Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований Российский патент 2023 года по МПК C12N15/10 C12Q1/68 C12P19/34 

Изобретение относится к способам выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ) и может быть использовано в области медицины и молекулярной биологии для индикации и идентификации нейровирулентных РНК-содержащих вирусов с применением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и других молекулярно-биологических методов.

Известно, что концентрация нейровирулентных вирусов в СМЖ может быть крайне низкой, что затрудняет индикацию и идентификацию возбудителя молекулярно-биологическими методами [1-5]. Применительно к диагностике энтеровирусной инфекции это приводит к необходимости детекции РНК возбудителя в фекалиях, что в свою очередь увеличивает вероятность ложноположительного результата из-за высокой распространенности бессимптомного носительства возбудителя [2]. Использование культуральных методов для повышения концентрации возбудителя применяется, но является длительным и трудоемким [1,5].

Выделение нуклеиновых кислот (НК) из образцов биоматериала включает следующие этапы: высвобождение (лизирование), сепарация (отделение НК от балластных веществ, включая механические примеси, белки и т.п.), очистка (удаление остаточных примесей) и (опционально) концентрирование [6].

Известные методы лизирования включают воздействие солей [7], хаотропных агентов (гуанидина тиоцианат), детергентов (натрия додецилсульфат), ферментов и физических факторов [8,9]. При этом гуанидина тиоцианат является предпочтительным средством лизирования для выделения РНК, поскольку обладает свойством инактивировать нуклеазы [10].

Для отделения НК от балластных веществ и примесей применяются методы, связанные с разделением в жидкой или твердой фазах [6]. Для отделения НК в жидкой среде используется фенол (который также денатурирует белки), часто в сочетании с хлороформом и изоамиловым спиртом [11]. Последние способствуют разделению фаз с переходом НК в водный раствор, а также препятствуют пенообразованию. Дальнейшим этапом выделения и концентрирования является осаждение НК спиртами (этанолом или изопропанолом) в присутствии солей (ацетата натрия, ацетата аммония, хлорида натрия) [12]. Осажденные НК концентрируются путем центрифугирования и промываются с последующим их растворением. Описанный метод позволяет получать высокоочищенные НК, однако отличается трудоемкостью. Кроме того, спирты помимо НК способны осаждать и другие вещества, содержащиеся в исходных образцах [6].

Отделение НК с использованием твердой фазы предполагает разделение в геле, основанное на разнице молекулярных масс [13], ионообменную хроматографию с обратимой адсорбцией на основе заряда молекул [14, 15] и аффинную хроматографию с обратимой адсорбцией [16]. Последний метод является наиболее распространенным и основан на способности НК адсорбироваться на поверхности диоксида кремния (диатомита) в присутствии спиртов и солей или хаотропных агентов при рН менее 7 в безводной среде. Данный метод отличается технической простотой реализации, поскольку не требует неоднократного промывания осажденной НК с ручным удалением надосадочной жидкости.

Известен способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа с использованием обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции (патент РФ №2313792, МПК G01N 33/50, С 12Q1 /68, опубл. 27.12.2007 г.) [20], включающий разрушение вирионов путем прогревания в лизирующем буфере, фракционирование лизата и осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что фракционирование лизата проводят путем центрифугирования в присутствии перхлората натрия, РНК осаждают охлажденным изопропиловым спиртом.

Известен способ выделения нуклеиновых кислот из СМЖ (патент США №10633647, МПК C12N 15/10, опубл. 28.04.2020 г.) [18], включающий: получение связывающего фрагмента раствора в технологической камере; смешивание связующего раствора фрагмента с биологическим образцом в технологической камере с целью получения смеси из фрагмента образца; инкубация смеси фрагмента-образца в течение временного окна, тем самым получая раствор, содержащий набор частиц нуклеиновых кислот, связанных фрагментом, и объем отходов; отделение множества связанных с фрагментами частиц нуклеиновых кислот от объема отходов; промывка набора частиц нуклеиновых кислот, связанных с фрагментами; и высвобождение образца нуклеиновой кислоты из набора частиц нуклеиновых кислот, связанных фрагментами. Способ предпочтительно использует связующий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один из поли(аллиламина) и полипропиленимин тетрамина дендримера, оба из которых обратимо связываются и не привязаны к нуклеиновым кислотам на основе рН окружающей среды.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к предлагаемому способу является метод выделения РНК с использованием гуанидина тиоцианата, фенола и хлороформа [17] (далее сравниваемый метод №1). Указанный способ выделения общей РНК из биологических образцов различных источников состоит в следующем. РНК отделяют от ДНК после экстракции кислым раствором, содержащим тиоцианат гуанидина, ацетат натрия, фенол и хлороформ, с последующим центрифугированием. В кислых условиях общая РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается либо в интерфазе, либо в нижней органической фазе.

