Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ использования вируса болезни Ньюкасла в качестве внутреннего контрольного образца при постановке ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6844 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к использованию вируса болезни Ньюкасла в качестве внутреннего контрольного образца (ВКО) при постановке обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для выявления генома вируса бешенства.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко используется во всем мире при диагностике инфекционных заболеваний, в том числе в варианте ОТ-ПЦР, применяемом для обнаружения вирусов с РНК-геномом (РНК-вирусов).

На достоверность результатов, получаемых при проведении ПЦР-диагностики, могут влиять такие факторы как ошибки оператора, неполадки в работе амплификатора, наличие в образце ингибиторов ПЦР, низкое качество реактивов и т.п. [1]. Эти факторы могут приводить к появлению так называемых ложноотрицательных результатов, когда в ходе анализа получают отрицательный результат, несмотря на то, что искомый агент содержится в анализируемом образце. Одним из самых действенных методов, направленных на то, чтобы сделать ПЦР-анализ более достоверным, является использование внутренних контрольных образцов [2]. ВКО - это определенный объект, содержащий нуклеиновую кислоту, который добавляется к тестируемому образцу и проходит вместе с ним все или некоторые этапы анализа. При этом происходит специфическая амплификация фрагмента нуклеиновой кислоты этого объекта, по наличию которой можно судить о надлежащем ходе анализа.

В целом, использование ВКО широко применяется при ПЦР-диагностике различных патогенов. При этом существуют различные стратегии дизайна ВКО. Так, Coertse et al. [3] использовали искусственно синтезированную РНК, последовательность которой соответствовала фрагменту генома вируса бешенства штамма CVS. В качестве внутреннего контроля Smith et al. [4] использовали рибосомальную РНК, которая, по их утверждению, имеет кинетику деградации, сходную с вирусной РНК. В ряде работ описано применение ВКО из бактериофага MS2 [5, 6, 7, 8]. Наряду с этим использовались также полученные генно-инженерным способом вирусоподобные частицы [9, 10, 11]. Одним из классических объектов для ВКО являются плазмиды, содержащие вставку с участками, отвечающими праймерам для целевой ПЦР [12, 13, 14, 15].

При всем разнообразии применяемых для ВКО дизайнов, каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Так, искусственно синтезированная РНК [3] подвержена разрушительному действию РНК-рестриктаз, которые в норме в изобилии присутствуют в образце. Рибосомальная РНК, использованная Smith et al. [4], за счет развитых третичных структур в принципе более устойчива к действию рестриктаз, но насколько надежно и в каком спектре условий - остается неизученным. Бактериофаг MS2, будучи вирусной частицей, лишен этого недостатка, так как обладает белковой оболочкой, защищающей его от рестриктаз. Однако получение культуры фага трудоемко, а сама культура нуждается в постоянной поддержке. Искусственно созданные вирусоподобные частицы имеют много преимуществ, включая наличие белковой оболочки, нуклеотидной последовательности генома с заданными свойствами, нужным типом нуклеиновой кислоты. В то же время создание таких частиц высокотехнологично, а поддержание, опять же, трудоемко.

Изготовление плазмид, которые используются в качестве ВКО во многих отечественных коммерческих диагностикумах, при налаженном производстве не требует больших экономических затрат. Однако такая стратегия ограничивает тип нуклеиновой кислоты одной лишь ДНК, а в случае использования при диагностике РНК-вирусов исключается контроль такого важного этапа как обратная транскрипция.

Одной из наиболее удачных стратегий использования ВКО, сочетающей в себе многие преимущества других подходов, является использование гетерологичных вирусов. Во-первых, они обладают надежной белковой оболочкой, защищающей их от действия рестриктаз. Во-вторых, можно выбрать вирус с типом нуклеиновой кислоты, как у целевого вируса (ДНК/РНК, одна/две нити). В-третьих, это уже готовые биологические объекты, и их можно сравнительно легко размножать в культуре клеток. При использовании же готового препарата в виде вакцины, содержащей лиофилизированный гетерологичный вирус, исключаются даже этапы культивирования и титрования в культуре клеток. Кроме использования оптимального объекта для ВКО, необходим надлежащий дизайн синтетических олигонуклеотидных праймеров, а также оптимизированный способ выявления нуклеиновой кислоты ВКО, позволяющий получать высокоспецифичные и стабильные результаты.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ использования вируса диареи КРС в качестве внутреннего контрольного образца при проведении ПЦР-диагностики вируса гепатита С [16]. Главным недостатком этого способа является то, что вирус диареи КРС, который используется в ходе анализа, имеет явно выраженную склонность к контаминации клеточных культур и сывороток, используемых при культивировании вируса в лабораториях и на производстве [17], что может привести к негативным последствиям при его активном использовании.

