Радиолигандный способ количественной оценки активности бета-адренорецепторов на поверхности лимфоцитов человека Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины. Более конкретно, изобретение обеспечивает модифицированный радиолигандный способ количественной оценки активности связывания β-адренорецепторов (β-АР) на поверхности лимфоцитов человека, позволяющий достоверно определять специфическое связывание с β1-адренорецепторами (β1-AP) и β2-адренорецепторами (β2-АР) при их малых концентрациях, на основе которого возможно выполнение анализов в рамках клинических исследований.

Уровень техники

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и бронхиальная астма (БА) и являются широко распространенными заболеваниями, которые представляют собой серьезную медицинскую и социальную проблему: по данным Всемирной организации здравооохранинения (ВОЗ) в 2019 году число больных ХОБЛ в возрасте 30-79 лет во всем мире оценено 391,9 млн., из которых 315,5 млн. (80,5%) проживают в странах с низким и средним доходом населения. ХОБЛ стала третьей по значимости (3,23 млн. случаев) причиной смертности после онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний (примерно по 18 млн.) (Adeloye D., Song P., Zhu Y., Campbell H., Sheikh A., Rudan I. Global, regional, and national prevalence of, and risk factors for, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in 2019: a systematic review and modeling analysis. II Lancet Respir. Med. - 2022. - V.10, Iss.5. - P.447-458).

В том же году ВОЗ зарегистрировано 262 млн. больных БА и 455 тыс.смертельных исходов этого заболевания (Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. // Lancet. - 2020. - V.396, Iss. 10258. - P. 1204-1222). Особую обеспокоенность вызывает высокая распространенность БА среди детей по сравнению с остальными возрастными группами.

Ключевой особенностью этих заболеваний является развитие обструкции дыхательных путей. Развитие морфофункциональных изменений при ХОБЛ и БА связаны с формированием локального и системного хронического воспаления в дыхательных путях (Barnes P.J. Cellular and molecular mechanisms of asthma and COPD. // Clinical science. - 2017. -V.131 (13). - P. 1541-1558; Eliseeva T.I., Tush E.V., Krasilnikova S.V., Kuznetsova S.V., Larin R.A., Kubysheva, N.I., Khaletskay O.V., Potemina Т.Е., Ryazantsev S.V., Ignatov S.K. Metabolism of the Extracellular Matrix in Bronchial Asthma.// Sovremennye Tehnologii v Medicine. - 2018. - V. 10 (4).- P. 220).

При этом воспаление дыхательных путей при БА и ХОБЛ заметно различается. Астма характеризуется активацией тучных клеток и Т-хелперов 2-го типа, эозинофильной инфильтрацией в дыхательных путях. При ХОБЛ, как правило, в дыхательных путях наблюдается инфильтрация нейтрофилов и макрофагов, которая вызывается Т-хелперами, клетками типа 1 и 17 и Т-клетками CD8 (Lane N., Robins R. A., Corne J., Fairclough L. Regulation in chronic obstructive pulmonary disease: the role of regulatory T-cells and Th17 cells. // Clin. Sci. - 2010. - V. l 19(2). - P. 75-86).

На молекулярном уровне в патологию БА и ХОБЛ вовлечены АР, которые по структуре относятся к группе рецепторов, соединенных с гуанин-нуклеотид связывающими белками (G-белок). На тканевом уровне в легких присутствуют преимущественно Р2-АР (Sano М., Yoshimasa Т., Yagura Т., Yamamoto I. Non-homogeneous distribution of beta 1- and beta 2-adrenoceptors in various human tissues. // Life Sci. - 1993. - Vol.52(12). - P. 1063-1070), которые также имеются и на поверхности лимфоцитов. Поэтому для диагностики и лечения Б А и ХОБЛ большое значение имеют характеристики β2-АР, такие как их плотность на поверхности клеток и активность.