Затем общая РНК восстанавливается путем осаждения изопропанолом и может быть использована для нескольких применений. Оригинальный протокол позволяет выделять РНК из клеток и тканей менее чем за 4 часа. Данный метод является одним из наиболее эффективных с точки зрения полноты выделения продукта и степени его очистки [10].

Вместе с тем, он не устраняет проблему низкой концентрации вируса в исходном образце, а получаемый препарат РНК нуждается в повторном переосаждении для удаления остаточного количества примесей, что может приводить к частичной потере РНК.

В отличие от способа-прототипа, предлагаемый способ предполагает предварительное концентрирование образца и дополнительную очистку РНК методом аффинной сорбции.

В отличие от другого способа выделения РНК нейровирулентного вируса из СМЖ [18] и от выделения методом аффинной сорбции [16] (далее сравниваемый метод №2), предлагаемый способ включает этапы концентрирования и избирательного растворения РНК с последующим осаждением, что обеспечивает повышение концентрации и степени очистки РНК при ее выделении из биологических образцов (спинномозговой жидкости) с низкой исходной концентрацией возбудителя при ожидаемом отсутствии ингибиторов ОТ и ПЦР.

Техническим результатом заявляемого технического решения является повышение концентрации и степени очистки РНК при ее выделении из биологических образцов СМЖ с низкой исходной концентрацией возбудителя при ожидаемом отсутствии ингибиторов ОТ и ПЦР.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ) для молекулярно-биологических исследований, согласно изобретения, образец СМЖ предварительно концентрируют в центробежном вакуумном концентраторе для частичного удаления из него воды с ускорением 150-300 g и отрицательным давлением 2 кПа до уменьшения конечного объема образца не менее чем в 5 раз; к полученному концентрату СМЖ добавляют в соотношении 1:10 лизирующий раствор, содержащий 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,5% натрия лаурилсаркозината, 0,1 М 2-меркоптоэтанола, смесь инкубируют до полного растворения компонентов и к полученному раствору последовательно добавляют в соотношении 1:10:2 1-3 М ацетат натрия, фенол и смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1 при перемешивании; полученный образец охлаждают и центрифугируют с ускорением 10-13 тыс. g; из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК, которую переосаждают добавлением изопропанола и инкубированием при температуре не менее минус 20°С; полученный образец осадка РНК переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 10-13 тыс. g; адсорбированную РНК промывают 70-90% раствором этанола и остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 10-13 тыс. g с последующим удалением очищенной РНК с мембраны колонки растворением в воде.

Таким образом сущность изобретения заключается в предварительном концентрировании образца, выделением РНК путем ее высвобождения под воздействием хаотропного агента - гуанидина тиоцианата, сепарации в присутствии фенола и хлороформа в кислой среде с последующим переосаждением и очисткой методом аффинной сорбции диоксидом кремния.

Изобретение поясняется чертежом, представленным на фиг. 1, на котором изображены стадии выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований.

Пример 1. Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований представлен на фиг. 1 и более подробно реализуется (с минимальным содержанием веществ и других параметров способа) следующим образом. Образец СМЖ объемом 0,5 мл переносят в стерильную пробирку и помещают в центробежный вакуумный концентратор для частичного удаления воды из образца. Образец концентрируется с ускорением 150 g и отрицательным давлением 2 кПа в течение 40 минут. Для предотвращения пересушивания образца процедуру проводят до достижения конечного объема образца 0,1 мл. К 0,1 мл полученного концентрата добавляют 1 мл лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, рН 6, натрия лаурилсаркозината в концентрации 0,5%, 0,1 М 2-меркоптоэтанола. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 12 минут. К полученному раствору последовательно добавляют 0,1 мл 1 М ацетата натрия, рН 4,0, 1 мл фенола, 0,2 мл смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1; полученную смесь перемешивают встряхиванием вручную в течение 10 секунд. Образец охлаждают на льду в течение 15 минут и центрифугируют с ускорением 10 тыс.g в течение 20 минут при температуре 4°С. Из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК. Раствор переосаждают добавлением 1 мл изопропанола и инкубированием при температуре - 20°С в течение 60 минут. Образец переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 10 тыс.g в течение 30 секунд. Адсорбированную РНК дважды промывают 70% раствором этанола объемом 0,5 мл, остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 10 тыс.g в течение 30 секунд и подсушиванием на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем РНК элюируют в 25 мкл воды, оставляя мембрану колонки с нанесенной на нее водой в течение 3 минут.