Задачей настоящего изобретения являлся подбор оптимального внутреннего контрольного образца, разработка чувствительного и экономичного способа использования вируса болезни Ньюкасла в качестве внутреннего контрольного образца и синтетических олигонуклеотидных праймеров при постановке ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства.

Данная задача была решена благодаря созданию олигонуклеотидных праймеров, а также выбору оптимального ВКО, способных амплифицировать фрагмент генома ВКО при проведении целевой ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства, обеспечивающей получение результатов в короткие сроки (3 часа) и при незначительных материальных затратах, снижая до минимума манипуляции при исследовании разнообразного биологического материала (ткани головного и спинного мозга, культура клеток), пригодного для проведения исследований без возможности получения ложноотрицательных результатов; возможность использования широкого спектра амплификаторов, отвечающих минимальным требованиям для постановки ПЦР.

При разработке настоящего изобретения в качестве объекта для внутреннего контрольного образца был выбран штамм «Ла-Сота» вируса болезни Ньюкасла, входящий в состав сухой живой вакцины против этого заболевания, чем достигается снижение материальных затрат на получение ВКО. Основанием для такого выбора послужило то, что, будучи представителем семейства Paramyxoviridae, вирус болезни Ньюкасла, подобно вирусу бешенства, обладает геномом из однонитевой РНК негативной полярности. Кроме того, вакцина является фактически готовым к применению препаратом ВКО и требует только разбавления водой, поэтому выпадают такие трудоемкие этапы как культивирование и титрование вируса.

Сущность изобретения заключается в новом подходе к ПЦР-анализу для выявления генома вируса бешенства с использованием вируса болезни Ньюкасла штамма «Ла-Сота», в качестве внутреннего контрольного образца, и с использованием специально разработанных олигонуклеотидных праймеров (LASF107, LASR800), специфически фланкирующих фрагментов генома данного вируса. Для проведения амплификации представленный метод включает последовательности олигонуклеотидных праймеров, имеющих следующий нуклеотидный состав:

Характеристика олигонуклеотидных праймеров приведена в таблице 1.

При помощи указанных олигонуклеотидных праймеров (LASF107, LASR800) проводят ОТ-ПЦР (совместно с целевой ОТ-ПЦР для детекции вируса бешенства), в ходе которой образуются фрагменты ДНК определенной длины, что позволяет контролировать соблюдение всех условий для надлежащего проведения целевого анализа.

Изобретение может быть использовано в ветеринарии, клинической и лабораторной диагностике в качестве внутреннего контроля при постановке ОТ-ПЦР анализа, при проведении исследований на наличие в биологическом материале генома вируса бешенства.

Техническим результатом изобретения являются: расширенный спектр биологического материала (ткани головного и спинного мозга, культура клеток), пригодного для проведения исследований без возможности получения ложноотрицательных результатов; возможность использования широкого спектра амплификаторов, отвечающих минимальным требованиям для постановки ПЦР; сокращение времени для производства внутреннего контрольного образца.

В основе предложенного способа лежит образование специфического продукта, представляющего собой фрагменты ДНК определенной длины, наработанные в достаточном количестве, чтобы быть визуализированными в агарозном геле после проведения электрофореза, нуклеотидная последовательность которых соответствует последовательности участка гена NP вируса болезни Ньюкасла, штамма «Ла-Сота». При проведении ПЦР-анализа на выявление генома вируса бешенства, к тестируемому образцу добавляют 10 мкл суспензии вируса болезни Ньюкасла штамма «Ла-Сота», которую готовят согласно инструкции к вакцине, после чего проводят анализ. Данный анализ состоит из следующих этапов: выделение РНК, обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция, анализ продуктов ПЦР путем электрофореза в агарозном геле, согласно используемой методике выявления генома вируса бешенства. Наличие в продуктах ПЦР фрагмента ДНК размером 693 п. н. свидетельствует о корректном проведении анализа.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Определение чувствительности способа использования вируса болезни Ньюкасла в качестве внутреннего контрольного образца при постановке ОТ-ПЦР.