Отмечено, что при заболеваниях бронхо-легочной системы у пациентов уже имеется исходно измененный фон активности АР. В основе терапии таких заболеваний часто лежат β-адреномиметики, которые для соответствующих рецепторов являются лигандами. Изменения экспрессии и аффинности рецепторов, происходящие под воздействием соответствующих препаратов, часто приводят к снижению эффективности назначенной терапии, а в ряде случаев - к развитию серьезных побочных эффектов, таких как бронхоспазм.

Взаимодействие «лиганд-рецептор» зависит от типа лиганда (агонист или обратный агонист) и проявляется в изменении клеточной активности. Агонисты, связываясь с рецептором, активируют G-белок и увеличивают внутриклеточное содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Одновременно с возникновением клинического эффекта данные изменения в клетке также вызывают изменение активности рецептора. Зачастую назначение агонистов приводит к снижению чувствительности рецепторов к лиганду и их десенситизации (Mickey J., Tate R., Lefkowitz J. Subsensitivity of adenylate cyclase and decreased beta-adrenergic receptor binding after chronic exposure to (-)isoproterenol in vitro. II J. biol. С hem. - 1975. - V.250. - P. 5727-5729), что в ряде случаев вызывает неблагоприятное изменение клинического течения заболевания в виде утяжеляющейся бронхиальной обструкции и отсутствии ответа на проводимую терапию.

Применение антагонистов, напротив, приводит к повышению плотности β-АР на поверхности клеток и может повлиять на их аффинность (Парфенова Е.Ф., Красникова Т.Л., Арипова Н.А. и др. II Гер. Архив. - 1993. - Т. 65(4). - С. 49-52).

В результате исследований, описанных в статье Bishopric N., Cohen Н., Lefkowitz R. Beta adrenergic receptors in lymphocyte subpopulations. // J. Allergy and Clin. Immun. - 1980. V.65(1). - P. 29-33, было установлено, что периферические В- и Т-лимфоциты имеют приблизительно равную плотность бета-адренорецепторов и показывают сопоставимо сильные ответы на изопротеренол, стимулирующий внутриклеточное накопление цАМФ, уменьшающее иммунный цитолиз.

Для специфического связывания популяций лимфоцитов, обогащенных В- или Т-клетками, с (-)-[³Н]-дигидроалпренололом ([³H]DHA, специфичный бета-антагонист с высоким сродством), а также для исходной смеси без разделения при насыщении были определены следующие характеристики:

В заключение авторы отмечают, что различия в содержании рецепторов, отмечаемые в популяциях лимфоцитов при различных заболеваниях не могут быть отнесены к различиям в соотношении В- и Т-субпопуляций, но могут отражать изменения, характерные именно для патологического состояния.

В статье Landmann R.M.A., Burgisser Е., Wesp М., Buhler F.R. Beta-Adrenergic Receptors are Different in Subpopulations of Human Circulating Lymphocytes. // J. Receptor. Res. - 1984. - V.4. - P. 37-50 приведены результаты исследований зависимостей специфического и неспецифического связывания В-клеток и Т-клеток с (±)¹²⁵I-цианопиндололом ([¹²⁵I]CYP) от его концентрации (пМ), представленные на Фиг. 1. Для специфического связывания (сплошные линии) зависимости имеют вид кривых насыщения, и связывание В-клеток с лигандом примерно в 2,5 раза выше, чем для Т-клеток. Для неспецифического связывания (пунктирные линии) зависимости являются линейными, а указанное различие менее выражено.

Для популяций лимфоцитов, отсортированных непосредственно цитофлуорографически (В-клетки) и после иммунофлуоресцентного мечения моноклональными антителами против фенотипов Т-, Т-хелперных (Th) и Т-суппрессорных (Ts) клеток, по результатам инкубации с [¹²⁵I]CYP были определены параметры связывания и соотношения рецепторов в клетках, имеющие следующие значения:

Для В-лимфоцитов число сайтов связывания в 2,6 раза больше, а константа диссоциации в 1,5…3 раза выше по сравнению с Т-лимфоцитами. Таким образом, возможность оценки характеристик Т-лимфоцитов по показателям суммарных лимфоцитов не является очевидной.

