ИСПОЛЬЗОВАНИЕ CLOSTRIDIUM GHONII В СОЧЕТАНИИ С ИНГИБИТОРОМ АНГИОГЕНЕЗА ОПУХОЛИ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A61K35/742 A61K31/444 A61P35/00 

[01] Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на выдачу патента в Китае № CN 202111177878.9, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая (CNIPA) 9 октября 2021 г. и озаглавленной «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ CLOSTRIDIUM GHONII В СОЧЕТАНИИ С ИНГИБИТОРОМ АНГИОГЕНЕЗА ОПУХОЛИ», которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[02] Настоящее изобретение относится к технической области онкологии и относится к использованию Clostridium ghonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли, в частности к использованию Clostridium ghonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли для ослабления иммуносупрессивного микроокружения опухоли, улучшения микроокружения опухоли и усиления эффекта лечения опухолей.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[03] Микроокружение опухоли представляет собой локальную устойчивую среду, состоящую из опухолевых клеток, стромальных клеток, внеклеточного матрикса и биомолекул, проникающих в нее в процессе роста опухоли. Микроокружение опухоли обеспечивает материальную основу для онкогенеза, развития, инвазии и т.д., а также регулирует и контролирует биологическое поведение, такое как метастазирование опухоли и рецидив. Между тем, микроокружение опухоли повышает лекарственную и радиационную устойчивость опухолей и снижает эффект лечения. Иммуномодуляция в микроокружении опухоли играет важную роль в онкогенезе и развитии и приводит к локальной иммуносупрессии в опухолях посредством различных механизмов. Микроокружение опухоли в значительной степени влияет на рост и инвазию опухолей и ангиогенез. Поэтому способы регулирования стратегии иммунотерапии на основе микроокружения опухоли и реконструирования активного иммунного микроокружения имеют большое значение для противоопухолевой терапии.

[04] Злокачественные опухоли избегают иммунного надзора хозяина с помощью различных механизмов, включая нарушение инфильтрации лимфоцитов, апрегуляцию белков иммунных контрольных точек за счет гипоксии, рекрутирование регуляторных Т-клеток и создание иммуносупрессивного микроокружения опухоли, которое ухудшает функции резидентных и иммунных эффекторных транспортирующих клеток. Миелоидные клетки, проникшие в микроокружение опухоли, могут регулировать и контролировать ускользание опухолевых клеток от иммунологического надзора, метастазирование опухоли и другие ключевые звенья в развитии опухоли.

[05] Солидные опухоли часто инфильтрированы большим количеством иммуносупрессивных агентов, таких как опухоль-ассоциированные макрофаги, миелоидные супрессорные клетки и регуляторные Т-клетки. Трансформирующий фактор роста бета (TGFβ) играет важную роль в иммунном ответе микроокружения опухоли и способен содействовать противоопухолевой иммуносупрессии и формированию лекарственной устойчивости к антиангиогенной терапии.

[06] Гипоксия или низкое содержание кислорода является типичной особенностью солидных опухолей. Гипоксия солидных опухолей может напрямую положительно регулировать экспрессию белка иммунной контрольной точки PD-L1 миелоидных супрессорных клеток, дендритных клеток и опухолевых клеток с помощью фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1α), способствуя иммуносупрессии и ускользанию. Между тем, гипоксия опухолей может еще больше увеличить инвазивный потенциал опухолевых клеток, индуцируя выработку медиаторов клеточной миграции (таких как фактор стромального происхождения 1-альфа SDF-1α и фактора роста гепатоцитов HGF) и молекул внеклеточного матрикса клеточной инвазии. Гипоксия также повышает устойчивость опухолей к лучевой терапии и химиотерапии.

[07] Clostridium ghonii является облигатным анаэробом, может специфически прорастать и размножаться только в зонах гипоксии или некроза опухоли, эффективно растворять опухолевые ткани независимо от их типа и разрушать микроокружение опухоли. После онколиза Clostridium ghonii изменяется иммуногенность микроокружения опухоли, корректируется иммуносупрессивное микроокружение опухоли и индуцируется противоопухолевый иммунный ответ. В настоящее время нет соответствующих отчетов о том, что Clostridium ghonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли может значительно изменить иммуносупрессивное микроокружение опухоли и усилить противоопухолевый эффект.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[08] Устраняя недостатки предшествующего уровня техники, настоящее изобретение обеспечивает использование более безопасной и узконаправленной анаэробной бактерии Clostridium ghonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли для лечения солидных опухолей.

[09] Предлагается использование Clostridium ghonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли при приготовлении фармацевтической композиции для лечения опухоли.

[010] Предлагается препарат для лечения опухоли, содержащий активный компонент Clostridium ghonii и ингибитор ангиогенеза опухоли.

[011] Согласно настоящему изобретению, предпочтительно, Clostridium ghonii может быть штаммом Clostridium ghonii MW-DCG-LCv-26 или штаммом, полученным после одомашнивания Clostridium ghonii; Clostridium ghonii MW-DCG-LCv-26 депонирован в Национальном институте измерений Австралии под номером депонирования V12/001486; и штамм, полученный после одомашнивания Clostridium ghonii, включает бактериальный штамм MW-DCG-HNCv-18 или бактериальный штамм MW-DCG-CCv-17. Штамм MW-DCG-HNCv-18 депонирован в Национальном институте измерений Австралии под номером депонирования V12/001485; и штамм MW-DCG-CCv-17 депонирован в Национальном институте измерений Австралии под номером депонирования V12/001487.