В качестве внутреннего контрольного образца использовали вакцину против болезни Ньюкасла штамм «Ла-Сота» (производство ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир). Для определения чувствительности способа была приготовлена серия десятикратных разведений данной вакцины на дистиллированной воде. При этом активность исходной вакцины составила (согласно паспорту на вакцину) 1,067×10⁶ ЭИД50/мл (эмбриональных инфекционных доз, вызывающих инфицирование в 50% случаев, на 1 мл).

Использовали разведения в соотношении исходная вакцина: дистиллированная вода:

1) 1:10;

2) 1:100;

3) 1:1000;

4) 1:10000;

5) 1:100000.

Из приготовленных разведений была выделена РНК с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» (производство ООО «Интерлабсервис», г. Москва) согласно инструкции производителя.

Для проведения обратной транскрипции приготовили смесь, состоящую из следующих компонентов (из расчета на 1 реакцию):

деионизированная вода 12 мкл буферный раствор для обратной транскриптазы (5х) 5 мкл дезоксинуклеотидтрифосфаты (по 10 мМ каждого) 2,5 мкл праймер LASF107 (10 пмоль/мкл) 1 мкл праймер LASR800 (10 пмоль/мкл) 1 мкл обратная транскриптаза 0,5 мкл

В 0,2 мл пробирки к 22 мкл смеси добавили по 3 мкл РНК из каждого разведения, перемешали и поместили пробирки в амплификатор на 40 мин при температуре 42°С.

Для проведения полимеразной цепной реакции была приготовлена смесь, состоящая из следующих компонентов (из расчета на 1 реакцию):

деионизированная вода 10,5 мкл буферный раствор для полимеразы (5х) 5 мкл раствор хлорида магния (25 мМ) 3 мкл дезоксинуклеотидтрифосфаты (по 10 мМ каждого) 1 мкл праймер LASF107 (10 пмоль/мкл) 1 мкл праймер LASR800 (10 пмоль/мкл) 1 мкл полимераза 0,5 мкл

В 0,2 мл пробирки к 22 мкл смеси добавляли по 3 мкл кДНК (продуктов обратной транскрипции), перемешали и поместили пробирки в амплификатор для 40 циклов амплификации, каждый из которых состоял из следующих шагов:

94°С 1 мин 55°С 1 мин 72°С 1 мин

После проведения амплификации по 5 мкл продуктов ПЦР визуализировали путем электрофореза в 2% агарозном геле.

В результате было установлено, что фрагменты ожидаемой длины (693 п.н.) были получены в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000 и 1:10000. Принимая наибольшее разведение, при котором был получен положительный результат, за чувствительность метода, получаем, что чувствительность метода составила 1,067×10² ЭИД50/мл (округленно - 1×10² ЭИД50/мл).

Пример 2. Применение синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа использования вируса болезни Ньюкасла в качестве внутреннего контрольного образца при постановке ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства.

Предлагаемые праймеры и способ были использованы при проведении ПЦР-анализа на наличие вируса бешенства в биологическом материале.

Было протестировано 52 положительных и 48 отрицательных на вирус бешенства образцов головного мозга различных животных. Статус образцов (наличие или отсутствие в образце вируса бешенства) был предварительно определен в реакции иммунофлуоресценции (РИФ).

Для этого была приготовлена 0,3% суспензия каждого образца на дистиллированной воде. К 50 мкл суспензии добавляли 10 мкл вакцины против болезни Ньюкасла штамма «Ла-Сота» (производство ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) и выделяли РНК с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» (производство ООО «Интерлабсервис», г. Москва) согласно инструкции производителя.

Для проведения обратной транскрипции была приготовлена смесь, состоящая из следующих компонентов (из расчета на 1 реакцию):

деионизированная вода 10 мкл буферный раствор для обратной транскриптазы (5х) 5 мкл дезоксинуклеотидтрифосфаты (по 10 мМ каждого) 2,5 мкл праймер LASF107 (10 пмоль/мкл) 1 мкл праймер LASR800 (10 пмоль/мкл) 1 мкл праймер G0341 (10 пмоль/мкл, праймер опубликован в [18]) 1 мкл праймер G0342 (10 пмоль/мкл, праймер опубликован в [18]) 1 мкл обратная транскриптаза 0,5 мкл

В 0,2 мл пробирки к 22 мкл смеси добавляли по 3 мкл РНК из каждого разведения, перемешивали и помещали пробирки в амплификатор на 40 мин при температуре 42°С.