Кроме того, следует отметить, что способ, раскрытый в рассматриваемой статье, позволяет оценивать только экспрессию АР, но не активность связывания, под которой понимают способность рецептора связывать регистрируемое количество меченого лиганда в строго определенных условиях, выраженное в имп/(мин ⋅ 10⁶) клеток. Данный параметр является интегральным, то есть зависящим от изменения экспрессии и аффинности рецепторного аппарата и функциональным, поскольку измеряемое изменение активности связывания отражает реакцию рецепторной системы на воздействие специфических лигандов или лекарственных средств.

Из уровня техники известен способ селективной количественной оценки активности связывания β1-АР на поверхности лимфоцитов человека, раскрытый в патентной публикации ЕА 026837 (опубл. 31.05.2017), при осуществлении которого для оценки активности связывания β-AP по специфическому связыванию [¹²⁵I]CYP клетками, определяют разность связывания [¹²⁵I]CYP клетками в присутствии 1,5-2,0 мкМ нерадиоактивного цианопиндолола и связывания [¹²⁵I]CYP клетками в присутствии 0,20-0,28 мкМ β1-специфического лиганда CGP-20712 (химическое название - дигидрохлорид [2-((3-карбамоил-4-гидрокси)фенокси)этиламино]-3-[4-(1-метил-4-трифторметил-2-имидазолил)фенокси]-2-пропанола), для чего реакционную смесь, содержащую водный раствор [¹²⁵I]CYP, фосфатный буферный раствор (PBS), раствор немеченого лиганда (цианопиндолола или CGP-20712) и суспензию клеток инкубируют в течение 45-60 мин при 37°С при осторожном перемешивании, процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют в тех же условиях, супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS и центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 мин, супернатант отбрасывают, а осадок просчитывают на γ-счетчике, измеряя количество радиоактивного материала в каждой пробе, после чего вычисляют активность связывания β1-АР по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн клеток.

Для количественной селективной оценки активности связывания β2-АР определяют разность связывания [¹²⁵I]CYP клетками в присутствии 1,5-2,0 мкМ нерадиоактивного цианопиндолола и связывания [¹²⁵I]CYP клетками в присутствии 0,14-0,18 мкМ β2-специфического лиганда ICI 118551 (химическое наименование гидрохлорид (±)-эритро-(S*,S*)-1-[2,3-(дигидро-7-метил-1Н-инден-4-ил)окси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-бутанола), для чего реакционную смесь, содержащую водный раствор [¹²⁵I]CYP, PBS, раствор немеченого лиганда (цианопиндолола или ICI 118551) и суспензию клеток, инкубируют в течение 45-60 мин при 37°С при осторожном перемешивании, процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют в тех же условиях, супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS и центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 мин, супернатант отбрасывают, а осадок просчитывают на γ-счетчике, измеряя количество радиоактивного материала в каждой пробе, после чего вычисляют активность связывания β2-АР по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток. Недостатком данного технического решения является низкая чувствительность в отношении β1-AP.

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения его авторы рассматривают способ радиолигандного определения активности связывания β1-AP Т-лимфоцитов человека, предложенный в патентной публикации ЕА 036081 (опубл. 23.09.2020), для осуществления которого проводят:

а) забор у объекта крови из периферической вены;

б) выделение Т-лимфоцитов общепринятым способом;

в) постановку четырех параллельных анализов, при этом в первом из них к среде, содержащей Т-лимфоциты, добавляют воду, во втором в избытке добавляют «холодный» цианопиндолол, в третьем добавляют β1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом добавляют β2-АР лиганд ICI 118551;

г) инкубацию в течение 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;

д) добавление ко всем четырем предварительно инкубированным реакционным смесям по 100 мкл [¹²⁵I]CYP;

е) остановку реакции добавлением холодной воды;

ж) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 мин с отбрасыванием супернатанта;

з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) PBS с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;

и) суспендирование осадка в холодном (+4°С) PBS с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 мин с отбрасыванием супернатанта;

к) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе;

л) вычисление активности связывания β1-АР по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток.