[012] Согласно настоящему изобретению Clostridium ghonii предпочтительно может находиться в форме спор.

[013] Согласно настоящему изобретению, предпочтительно, ингибитор ангиогенеза опухоли может представлять собой один из или комбинацию из двух или более ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из апатиниба (Aitan), сунитиниба, пазопаниба, бевацизумаба, рамуцирумаба, конберцепта, афлиберцепта, сорафениба и регорафениба.

[014] Согласно настоящему изобретению, предпочтительно, активный компонент Clostridium ghonii и ингибитор ангиогенеза опухоли могут вводиться последовательно или одновременно.

[015] Согласно настоящему изобретению, предпочтительно, каждые 1×10⁷ КОЕ лиофилизированного порошка спор Clostridium ghonii можно комбинировать с Aitan в оптимальной дозе 60 мг/кг/сут.

[016] Согласно настоящему изобретению, предпочтительно, опухоль может включать, но не ограничиваться, рак толстой кишки, карциному легких Льюиса, рак носоглотки, немелкоклеточный рак легкого, фибросаркому, меланому и т.д.

[017] В настоящем изобретении ингибитор ангиогенеза опухоли может быть использован в произвольной комбинации. Споры Clostridium ghonii должны быть чистыми, то есть не содержать других бактерий, и ингибитор ангиогенеза опухоли также должен быть стерильным. Споры Clostridium ghonii получают и очищают в соответствии с существующим в данной области способом для получения препарата, отвечающего соответствующим стандартам качества.

[018] Преимущества

[019] 1. В настоящем изобретении впервые обнаружен более безопасный и узконаправленный Clostridium ghonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли для эффективного предотвращения опухолей.

[020] 2. Впервые обнаружено, что Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой ингибитора ангиогенеза опухоли уменьшает инфильтрацию М2-подобных макрофагов, миелоидных супрессорных клеток и т.п. в опухолях, снижает количество TGFβ в опухолях и эффект ингибирования противоопухолевого иммунного ответа в микроокружении опухоли. Между тем, сочетание с низкой дозой ингибитора ангиогенеза опухоли может способствовать инфильтрации в опухоли иммунных клеток, таких как Т-клеток CD8⁺, CD3⁺ и F4/80⁺, улучшает иммунное микроокружение в опухолях и усиливает противоопухолевый лечебный эффект.

[021] 3. Настоящее изобретение определяет оптимальную дозу ингибитора ангиогенеза опухоли в сочетании с Clostridium ghonii.

[022] 4. Clostridium gonii в сочетании с ингибитором ангиогенеза опухоли можно использовать при поздних стадиях злокачественных солидных опухолей. Clostridium Ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (апатиниба) снижает эффект ингибирования противоопухолевого иммунного ответа в микроокружении опухоли, переводит иммуносупрессивное состояние микроокружения опухоли в иммуноактивированное состояние и эффективно предотвращает опухоли. Уникальный эффект лечения обусловлен изменением противоопухолевого иммунного микроокружения вместо создания бескислородной среды для размножения Clostridium ghonii с помощью высокой дозы Aitan для усугубления гипоксии опухоли.

[023] 5. Композиция по настоящему изобретению является более безопасной и более узконаправленной при лечении опухолей, может прорастать только в гипоксической среде опухоли, но не может прорастать в бактерии в неопухолевой гипоксической среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[024] ФИГ. 1 - гистограмма, показывающая чистую массу тела в примере 2;

[025] На ФИГ. 2A-2B показано окрашивание ТТС тканей при инфаркте головного мозга в примере 2;

[026] На ФИГ. 3A-3D показано окрашивание по Граму срезов ткани в примере 2;

[027] На ФИГ. 4 показано окрашивание ТТС тканей при инфаркте миокарда в примере 2;

[028] На ФИГ. 5 показано окрашивание по Граму срезов ткани в примере 2;

[029] ФИГ. 6 - гистограмма, показывающая чистую массу тела подопытных мышей в примере 3;

[030] ФИГ. 7 - график кривой, показывающий объем опухоли у подопытных мышей в примере 3;

[031] ФИГ. 8 - гистограмма, показывающая вес опухоли у подопытных мышей в примере 3;

[032] На ФИГ. 9A-9H представлены анатомические схемы опухолей у подопытных мышей в примере 3;

[033] На ФИГ. 10A-10C показано соотношение инфильтрирующих Т-клеток в опухолевых тканях в примере 4;

[034] На ФИГ. 11A-11B показана экспрессия цитокинов Т-клеток в опухолевых тканях;

[035] На ФИГ. 12A-12D показана экспрессия цитокинов в опухолях мышей в примере 4;

[036] На ФИГ. 13A-13B и ФИГ. 14 показано соотношение миелоидных супрессорных клеток и опухоль-ассоциированных макрофагов в опухолях мышей в примере 4; и

[037] ФИГ. 15A-15D и ФИГ. 16A-16C представляют собой изображения опухолевых тканей мыши с иммуногистохимическим окрашиванием и график, показывающий долю клеток CD163 в примере 4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[038] Настоящее изобретение подробно описано ниже в сочетании с конкретными примерами. Описанные примеры являются лишь частью технических решений, перечисленных в настоящем изобретении для удобства восприятия. Эти примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают объем защиты настоящего изобретения. Объем защиты настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

