Вакцина на основе вирусоподобных частиц (VLP) для профилактики COVID-19 для интраназального применения Российский патент 2024 года по МПК A61K39/215 

Описание патента на изобретение RU2828323C1

Область техники

Группа изобретений относится к области к биотехнологии, иммунологии и вирусологии и касается интраназальной вакцины на основе вирусоподобных частиц, состоящая из смеси вирусоподобных частиц и фармацевтически приемлемого буфера, где вирусоподобные частицы состоят из четырёх структурных белков S, M, N, E SARS-CoV-2, где S белок выбран из вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2. Также разработан способ профилактики COVID-19, включающий введение интраназально трижды с интервалом между введениями 21 день.

Уровень техники

Отмена Всемирной организацией здравоохранения режима чрезвычайной ситуации в области здравоохранения, введенного из-за пандемии COVID-19 более чем на 3 года, не означает, что коронавирусная инфекция перестала представлять угрозу. Одна из основных проблем - многообразие генетических вариантов SARS-CoV-2. Накопление мутаций, возникающих в результате последующих репликации вируса, является естественным процессом. Известно, что вирус SARS-CoV-2 эволюционирует со скоростью примерно 1,1 × 10 - 3 замены на участок в год. ВОЗ в конце 2020 года для растущего числа вариантов SARS-CoV-2 предложила классифицировать новые штаммы SARS-CoV-2 следующим образом:

• варианты, представляющие интерес (VOIs) - варианты с мутациями, которые приводят к изменениям в связывании с рецепторами, снижению эффективности лечения, снижению нейтрализации антителами и потенциальному увеличению тяжести заболевания и/или трансмиссивности

• варианты, вызывающие озабоченность (VOCs) - варианты, в отношении которых могут быть убедительные доказательства увеличения трансмиссивности, большей тяжести заболевания, заметного снижения нейтрализации вырабатываемыми антителами и, следовательно, снижения реакции на лечение и вакцины.

Кроме того, для универсальной номенклатуры, облегчающей упрощенное отслеживание каждого из новых вариантов SARS-CoV-2, ВОЗ рекомендовала использовать греческий алфавит для однозначной идентификации каждого нового варианта.

Несмотря на многочисленные исследования, эффективного специфического лечения нет, а основа лечения - противовирусные препараты, нацеленные на широкий спектр вирусов, иммуномодуляторы. Поэтому основа профилактики и защиты от COVID-19 является вакцинация.

Различные платформы вакцинации против COVID-19 представлены векторными, мРНКовыми, цельновирусными инактивированными и белковыми вакцинами, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. В их основе лежит формирование иммунитета на спайковый гликопротеин SARS-CoV-2. В результате постоянных и быстрых мутаций у новых штаммов может происходить изменение эпитопов в S-белке и соответственно их прогнозируемый выход из-под действия вакциноиндуцированных антител.

Прогнозирование влияния новых VOCs на эффективность вакцин против COVID-19 должно лежать в основе подходов к разработке и оптимизации вакцин, которые не позволят эволюционирующему вирусу избегать или подавлять иммунные реакции человека.

Одним из перспективных подходов создания эффективных, а главное безопасных вакцин, является технология создания нереплицирующихся вакцин на основе вирусоподобных частиц (VLP). VLP - это ансамбли вирусных структурных белков, способных к самосборке, имитирующих структуру нативных вирионов, но не несущие в себе вирусного генома. В отличие от субъединичных вакцин VLP-вакцины презентуют эпитоп в конформации, более похожей на ту, которую имеет нативный вирус, и это значительно усиливает иммунный ответ. VLP-вакцины одобрены и находятся на разных стадиях клинических исследований - NVX-CoV2373 (Novavax), Covifenz (Medicago), ABNCoV2 (Radboud University) и LYB001 (Yantai Patronus Biotech Co Ltd). Большинство используемых вакцин против COVID-19, в том числе и на основе VLP, вводятся путем внутримышечной инъекции, и большинство из них содержат в своем составе адъюванты различной природы для повышения иммуногенности, и перечисленные выше вакцины не исключение.

В качестве ближайшего аналога можно рассмотреть документ US10953089B1, опуб. 23.03.2021, в котором раскрывается иммуногенная композиция основанная на наночастицах, образованных пептидами S белка коронавируса (например, гликопротеин BV2373 Spike), фармацевтически приемлемый буфер и сапониновый адъювант (например, MATRIX-M™). Показана иммуногенность полученной вакцины на модели яванского макака с инфекцией SARS-CoV-2. Недостатком решения является то, что данные наночастицы не имитируют вирион SARS-CoV-2, а также то, что в отличии от приведенного аналога, в заявленном техническом решении присутствуют 4 белка коронавируса - М, N, Е и S, поэтому спектр антител, после иммунизации данной вакциной значительно шире.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании новой удобной в применении вакцины, способной обеспечить защиту от инфекций, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая задача заявленной группы изобретений заключается в разработке вакцины против COVID-19, которая обладает иммуногенностью, достаточной для формирования иммунного ответа против COVID-19.

Технический результат заключается в создании интраназальной вакцины, не содержащей адъюванта, и при этом обладающей иммуногенностью, достаточной для формирования иммунного ответа против COVID-19, способностью индуцировать гуморальный и клеточный иммунный ответ, стимулировать защитный иммунитет слизистых оболочек, а также имеющей дополнительное преимущество простоты введения по сравнению с инъекционными формами. Также технический результат заключается в том, что создана вакцина, которая обладает иммуногенностью против различных штаммов SARS-CoV-2.

Технический результат достигается тем, что создана интраназальная вакцина на частиц для профилактики COVID-19, состоящая из рекомбинантных вирусоподобных частиц, содержащих на поверхности S белок, вариантов19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии - 80-120 мкг; калия дигидрофосфат - 0,63 мг; динатрия гидрофосфат - 0,65 мг; натрия хлорид - 3,84 мг; калия хлорид - 0,09 мг; кальция хлорид - 0,02 мг; трис(гидроксиметил)аминометан-HCl - 0,03 мг; тиомерсал - 4,00 мкг; вода для инъекций - до 0,5 мл.

В частном случае выполнения вакцина не содержит адъюванта.

В частном случае выполнения вакцины количество антигена в вакцине на дозу выбрано из 80, 90, 100, 110, 120 мкг.

Также технический результат достигается тем, что разработан способ профилактики COVID-19, включающий введение разработанной вакцины интраназально трижды с интервалом между введениями 21 день.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены результаты реакции бласттрансформации лимфоцитов мышей линии hACE2 Ac70 на 7 сутки после 2-й и 3-й иммунизации. По оси абсцисс указаны группы мышей, которым вводили интраназально: Плацебо (физ. р-р); адъювант SEPPIC с буферным раствором (Seppic); адъювант ГЕЛЬ с буферным раствором (гель); VLP вакцину 80 мкг/доза без адъюванта (VLP); VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC (VLP+Seppic); VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом Гель (VLP+гель). По оси ординат приведены средние значения ИСП.