Пример 2. Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований (фиг. 1) более подробно реализуется (с максимальным содержанием веществ и других параметров способа) следующим образом. Образец СМЖ объемом 0,6 мл переносят в стерильную пробирку и помещают в центробежный вакуумный концентратор для частичного удаления воды из образца. Образец концентрируется с ускорением 300 g и отрицательным давлением 2 кПа в течение 60 минут. Для предотвращения пересушивания образца процедуру проводят до достижения конечного объема образца 0,15 мл. К 0,15 мл полученного концентрата добавляют 1 мл лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, рН 8, натрия лаурилсаркозината в концентрации 0,5%, 0,1 М 2-меркоптоэтанола. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. К полученному раствору последовательно добавляют 0,1 мл 3 М ацетата натрия, рН 4,0, 1 мл фенола, 0,2 мл смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1; полученную смесь перемешивают встряхиванием вручную в течение 15 секунд. Образец охлаждают на льду в течение 15 минут и центрифугируют с ускорением 13 тыс. g в течение 20 минут при температуре 4°С. Из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК. Раствор переосаждают добавлением 1 мл изопропанола и инкубированием при температуре - 20°С в течение 70 минут. Образец переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 13 тыс. g в течение 40 секунд. Адсорбированную РНК дважды промывают 90% раствором этанола объемом 0,5 мл, остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 13 тыс. g в течение 60 секунд и подсушиванием на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем РНК элюируют в 25 мкл воды, оставляя мембрану колонки с нанесенной на нее водой в течение 5 минут.

Ниже приведены примеры 3-4 конкретного выполнения заявляемого способа.

Пример 3. Сравнительные результаты выделения РНК Echovirus Е6 с использованием предлагаемого способа и двух альтернативных методов-аналогов.

Результаты выделения РНК сравнивали, используя продукт выделения для ОТ-ПЦР в соответствии с ранее описанной методикой, применяемой для генотипирования энтеровирусов [19]. Образцы РНК из СМЖ выделяли предлагаемым методом по примеру 1, а также методом с использованием гуанидина тиоцианата, фенола и хлороформа (далее метод №1) и методом аффинной сорбции с диоксидом кремния (далее метод №2). Образцы РНК использовали для постановки ОТ-ПЦР, результаты визуализировали с использованием электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Ампликоны выделяли из геля и очищали с использованием коммерческого набора «Cleanup Standard)) (производитель ЗАО «Евроген))) и концентрацию продукта измеряли с использованием спектрофотометра.

Концентрация продукта ОТ-ПЦР, РНК для постановки которой была выделена предлагаемым методом, была статистически значимо выше, чем в группе метода №1 и метода №2 (критерий Краскела-Уоллиса 8,96, df=2, р=0,01; post-hoc тест Коновера-Аймана: р=0,0022 для предлагаемого метода и метода №1, р=0,0005 для предлагаемого метода и метода №2, таблица 1).

Пример 4. Сравнительные результаты выделения РНК Coxsackievirus А9 с использованием предлагаемого метода и двух альтернативных методов. Образцы РНК из СМЖ выделяли предлагаемым методом по примеру 2, а также методом с использованием гуанидина тиоцианата, фенола и хлороформа (далее метод №1) и методом аффинной сорбции с диоксидом кремния (далее метод №2).

Результаты выделения РНК сравнивали, как описано в Примере 3.

Концентрация продукта ОТ-ПЦР, РНК для постановки которой была выделена предлагаемым методом, была статистически значимо выше, чем в группе метода №1 и метода №2 (критерий Краскела-Уоллиса 6.74, df=2, р=0,03; post-hoc тест Коновера-Аймана: р=0,0109 для предлагаемого метода и метода №1, р=0,0047 для предлагаемого метода и метода №2, таблица 2).

Источники научно-технической и патентной информации

1. Kermanian М. и др. Enrichment of cerebrospinal fluid samples on cell culture for enhancement of sensitivity of mumps and enterovirus detection by multiplex RT-PCR // Diagn Microbiol Infect Dis. 2008. T. 60, №4. C. 375-379.

2. Harvala H. и др. Recommendations for enterovirus diagnostics and characterisation within and beyond Europe // Journal of Clinical Virology. 2018. T. 101. C. 11-17.