[039] Пример 1

[040] Материалы и методы

[041] Лиофилизированный порошок спор Clostridium ghonii

[042] Лиофилизированный порошок спор Clostridium ghonii для инъекций: штамм MW-DCG-LCv-26 был депонирован в Национальном институте измерений Австралии под номером депонирования V12/001486 и серийным номером 202003001-1 и разработан компанией Shandong Xinchuang Biotechnology Co., Ltd. Лиофилизированный порошок спор Clostridium ghonii для инъекций был приготовлен из спор Clostridium ghonii в качестве активного компонента и 1% сахарозы в качестве вспомогательного материала и был получен методом лиофилизации: замораживание при -40°C в течение 4 ч, вакуумирование при -35°С в течение 10 мин; и лиофилизация при -30°С в течение 10 мин, -25°С в течение 10 мин, -20°С в течение 26 ч, -15°С в течение 2 ч, -10°С в течение 10 мин, -5°С в течение 10 мин, 0°C в течение 10 мин, 10°C в течение 2 ч, 15°C в течение 10 мин, 20°C в течение 3 ч и 27°C в течение 3 ч, и имел параметр 1×10⁸ КОЕ/флакон; лиофилизированный порошок эталонного вещества имел серийный номер: 201910002F и был разработан компанией Shandong Xinchuang Biotechnology Co., Ltd. и приготовлен из 1 мл 1% раствора сахарозы путем вышеуказанной процедуры лиофилизации; 0,9% хлорид натрия для инъекций имел серийный номер 2005062146 и был коммерчески доступен в CISEN Pharmaceutical Co., LTD.; и стерильная вода для инъекций имела серийный номер 1902212162 и была коммерчески доступна в CISEN Pharmaceutical Co., LTD.

[043] Клеточная линия и культура клеток

[044] Клетки рака толстой кишки CT26.WT имели номер 3131C0001000800037 и были депонированы в Центре клеточных ресурсов Шанхайского института биологических наук Китайской академии наук. Эмбриональная бычья сыворотка специального сорта в объемном проценте 10% (после низкотемпературного оттаивания в сыворотке могут присутствовать плавающие вещества, сыворотку центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин для удаления плавающих веществ) и смесь пенициллина со стрептомицином в объемном проценте 1,1% добавили в основную среду RPMI Medium 1640 для полного и равномерного перемешивания, клетки ресуспендировали, клеточную суспензию инокулировали в колбу для культивирования клеток площадью 75 см², в каждую колбу добавили по 25 мл среды для культивирования клеток и поместили клетки в клеточный инкубатор с 5% CO₂ для статического культивирования при 37°C.

[045] Реагент

[046] Основная среда RPMI Medium 1640 была приобретена у компании Gibco, эмбриональная бычья сыворотка специального сорта и смесь пенициллина со стрептомицином были приобретены у компании BI, Aitan (апатиниб) был приобретен у компании Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd., и споры Clostridium ghonii были получены и очищены в соответствии с существующим в данной области способом для получения препарата, отвечающего соответствующим стандартам качества.

[047] Создание моделей

[048] Мышам линии BALB/c подкожно инокулировали опухолевые клетки CT26 для создания подкожной модели опухоли рака толстой кишки. 0,2 мл клеточной суспензии с концентрацией 7,5×10⁶ клеток/мл (приемлемый диапазон: 6,75×10⁶ клеток/мл - 8,25×10⁶ клеток/мл) экстрагировали одноразовым стерильным шприцем объемом 1 мл и медленно подкожно вводили в подмышечные впадины правых передних конечностей мышей (предварительно стерилизованных 75% спиртом). После инъекции ушки игл аккуратно прижимали сухими ватными шариками.

[049] Наблюдение и осмотр

[050] Клиническое наблюдение: в течение периода введения невооруженным глазом наблюдали за поведением животных, их смертью или предсмертным состоянием и т.д. один раз утром и днем.

[051] Измерение опухоли: максимальный продольный диаметр (L) и максимальный поперечный диаметр (W) опухоли (включая толщину кожи мыши) измеряли штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали по формуле .

[052] Масса тела: в течение периода введения массу тела измеряли в день измерения опухоли со дня начала лечения.

[053] Вес опухоли: опухолевую ткань иссекали и взвешивали, записывали вес опухоли.

[054] Степень ингибирования опухоли (IR_TW%)=(средний вес опухоли контрольной группы-средний вес опухоли экспериментальной группы)/средний вес опухоли контрольной группы×100%.

[055] Анализ методом проточной цитометрии

[056] Опухоли и селезенки в модели рака толстой кишки собирали в соответствующее время и расщепляли при 37°C в течение 1 ч в среде DMEM, содержащей коллагеназу IV типа (1 мг/мл, Sigma), гиалуронидазу (1 мг/мл, Sigma) и ДНКазу I (20 ед./мл, Sigma). Собирали отдельные опухолевые клетки и клетки селезенки. Выделенные отдельные клетки по отдельности промывали фосфатно-буферным солевым раствором (PBS), содержащим 2% фетальную сыворотку телят (FCS), и окрашивали поверхность соответствующим антителом. После тщательной промывки клеток данные получали с помощью прибора BD FACS Calibur (производитель: Becton Dickinson). Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программы NovoExpress™ (производитель: ACEA Biosciences, Inc.).

[057] Определение цитокинов с помощью Multi-ELISA

[058] У подопытных мышей собирали периферическую кровь и опухолевые ткани. Оценивались такие цитокины, как IL-10, TNF-α, GM-CSF и TGFβ. Набор Multi-ELISA был приобретен у компании Qiagen (Австралия), и эксперимент проводился в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору.