Исследования перспектив клинического применения способа, раскрытого в ЕА 036081, выявили его основной недостаток, заключающийся в существенных затратах времени на стадии пробоподготовки. В частности, стадия выделения слоя мононуклеарных клеток (суммарных лимфоцитов) занимает 85 минут. Дальнейшее выделение Т-лимфоцитов предполагает инкубацию ранее полученного и ресуспендированного центрифугата лимфоцитов со смесью антител Pan Т Cell Biotin Antibody Cocktail в течение 7 минут, последующую инкубацию смеси с магнитными частицами Pan Т Cell MicroBeard Cocktail в течение 15 минут, пропускание полученной суспензии через магнитные колонки и магнитную сепарацию, что требует времени, сопоставимого с предыдущей стадией. Последующие стадии прединкубации со специфическими лигандами и радиолигандного анализа занимают 45 минут и 90 минут соответственно. Таким образом, на долю подготовительных стадий приходится 60% общего времени выполнения анализа: осаждение эритроцитов и выделение Т-лимфоцитов занимают по 30% всего времени, что является существенным недостатком.

Специалисту в области клинического анализа очевидно, что при идентичных аналитических областях и сопоставимых оценках специфичности, пределов обнаружения и определения, правильности, прецизионности и устойчивости предпочтителен наиболее экспрессный метод анализа. Исходя из этого, следует разработать радиолигандный способ количественной оценки активности β-АР на поверхности лимфоцитов человека, лишенный указанного недостатка известного технического решения, который будет иметь перспективы клинического применения.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлены зависимости специфического и неспецифического связывания В-клеток и Т-клеток с [¹²⁵I] от его концентрации (пМ), приведенные в публикации Landmann R.M.A., Btirgisser Е., Wesp М., Btihler F.R. Beta-Adrenergic Receptors are Different in Subpopulations of Human Circulating Lymphocytes. // J. Receptor. Res. - 1984. - V.4. - P. 37-50)

На Фиг. 2 представлена корреляция количественной оценки (процент связывания) активности β2-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека с активностью β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов для выборки здоровых добровольцев.

Раскрытие сущности изобретения

Целью заявляемого изобретения является разработка радиолигандного способа количественной оценки активности β2-АР на поверхности лимфоцитов человека с улучшенной экспрессностью.

Первым техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для количественной оценки активности β2-АР на поверхности лимфоцитов человека.

Вторым техническим результатом изобретения является способ количественной оценки активности 02-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека по корреляции с активностью β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов.

В результате проведения обширных исследований авторы настоящего изобретения адаптировали способ радиолигандного определения активности связывания β1-АР Т-лимфоцитов человека, раскрытый в ЕА 036081, для определения активности связывания β2-АР суммарных лимфоцитов человека.

Также на образцах крови здоровых добровольцев авторы изобретения неожиданно выявили статистически достоверную корреляцию активности связывания β2-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека с активностью связывания β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов, что позволило упростить стадию пробоподготовки и ускорить ее проведение. Данный факт улучшает перспективы клинического применения заявляемого способа после его апробации на образцах крови пациентов, страдающих БА, ХОБЛ и другими бронхо-легочными заболеваниями, и последующей валидации.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ радиолигандного определения активности связывания β2-адренорецепторов (β2-АР) лимфоцитов человека, для осуществления которого проводят:

а) забор у объекта крови из периферической вены;

б) центрифугирование крови при 500 об/мин в течение 5-10 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов с получением плазмы, обогащенной лейкоцитами и лимфоцитами;

в) наслаивание полученной плазмы на Histopaque-1077 и центрифугирование при 400 g при комнатной температуре в течение 25 мин с получением интерфазного кольца, содержащего пул суммарных лимфоцитов;