3. Edridge A.W.D. и др. Viral Metagenomics on Cerebrospinal Fluid // Genes (Basel). 2019. T. 10, №5. C. 332.

4. Miller S. и др. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid // Genome Res. 2019. T. 29, №5. C. 831-842.

5. Faleye T.O.C., Adewumi M.O., Adeniji J.A. Defining the Enterovirus Diversity Landscape of a Fecal Sample: A Methodological Challenge? // Viruses. 2016. T. 8, №1. С. E18.

6. Thatcher S.A. DNA/RNA Preparation for Molecular Detection // Clinical Chemistry. 2015. T. 61, №1. c. 89-99.

7. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res. 1988. T. 16, №3. C. 1215.

8. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. T. 7, №6. C. 1513-1523.

9. van Tongeren S.P., Degener J.E., Harmsen H.J.M. Comparison of three rapid and easy bacterial DNA extraction methods for use with quantitative real-time PCR // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011. T. 30, №9. С.1053-1061.

10. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on // Nat Protoc. 2006. Т. 1, №2. C. 581-585.

11. Moore D., Dowhan D. Purification and concentration of DNA from aqueous solutions // Curr Protoc Mol Biol. 2002. T. Chapter 2. C. Unit 2.1 A.

12. Eickbush Т.Н., Moudrianakis E.N. The compaction of DNA helices into either continuous supercoils or folded-fiber rods and toroids // Cell. 1978. T. 13, №2. C. 295-306.

13. Adeli K., Ogbonna G. Rapid purification of human DNA from whole blood for potential application in clinical chemistry laboratories // Clin Chem. 1990. T. 36, №2. C. 261-264.

14. Polski J.M. и др. Rapid and effective processing of blood specimens for diagnostic PCR using filter paper and Chelex-100 // Mol Pathol. 1998. T. 51, №4. C. 215-217.

15. Feng G. и др. A new ion-exchange adsorbent with paramagnetic properties for the separation of genomic DNA // Analyst. 2011. T. 136, №22. C. 4822-4829.

16. Vogelstein В., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. T. 76, №2. C. 615-619.

17. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. 1987. T. 162, №1. С. 156-159 (прототип).

18. Патент США №10633647, МПК C12N 15/10, опубл. 28.04.2020 г.

19. Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, Seminested PCR Amplification of VP1 Sequences for Direct Identification of All Enterovirus Serotypes from Original Clinical Specimens // Journal of Clinical Microbiology. 2006. T. 44, №8. C. 2698-2704.

20. Патент РФ №2313792, МПК G01N33/50, С 12Q1/68, опубл. 27.12.2007 г.

Изобретение относится к молекулярной биологии. Предложен способ выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ), включающий концентрацию образца СМЖ в центробежном вакуумном концентраторе с ускорением 150-300 g и отрицательным давлением 2 кПа до уменьшения конечного объема образца в 4 или в 5 раз; добавление в соотношении 1:10 лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,5% натрия лаурилсаркозината, 0,1 М 2-меркоптоэтанола, инкубирование смеси до полного растворения компонентов; далее последовательно добавляют в соотношении 1:10:2 1-3 М ацетат натрия, фенол и смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1 при перемешивании; охлаждают и центрифугируют с ускорением 10-13 тыс. g; верхнюю прозрачную водную фазу переосаждают добавлением изопропанола и инкубированием при минус 20°С; полученную РНК дополнительно очищают методом аффинной сорбции с использованием диоксида кремния. Изобретение обеспечивает повышение концентрации и степени очистки РНК при ее выделении из биологических образцов СМЖ с низкой исходной концентрацией возбудителя. 1 ил., 2 табл., 4 пр.

Способ выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ) для молекулярно-биологических исследований, характеризующийся тем, что образец СМЖ предварительно концентрируют в центробежном вакуумном концентраторе для частичного удаления из него воды с ускорением 150-300 g и отрицательным давлением 2 кПа до уменьшения конечного объема образца в 4 или в 5 раз; к полученному концентрату СМЖ добавляют в соотношении 1:10 лизирующий раствор, содержащий 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,5% натрия лаурилсаркозината, 0,1 М 2-меркоптоэтанола, смесь инкубируют до полного растворения компонентов и к полученному раствору последовательно добавляют в соотношении 1:10:2 1-3 М ацетат натрия, фенол и смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1 при перемешивании; полученный образец охлаждают и центрифугируют с ускорением 10-13 тыс. g; из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК, которую переосаждают добавлением изопропанола и инкубированием при температуре минус 20°С; полученный образец осадка РНК переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 10-13 тыс. g; адсорбированную РНК промывают 70-90% раствором этанола и остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 10-13 тыс. g с последующим удалением очищенной РНК с мембраны колонки растворением в воде.