[059] Результаты ИФА считывали при 450 нм на микропланшетах для ИФА (96-луночный микропланшет Polarstar Omega BMG Labtech GmBH, Германия).

[060] Окрашивание TTC

[061] После быстрого замораживания опухолевой ткани в жидком азоте ткань равномерно разрезали на 5 срезов одинаковой толщины с помощью микротомного ножа. Срезы опухолевой ткани помещали на предметные стекла, по каплям добавляли 2% раствор TTC, чтобы покрыть срезы ткани, проводили реакцию в темноте в течение 30 мин и фотографировали с помощью цифровой камеры.

[062] Иммуногистохимическое окрашивание

[063] Опухолевую ткань быстро фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, фиксированную ткань заливали в парафин и делали срезы с ткани, залитой в парафин. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали. Срезы инкубировали в 3% деионизированной воде H₂O₂ в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте для блокировки активности эндогенной пероксидазы и промывали фосфатно-буферным солевым раствором 3 раза по 5 мин каждый раз. Срезы погружали в восстанавливающий раствор ЭДТА (1×) и нагревали до закипания в СВЧ-печи, отключали питание, восстанавливали срезы 1-2 раза с интервалом 5-10 мин и охлаждали. На срезы по каплям добавляли 5% блокирующий раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA), срезы инкубировали при 37°C в течение 30 мин и высушивали в центрифуге. На срезы по каплям добавляли тщательно разведенные первичные мышиные моноклональные антитела к CD163 и HIF-1α, и срезы инкубировали при 37°C в течение 1-2 ч или при 4°C в течение ночи. Срезы промывали 3 раза фосфатно-буферным солевым раствором по 5 мин каждый раз. На срезы по каплям добавляли меченное биотином вторичное антитело козы к IgG кролика и инкубировали срезы при 37°C в течение 30 мин. Срезы промывали 3 раза фосфатно-буферным солевым раствором по 5 мин каждый раз. SABC добавляли по каплям на срезы и срезы инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Срезы промывали 3 раза фосфатно-буферным солевым раствором по 5 мин каждый раз. По 1 капле хромогенных реагентов A, B и C добавляли в 1 мл дистиллированной воды для равномерного перемешивания, полученную смесь наносили на срезы образцов для проявления в течение 1-10 мин и промывали дистиллированной водой для завершения реакции. Проводили контрастное окрашивание гематоксилином. Окрашенные срезы обезвоживали до прозрачности. После закрепления нейтральной смолой срезы просматривали под микроскопом.

[064] Окрашивание по Граму срезов опухолевой ткани

[065] Опухолевую ткань быстро фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, фиксированную ткань заливали в парафин и делали срезы с ткани, залитой в парафин. Срезы подвергали термической обработке в течение 30 мин, обработанные срезы пропитывали ксилолом I в течение 5 мин, ксилолом II в течение 5 мин, 100% этанолом I в течение 2 мин, 95% этанолом I в течение 2 мин и 80% этанолом I в течение 2 мин, затем пропитанные срезы промывали проточной водой и высушивали на воздухе; срезы покрывали реактивом Грама I на 1 мин и промывали проточной водой, покрывали реактивом Грама II на 1 мин и промывали проточной водой, покрывали реактивом Грама III примерно на 20 с и промывали проточной водой, окрашивали эозином на примерно 20 с и промывали проточной водой; срезы пропитывали 95% этанолом II в течение 30 с, 95% этанолом III в течение 1 мин, 100% этанолом II в течение 2 мин, ксилолом III в течение 3 мин и ксилолом IV в течение 3 мин, затем пропитанные срезы закрепляли нейтральной смолой и просматривали.

[066] Количественный анализ Clostridium ghonii

[067] РНК из ткани выделяли методом Trizol и проводили обратную транскрипцию РНК в кДНК с помощью набора реагентов PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time). кДНК использовали в качестве матрицы, а для определения Clostridium ghonii использовали специфические праймеры для тиоредоксина Clostridium ghonii. Последовательности праймеров были следующими:

[068] Тиоредоксин Trx Прямой праймер (идентификационный номер последовательности: 1): 5'-AATACAGGGAATTTTAGAGGTGCAG-3'

[069] Тиоредоксин Обратный праймер (идентификационный номер последовательности: 2): 5'-GCTAACATCTTACAAGGCCCACA-3'

[070] Статистический анализ

[071] Статистический анализ проводился с помощью двустороннего t-критерия или критерия Манна-Уитни с использованием программного решения Prism 6.0 (производитель: Graphpad Software, SanDiego). р<0,05 указывает на то, что разница статистически значима.

[072] Пример 2

[073] Высокая безопасность и узкая направленность использования Clostridium ghonii в моделях солидной опухоли

[074] Создание моделей

[075] Была создана подкожная модель ксенотрансплантата при раке толстой кишки. На крысах линии Спрег-Доули была создана модель окклюзии средней мозговой артерии (MCAO). На мышах линии C57BL/6 была создана модель острого инфаркта миокарда (ИМ).

[076] Группировка животных

[077] В день скрининга животных-опухоленосителей для эксперимента отбирали подопытных животных с объемом опухоли 0,35-0,60 см³. Отобранные подходящие животные были случайным образом разделены на 4 группы путем жеребьевки: контрольная группа внутривенного введения, контрольная группа внутриопухолевого введения, группа внутривенного введения спор Clostridium ghonii, группа внутриопухолевого введения спор Clostridium ghonii, по 8 мышей в каждой группе.