На фиг. 2 представлено определение титра антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 у мышей линии hACE2 Ac70 после 2-й и 3-й иммунизации. По оси абсцисс указаны группы мышей, которым вводили интраназально: Плацебо (физ. р-р); адъювант SEPPIC с буферным раствором (Seppic); адъювант ГЕЛЬ с буферным раствором (гель); VLP вакцину 80 мкг/доза без адъюванта (VLP); VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC (VLP+Seppic); VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом Гель (VLP+гель). По оси ординат приведены обратные значения титра антител.

На фиг. 3 представлена выживаемость мышей линии hACE2 AC70 опытных и контрольных групп после инфицирования вирусом SARS-CoV-2 (100 LD50). Группы мышей, которым вводили интраназально: Плацебо (физ. р-р); адъювант SEPPIC с буферным раствором (Seppic); адъювант ГЕЛЬ с буферным раствором (гель); VLP вакцину 80 мкг/доза без адъюванта (VLP); VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC (VLP+Seppic); VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом Гель (VLP+гель). По оси абсцисс указаны сутки после заражения. По оси ординат количество выживших животных, выраженное в %.

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение VLP с использованием рекомбинантных бакуловирусов и получение состава вакцины.

Активным компонентом разработанной вакцины является рекомбинантные вирусоподобные частицы (VLP), которые состоят из четырёх структурных белков S, M, N, E SARS-CoV-2, где S белок выбран из вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, содержащие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7. Указанные частицы синтезированы в бакуловирусной системе экспрессии, как это указано в примерах в публикации RU 2769223 С1.

pFastBac донорная плазмида содержит экспрессионную кассету, в которой помимо клонированных генов находится фланкирующие последовательности транспозона Tn7. Рекомбинантная трансферная плазмида используется для трансформации клеток DH10Bac E.coli, которые содержат модифицированный бакуловирусный геном в виде большой плазмиды (бакмиды) и вектор-помощник, кодирующий фермент транспозазу. В трансформированных клетках DH10Bac транспозаза осуществляет сайт-специфический перенос экспрессионной кассеты из трансферного вектора в модифицированный бакуловирусный геном. Отбор рекомбинатных клонов DH10Bac осуществляется методом цветного теста, в выбранных колониях белого цвета перенос экспрессионной кассеты в бакуловирусный геном подтверждается методом ПЦР с праймерами, один из которых специфичен к клонированной последовательности, а другой - к геному бакуловируса.

Для дальнейшей работы отбирали клон, из которых выделили бакмиды. Выделенные рекомбинантные бакмиды смешивают с липосомным агентом Cellfectin для трансфекции клеток насекомых Sf-9 или Sf-21. Проникшая в клетку кольцевая молекула бакмидной ДНК инфекционна и запускает жизненный цикл бакуловируса в клетке. Таким образом, получаются рекомбинантные бакуловирусы. Трансфекцию перевиваемой линии клеток Spodoptera frugiperda Sf-21 проводили очищенными препаратами бакмидной ДНК, содержащей оптимизированные гены коронавируса,с использованием катионного липосомного агента Cellfectin (Invitrogen, США), для каждой конструкции использовали по два клона (посевная концентрация клеток 5х105/мл, 10 мкл бакмиды).После трансфекции проводили еще два пассажа на клетках Sf-9 или Sf-21. Таким образом, получили рекомбинантные бакуловирусы.

Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора “Micro BCA Protein Assay Kit” (Thermo, США). Анализ структурных белков Sars-CoV-2 проводили методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) по методу Laemmli (1970) Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля размером 70 × 100 × 0,75 на приборе Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при по-стоянном напряжении 200 V. Разделяющий гель содержал 12% акриламида, 0,5% N,N-метилен-бис-акриламида, 0,375 М трис-HCl pH 8,8 и 0,1% ДСН. Фокусирующий гель содержал 4% акриламида, 10% N,N-метилен- бисакриламида в 0,125 М трис-HCl буфере pH 6,8. Для полимеризации в оба геля вносили по 0,025% персульфата аммония и 0,075% TEMED. Электродный буфер содержал 0,025 М трис-HCl, 0,192 М глицина, pH 8,3 и 0,1% ДСН. Все испытуемые пробы содержали лизирующий буфер с восстановителем (0,125 М трис-HCl, pH 6,8, 5% ДСН, 0,5% β-меркаптоэтанола, 10,8% глицерина, 0,01% бромфенолового синего) и были прогреты в течение 5 минут при 100 °C. Заливку геля и подготовку аппарата для электрофореза к работе проводили согласно рекомендациямизготовителя. Белки в гелях окрашивали в течение 1 часа 0,1% раствором Кумасси ярко-голубого (CBB R-350) в водном растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 30% метанола. Избыток красителя отмывали 10% раствором уксусной кислотой такое же время с несколькими его сменами. В качестве белков-маркеров молекулярной массы использовали β-галактозидазу- 116 кД; фосфорилазу В - 94 кД, БСА- 66 кД, овальбумин- 45 кД, карбонат ангидразу-30 кД, ингибитор трипсина- 20,1 кД. Для определения антигенной активности структурных белков SARS-CoV-2 использовали сэндвич-ИФАвестерн-блот.

Таким образом, было определено, что были получены структурные белки коронавируса M, E, N и S.

VLP получали методом коинфекции, то есть одновременного заражения перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов. Перевиваемую культуру клеток насекомых Trichoplusia ni, культивировали в течение 4 суток после заражения. Был использован 2 пассаж рекомбинантных бакуловирусов.

Культуральную жидкость, содержащую вирус или вирусоподобные частицы, подвергали низкоскоростному центрифугированию, освобождаясь от клеток и клеточного дебриса при 1000 об/мин в течение 5 минут и при 6000 об/мин в течение 20 минут соответственно (+4°С, ротор Sorval® SS34). Распределение SARS-VLP в процессе предварительной очистки представлено на фиг. 5. Фракция 5 использовалась для выделения и очистки SARS-VLP методом ультрацентрифугирования. Полученные осветлённые суспензии наслаивали на 6 мл 25% или 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNC (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2 рН 7.4). Центрифугировали в течение 2 часов при 28 000 об/мин (центрифуга Optima XE-100, ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, +4°С). Полученные осадки ресуспендировали в буфере TNC, и хранили при температуре +4°С.

Таким образом, был получен препарат, содержащий очищенные VLP.

Была получена вакцина следующего состава:

- рекомбинантные вирусоподобные частиц, содержащие на поверхности S белок, вариантов19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии - 80-120 мкг;

калия дигидрофосфат - 0,63 мг;

динатрия гидрофосфат - 0,65 мг;

натрия хлорид - 3,84 мг;

калия хлорид - 0,09 мг;

кальция хлорид - 0,02 мг;

трис(гидроксиметил)аминометан-HCl - 0,03 мг;

тиомерсал - 4,00 мкг;

вода для инъекций - до 0,5 мл.