Для проведения полимеразной цепной реакции была приготовлена смесь, состоящая из следующих компонентов (из расчета на 1 реакцию):

деионизированная вода 8,5 мкл буферный раствор для полимеразы (5х) 5 мкл раствор хлорида магния (25 мМ) 3 мкл дезоксинуклеотидтрифосфаты (по 10 мМ каждого) 1 мкл праймер LASF107 (10 пмоль/мкл) 1 мкл праймер LASR800 (10 пмоль/мкл) 1 мкл праймер G0341 (10 пмоль/мкл, праймер опубликован в [18]) 1 мкл праймер G0342 (10 пмоль/мкл, праймер опубликован в [18]) 1 мкл полимераза 0,5 мкл

В 0,2 мл пробирки к 22 мкл смеси добавляли по 3 мкл кДНК (продуктов обратной транскрипции), перемешивали и помещали пробирки в амплификатор для 40 циклов амплификации, каждый из которых состоял из следующих шагов:

94°С 1 мин 55°С 1 мин 72°С 1 мин

После проведения амплификации по 5 мкл продуктов ПЦР визуализировали путем электрофореза в 2% агарозном геле.

При постановке ОТ-ПЦР во всех образцах результаты детекции вируса бешенства совпали с результатами РИФ. Это показывает, что заявленное изобретение не мешает ходу целевого анализа (детекции генома вируса бешенства). При тестировании отрицательных образцов в продуктах ПЦР всегда присутствовал фрагмент размером 693 п. н., что свидетельствовало об амплификации фрагмента генома ВКО, то есть, об отсутствии ложноотрицательного результата.

Таким образом, изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления наличия в биологическом материале генома вируса бешенства при проведении лабораторных исследований, для постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач. Применение олигонуклеотидных праймеров и способа использования вируса болезни Ньюкасла в качестве внутреннего контрольного образца в исследуемых пробах методом ОТ-ПЦР позволяет снизить риск ложноотрицательных результатов.

Источники информации:

1. Hoorfar J, Malorny В, Abdulmawjood A, Cook N, Wagner M, Fach P. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. J ClinMicrobiol. 2004 May;42(5): 1863-8. doi: 10.1128/JCM.42.5.1863-1868.2004.

2. Buckwalter SP, Sloan LM, Cunningham SA, Espy MJ, Uhl JR, Jones MF, Vetter EA, Mandrekar J, Cockerill FR 3rd, Pritt BS, Patel R, Wengenack NL. Inhibition controls for qualitative real-time PCR assays: are they necessary for all specimen matrices? J ClinMicrobiol. 2014 Jun;52(6):2139-43. doi: 10.1128/JCM.03389-13. Epub 2014 Apr 16.

3. Coertse J, Weyer J, Nel LH, Markotter W. Improved PCR methods for detection of African rabies and rabies-related lyssaviruses. J ClinMicrobiol. 2010 Nov;48(11):3949-55. doi: 10.1128/JCM.01256-10. Epub 2010 Sep 1. // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol.48. - P. 3949 - 3955.

4. Smith J, McElhinney LM, Heaton PR, Black EM, Lowings JP. Assessment of template quality by the incorporation of an internal control into a RT-PCR for the detection of rabies and rabies-related viruses. J VirolMethods. 2000 Feb;84(2):107-15. doi: 10.1016/s0166-0934(99)00124-x.

5. Zambenedetti MR, Pavoni DP, Dallabona AC, Dominguez AC, Poersch CO, Fragoso SP, et al. Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics. MemInst Oswaldo Cruz. 2017 May;112(5):339-347. doi: 10.1590/0074-02760160380. Epub 2017 Apr 6.

6. Dreier J, Störmer M, Kleesiek K. Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays. J ClinMicrobiol. 2005 Sep;43(9):4551-7. doi: 10.1128/JCM.43.9.4551-4557.2005.

7. Felder E, Wölfel R. Development of a versatile and stable internal control system for RT-qPCR assays. J VirolMethods. 2014 Nov;208:33-40. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.07.028. Epub 2014 Jul 26.