[078] В модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у крыс линии Спрег-Доули крысы были случайным образом разделены на 4 группы: контрольная группа здоровых крыс, контрольная группа модели инфаркта головного мозга, группа внутривенного введения модели инфаркта головного мозга, группа внутричерепного введения модели инфаркта головного мозга, по 5 крыс в каждой группе.

[079] В модели острого инфаркта миокарда (ИМ) у мышей линии C57BL/6 мыши были случайным образом разделены на 3 группы: группа окрашивания ТТС модели инфаркта миокарда, контрольная группа модели инфаркта миокарда и группа введения в хвостовую вену модели инфаркта миокарда, по 5 мышей в каждой группе.

[080] Введение

[081] Модель рака толстой кишки: мышам внутриопухолево вводили споры в дозе 1×10⁷ КОЕ/опухоль/раз в группе внутриопухолевого введения спор Clostridium ghonii и такой же объем инъекции хлорида натрия в массовой/объемной процентной концентрации 0,9% в контрольной группе внутриопухолевого введения; и мышам через хвостовую вену вводили споры в дозе 1×10⁸ КОЕ/опухоль/раз в группе внутривенного введения спор Clostridium ghonii и такой же объем инъекции хлорида натрия в массовой/объемной процентной концентрации 0,9% в контрольной группе внутривенного введения.

[082] Модель окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у крыс линии Спрег-Доули: доза при введении в хвостовую вену составляла 5×10⁷ КОЕ, доза при внутричерепном введении - 1×10⁶ КОЕ.

[083] Модель острого инфаркта миокарда (ИМ) у мышей линии C57BL/6: доза при введении в хвостовую вену составляла 2×10⁷ КОЕ.

[084] Наблюдение и осмотр

[085] Во время эксперимента на модели рака толстой кишки наблюдали за смертью или предсмертным состоянием, поведением и массой тела мышей.

[086] Для модели MCAO и модели ИМ ткани головного мозга и ткани сердца брали отдельно для окрашивания ТТС, кПЦР Clostridium ghonii, обнаружения культуры спор, а срезы тканей окрашивали по Граму на Clostridium ghonii.

[087] Результаты

[088] В ходе эксперимента все мыши, подвергнутые внутриопухолевому или внутривенному введению в модели рака толстой кишки, были живы. Не было существенной разницы в чистой массе тела мышей в группах введения спор Clostridium ghonii по сравнению с контрольными группами (ФИГ. 1).

[089] В эксперименте на модели MCAO ткани головного мозга крыс в контрольной группе здоровых крыс, контрольной группе модели инфаркта головного мозга, группе внутривенного введения модели инфаркта головного мозга, группе внутричерепного введения модели инфаркта головного мозга подвергали окрашиванию ТТС. Окрашивание ТТС показало, что срезы ткани головного мозга здоровых крыс были красными, а часть участка ткани головного мозга крыс, перенесших инфаркт головного мозга, была бледно-белой на срезах ткани головного мозга крыс в модели MCAO (ФИГ. 2A и ФИГ. 2B).

[090] Обнаружение Clostridium gonii и спор проводилось в тканях головного мозга в эксперименте на модели MCAO. Споры Clostridium ghonii были обнаружены в тканях головного мозга при инфаркте головного мозга, но Clostridium ghonii не были обнаружены после однократного введения в хвостовую вену спор Clostridium ghonii для инъекций и однократного внутричерепного введения спор Clostridium ghonii для инъекций.

[091] Ткани головного мозга были срезаны и окрашены по Граму. Окрашенные срезы ткани головного мозга крыс в каждой группе сканировали с помощью системы цифровой патологии для обнаружения распространения Clostridium ghonii. В срезах опухолевой ткани с Clostridium ghonii (позитивный контроль) после окрашивания по Граму были обнаружены короткие палочковидные и сине-фиолетовые Clostridium ghonii (ФИГ. 3A); в срезах опухолевой ткани без Clostridium ghonii (негативный контроль) после окрашивания по Граму не было обнаружено Clostridium ghonii (ФИГ. 3B); и Clostridium ghonii не было обнаружено в срезах ткани головного мозга при инфаркте головного мозга после однократного введения в хвостовую вену спор Clostridium ghonii и однократного внутричерепного введения спор Clostridium ghonii после окклюзии артерии головного мозга крыс (ФИГ. 3C и ФИГ. 3D).

[092] Окрашивание ТТС показало, что ткань миокарда мышей в группе окрашивания ТТС модели ИМ была белой, что указывает на то, что мыши в модели ИМ страдали от очевидного инфаркта (ФИГ. 4). Споры Clostridium ghonii были обнаружены в тканях миокарда при инфаркте миокарда, но Clostridium ghonii не были обнаружены после однократного введения спор Clostridium ghonii в хвостовую вену для инъекции мышам в модели ИМ.

[093] Ткани сердца были срезаны и окрашены по Граму. Окрашенные срезы ткани сердца мышей в каждой группе сканировали с помощью системы цифровой патологии для обнаружения распространения Clostridium ghonii. Короткие палочковидные и сине-фиолетовые Clostridium ghonii были обнаружены в срезах опухолевой ткани позитивной контрольной группы после окраски по Граму (ФИГ. 3A); в срезах опухолевой ткани негативной контрольной группы после окрашивания по Граму не было обнаружено Clostridium ghonii (ФИГ. 3B); и Clostridium ghonii не было обнаружено в тканях миокарда при инфаркте миокарда после однократного введения в хвостовую вену спор Clostridium ghonii для инъекций мышам в модели ИМ (ФИГ. 5).

