Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Важную роль в ветеринарной вирусологии отводят такому особо опасному заболеванию, как ящур. В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии возбудитель данного заболевания относится к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus. Выделяют 7 следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом представители серотипа А являются очень разнообразными [1].

Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов возбудителя ящура серотипа А имеют одинаковую длину около 8400-8500 и.о. [1,2].

РНК одновременно является матрицей для репликации генома и трансляции вирусных белков. РНК возбудителя ящура включает три отдельные части, а именно длинную 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) (около 1300 и.о.), кодирующую область с одной открытой рамкой считывания (ORF) (в этом заключается сходство с мРНК эукариотических клеток) длиной около 7000 н.о. и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) длиной около 90 н.о. Для изолятов и штаммов вируса ящура в связи с высокой генетической изменчивостью собирают данные для картирования генома, что позволяет детально анализировать конкретный изолят/штамм при проведении молекулярно-биологических исследований [1, 3, 4].

С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Данные вакцины включают в свой состав штаммы вируса ящура серотипа А, представители которого периодически вызывают вспышки на территории России, в частности, в Краснодарском и Забайкальском краях, Амурской области и на территории соседних государств [4].

Учитывая, что штаммы серотипа А вируса ящура применяются для производства вакцинных препаратов, но при этом отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля производственного материала использовать диагностические инструменты, которые могут быстро и специфически дифференцировать геном вируса ящура производственных штаммов серотипа А. Данный этап важен при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования для производства противоящурных вакцин требуемого штамма.

В настоящее время для изготовления вакцин против ящура применяют следующие производственные штаммы вируса ящура серотипа А: «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV).

В связи с этим целесообразно провести поиск способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома вируса ящура, что даст возможность разработать метод для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию нового поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной ПЦР анализ кривой плавления с высоким разрешением стал важным и перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов, в частности вируса ящура серотипа А [5, 6, 7].

Флуоресцентный анализ плавления ДНК стал популярным с появлением в 1997 году прибора для ПЦР в реальном времени LightCycler®. Данная технология и соответствующий амплификатор позволяет достовернее контролировать температуру и обеспечить высокую скорость плавления 0,1-1,0°С/сек, сократив время плавления до нескольких минут [8, 9, 10].

Анализ плавления с высоким разрешением - новый метод, представленный в 2003 году, который использует сбор данных с высокой плотностью и обнаруживает небольшие различия в последовательностях фрагментов ПЦР только путем прямого плавления. Кривые плавления можно использовать для сканирования мутаций и анализа мультиплексного генотипирования [8, 10].

Анализ плавления ампликонов с высоким разрешением представляет собой количественный анализ кривой плавления ампликона после реакции амплификации. Для данного метода требуется система ПЦР-детекции в режиме реального времени с высокой термостабильностью и чувствительностью. Комбинация улучшенного инструментария количественной детекции продуктов ПЦР и насыщающих ДНК-связывающих красителей позволила идентифицировать генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечного ампликона [9].

Сущность представленного метода заключается в следующем: после проведения ПЦР с интеркалирующим красителем смесь постепенно нагревают, и при достижении определенной температуры двухцепочечные молекулы ДНК начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой амплификатора, падает. ПЦР-продукты с разной последовательностью за счет наличия делеций, инсерций и других мутаций «плавятся» при разной температуре. Чувствительность метода достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного анализа можно проводить детекцию даже однонуклеотидных полиморфизмов [10].

Прототипным вариантом проведения дифференциального анализа является постановка полимеразной цепной реакции с электрофорезом с оригинальными праймерами и с последующим секвенированием по Сенгеру [9]. Однако, данный метод является очень дорогостоящим, продолжительным во времени, поскольку предполагает проведение дополнительных этапов работы с последующим расшифровыванием нуклеотидной последовательности и анализом их с помощью BioEdit и MEGA 7 или аналогов. Исходя из этого, необходимо разработать альтернативный способ контроля сырья для изготовления противоящурных вакцин, а именно культуральных суспензий вакцинных штаммов вируса ящура серотипа А.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспрессного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего ассиметричного цианинового красителя SYBR Gold с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold. Суть метода заключается в следующем: проводится разработка дизайна оригинальных олигонуклеотидных праймеров с тем расчетом, чтобы амплифицировать фрагмент кДНК содержащий мутации, наличие которых имеет место в разных штаммах вируса ящура серотипа А. ПЦР проводится в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Gold, который встраивается в двуцепочечную кДНК, после чего ее можно обнаружить с помощью считывания флуоресцентного сигнала. Фрагменты анализируемых участков кДНК отличаются друг от друга по нуклеотидному составу. Полученные участки постепенно нагревают в широком диапазоне температур. При достижении температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи. При этом пропадает флуоресцентный сигнал специфичного для нуклеиновой кислоты красителя. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления [7]. Анализируя кривые плавления фрагментов кДНК можно уверенно определять нуклеотидный состав этих фрагментов, а значит - дифференцировать производственные штаммы вируса ящура серотипа А друг от друга.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять современный интеркалирующий краситель SYBR Gold, который обеспечивает пиковые значения флуоресценции, что позволяет достичь высокой точности и чувствительности проводимого анализа (SYBR Gold является наиболее чувствительным флуоресцентным красителем из семейства красителей SYBR для обнаружения нуклеиновых кислот); 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК вируса ящура серотипа А. Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества сырья при производстве культуральных противоящурных инактивированных вакцин.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для целевого участка 1D-гена вируса ящура серотипа А; 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению интеркалирующего красителя SYBR Gold; 3) с помощью анализа пиков высокого разрешения проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа А.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе производственных штаммов вируса ящура серотипа А. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя ящура: «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А/Забайкальский/2013» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А/Забайкальский/2013» вируса ящура.