Активный компонент (вирусоподобные частицы) в буфере TNC (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2 рН 7.4) ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе (0,01М КН2РО4, 0,01М Na2HPO4; 0,137М NaCl; 0,0027М KCl, рН 7,4) до необходимой концентрации, и затем перемешивают в течение 30 минут при скорости вращения 250-300 оборотов в минуту.

Вакцина разливается в стерильные флаконы. Хранение производят в защищенном от света месте, при температуре 2-8°С.

Пример 2. Исследование Т-клеточного иммунного ответа

1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов

У мышей в стерильных условиях извлекали селезенки и гомогенизировали в 3 мл чистой среды RPMI-1640. Суспензию клеток центрифугировали на одноступенчатом градиенте плотности фиколла, выделяли фракцию мононуклеарных клеток, отмывали дважды в чистой среде RPMI-1640 и помещали в 96-луночные культуральные планшеты с концентрацией 105 клеток в 100 мкл в лунку. Антигены-стимуляторы добавлялись по 100 мкл в лунку к клеткам до конечных концентраций. В качестве положительного контроля служили спленоциты, активированные конковалином А. В качестве отрицательных контролей использовали: клеточные культуры из селезенок неиммунизированных мышей; нестимулированные клеточные культуры из селезенок мышей; культуры, стимулированные неспецифическим антигеном - инактивированного вируса Конго-крымской геморрагической лихорадки. Клетки культивировали в полноростовой среде RPMI-1640, с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 4.5 г/л глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина, 0.2 ед/мл инсулина при 37°С в атмосфере 5% СО2.

Пролиферацию спленоцитов оценивали в РБТЛ через 4-5 суток с помощью инвертированного микроскопа (увеличение x400). Результаты РБТЛ (фиг.1) выражали в виде индекса стимуляции пролиферации (ИСП) - отношения среднего количества бластов в присутствии стимуляторов к среднему количеству бластов в отсутствие стимуляторов. Положительным считали результат, если ИСП превышает 2.

2. Определение количества клеток, синтезирующих IFN-γ, методом ELISpot

Количественное определение клеток, секретирующих IFN-γ, проводили с помощью набора мышиных IFN-γ ELISpot («BD Biosciences», США). Окрашивание клеток проводили в соответствии с инструкцией производителя. Визуализацию окрашенных пятен «spots» проводили на стереомикроскопе МБС-10 (ЛОМЗ, Россия). Результаты были выражены как разница в количестве пятен (пятнообразующих единиц, SFU) на 106 клеток между лунками, стимулированными специфическим антигеном и средними контрольными лунками без специфических стимуляторов (только питательная среда).

Таблица 1. Формирование IFN-γ-секретирующих лимфоцитов в культуре клеток, выделенных из селезенок мышей, иммунизированных интраназально VLP вакциной на 7 сутки после второй и третьей иммунизации.

Группа АГ SARS ККГЛ Seppic контроль Плацебо (физ. р-р); 62 46 50 Адъювант SEPPIC с буферным раствором 44 9 40 Адъювант ГЕЛЬ с буферным раствором 101 68 48 2я им-я VLP вакцина, доза 80 мкг/доза без адъюванта 85 35 65 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC 75 35 65 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом ГЕЛЬ 55 45 65 3я им-я VLP вакцина, доза 80 мкг/доза без адъюванта 154 38 43 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC 121 25 65 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом ГЕЛЬ 186 82 67

Результаты исследования Т-клеточного иммунного ответа показали, что мыши, получившие три дозы вакцины для профилактики COVID-19 на основе VLP, потенциально способны к количественному эффективному клеточно-опосредованному иммунному ответу. Клеточный ответ является защитным, что подтверждается высоким ИСП в реакции РБТЛ при двукратном интраназальном введении вакцины в сочетании с адъювантом Seppic (ИСП 3,75±0,57) и после третьей дозы вакцины без адъюванта (2,9±0,24) и в сочетании с адъювантом гель (ИСП 3,3±0,28) (фиг. 1), коррелирующим с формированием IFN-γ секретирующих клеток (табл. 1).

Пример 3. Исследование гуморального иммунного ответа.

1. Определение антител к S-белку вируса SARS-CoV-2

Уровень антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 после иммунизации определяли методом непрямого ИФА. Для этого рекомбинантный белок RBD (иммуногенный фрагмент S-белка вируса SARS-CoV-2) сорбировали в лунках микропланшета в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,5 в концентрации 5 мкг/мл по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки, разведенной в фосфатно-солевом буфере рН 7.5, содержащим 0.01% Твин 20 и 0.5% желатина (Gerbu). Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл пероксидазного конъюгата антител к IgG мыши или хомяка. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0.1 мл 1 М H2SO4 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan FX (Thermo, США).

После 2-ой и 3-ей иммунизации у животных групп, получавших вакцину на основе VLP c адъювантом Seppic и без адъюванта определяли специфические антитела к RBD белка S SARS-CoV-2 в сыворотках крови методом непрямого ИФА. Результаты представлены на фиг. 2. Указаны средние уровни обратной величины титра специфических антител по группам.

2. Реакция нейтрализации (РН)

Для проведения реакции нейтрализации штамм SARS-CoV-2 PMVL-12 (клайд 20В) накопили, пулировали и заморозили при -70°С. Определение lg ТЦИД50 пула вируса проводили методом конечных разведений, для чего вирус титровали на клетках Vero E6 от 10-1 до 10-8. Подсчет lg ТЦИД50 делали по методике Рида и Менча.

Реакцию нейтрализации проводили микрометодом в 96-луночных планшетах (Costar, США) на перевиваемой культуре клеток Vero E6, выращенной на среде Игла с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Поддерживающая среда содержала 1% сыворотки. При постановке реакции нейтрализации использовали разведение вируссодержащей культуральной жидкости, содержащее 100 ТЦИД50 в 100 мкл.

Из сывороток, готовили разведения от 1:5 до 1:1280 и вносили по 100 мкл в лунки 96-ти луночного планшета. К разведениям сывороток добавляли по 100 мкл вируссодержащей суспензии и инкубировали смесь в течение часа при 37°С. Затем смесь переносили в 96-ти луночный планшет с монослоем клеток Vero E6. Через 72 часа реакцию учитывали, просматривая лунки планшета в микроскоп. Если в сыворотке крови есть нейтрализующие вирус антитела, вирус не будет вызывать ЦПД клеток. Титром сыворотки (последним нейтрализующим разведением) считали разведение, при котором обеспечивается 100% защита клеток (нет ЦПД).

Таблица 2. Результаты РН с сыворотками мышей линии hACE2 Ac70 при интраназальном введении вакцины после после 2-й и 3-й иммунизации.