[094] Пример 3

[095] Противоопухолевый эффект спор Clostridium ghonii в сочетании с различными дозами Aitan на мышиной модели CT26

[096] Подходящие мыши (объем опухоли 0,31-0,41 см³) были случайным образом разделены на 8 групп путем жеребьевки: контрольная группа, группа спор, группа высокой дозы Aitan, группа средней дозы Aitan, группа низкой дозы Aitan, группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan, группа Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan и группа Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan.

[097] Контрольная группа: мышам внутриопухолево вводили тот же объем 0,9% хлорида натрия для инъекций;

[098] группа спор: мышам дважды внутриопухолево вводили дозу 1×10⁷ КОЕ/опухоль/раз;

[099] Группа высокой дозы Aitan: мышам вводили через зонд дозу 180 мг/кг/сут один раз в день в общей сложности 7 раз;

[0100] Группа средней дозы Aitan: мышам вводили через зонд дозу 120 мг/кг/сут один раз в день в общей сложности 7 раз;

[0101] Группа низкой дозы Aitan: мышам вводили через зонд дозу 60 мг/кг/сут один раз в день в общей сложности 7 раз; и

[0102] Группы Clostridium ghonii в сочетании с Aitan: мышам сначала внутриопухолево вводили Aitan один раз в день в течение 3 дней, а затем - споры Clostridium ghonii в дозе 1×10⁷ КОЕ/опухоль/раз один раз в два дня, в общей сложности два раза. Доза Aitan в группах в сочетании с высокой, средней и низкой дозой Aitan была такой же, как и в группах высокой, средней и низкой дозы Aitan.

[0103] Результаты

[0104] В течение периода лечения в каждой группе не было случаев смерти или предсмертного состояния мышей. До начала лечения не было значительной разницы в массе тела мышей в каждой группе (все р>0,05). Не было существенной разницы в чистой массе тела мышей в каждой группе по сравнению с контрольной группой (все р>0,05). Чистая масса тела мышей-опухоленосителей показана в таблице 1 и на ФИГ. 6.

[0105] Таблица 1. Чистая масса тела подопытных мышей

[0106]

Группа Контрольная группа (n=7) Группа только спор (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (n=7) Группа низкой дозы Aitan (n=7) Чистая масса тела (г) 17,66±1,22 16,06±1,01 16,16±1,74 18,32±1,12 Группа Группа Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan (n=7) Группа средней дозы Aitan (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (n=7) Группа высокой дозы Aitan (n=7) Чистая масса тела (г) 17,18±0,78 18,02±1,61 16,12±0,72 18,44±1,42

[0107] Примечание: n - количество подопытных животных в каждой группе, а чистая масса тела мышей - масса тела мышей после иссечения мышей-опухоленосителей. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение.

[0108] До начала лечения не было обнаружено существенной разницы в объеме опухоли у мышей-опухоленосителей в каждой группе (у всех p>0,05). По окончании введения, по сравнению с контрольной группой, объем опухоли у мышей в группе только спор, группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan и группе Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan был значительно меньше, чем у мышей в контрольной группе (p=0,045, p=0,000 и p=0,026). Объем опухоли у мышей-опухоленосителей представлен в таблице 2 и на ФИГ. 7.

[0109] Таблица 2. Объем опухоли у мышей-опухоленосителей

[0110]

День Контрольная группа (мм³) (n=7) Группа только спор (мм³) (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (мм) (n=7) Группа низкой дозы Aitan (мм) (n=7) Д-1 996,37±130,93 1023,59±200,27 1026,03±97,91 931,50±97,91 Д-4 1606,25±291,83 1584,84±401,26 1669,35±504,54 1489,82±232,84** Д-8 2813,11±416,55 1982,64±533,59* 1025,99±676,02 2275,35±348,84 День Контрольная группа (мм³) (n=7) Группа только спор (мм³) (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (мм³) (n=7) Группа низкой дозы Aitan (мм³) (n=7) Д-1 968,47±198,03 892,74±156,30 865,43±198,95 1049,42±166,37 Д-4 1573,97±357,26 1698,84±177,49 1566,05±359,30 1499,45±303,10 Д-8 1880,47±279,87* 2615,77±351,13 2160,22±704,11 2442,80±882,95

[0111] Примечание: n - количество подопытных животных в каждой группе. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. По сравнению с контрольной группой ^*p<0,05 и ^**p<0,01.

[0112] Вес опухоли в группе только спор, группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan, группе Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan и группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan был значительно ниже, чем в контрольной группе (p = 0,000, p =0,000, р=0,000 и р=0,000). Вес опухоли у мышей в каждой группе показан в таблице 3 и на ФИГ. 8.

[0113] Таблица 3. Вес опухоли

[0114]

Группа Контрольная группа (n=7) Группа только спор (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (n=7) Группа низкой дозы Aitan (n=7) Вес опухоли (г) 4,45±0,92 2,72±0,48** 1,33±0,84** 3,55±0,61 Группа Группа Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan (n=7) Группа средней дозы Aitan (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (n=7) Группа высокой дозы Aitan (n=7) Вес опухоли (г) 2,46±0,41** 3,84±0,69 2,58±0,76** 3,49±0,86

[0115] Степень ингибирования опухоли рассчитывалась в зависимости от веса опухоли. Степень ингибирования опухоли в каждой группе была следующей: Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan > Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan > Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan > группа только спор > группа высокой дозы Aitan > группа низкой дозы Aitan > группа средней дозы Aitan, как показано в таблице 4. Анатомические фотографии опухолей представлены на ФИГ. 9А-9Н.