г) постановку четырех параллельных анализов с добавлением в каждом из них [¹²⁵I]цианопиндолола ([¹²⁵I]CYP) к среде, содержащей пул суммарных лимфоцитов:

в первом анализе добавляют воду, во втором анализе в избытке добавляют «холодный» цианопиндолол, в третьем анализе добавляют β1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом анализе добавляют β2-АР лиганд ICI 118551 и проводят инкубацию каждого анализируемого образца в течении 25-30 минут при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;

д) остановку реакции добавлением холодной воды;

е) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 минут с отбрасыванием супернатанта;

ж) суспендирование осадка в холодном (+4°С) физиологическом растворе с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;

з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) физиологическом растворе с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 минут с отбрасыванием супернатанта;

и) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе и

к) вычисление активности связывания β2-АР по результатам четвертого анализа по разности общего связывания и бета-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток.

В соответствии с изобретением осуществляют способ радиолигандного определения активности связывания β2-адренорецепторов (β2-АР) суммарных лимфоцитов человека. В качестве способа сравнения выбирают адаптированный способ радиолигандного определения активности связывания β1-АР Т-лимфоцитов человека, раскрытый в описании изобретения к патенту ЕА 036081, путем замены фосфатного буферного раствора (PBS) на натрия хлорида 0,9% раствор в воде очищенной стерилизованный (физиологический раствор, ФР). Авторы установили, что указанная замена не влияет на аналитические характеристики способа. Не ограничиваясь данным объяснением, авторы полагают, что стабилизация рН буферным раствором не имеет принципиального значения вследствие низких концентраций компонентов анализируемых растворов и их достаточной химической стабильности в среде, близкой к нейтральной.

В результате осуществления способа в соответствии с заявляемым изобретением и способа сравнения установлена корреляция с коэффициентом корреляции R = 0,598 (Фиг. 2) активности связывания β2-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека с активностью связывания β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов человека, наличие которой неочевидно для среднего специалиста в данной области, ознакомленного с уровнем техники.

Существенный разброс значений активности связывания обусловлен сложным совместным влиянием факторов индивидуальных особенностей организма каждого добровольца, которое не может быть заранее оценено и учтено. Тем не менее, при назначении препаратов, влияющих на β2-АР, и корректировке режимов их введения клиническое значение имеют не абсолютные показатели активности связывания, а динамические изменения полученных значений при проведении терапии.

Существование установленной корреляции позволяет связать результаты, полученные для суммарных лимфоцитах, с динамикой изменения в Т-лимфоцитах периферической крови и экстраполировать количественные характеристики β-АР лимфоцитарного звена на легкие. Ранее было продемонстрировано снижение β-АР в легких под действием β-агонистов, что соответствует изменениям, происходящим в циркулирующих мононуклеарных лейкоцитах.

Осуществление изобретения

A. Материалы

Для анализа применяют специфические лиганды: CGP-20712 (β1-адреноблокатор), ICI 118551 (β2-адреноблокатор) и цианопиндолол, полученные от фирмы Sigma (США). Радиоактивный изотоп [¹²⁵I] в виде иодида натрия с молярной активностью более 2000 Ки/ммоль получен от фирмы В/О «Изотоп» (РФ). Остальные реактивы, использованные в исследованиях, были квалификации не ниже ч.д.а.

Б. Добровольцы

Все добровольцы перед включением в исследование подписывают информированное согласие в соответствии со всеми правилами этического положения Хельсинской декларации и Национальным стандартом Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика» по ГОСТ Р 52379-2005.

В исследование включены 15 здоровых добровольцев старше 18 лет и не принимавшие препараты, воздействующие на β-адренорецепторы. Все участвующие проходят врачебный осмотр и обследование с помощью стандартных методик оценки состояния бронхо-легочной системы перед забором крови.