Группа Средний титр в РН Ухань Дельта Омикрон 2я им-я VLP вакцина, доза 80 мкг/доза без адъюванта 1:80 1:160 1:160 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC 1:10 1:10 1:10 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом ГЕЛЬ 1:10 1:10 1:10 3я им-я VLP вакцина, доза 80 мкг/доза без адъюванта 1:360 1:360 1:360 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом SEPPIC 1:20 1:10 1:10 VLP вакцина, доза 80 мкг/доза с адъювантом ГЕЛЬ 1:10 1:10 1:10

При исследовании гуморального иммунитета выявлено, что после третьей иммунизации интраназально у мышей линии hACE2 Ac70, наблюдалась выработка специфических антител к RBD домену белка S SARS-CoV-2. При этом, в группе, иммунизированной вакциной 80 мкг/доза с адъювантом Seppic, средний титр специфических антител составлял 1/400, а в группе, иммунизированной вакциной 80 мкг/доза без адъюванта - средний титр специфических антител был существенно выше (в 24 раза) и составлял выше 1/9600. В группе животных, вакциной 80 мкг/доза с адъювантом гель, специфических антител не выявлено.

После заражения мышей hACE2 Ac70 SARS-CoV-2 не зарегистрировано низкоавидных антител, что также может быть косвенной проверкой на проявление потенциального ADE-эффекта.

Показано также, что после второй и третьей иммунизации интраназально, у животных вырабатываются нейтрализующие антитела против вируса SARS-CoV-2, количество вируснейтрализующих антител было максимальным в группе, в которой животных иммунизировали VLP вакциной 80 мкг/доза без адъюванта.

Пример 4. Исследование протективности вакцины Гам-VLP-Мультивак

Протективную эффективность вакцины оценивали путем учета потребления корма и воды животными, количества павших животных опытных и контрольных групп. После заражения потребление корма в контрольных группах, получавших буфер с адъювантами и плацебо было меньше практически в 2 раза, по сравнению с группами, получавшими вакцину с адъювантом и без адъюванта. Снижение потребление корма связано с гибелью животных после инфицирования. Также показано, что в группе животных, получивших вакцину 80 мкг/доза без адъюванта, потребление корма было максимальное, в том числе и за счет минимальной гибели животных.

Потребление воды определяли количественно для клетки содержания еженедельно замеряя начальный объем и спустя 24 часа. Потребление воды животными контрольных групп, получавших буфер с адъювантами и плацебо, сократилось, начиная с 6 дня практически в 2, а затем в 3 раза, тогда как в группах, получавшими вакцину с адъювантом и без адъюванта животными потребление воды сократилось, но гораздо меньше. Потребление воды в группе животных, получивших вакцину 80 мкг/доза без адъюванта было максимальное, в том числе и за счет того, что гибель животных была минимальная.

Учет выживаемости инфицированных животных проводили в течение 14 дней после инфицирования вирусом SARS-CoV-2 дозой 100LD50. Результаты учета представлены на фиг. 3.

Гибель животных отмечали, начиная с 6-го дня после инфицирования. В контрольных группах гибель мышей составила 100%. В группах, получавших вакцину VLP с адъювантом Гель и без адъюванта выживаемость животных составила 50% и 83,4% соответственно.

Средняя продолжительность жизни мышей в группе, получавшей VLP вакцину 80 мкг/доза с адъювантом Гель составила 11 дней. Максимальная продолжительность жизни животных 13 дней наблюдалась в группе, получавшей VLP вакцину 80 мкг/доза без адъюванта. В контрольных группах средняя продолжительность жизни животных была существенно меньше и составила от 8,5 до 9,75 дней.

При интраназальной вакцинации наибольшую протективность показала VLP вакцина 80 мкг/доза без адъюванта. Выживаемость животных составила 83,4%.

Пример 5. Исследование острой и субхронической токсичности вакцины при однократном и многократном введении.

Доклинические исследования острой токсичности проводили на 60 половозрелых аутбредных мышах (30 самцах и 30 самках). Животным вводилась интраназально одна прививочная доза, превышающая дозу для человека более чем в 2000 раз. Введение проводилось дробно с интервалом 1,5 часа в максимально возможном объёме для однократного интраназального введения - 25 мкл. В течение 14 суток за животными велось ежедневное наблюдение, на 15 сутки - эвтаназия с последующей некропсией и морфометрической оценкой внутренних органов. На протяжении всего исследования у животных не было установлено клинической картины интоксикации, гибели не зарегистрировано. Масса животных на протяжении эксперимента значимо не различалась между группами (табл. 3).

Таблица 3. Динамика массы тела мышей, гр. (M±m).

Сутки Группы Физ. р-р Seppic VLP 0 34,0±0,92 30,6±0,81 33,4±0,86 31,0±0,97 33,1±1,09 31,2±0,97 1 33,9±0,90 30,7±0,77 33,1±0,99 31,4±1,09 33,7±1,06 33,5±0,83 2 33,3±0,89 30,2±0,75 32,3±0,95 30,5±1,03 32,4±1,11 31,2±0,82 3 33,9±0,83 31,0±0,79 33,0±0,87 30,8±0,98 33,0±1,15 31,0±0,77 4 34,0±0,88 30,7±0,75 33,0±0,97 30,5±1,03 33,3±1,16 31,0±0,67 7 36,5±1,01 32,6±0,69 35,1±0,94 32,7±0,98 34,7±1,24 32,8±0,70 8 37,6±0,99 34,1±0,64 36,8±1,00 34,5±1,00 36,2±1,27 34,3±0,68 15 36,9±1,16 32,3±0,95 35,8±0,89 33,1±0,86 35,3±1,24 31,9±1,05

У некоторых животных появилось покраснение и припухлость носового зеркальца (исчезало в течение суток) при многократных инстилляциях, как вакцины, так и носителя. При вскрытии не выявлено отрицательного воздействия вакцины на структуру и массу органов (табл. 4).

Таблица 4. Средние групповые показатели относительной массы внутренних органов мышей, % (M±m).

Органы Группы Физ. р-р Seppic VLP Печень 3,58±0,062 3,77±0,128 3,64±0,073 3,78±0,142 3,83±0,091 3,64±0,097 Почки 1,24±0,044 1,07±0,037 1,26±0,032 1,05±0,038 1,32±0,055 1,06±0,038 Селезенка 0,30±0,020 0,43±0,073 0,33±0,020 0,43±0,080 0,36±0,028 0,40±0,067 Сердце 0,40±0,013 0,37±0,013 0,39±0,006 0,37±0,016 0,42±0,015 0,37±0,014 Тимус 0,13±0,013 0,18±0,030 0,15±0,015 0,18±0,007 0,16±0,011 0,17±0,020 Семенники/Яичники 0,64±0,035 0,12±0,010 0,67±0,031 0,12±0,010 0,67±0,046 0,15±0,013 Легкие 0,71±0,069 0,84±0,110 0,86±0,111 0,67±0,057 0,74±0,121 0,94±0,105 Надпочечники 0,018±0,0009 0,035±0,0022 0,020±0,0016 0,030±0,0022 0,021±0,0012 0,035±0,0019 Головной мозг 1,11±0,061 1,24±0,064 1,03±0,042 1,28±0,047 1,06±0,075 1,29±0,089 Тимус/селезенка 0,45±0,048 0,53±0,121 0,47±0,053 0,49±0,056 0,48±0,053 0,53±0,100

Доклинические исследования субхронической токсичности проводили на 90 аутбредных половозрелых крысах (45 самцах и 45 самках). Вакцину вводили интраназально трижды с интервалом между введениями 21 день. Такой режим введения приближен к планируемому клиническому применению. Использовали одну прививочную дозу для человека (80 мкг) и удвоенную (160 мкг). Из-за невозможности разового введения таких доз крысам, ведение производилось дробно с интервалом 3 часа. Через сутки после последнего введения вакцины (43-44 день эксперимента) проводили эвтаназию части животных из каждой группы, оставшихся животных подвергали эвтаназии на 58 день эксперимента. При исследовании использовали общепринятые методы: оценка интегральных и физиологических показателей, исследования клинических и биохимических показателей (кровь, моча), морфометрическая и гистологическая оценка внутренних органов и тканей.

При наблюдении за животными в течение всего исследования не было каких-либо отклонений в поведении (тест «Открытое поле») и общем состоянии крыс. Гибели животных на протяжении исследования не зарегистрировано.

Оценка динамики массы тела крыс показало, что интраназальное введение вакцины в исследуемых дозах не оказывает негативного влияния на данный показатель (табл. 5).

Таблица 5. Динамика массы тела крыс, гр. (M±m).

Сутки Группы Seppic VLP 80 мкг VLP 160 мкг 0 424,0±6,54 274,8±6,77 423,3±7,25 273,1±5,35 423,5±8,08 273,0±5,70 8 434,4±7,59 284,8±6,04 433,1±7,52 283,2±5,26 437,6±9,29 283,9±4,27 15 443,9±7,61 288,2±4,89 435,0±8,98 289,1±5,00 447,4±9,26 290,5±4,23 22 437,4±7,91 289,0±5,87 431,9±7,30 287,3±4,82 443,0±11,64 289,6±3,85 29 440,0±6,60 295,6±5,50 439,6±6,70 289,3±5,14 452,4±11,40 298,4±5,55 36 454,5±9,05 300,1±5,40 445,4±7,46 291,5±5,85 461,3±11,37 305,3±5,21 43-44 466,2±10,08 305,8±5,63 462,1±7,55 300,8±5,29 474,1±11,60 304,9±5,21 50 441,0±7,09 291,9±8,56 459,2±16,16 295,5±7,88 449,0±13,71 309,6±9,10 58 445,8±7,67 298,0±9,57 470,3±16,29 298,9±8,66 456,0±14,67 310,9±11,21

Средние групповые значения клинического анализа крови представлены на табл. 6. Анализ данных гематологических показателей выявил обратимое увеличение количества тромбоцитов (менее чем в 2 раза) у самцов крыс на 43 день эксперимента (через сутки, после последней иммунизации), получавших удвоенную прививочную дозу. Через 14 суток данный показатель в опытных группах не отличался от контрольных групп. Остальные показатели клинического анализа крови находились в пределах физиологической нормы для крыс и не отличались между группами.

Таблица 6. Средние значения показателей клинического анализа крови крыс (M±m).

Показатель Сутки Группы Seppic VLP 80 мкг VLP 160 мкг RBC*, 1012 43-44 7,9±0,37 7,8±0,11 8,3±0,20 7,7±0,33 8,3±0,19 7,9±0,30 58 8,7±0,23 8,0±0,26 8,7±0,27 7,8±0,14 8,2±0,42 7,6±0,12 PLT, 109 43-44 355,7±49,87 374,6±28,01 363,2±28,48 417,2±32,29 600,4±67,74** 517,6±70,96 58 338,0±16,10 347,2±10,84 369,2±5,15 365,2±7,89 372,4±7,55 330,0±10,50 HCT, % 43-44 41,6±1,75 43,0±0,69 43,9±1,00 41,5±1,72 44,0±1,08 42,9±1,63 58 46,1±1,18 43,3±1,04 45,0±1,29 42,2±1,06 43,9±2,02 41,7±0,47 HGB, г/л 43-44 139,4±6,10 147,3±2,58 147,1±3,46 141,8±6,04 144,0±7,91 146,1±5,87 58 160,0±4,45 149,2±3,83 154,3±5,18 146,7±4,14 144,7±7,02 144,2±2,06 WBC, 109 43-44 10,1±0,99 10,9±1,72 9,0±1,20 9,9±1,11 11,0±1,54 9,8±1,09 58 17,5±1,60 11,0±1,72 12,2±2,40 11,0±1,55 15,7±0,72 15,0±1,19 LYM, % 43-44 64,4±0,95 63,1±1,90 67,3±1,73 67,7±0,99 64,9±1,78 65,8±1,93 58 57,3±2,20 64,5±2,32 53,5±3,24 62,0±1,18 56,5±5,37 63,8±5,59 MON, % 43-44 3,8±0,16 4,1±0,27 3,3±0,14 3,7±0,18 3,7±0,17 4,0±0,35 58 4,0±0,35 4,1±0,86 3,9±0,22 4,5±0,34 4,0±0,33 3,8±0,27 GRAN, % 43-44 31,9±0,87 32,8±1,90 29,4±1,66 28,6±0,88 31,5±1,67 30,2±1,85 58 38,7±2,34 31,4±2,25 39,9±3,42 31,7±0,90 36,5±4,42 28,4±8,36 * RBC-эритроциты, PLT-тромбоциты, HCT-гематокрит, HGB-гемоглобин, WBC-лейкоциты, LYM-лимфоциты, MON-моноциты, GRAN-гранулоциты.
** статистически значимое различие в сравнении с контролем по t-критерию Стьюдента (р<0,05)

Показатели гемостаза (время рекальцификации, АЧТВ, фибриноген), биохимического анализа крови (АЛТ, АСТ, ЩФ, билирубин общий, холестерин, триглицериды, общий белок, мочевина) и анализа мочи (удельный вес, рН, белок, кетоны) у животных, получавших интраназально вакцину в обеих исследуемых дозах, значимо не отличался от аналогичных показателей у крыс контрольных групп.

У крыс не обнаружены проявления интоксикации и патологических отклонений в структуре внутренних органов. Морфометрический анализ внутренних органов крыс представлен в табл 7.

Таблица 7. Средние групповые показатели относительной массы внутренних органов крыс на 1 и 14 сутки после последней вакцинации (43-44 и 58 сутки эксперимента, соответственно), % (M±m).

Органы Сутки Группы Seppic VLP 80 мкг VLP 160 мкг Печень 43-44 2,50±0,081 2,43±0,052 2,38±0,059 2,41±0,064 2,34±0,042 2,39±0,058 58 2,44±0,104 2,54±0,045 2,47±0,125 2,50±0,131 2,25±0,045 2,82±0,129 Почки 43-44 0,56±0,020 0,58±0,012 0,58±0,020 0,56±0,015 0,53±0,012 0,59±0,009 58 0,56±0,034 0,58±0,017 0,56±0,010 0,57±0,014 0,55±0,016 0,63±0,033 Селезенка 43-44 0,19±0,008 0,25±0,014 0,21±0,010 0,27±0,016 0,19±0,007 0,24±0,011 58 0,19±0,009 0,25±0,012 0,17±0,004 0,25±0,013 0,22±0,015 0,33±0,030* Сердце 43-44 0,28±0,015 0,29±0,008 0,27±0,007 0,26±0,030 0,26±0,004 0,30±0,005 58 0,28±0,015 0,30±0,006 0,27±0,005 0,30±0,006 0,28±0,016 0,30±0,014 Тимус 43-44 0,11±0,007 0,13±0,012 0,09±0,007 0,13±0,011 0,10±0,008 0,13±0,005 58 0,10±0,007 0,10±0,010 0,12±0,003 0,11±0,006 0,11±0,011 0,10±0,009 Семенники/
яичники
43-44 0,68±0,022 0,039±0,0036 0,71±0,026 0,036±0,0022 0,68±0,020 0,037±0,0023
58 0,73±0,027 0,041±0,0021 0,72±0,009 0,040±0,0045 0,78±0,027 0,043±0,0014 Легкие 43-44 0,43±0,026 0,56±0,050 0,45±0,027 0,59±0,050 0,38±0,032 0,54±0,051 58 0,47±0,036 0,52±0,031 0,39±0,035 0,54±0,045 0,64±0,022* 0,50±0,033 Надпочечники 43-44 0,011±0,0008 0,020±0,0018 0,012±0,0007 0,020±0,0008 0,012±0,0006 0,019±0,0010 58 0,014±0,0010 0,022±0,0025 0,013±0,0008 0,022±0,0022 0,013±0,0009 0,021±0,0023 Головной мозг 43-44 0,40±0,011 0,58±0,022 0,39±0,017 0,59±0,013 0,39±0,013 0,61±0,015 58 0,42±0,019 0,60±0,032 0,40±0,012 0,58±0,028 0,45±0,019 0,60±0,018 * статистически значимое различие в сравнении с контролем по t-критерию Стьюдента (р<0,05)

У крыс, получавших двойную прививочную дозу, через 14 дней после последней вакцинации выявлено статистически значимое увеличение (~ в 1,5 раза) по сравнению с контрольными крысами легких у самцов, а селезенок у самок, при этом значения не превышают физиологические нормы для лабораторных крыс.

Визуальная оценка и цитогистоархитектонический анализ не выявил местно-раздражающего действия места введения (носовые ходы) в рамках данного исследования.

Пример 6. Изучение иммунотоксичности

Исследование иммунотоксичности вакцины проводили путем изучения иммунного ответа на стандартный антиген (KLH) при введении крысам SD (Sprague-Dawley) 30 самцах и 30 самках.

Все животные осматривались дважды в день на наличие смертности и умирающих животных. Подробный клинический осмотр с измерением массы тела и регистрацией потребления корма выполняли непосредственно после введения препарата и далее еженедельно в течение исследования. В конце прижизненной фазы животные были подвергнуты эвтаназии путем анестезии (Телазол®/Ксила®) с последующим терминальным взятием крови для определения наличия иммунотоксических эффектов (43-й день исследования).

Анализ сыворотки крови на наличие иммуноглобулинов класса М (IgM) и G (IgG) к препарату KLH проводился методом конкурентного иммуноферментного анализа с помощью планшетного спектрофотометра” Multiscan Go” (Thermo Fisher Scientific Oy, Финляндия) с использованием соответствующих тест-систем («Rat keyhole limpet hemocyanin antibody (KLH-IgM) Elisa kit» и «Rat keyhole limpet hemocyanin antibody (IgG) (KLH-IgG) Elisa kit»).

Принцип метода основан на конкуренции KLH-Ig из образцов и конъюгата KLH-Ig-HRP за сайт связывания антител против KLH-Ig. Поскольку количество сайтов-связывания ограничено, чем больше сайтов занято KLH-Ig из образца, тем меньше сайтов остается для связывания конъюгата KLH-Ig-HRP. При этом происходит изменении интенсивности окраски в зависимости от концентрации антител в образцах или стандартных растворах. Строится стандартная калибровочная кривая, отражающая зависимость интенсивности окраски от концентрации стандартных растворов. Концентрация антител в каждом образце интерполируется по данному калибровочному графику.

На протяжении всего исследования ни в одной экспериментальной группе гибели животных не было. Ни у самцов, ни у самок крыс SD в острой фазе после первой инъекции вакцины не наблюдалось никаких клинических отклонений, связанных с тестируемым объектом. На 1-2 день исследования у самцов и самок животных в группах, получавших тестируемый препарат в двух дозах, было выявлено статистически значимое изменение потребления корма относительно контрольной группы, получавшей носитель. Во всех случаях зарегистрированные отклонения проявлялись в виде снижения потребления корма. Уменьшенное потребление корма не привело к изменениям в показателе прироста массы тела, следовательно, отклонение в потребление корма было краткосрочным и не является критичным. В дальнейший период наблюдения на 6-7 день исследования и далее - отличий в потреблении корма не выявлено. Статистически значимых межгрупповых различий показателей массы тела и прироста массы тела ни у самцов, ни у самок, на протяжении текущего периода наблюдения выявлено не было. Введение тестируемого объекта не изменило показатели иммунного ответа (KLH-IgM) у самок крыс во все дни проведения анализа. В то же время уровень KLH-IgG был достоверно увеличен на 42й день исследования, однако это было временное и преходящее изменение, и на 35й и 49й дни исследования данный показатель не отличался от показателей животных контрольной группы. Введение тестируемого объекта не изменило показатели иммунного ответа (KLH-IgM и KLH-IgG) на введение KLH самцам крыс. Следовательно, иммунотоксического действия не выявлено в исследуемых дозах: предполагаемой клинической (40 мкг) и в 4 раза большей (160 мкг).

Исследования иммунотоксичности также проводили на здоровых половозрелых мышах самцах и самках линий СВА, C57BL/6 и мышах-гибридах первого поколения (СВА × C57BL/6)F1 с помощью определения массы и количества ядросодержащих клеток в органах иммунной системы, оценки клеточного и гуморального иммунного ответа и активности фагоцитов. Было показано, что вакцина стимулирует повышенную выработку антителообразующих клеток (АОК) и содержание антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Введение адъюванта приводит к усилению иммунного ответа на эритроциты барана, происходит значимое увеличение количества АОК и титров антител в реакции гемагглютинации. Вакцина и адъювант также приводят к стимуляции клеточного звена иммунной системы и не индуцируют реакции гиперчувствительности замедленного типа к корпускулярному антигену (ЭБ). Вакцина и адъювант не оказывают значимого влияния на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. В результате проведенных гистологических исследований установлено, что вакцина и адъювант вызывают функциональные изменения в органах иммунной системы: изменение соотношения зон селезенки: увеличение площади белой пульпы и сокращение площади красной пульпы; увеличение митозов в тимусе и лимфатическом узле по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что вакцина против COVID-19, вызываемого вирусом SARS-CoV-2, на основе вирусоподобных частиц и адъювант обладают иммунологической активностью, что непосредственно связано с механизмом их действия.

Пример 7. Изучение генотоксичности

Исследование генотоксичности вакцины проводилось в тесте in vivo на хромосомы и/или митотический аппарат в тесте in vivo на образование микроядер в эритробластах крыс SD (30 самцов и 30 самок). Через 24 часа после последнего введения животные подвергались эвтаназии в CO2-камере. Сразу после эвтаназии у крыс забирается костный мозг из бедренной кости аспирацией, и готовится 2 мазка с последующей их фиксацией и окраской по Романовскому и Май-Грюнвальду. В мазках подсчитывается частота встречаемости микроядерных полихромных (незрелых) эритроцитов (анализ 4000 полихромных эритроцитов) и соотношение между полихромными и зрелыми эритроцитами (подсчет 500 эритроцитов). Максимальная вводимая доза не должна обладать выраженной токсичностью на систему гемопоэза: соотношение незрелых эритроцитов к общему количеству эритроцитов не должно отличаться более чем на 20% от соотношения в контрольной группе с растворителем. Статистически значимое увеличение частоты встречаемости микроядер в полихромных эритроцитах, по крайней мере, в одной из получавших препарат групп по сравнению с контрольной считается основанием предполагать у тестируемого препарата наличие генотоксического действия. Кроме того, у животных в прижизненной фазе исследования контролируется проявление токсических эффектов вводимого препарата: масса тела, потребление корма, внешние клинические признаки. В конце исследования после эвтаназии и взятия костного мозга выполняляется некропсия тел с осмотром и взвешиванием органов.

Таблица 8. Суммарные данные встречаемости микроядер в эритроцитах костного мозга

Показатель Группы Seppic VLP 40 мкг VLP 160 мкг VLP 320 мкг Контроль 1 Контроль 2 Кол-во зрелых эритроцитов (НХЭ) на 500 клеток 248±2 252±8 248±3 249±6 248±5 250±5 248±3 249±9 260±5* 259±4 260±2* 260±5 Кол-во полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) на 500 клеток 252±2 248±8 253±3 252±6 253±3 250±5 252±5 251±9 240±5* 241±4 240±2* 240±5 Кол-во ПХЭ с микроядрами на 4000 клеток 9±4 5±2 7±1 6±2 7±2 5±2 8±2 6±1 27±5* 33±6* 39±1* 50±10* Доля ПХЭ от общего кол-ва зритроцитов 0,50±0.00 0,50±0,02 0,51±0,01 0,50±0,01 0,51±0,01 0,50±0,01 0,50±0,01 0,50±0,02 0,48±0,01* 0,48±0,01 0,48±0,00* 0,48±0,01 Кол-во ПХЭ с микроядрами, % 0,23±0,09 0,13±0,06 0,17±0,03 0,16±0.06 0,17±0,06 0,13±0,04 0,20±0,05 0,14±0,03 0,68±0,13* 0,83±0,14* 0,98±0,03* 1,24±0,24* *р<0,05 (тест Манна-Уитни), Контроль 1 - Этилметан Сульфонат, контроль 2 - Циклофосмфамид

Исследуемые дозы не оказывали общетоксического действия и токсического действия на гемопоэз. Результаты исследования свидетельствуют об отсутствии способности тестируемого объекта оказывать повреждающее действие на хромосомы или митотический аппарат эритробластов у используемой животной модели, при введении в предполагаемой клинической дозе (40 мкг) и при введении в дозах, превышающих предполагаемую клиническую в 4 и 8 раз (160 мкг и 320 мкг, соответственно).

Исследование генотоксичности вакцины также проводилось в тесте Эймса на аутбредных крысах SD (30 самцах и 30 самках). Тестируемый образец рассматривают как обладающим мутагенной активностью, если он вызывает воспроизводимое, зависящее от дозы и статистически достоверное увеличение частоты мутаций по сравнению с соответствующими отрицательными контролями у одного или более штаммов в условиях метаболической активации или без нее, по меньшей мере, в двух независимых экспериментах. При этом число ревертантных колоний на чашку в опыте должно в 2 или более раз превышать число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле в случае штаммов ТА97, ТА98, ТА100, ТА102 и в 3 или более раз в случае ТА1535. Положительные результаты в тесте оценки обратных мутации на бактериях свидетельствуют о том, что вещество индуцирует точковые мутации типа замены пар оснований или сдвига рамки считывания в геноме Salmonella typhimurium.

Неопределенный результат отмечается тогда, когда при одной или более дозах, по меньшей мере, на одном штамме наблюдается повышенное количество ревертантных колоний на чашку в опыте, по сравнению с отрицательным контролем, но отсутствует отчетливая зависимость доза-эффект. Испытуемое вещество, результаты исследования которого не соответствуют вышеупомянутым критериям, рассматривается как не мутагенное в данном тесте. Статистический анализ проводили, используя критерий Даннетта t и ранговый метод Спирмена (при α=0,05).

Тест Даннетта t показал отсутствие значимого повышения частоты обратных генных мутаций при действии вакцины и адъюванта по сравнению с отрицательным контролем при α = 0,05 в условиях эксперимента. Методом Спирмена не выявлено значимой монотонной зависимости повышения количества ревертантов от концентрации ни для одного из штаммов при α = 0,05.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что число ревертантных колоний на чашках при действии вакцины и адъюванта, сопоставимо с числом спонтанных ревертантных колоний на чашках в отрицательных контрольных вариантах, как в условиях метаболической активации, так и в ее отсутствии. Таким образом, вакцина против COVID-19, вызываемого вирусом SARS-CoV-2, на основе вирусоподобных частиц и адъювант не проявляли способности к индукции точковых мутаций у исследуемых штаммов Salmonella typhimurium в концентрациях 0,05-5,0 мкл/чашка, что свидетельствуют об отсутствии способности тестируемых образцов вызывать генные мутации в условиях проведенных экспериментов.

Таким образом, разработанная вакцина обладает высоким уровнем безопасности, вызывает гуморальный и Т-клеточный иммунитет и может быть использована для вакцинации и ревакцинации.