[0116] Таблица 4. Степень ингибирования опухоли

[0117]

Группа Контрольная группа (n=7) Группа только спор (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (n=7) Группа низкой дозы Aitan (n=7) Антибактериальный показатель (%) / 38,97 70,07 20,21 Группа Группа Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan (n=7) Группа средней дозы Aitan (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (n=7) Группа высокой дозы Aitan (n=7) Антибактериальный показатель (%) 44,70 13,89 42,12 21,68

[0118] 28,6% опухолей у мышей в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan были полностью устранены, и в конце эксперимента не наблюдалось роста опухолей. У мышей в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan коэффициент эффективности лечения был значительно выше, чем у мышей в группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (14,3%) и группе Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan (14,3%). Однако опухоли не были устранены в группе высокой, средней и низкой дозы Aitan и в группе только спор, и коэффициент эффективности лечения в этих группах составил 0%. Как видно из таблицы 5, Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan продемонстрировали значительный противоопухолевый эффект, который был значительно лучше, чем у других групп.

[0119] Таблица 5. Коэффициент эффективности лечения

[0120]

Группа Контрольная группа (n=7) Группа только спор (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (n=7) Группа низкой дозы Aitan (n=7) Коэффициент эффективности лечения (%) 0 0 28,6 0 Группа Группа Clostridium ghonii в сочетании со средней дозой Aitan (n=7) Группа средней дозы Aitan (n=7) Группа Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (n=7) Группа высокой дозы Aitan (n=7) Коэффициент эффективности лечения (%) 14,3 0 14,3 0

[0121] Из приведенных выше результатов видно, что лечение каждой дозой оказало ингибирующий эффект на рост опухоли, а Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan оказали наиболее очевидный противоопухолевый эффект. Комбинированное лечение спорами Clostridium ghonii и антиангиогенным ингибитором, таким как Aitan, показало сверхаддитивный эффект, а Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan оказали лучший противоопухолевый эффект.

[0122] Пример 4

[0123] Изучение механизма противоопухолевого действия Clostridium ghonii в сочетании с высокой и низкой дозой Aitan

[0124] Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan оказывали явно лучший противоопухолевый эффект, чем Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan. Изучен механизм противоопухолевого действия Clostridium ghonii в сочетании с высокой и низкой дозой Aitan.

[0125] Опухолевые ткани мышей, получавших лечение в контрольной группе, группе только спор, группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan и группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan были взяты отдельно и подвергнуты проточной цитометрии с помощью проточного цитометра. По сравнению с контрольной группой, доля инфильтрирующих опухоль Т-клеток D45⁺CD3⁺, CD45⁺CD3⁺CD8⁺ и клеток F4/80⁺ в опухолевых тканях была значительно увеличена в группе только спор, группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan и группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan; и по сравнению с группой только спор, доля инфильтрирующих опухоль Т-клеток CD45⁺CD3⁺, CD45⁺CD3⁺CD8⁺ и клеток F4/80⁺ в опухолевых тканях была значительно увеличена в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan, но не показала существенной разницы в группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (ФИГ. 10A-10C).

[0126] Экспрессию цитокинов Т-клеток в опухолях исследовали методом внутриклеточного окрашивания. По сравнению с группой только спор, T-клетки CD3⁺ IL-10⁺ и CD3⁺ IFN-γ⁺ в опухолях были значительно увеличены в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan (p<0,05), в то время как Т-клетки CD3⁺ IL-10⁺ и CD3⁺ IFN-γ⁺ не показали существенных изменений в группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (ФИГ. 11A-11B).

[0127] Внутриопухолевые цитокины, такие как IL-10, TNF-α, GM-CSF и TGFβ, обнаруживали с помощью Multi-ELISA. По сравнению с контрольной группой, уровень IL-10, TNF-α и GM-CSF был повышен в группе только спор, группе Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan и группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan. По сравнению с другими группами, экспрессия TGFβ в опухолях группы Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan была значительно снижена (ФИГ. 12A-12D). Как видно, онколиз Clostridium ghonii может индуцировать экспрессию цитокинов и хемокинов в микроокружении опухоли. В то же время Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan может значительно снизить экспрессию TGFβ и ослабить иммуносупрессивное микроокружение опухоли. Но сочетание с высокой дозой Aitan не оказало явного ингибирующего эффекта на экспрессию TGFβ.

[0128] Количество миелоидных супрессорных клеток и опухоль-ассоциированных макрофагов в опухолях анализировали методом проточной цитометрии. По сравнению с контрольной группой количество внутриопухолевых мононуклеарных миелоидных супрессорных клеток CD11b⁺ Ly6G^- Ly6C^high (Mo-MDSC) и полиморфноядерных миелоидных супрессорных клеток CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^low (PMN-MDSC) существенно не отличалось в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan. По сравнению с группой Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan, в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan количество Mo-MDSC и PMN-MDSC было снижено (ФИГ. 13A-13B). Кроме того, доля опухоль-ассоциированных макрофагов CD11b⁺ F4/80⁺ в общем количестве жизнеспособных клеток была значительно снижена в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan по сравнению с другими группами лечения (ФИГ. 14). CD163⁺ (маркер М2-подобных макрофагов) в опухолях выявляли с помощью ИГХ-окрашивания. Результаты показали, что количество CD163⁺ клеток в опухолях группы Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan уменьшилось, что указывает на то, что Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan может эффективно снижать количество опухоль-ассоциированных макрофагов в опухолях (ФИГ. 15A-15D).