B. Получение [¹²⁵I]-цианопиндолола

Введение радиоактивного изотопа ¹²⁵I в молекулу цианопиндолола проводят модифицированным способом, описанным в статье Greenwood F. С, Hunter W. М. The preparation of labelled human growth hormone of high specific radioactivity. // Biochem. J. - 1963.-V.89(1). - P. 114-123.

Реакционная смесь для радиоиодирования содержит 1 мкг цианопиндолола, 0,2М калий-фосфатный буфер (рН 7,0), 1 мКи Na¹²⁵I в объеме 50 мкл. Реакцию инициируют добавлением 10 мл раствора хлорамина Т (10 мг/мл). Длительность инкубации при комнатной температуре составляет 1 мин. Реакцию останавливают добавлением 10 мкл тиосульфата натрия (20 мг/мл) и после 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 1 мкл раствора «холодного» йодида натрия (6 мг/мл).

Целевой продукт выделяют ВЭЖХ (хроматограф производства фирмы Gilson, Франция) на колонке Nucleosil 100 С-18 (5 мкм, 150 мм) в ион-парном режиме. Буфер А: 10% уксусная кислота, буфер Б: 100% ацетонитрил. Элюирование осуществляют градиентом концентрации ацетонитрила от 0 до 100% за 20 минут с расходом 0,5 мл/мин. Детектирование элюата производят по УФ-поглощению при 280 нм и по проточному детектору радиоактивности. Фракции, содержащие [¹²⁵I]цианопиндолол, объединяют, выпаривают досуха, растворяют в 70% этаноле и хранят при -20°С.

Г. Забор крови и выделение мононуклеарных клеток

У добровольца из периферической вены забирают кровь в 2 вакуумные пробирки S-Monovette К3ЭДТА (Sarstedt, Германия) объемом 9 мл. Кровь центрифугируют при 500 об/мин в течение 5-10 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов и получают плазму, обогащенную лейкоцитами и лимфоцитами.

Плазму из двух пробирок (18 мл) отбирают и аккуратно наслаивают на 15 мл Histopaque-1077 (Sigma, США; кат. № Н8889), содержащегося в пробирке объемом 50 мл. Для работы используют стерильные пробирки, стерильные пипетки или пипетки с дозатором. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 25 минут на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки (лимфоциты) в чистые пробирки объемом 50 мл.

Суспензию лимфоцитов однократно отмывают 30 мл буфера PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,2, 2 мМ ЭДТА; autoMACS Rinsing solurion, Miltenyi Biotec, Германия, кат. №130-091-222) и центрифугируют 10 минут при 400 g. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 500 мкл буфера PBS и переносят в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки эппендорф, используя автоматическую пипетку и наконечники с фильтром. Центрифугируют 10 мин при 400 g при комнатной температуре. Надосадочную жидкость аккуратно удаляют и получают интерфазное кольцо, содержащее пул суммарных лимфоцитов.

Д. Выделение Т-лимфоцитов для примера сравнения

Интерфазное кольцо, полученное как раскрыто в разделе Г., используют для выделения Т-лимфоцитов с помощью набора Pan Т cell isolation kit (human) (Miltenyi Biotec, Германия, кат. №130-096-535), согласно инструкции к набору. Для этого осадок в пробирке ресуспендируют в 40 мкл буфера PBS-BSA и добавляют 10 мкл смеси антител (Pan Т Cell Biotin Antibody Cocktail), хорошо перемешивают и инкубируют 7 мин в холодильнике при температуре 2-8°С. В пробирку к полученной смеси добавляют 30 мкл буфера PBS-BSA и 20 мкл магнитных частиц (Pan Т Cell MicroBeard Cocktail), аккуратно перемешивают и инкубируют 15 мин в холодильнике при температуре 2-8°С. Далее в пробирку добавляют 500 мкл буфера PBS-BSA, перемешивают и пропускают полученные суспензии через магнитные колонки, заранее промытые буфером PBS-BSA. Магнитную сеперацию проводят с применением сепаратора OctoMACS (Miltenyi Biotec, Германия, кат. №130-042-201) согласно инструкции производителя. Проходящий раствор (Т-клетки) собирают в пробирку.