8. Blaise-Boisseau S, Hennechart-Collette C, Guillier L, Perelle S. Duplex real-time qRT-PCR for the detection of hepatitis A virus in water and raspberries using the MS2 bacteriophage as a process control. J Virol Methods. 2010 Jun; 166(1-2):48-53. doi: 10.1016/j.jviromet.2010.02.017. Epub 2010 Feb 25.

9. Borghetti IA, Zambenedetti MR, Requiao L, Vieira DS, Krieger MA, de CássiaPontelloRampazzo R. External Control Viral-Like Particle Construction for Detection of Emergent Arboviruses by Real-Time Reverse-Transcription PCR. Biomed Res Int. 2019 Oct 7;2019:2560401. doi: 10.1155/2019/2560401.

10. Wei Y, Yang C, Wei B, Huang J, Wang L, Meng S, Zhang R, Li J. RNase-resistant virus-like particles containing long chimeric RNA sequences produced by two-plasmid coexpression system. J ClinMicrobiol. 2008 May;46(5): 1734-40. doi: 10.1128/JCM.02248-07. Epub 2008 Feb 27.

11. Wang X, Liu F, Jiang L, Bao Y, Xiao Y, Wang H. Use of chimeric influenza viruses as a novel internal control for diagnostic rRT-PCR assays. ApplMicrobiolBiotechnol. 2016 Feb; 100(4): 1667-1676. doi: 10.1007/s00253-015-7042-y.

12. Ursi JP, Ursi D, Ieven M, Pattyn SR. Utility of an internal control for the polymerase chain reaction. Application to detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens. APMIS. 1992 Jul;100(7):635-9. doi: 10.1111/j.1699-0463.1992.tb03978.x.

13. Zimmermann K, Mannhalter JW. Technical aspects of quantitative competitive PCR. Biotechniques. 1996 Aug;21(2):268-72, 274-9. doi: 10.2144/96212rv01.

14. Brightwell G, Pearce M, Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. MolCellProbes. 1998 Dec;12(6):367-77. doi: 10.1006/mcpr.l998.0195.

15. Zimmermann K, Rieger M, Gross P, Turecek PL, Schwarz HP. Sensitive single-stage PCR using custom-synthesized internal controls. Biotechniques. 2000 Apr;28(4):694-6, 698, 700 passim, doi: 10.2144/00284st05.

16. Cleland A, Nettleton P, Jarvis L, Simmonds P. Use of bovine viral diarrhoea virus as an internal control for amplification of hepatitis С virus. Vox Sang. 1999;76(3):170-4. doi: 10.1159/000031044. PMID: 10341333.

17. Uryvaev LV, DedovaAV, DedovaLV, IonovaKS, ParasjukNA, SelivanovaTK, BunkovaNI, GushinaEA, GrebennikovaTV, PodchernjaevaRJ. Contamination of cell cultures with bovine viral diarrhea virus (BVDV). Bull ExpBiol Med. 2012 May;153 (1):77-81. doi: 10.1007/s 10517-012-1648-1. PMID: 22808499.

Изобретение относится к области вирусологии. Описан набор для постановки ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства, включающий синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области гена NP, кодирующего белок нуклеопротеин вируса болезни Ньюкасла, штамма «Ла-Сота», а также внутренний контрольный образец – вакцина против болезни Ньюкасла из штамма «Ла-Сота». Также описано применение данной вакцины в качестве внутреннего контрольного образца в наборе. Техническим результатом изобретения является снижение риска получения ложноотрицательных результатов, возможность использования широкого спектра амплификаторов, отвечающих минимальным требованиям для постановки ПЦР, сокращение времени для производства внутреннего контрольного образца. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Набор для постановки ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства, включающий:

- синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области гена NP, кодирующего белок нуклеопротеин вируса болезни Ньюкасла, штамма «Ла-Сота», имеющие следующий нуклеотидный состав:

LASF107 AAGCCTTCTGCCAACATGTC

LASR800 CTGCAAGAGACTGTCTGATC

- внутренний контрольный образец – вакцина против болезни Ньюкасла из штамма «Ла-Сота».

2. Применение вакцины против болезни Ньюкасла из штамма «Ла-Сота» в качестве внутреннего контрольного образца в наборе для постановки ОТ-ПЦР для выявления генома вируса бешенства по п. 1.