[0129] Иммуногистохимическое окрашивание антителами к HIF-1α опухолевых тканей показало, что по сравнению с контрольной группой гипоксия была значительно снижена в опухолевых тканях группы Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan, но увеличена в опухолевых тканях группы Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan (ФИГ. 16A-16C). Результаты показали, что высокая доза Aitan усугубляла гипоксию опухолевых тканей. Несмотря на создание гипоксической среды, способствующей размножению Clostridium ghonii, противоопухолевый эффект группы Clostridium ghonii в сочетании с высокой дозой Aitan был ниже, чем у группы Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan. Однако, хотя гипоксия опухоли в группе Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan была значительно снижена, рост опухоли теоретически мог быть ускорен, но объем опухоли показал, что рост опухоли был значительно подавлен.

[0130] В заключение следует отметить, что Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan может способствовать инфильтрации Т-клеток CD45⁺CD3⁺, CD45⁺CD3⁺CD8⁺, клеток F4/80⁺ и других иммунных клеток, индуцирует повышенную экспрессию интерферона гамма IFN-γ, TNF-α, GM-CSF и других цитокинов и хемокинов, эффективно снижает экспрессию TGFβ в опухолевых тканях и количество иммуносупрессивных агентов опухоль-ассоциированных макрофагов, миелоидных супрессорных клеток и т.д., а также снижает иммуносупрессию. Как видно, Clostridium ghonii в сочетании с низкой дозой Aitan высокоэффективно предотвращает развитие опухолей, вызывая нормализацию сосудов в опухолях, переводит иммуносупрессивное состояние микроокружения опухоли в иммуноактивированное состояние. Уникальный эффект лечения обусловлен изменением противоопухолевого иммунного микроокружения вместо создания бескислородной среды для размножения Clostridium ghonii с помощью высоких доз Aitan для усугубления гипоксии опухоли.

[0131] Хотя в приведенном выше примере подробно описано настоящее изобретение, он является лишь частью, а не всеми примерами настоящего изобретения. Другие примеры также могут быть получены специалистами на основе примера без участия творческого труда, и все эти примеры будут подпадать под объем защиты настоящего изобретения.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="GWPCTP20231209372_seqlist.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-03-22">

<ApplicantFileReference>GWPCTP20231209372</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>CN202111177878.9</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2021-10-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="en">SHIHUIDA PHARMACEUTICAL GROUP

(JILIN) CO., LTD.</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="en">USE OF CLOSTRIDIUM GHONII IN

COMBINATION WITH TUMOR ANGIOGENESIS INHIBITOR</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Trx Forward primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatacagggaattttagaggtgcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Trx Reverse primer</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctaacatcttacaaggcccaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к способу лечения опухоли толстой кишки. Предложен способ лечения опухоли толстой кишки, включающий введение штамма Clostridium gonii MW-DCG-LCv-26, депонированного в Национальном институте измерений Австралии под номером депонирования V12/001486, в сочетании с апатинибом. При этом Clostridium ghonii находится в форме спор, субъекту внутриопухолево вводят апатиниб один раз в день в течение 3 дней, а затем – споры Clostridium ghonii в дозе 1×10⁷ КОЕ/опухоль/раз один раз в два дня, в общей сложности два раза. При этом апатиниб вводят через зонд в дозе 60 мг/кг/сут, или 120 мг/кг/сут, или 180 мг/кг/сут. Изобретение обеспечивает ингибирование роста опухоли в модели рака толстой кишки, снижение иммуносупрессивного состояния микроокружения опухоли. 5 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Способ лечения опухоли толстой кишки, отличающийся тем, что штамм Clostridium gonii MW-DCG-LCv-26 вводят в сочетании с апатинибом;

Clostridium ghonii находится в форме спор; субъекту внутриопухолево вводят апатиниб один раз в день в течение 3 дней, а затем – споры Clostridium ghonii в дозе 1×10⁷ КОЕ/опухоль/раз один раз в два дня, в общей сложности два раза; и

апатиниб вводят через зонд в дозе 60 мг/кг/сут, или 120 мг/кг/сут, или 180 мг/кг/сут, при этом штамм Clostridium ghonii MW-DCG-LCv-26 депонирован в Национальном институте измерений Австралии под номером депонирования V12/001486.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активные компоненты Clostridium ghonii и апатиниб вводят последовательно или одновременно.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждые 1×10⁷ КОЕ Clostridium ghonii в споровой форме сочетают с апатинибом в дозе 60 мг/кг/сут.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что Clostridium ghonii представляет собой лиофилизированный порошок спор Clostridium ghonii.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что применяют лиофилизированный порошок спор Clostridium ghonii, полученный из спор Clostridium ghonii в качестве активного компонента и 1% сахарозы в качестве вспомогательного материала методом лиофилизации: выдерживание при -40°С в течение 4 ч, вакуумирование и лиофилизация при -35°С в течение 10 мин, -30°С в течение 10 мин, -25°С в течение 10 мин, -20°С в течение 26 ч, -15°С в течение 2 ч, -10°С в течение 10 мин, -5°С в течение 10 мин, 0°С в течение 10 мин, 10°С в течение 2 ч, 15°С в течение 10 мин, 20°С в течение 3 ч и 27°С в течение 3 ч.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что лиофилизированный порошок спор Clostridium ghonii имеет параметр 1×10⁸ КОЕ/флакон.