Раствор из пробирки (500 мкл) переносят в эппендорф, добавляют 500 мкл питательной среды 199, хорошо перемешивают. Из полученного объема (1 мл) отбирают 10 мкл в отдельный эппендорф для подсчета клеток (приблизительно 106 клеток/мл). Полученные клетки хранят в холодильнике при 4°С в течение не более 24 часов до использования в радиолигандном анализе.

E. Предынкубация со специфическими лигандами

В примере в соответствии с заявляемым изобретением суспензия клеток содержит полный пул суммарных лимфоцитов, полученный как раскрыто в разделе Г. В примере сравнения суспензия клеток содержит Т-лимфоциты, полученные как раскрыто в разделе Д.

В четыре отдельно взятых эппендорфа помещают:

(1) 10 мкл воды,

(2) 10 мкл водного раствора «холодного» цианопиндолола с концентрацией в интервале 10^-6⋅10^-8 М, содержащего избыток «холодного» цианопиндолола,

(3) 10 мкл 0,20-0,28 мкМ β1-специфического лиганда CGP-20712 (химическое название - дигидрохлорид [2-((3-карбамоил-4-гидрокси)фенокси)этиламино]-3-[4-(1-метил-4-трифторметил-2-имидазолил)фенокси]-2-пропанола) и

(4) 10 мкл 0,14-0,18 мкМ β2-специфического лиганда ICI 118551 (химическое название - гидрохлорид (±)-эритро-(8*,8*)-1-[2,3-(дигидро-7-метил-1Н-инден-4-ил)окси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-бутанола).

В каждый эпендорф вносят 100 мкл ФР (ООО «Гротекс», РФ) и 100 мкл суспензии клеток с концентрацией 5-10 млн/мл.

Смеси инкубируют в течение 25-30 минут при 37°С и осторожном перемешивании на шейкере со скоростью 100 об/мин. Процесс останавливают добавлением холодной воды со льдом (+4°С), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 минут, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) ФР и вновь центрифугируют в тех же условиях.

Супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном ФР и центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 минут и отбрасывают супернатант.

Ж. Радиолигандный анализ активности связывания β-адренорецепторов

В примере в соответствии с изобретением и в сравнительном примере каждый из осадков (1)-(4) после центрифугирования разбавляют ФР до концентрации 10 млн/мл и 100 мкл клеточной суспензии и осторожно перемешивают на шейкере со скоростью 100 об/мин. Затем в реакционную смесь добавляют 100 мкл раствора [¹²⁵I]CYP с концентрацией 1000 имп/(мин-мкл) и инкубируют 25-30 минут. Процесс останавливают добавлением в каждую пробу по 400 мкл холодной воды со льдом (+4 С). Для отмывки от не связавшейся радиоактивности клетки центрифугируют при 2000 g в течение 10 минут, осадок трижды промывают суспендированием в 200 мкл холодного ФР и центрифугированием в тех же условиях, после чего просчитывают на γ-счетчике Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer, США).

Пример значений γ-радиоактивностей, полученных при считывании осадка представлен ниже:

активность связывания β2-адренорецепторов по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн. клеток.

По разнице отсчетов Ni в пробирках i=1, 2, 3, 4 вычисляют общую специфическую активность связывания и активность связывания β1-AP и β2-АР:

Общая специфическая активность связывания рецепторов = N₁-N₂;

Активность связывания β₁-AP=N₁-N₃;

Активность связывания β₂-АР=N₁-N₄.

На суммарных лимфоцитах специфическая активность связывания рецепторов составляет 4831-2056=2775 имп/(мин⋅1 млн. клеток), активность связывания β1-AP составляет 4831-2979=1852 имп/(мин⋅1 млн. клеток) и активность связывания β2-АР составляет 4831-2874=1957 имп/(мин⋅1 млн. клеток).