Похожие патенты RU2828323C1

название год авторы номер документа
Вирусоподобные химерные частицы для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащие белки коронавируса и ротавируса 2022
  • Гребенникова Татьяна Владимировна
  • Елисеева Олеся Васильевна
  • Латышев Олег Евгеньевич
  • Черепушкин Станислав Андреевич
  • Цибезов Валерий Владимирович
  • Лебедева Варвара Викторовна
  • Ларичев Виктор Филиппович
  • Мусиенко Мария Ивановна
  • Прилипов Алексей Геннадьевич
  • Воркунова Галина Константиновна
  • Федякина Ирина Тимофеевна
  • Савочкина Татьяна Евгеньевна
  • Чернорыж Яна Юрьевна
  • Леснова Екатерина Ивановна
  • Ожмегова Екатерина Никитична
  • Филатов Илья Евгеньевич
  • Норкина Светлана Николаевна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2779810C1
Рекомбинантные вирусоподобные частицы для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 2021
  • Гребенникова Татьяна Владимировна
  • Елисеева Олеся Васильевна
  • Латышев Олег Евгеньевич
  • Савочкина Татьяна Евгеньевна
  • Цибезов Валерий Владимирович
  • Черепушкин Станислав Андреевич
  • Лебедева Варвара Викторовна
  • Ларичев Виктор Филиппович
  • Мусиенко Мария Ивановна
  • Южакова Ксения Андреевна
  • Куликова Надежда Юрьевна
  • Алтаева Эржена Георгиевна
  • Воркунова Галина Константиновна
  • Федякина Ирина Тимофеевна
  • Чернорыж Яна Юрьевна
  • Леснова Екатерина Ивановна
  • Аканина Дарья Сергеевна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2769224C1
Иммунобиологическое средство на основе вирусоподобных частиц для индукции специфического иммунитета против инфекции, вызываемой ротавирусом А человека 2022
  • Гребенникова Татьяна Владимировна
  • Елисеева Олеся Васильевна
  • Латышев Олег Евгеньевич
  • Черепушкин Станислав Андреевич
  • Савочкина Татьяна Евгеньевна
  • Цибезов Валерий Владимирович
  • Лебедева Варвара Викторовна
  • Ларичев Виктор Филиппович
  • Мусиенко Мария Ивановна
  • Хаметова Кизхалум Маликовна
  • Южакова Ксения Андреевна
  • Куликова Надежда Юрьевна
  • Воркунова Галина Константиновна
  • Кондратьева Валерия Михайловна
  • Чернорыж Яна Юрьевна
  • Леснова Екатерина Ивановна
  • Норкина Светлана Николаевна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2795055C1
Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2743595C1
Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2743593C1
Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2743594C1
Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2738081C1
ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ КОРОНАВИРУСА БЛИЖНЕВОСТОЧНОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА (MERS-COV) И СПОСОБЫ 2014
  • Смит Гейл
  • Лю Е
  • Массаре Майкл
RU2685185C2
Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 и живая вакцина Enterococcus faecium L3-pentF-covid-19 2020
  • Гупалова Татьяна Виталиевна
  • Бормотова Елена Алексеевна
  • Леонтьева Галина Федоровна
  • Крамская Татьяна Анатольевна
  • Дешева Юлия Андреевна
  • Алехина Галина Геннадьевна
RU2745626C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ГРИППА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ COVID-19 И ГРИППА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ 2022
  • Сергеева Мария Валерьевна
  • Елшин Никита Дмитриевич
  • Романовская-Романько Екатерина Андреевна
  • Стукова Марина Анатольевна
  • Лиознов Дмитрий Анатольевич
RU2802058C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 828 323 C1

Реферат патента 2024 года Вакцина на основе вирусоподобных частиц (VLP) для профилактики COVID-19 для интраназального применения

Группа изобретений относится к области к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описана интраназальная вакцина на основе вирусоподобных частиц, состоящая из смеси вирусоподобных частиц и фармацевтически приемлемого буфера. Вирусоподобные частицы состоят из четырёх структурных белков S, M, N, E SARS-CoV-2, где S белок выбран из вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2. Также разработан способ профилактики COVID-19, включающий введение вакцины интраназально трижды с интервалом между введениями 21 день. Группа изобретений обеспечивает создание интраназальной вакцины, обладающей иммуногенностью, достаточной для формирования иммунного ответа против COVID-19, способностью индуцировать гуморальный и клеточный иммунный ответ, стимулировать защитный иммунитет слизистых оболочек, а также имеющей дополнительное преимущество простоты введения по сравнению с инъекционными формами. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 8 пр.

Формула изобретения RU 2 828 323 C1

1. Интраназальная вакцина на основе вирусоподобных частиц для профилактики COVID-19, состоящая из:

- рекомбинантных вирусоподобных частиц, содержащих на поверхности S белок, вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии – 80-120 мкг;

- калия дигидрофосфата – 0,63 мг;

- динатрия гидрофосфата – 0,65 мг;

- натрия хлорида – 3,84 мг;

- калия хлорида – 0,09 мг;

- кальция хлорида – 0,02 мг;

- трис(гидроксиметил)аминометана-HCl – 0,03 мг;

- тиомерсала – 4,00 мкг;

- воды для инъекций – до 0,5 мл.

2. Интраназальная вакцина по п. 1, где вакцина не содержит адъюванта.

3. Интраназальная вакцина по любому из пп. 1-2, где количество антигена в вакцине на дозу выбрано из 80, 90, 100, 110, 120 мкг.

4. Способ профилактики COVID-19, включающий введение вакцины по любому из пп. 1-3 интраназально трижды с интервалом между введениями 21 день.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2828323C1

WO 2022046633 A1, 03.03.2022
Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 2021
  • Лысенко Андрей Александрович
  • Седова Елена Сергеевна
  • Алексеева Светлана Викторовна
  • Щербинин Дмитрий Николаевич
  • Тутыхина Ирина Леонидовна
  • Верховская Людмила Викторовна
  • Артемова Элина Алексеевна
  • Шмаров Максим Михайлович
  • Народицкий Борис Савельевич
  • Логунов Денис Юрьевич
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2751485C1
WO 2021248145 A2, 09.12.2021
WO 2021229311 A1, 18.11.2021
Ю.А.БЕЛИКОВА, Ю.В.САМСОНОВ, Е.В.АБАКУШИНА, СОВРЕМЕННЫЕ ВАКЦИНЫ И КОРОНАВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, Исследования и практика в медицине, 2020, т.7, N4, с
Способ обделки поверхностей приборов отопления с целью увеличения теплоотдачи 1919
  • Бакалейник П.П.
SU135A1
Е.В
ЗУЕВ, О.Л
ЕВДОКИМОВА и др., Сравнительная оценка безопасности

RU 2 828 323 C1

Авторы

Гребенникова Татьяна Владимировна

Кондратьева Валерия Михайловна

Чернорыж Яна Юрьевна

Елисеева Олеся Васильевна

Латышев Олег Евгеньевич

Савочкина Татьяна Евгеньевна

Лебедева Варвара Викторовна

Плотников Алексей Андреевич

Цибезов Валерий Владимирович

Черепушкин Станислав Андреевич

Филатов Илья Евгеньевич

Ларичев Виктор Филиппович

Федякина Ирина Тимофеевна

Норкина Светлана Николаевна

Костина Людмила Владимировна

Зайкова Ольга Николаевна

Хаметова Кизхалум Маликовна

Баландина Марина Владимировна

Плотникова Елена Михайловна

Леснова Екатерина Ивановна

Юрлов Кирилл Иванович

Аканина Дарья Сергеевна

Козлова Алина Александровна

Баранец Марина Сергеевна

Лосич Милана Анатольевна

Мельниченко Анна Валерьевна

Гинцбург Александр Леонидович

Даты

2024-10-09Публикация

2024-04-27Подача