без введения дополнительных противораковых агентов.

2. Способ по п. 1, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из саркомы мягких тканей, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланомы.

3. Способ по п. 1, где солидная опухоль представляет собой лейомиосаркому.

4. Способ по п. 3, где солидная опухоль представляет собой забрюшинную лейомиосаркому.

5. Способ по п. 1, где единица дозы включает приблизительно 1×10⁵ спор C. novyi.

6. Способ по п. 1, где единица дозы включает приблизительно 1×10⁴ спор C. novyi.

7. Способ по п. 1, где споры C. novyi выбраны из группы, состоящей из вегетативной формы и споровой формы.

8. Способ по п. 1, где стадия введения включает инъекцию единицы дозы в одно место локализации в опухоли.

9. Способ по п. 1, где стадия введения включает инъекцию единицы дозы во множественные уникальные места локализации в опухоли.

10. Способ по п. 1, где стадия введения включает инъекцию единицы дозы в 1-5 уникальных мест локализации в опухоли.

11. Способ по п. 1, где стадия введения включает инъекцию единицы дозы в 5 или более уникальных мест локализации в опухоли.

12. Способ по п. 1, в котором интервал между каждым циклом лечения составляет приблизительно 5-100 дней.

13. Способ по п. 1, в котором интервал между каждым циклом лечения составляет приблизительно 7 дней.

14. Способ по п. 1, дополнительно включающий в/в введение жидкостей человеку до, во время и/или после каждого введения спор C. novyi NT.

15. Способ по п. 1, дополнительно включающий обеспечение человека первым курсом антибиотиков в течение периода времени и в дозировке, которая является эффективной для лечения или облегчения неблагоприятного побочного эффекта, вызванного C. novyi.

16. Способ по п. 15, где антибиотики вводят в течение двух недель после введения C. novyi.

17. Способ по п. 15, где антибиотики выбраны из группы, состоящей из амоксициллина, клавуланата, метронидазола и их сочетаний.

18. Способ по п. 15, дополнительно включающий обеспечение человека вторым курсом антибиотиков в течение периода времени и в дозировке, которая является эффективной для лечения или облегчения неблагоприятного побочного эффекта, вызванного C. novyi.

19. Способ по п. 18, где второй курс антибиотиков начинается после завершения первого курса антибиотиков и проводится в течение 1-6 месяцев.

20. Способ по п. 18, где второй курс антибиотиков начинается после завершения первого курса антибиотиков и проводится в течение 3 месяцев.

21. Способ по п. 18, где антибиотик, используемый во втором курсе, представляет собой доксициклин.

22. Способ по п. 1, дополнительно включающий получение человеком терапии, выбранной из группы, состоящей из химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии и их сочетаний.

23. Способ по п. 22, где иммунотерапия включает введение человеку ингибитора иммунных контрольных точек.

24. Способ по п. 1, где солидная опухоль устойчива к терапии, выбранной из группы, состоящей из химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии и их сочетаний.

25. Способ по п. 22, где химиотерапия включает введение человеку агента, выбранного из группы, состоящей из антиметаболита, ингибитора микротрубочек, повреждающего ДНК агента, антибиотика, агента против ангиогенеза, молекулярно направленного агента и их сочетаний.

26. Способ по п. 22, где химиотерапия включает введение человеку агента, выбранного из группы, состоящей из гемцитабина, таксола, адриамицина, ифосфамида, трабектедина, пазопаниба, абраксана, авастина, эверолимуса и их сочетаний.

27. Способ по п. 1, где солидная опухоль не поддается стандартной терапии или солидная опухоль недоступна для стандартной терапии.

28. Способ по п. 1, где индуцируется мощный местный воспалительный ответ и адаптивный иммунный ответ у человека.