На Т-лимфоцитах специфическая активность связывания рецепторов составляет 3679-855=2824 имп/(мин⋅1 млн. клеток), активность связывания β1-АР составляет 3679-1152=2527 имп/(мин⋅1 млн. клеток) и активность связывания β2-АР составляет 3679-1107=2572 имп/(мин⋅1 млн. клеток).

Абсолютные значения активности связывания 0-АР имеют очень большой разброс в обоих случаях. Так, на суммарных лимфоцитах медиана специфической активности связывания и [25; 75] активности связывания рецепторов равны 2775 и [2318; 3339] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β1-АР равны и 1852 [1656; 2425] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β2-АР равны 1957 и [1723; 2218] имп/(мин⋅1 млн. клеток).

На Т-лимфоцитах медиана и [25; 75] специфической активности связывания рецепторов равны 1366 и [1007; 2128] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β1-АР на Т-лимфоцитах равны 1361 и [965; 1844] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β2-АР равны 1466 и [883; 1959] имп/(мин⋅1 млн. клеток).

Изобретение относится к области медицины и обеспечивает модифицированный радиолигандный способ количественной оценки активности связывания β2-адренорецепторов (β2-АР) на поверхности лимфоцитов человека, при их малых концентрациях. Способ предусматривает следующие стадии: а) забор у объекта крови из периферической вены; б) центрифугирование крови при 500 об/мин в течение 5-10 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов с получением плазмы, обогащенной лейкоцитами и лимфоцитами; в) наслаивание полученной плазмы на Histopaque-1077 и центрифугирование с получением интерфазного кольца, содержащего пул суммарных лимфоцитов; г) постановку четырех параллельных анализов с добавлением в каждом из них [¹²⁵I]цианопиндолола ([¹²⁵I]CYP) к среде, содержащей пул суммарных лимфоцитов, причем в первом анализе добавляют воду, во втором анализе в избытке добавляют «холодный» цианопиндолол, в третьем анализе добавляют β1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом анализе добавляют β2-АР лиганд ICI 118551 и проводят инкубацию каждого анализируемого образца; д) остановку реакции добавлением холодной воды со льдом (+4°С); е) центрифугирование реакционной массы с отбрасыванием супернатанта; ж) суспендирование осадка в холодном (+4°С) физиологическом растворе (ФР) с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта; з) суспендирование осадка в холодном ФР с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 мин с отбрасыванием супернатанта; и) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе и к) вычисление активности связывания β2-АР по результатам четвертого анализа по разности общего связывания и бета-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток. Предложенный способ позволяет сократить время проведения анализа и имеет перспективы клинического аналитического применения. 2 ил., 3 табл.

Способ радиолигандного определения активности связывания β2-адренорецепторов (β2-АР) лимфоцитов человека, для осуществления которого проводят:

а) забор у объекта крови из периферической вены;

б) центрифугирование крови при 500 об/мин в течение 5-10 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов с получением плазмы, обогащенной лейкоцитами и лимфоцитами;

в) наслаивание полученной плазмы на Histopaque-1077 и центрифугирование при 400 g при комнатной температуре в течение 25 мин с получением интерфазного кольца, содержащего пул суммарных лимфоцитов;

г) постановку четырех параллельных анализов с добавлением в каждом из них [¹²⁵I]цианопиндолола ([¹²⁵I]CYP) к среде, содержащей пул суммарных лимфоцитов: в первом анализе добавляют воду, во втором анализе в избытке добавляют «холодный» цианопиндолол, в третьем анализе добавляют β1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом анализе добавляют β2-АР лиганд ICI 118551 и проводят инкубацию каждого анализируемого образца в течении 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;

д) остановку реакции добавлением холодной воды со льдом (+4°С);

е) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 мин с отбрасыванием супернатанта;

ж) суспендирование осадка в холодном (+4°С) физиологическом растворе (ФР) с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;

з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) ФР с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 мин с отбрасыванием супернатанта;

и) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе и

к) вычисление активности связывания β2-АР по результатам четвертого анализа по разности общего связывания и бета-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток.