Лиофилизированный биопрепарат дрожжей для экспресс-мониторинга степени загрязненности воды органическими веществами Российский патент 2025 года по МПК C12M1/00 C12Q1/02 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и биотехнологии, а именно к штаммам микробных клеток, применяемых в биосенсорных устройствах для мониторинга загрязнения водных экосистем.

Загрязнение окружающей среды, вызванное промышленной революцией, является серьезной проблемой. Биохимическое потребление кислорода (БПК) - это один из основных показателей для оценки уровня загрязнения воды органическими соединениями. Стандартный метод анализа БПК [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПК_полн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. -25 с.] является наиболее широко используемым методом измерения биоразлагаемых органических веществ в водах, но не подходит для быстрого обнаружения и онлайн-мониторинга вследствие длительного (минимум пять суток) инкубирования проб. Поэтому для оперативного анализа и предотвращения попадания потенциально загрязненных вод в окружающую среду целесообразно осуществлять экспресс-оценку качества сточных вод с использованием биосенсоров на основе микроорганизмов, иммобилизованных на электроде. Для получения достоверных результатов по степени загрязнения анализируемых проб воды применяемые микробные клетки в составе чувствительного элемента сенсора должны обладать стабильной активностью, легко культивироваться и иметь ферментативную систему, окисляющую широкий спектр органических соединений.

Известна полезная модель для экспресс-мониторинга БПК природных вод [Зайцева А.С., Юдина Н.Ю., Арляпов В.А., Пономарева О.Н., Алферов В.А. Устройство для экспресс-мониторинга индекса биохимического потребления кислорода. Патент РФ №164144 от 03 августа 2016], в которой в качестве чувствительного элемента используется влажная биомасса дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482, полученная отделением от культуральной жидкости центрифугированием и иммобилизованная на графито-пастовом электроде методом адсорбции с использованием полупроницаемой мембраны и резинового кольца для предотвращения вымывания микробных клеток в анализируемую пробу. Существенными недостатками данной системы являются:

- применение биоматериала во влажной форме, который сложно хранить без потери жизнеспособности;

- необходимо наличие микробиологической лаборатории с дорогостоящим оборудованием для поддержания и роста микробной культуры;

- при длительном периоде стабильной работы БПК-биосенсора без замены чувствительного элемента требуется проведение ежедневной калибровки сенсора.

Прототипом изобретения является БПК-биосенсор, представленный в работе [Ponamoreva O.N., Afonina E.L., Kamanina О.А. et al. Yeast Debaryomyces hansenii within ORMOSIL shells as a heterogeneous biocatalyst // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2018. - V. 54. - P. 736-742.]. Для формирования биосенсорной установки также применяется влажная биомасса дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482, однако для закрепления биоматериала на кислородном электроде используется метод иммобилизации в кремнийорганическую золь-гель матрицу. К недостаткам данного устройства следует отнести необходимость наличия оборудования и материалов для изготовления чувствительных элементов по разработанной технологии помимо специальной лаборатории для культивирования дрожжей и ежедневный мониторинг изменения окислительной активности биоматериала при продолжительной работе сенсора без замены чувствительного элемента.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является создание биопрепарата для формирования чувствительного элемента БПК-биосенсора, использование которого позволяет уйти от ежедневной калибровки сенсора за счет однократного применения биопрепарата без ухудшения эксплуатационных характеристик биосенсора, увеличение срока хранения биоматериала без потери жизнеспособности микробных клеток и упрощение процесса его иммобилизации на электроде.

Решение задачи состоит в том, что биопрепарат, используемый для формирования чувствительного элемента биосенсора для экспресс-мониторинга степени загрязненности воды органическими веществами, включает дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482, которые лиофилизированы и запаяны в герметичные флаконы в среде инертного газа.

Техническим результатом изобретения является разработка биопрепарата дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 в лиофилизированной форме как составляющей части одноразового чувствительного элемента БПК-биосенсора с сохранением жизнеспособности микробных клеток на постоянном уровне в течение длительного срока хранения (не менее двух лет).

Обезвоживание микроорганизмов в процессе лиофилизации приостанавливает биохимические процессы в микробных клетках, что обеспечивает их жизнеспособность в течение длительного периода времени. Однократное применение чувствительного элемента предотвратит возможную контаминацию биоматериала и изменение состава микроорганизмов на электроде, что позволит отказаться от ежедневной калибровки сенсора. Для закрепления лиофилизированного биопрепарата на поверхности электрода используется только полупроницаемая мембрана, что считается менее трудоемким процессом, не требующим применения дополнительных реагентов.

Дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 представляют собой клетки овальной и сфероидальной формы, размер которых составляет (2-2,2)×(7,2-8,6) мкм. На твердой среде культура дрожжей имеет серовато-белый цвет с глянцевыми или тусклыми, полосатыми или морщинистыми колониями, псевдомицелий обычно отсутствует или слабо развит.Способны окислять широкий спектр органических соединений и устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды [Arlyapov V.A., Yudina N.Y., Asulyan L.D. et al. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly (vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone // Enzyme and microbial technology. - 2013. - V. 53. - №4. - P. 257-262.].

Ниже приведен пример приготовления биопрепарата для экспресс-мониторинга степени загрязненности воды органическими веществами.

Дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 поддерживают в пробирках со скошенным сусло-агаром при 4°С. Для получения лиофилизированной биомассы микроорганизмов культивирование проводят в ферментере на 6 л среды следующего состава, г/л: дрожжевой пептон - 8, дрожжевой экстракт - 5, глюкоза - 10, сульфат аммония - 3, сульфат магния - 0,3, дигидрофосфат калия - 1, пеногаситель - 2. После концентрирования центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин и промывки 33 мМ калий-натрий-фосфатным буферным раствором (рН 6,8) клеточную биомассу смешивают с защитной средой (раствор, содержащий 1% сухого молока, 1% трегалозы и 2% глутамата) и замораживают в кюветах при минус 40°С. Лиофильную сушку проводят при начальной температуре от минус 55°С до минус 50°С и разрежении ~1,25 Па. Через 2,5-3 ч включают нагрев полок до 35°С. Продолжительность процесса сушки составляет 19-20 часов. Готовая сухая биомасса дрожжей представляет собой порошок серовато-белого цвета, который запаивают в герметичные флаконы в среде инертного газа (азот). Хранят при минус 20°С не менее двух лет.

Используют биопрепарат следующим образом. Для иммобилизации биопрепарата дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 на рабочей поверхности кислородного электрода помещают 5 мг сухой биомассы клеток и закрепляют их с помощью полупроницаемой мембраны резиновым кольцом на электроде. В качестве электрода используется кислородный электрод типа Кларка, являющийся основой коммерчески доступного экспресс-анализатора БПК «Эксперт-009», разработанного научным коллективом Тульского государственного университета совместно с научно-производственной фирмой ООО «Эконикс-Эксперт» и работающего в соответствии с аттестованной методикой экспресс-оценки БПК (МУ 09-16/001). Процедура подготовки к измерению заключается только в восстановлении активной формы дрожжей, находящихся в лиофилизированной форме, путем их регидратации в калий-натрий-фосфатном буферном (рН=6,8, концентрация солей 33 мМ) физиологическом (0,9% NaCl) растворе при постоянном перемешивании.

В присутствии органических примесей в анализируемой пробе у дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 на поверхности электрода усиливается дыхательная активность и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода. По увеличению скорости потребления кислорода оценивается степень загрязнения воды.

В таблице 1 представлены характеристики прототипов и БПК-биосенсора на основе заявляемой полезной модели для определения БПК в загрязненных водах. В характеристиках БПК-биосенсора на основе предложенного изобретения время работы сенсора без замены чувствительного элемента отсутствует, поскольку предполагает однократное применение созданного биопрепарата для проведения измерений.

Таким образом, использование лиофилизированного биопрепарата дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 с длительным сроком хранения позволяет получить чувствительные элементы для биосенсора на основе кислородного электрода с эксплуатационными характеристиками, не уступающими прототипам, при этом не требуется проведение ежедневной калибровки сенсора и значительно облегчается процесс иммобилизации биоматериала на электрод.

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и биотехнологии, а именно к штаммам микробных клеток, применяемых в биосенсорных устройствах для мониторинга загрязнения водных экосистем. Биопрепарат, используемый для формирования чувствительного элемента биосенсора для экспресс-мониторинга степени загрязненности воды органическими веществами, создан на основе дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482. Дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 лиофилизированы и запаяны в герметичные флаконы в среде инертного газа. Биопрепарат дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 в лиофилизированной форме, являющийся составляющей частью одноразового чувствительного элемента БПК-биосенсора, обеспечивает сохранение жизнеспособности микробных клеток на постоянном уровне в течение длительного срока хранения - не менее двух лет. 1 табл.

Биопрепарат, используемый для формирования чувствительного элемента биосенсора для экспресс-мониторинга степени загрязненности воды органическими веществами, на основе дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482, отличающийся тем, что дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 лиофилизированы и запаяны в герметичные флаконы в среде инертного газа.