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» вируса ящура;

SEQ ID NO:4 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» вируса ящура.

SEQ ID NO:5 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А₂₂ Ирак 24/64» вируса ящура;

SEQ ID NO:6 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А₂₂ Ирак 24/64» вируса ящура.

SEQ ID NO:7 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А/Афганистан/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO:8 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А/Афганистан/2017» вируса ящура.

SEQ ID NO:9 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А/Иран/2018» вируса ящура;

SEQ ID NO:10 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А/Иран/2018» вируса ящура.

SEQ ID NO: 11 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура;

SEQ ID NO:12 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура.

SEQ ID NO:13 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «А №2205/G-IV/2018» вируса ящура;

SEQ ID NO:14 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «А №2205/G-IV/2018» вируса ящура.

SEQ ID NO:15 представляет последовательность нуклеотидов праймера FMDV-A-F3220.

SEQ ID NO:16 представляет последовательность нуклеотидов праймера FMDV-A-R3418.

Для отражения полноценных последовательностей NO:1-14 был проведен анализ полного 1D-гена вируса ящура (636 н.о.) и VP₁-белка (212 а.о.).

Сущность изобретения заключается в разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагировании РНК вируса ящура из культуральных вируссодержащих суспензий; 2) проведении амплификации специфического фрагмента кДНК 1D-гена вируса ящура размером 222 п. н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных специфических праймеров FMDV-A-F3220 (5'-AGCGCCGGCAAGGACTTT-3') и FMDV-A-R3418 (5'-GTGNGTYTGCATGAGGTCRA-3') (табл.1 и 2); 3) проведении плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов пиков высокого разрешения с использованием интеркалирующего красителя SYBR Gold; 4) детекции результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведении инструментального дифференциального анализа генома производственных штаммов «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «A №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV) вируса ящура серотипа А.

По данным проведенного анализа литературных данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации изолятов и штаммов вируса ящура с помощью секвенирования, однако, как указано выше, он очень дорогостоящий и трудоемкий. При анализе публикаций способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ППР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить контроль сырья при изготовлении вакцинных препаратов против ящура серотипа А. Кроме того, следует отметить, что SYBR Gold более чувствителен, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот. Превосходная чувствительность SYBR Gold обусловлена высоким квантовым выходом флуоресценции комплексов краситель-нуклеиновая кислота (~0,6-0,7) и большим усилением флуоресценции красителя при связывании с нуклеиновыми кислотами (~1000 раз). SYBR Gold может обнаруживать всего 25 пг ДНК [11].

В отличие от прототипа разработанный способ позволил провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК 1D-гена производственных штаммов вируса ящура серотипа А длиной 222 п.н. Данный способ предусматривает проведение реакции амплификации специфического фрагмента кДНК вируса ящура в диапазоне 3220…3441 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных специфических праймеров FMDV-A-F3220 и FMDV-A-R3418 для амплификации фрагмента размером 222 п.н. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов пиков высокого разрешения и применением интеркалирующего красителя SYBR Gold, а также детекцию результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведением инструментального дифференциального анализа генома указанных штаммов вируса ящура. Таким образом, актуально применять предложенный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Ключевым элементом заявляемого способа является применение анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold для дифференциация генома производственных штаммов «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV) вируса ящура серотипа А.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении способа ПЦР в режиме реального времени, оригинальных специфичных олигонуклеотидных праймеров FMDV-A-F3220 и FMDV-A-R3418, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 222 п.н. и технологии анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе производственных штаммов вируса ящура серотипа А (фиг.1).

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из культуральных суспензий, содержащих вирус ящура с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис»).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартных образцов и проб. Стандартными образцами являются положительные контроли, представляющие собой индивидуальные культуральные суспензии вируса ящура штаммов «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ. Проводят обратную транскрипцию с применением следующих реагентов: деионизированная вода - 50 мкл, буфер 5-кратный - 20 мкл, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты - 10 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 5 мкл, MMLV-ревертаза - 2 мкл, элюат РНК - 13 мкл.

Для постановки ПЦР в режиме реального времени готовят реакционную смесь. Реакционная смесь включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х - 5 мкл, хлорид магния 25 мМ - 5 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 2 мкл, краситель SYBR Gold - 2 мкл, Taq ДНК-полимераза - 1 мкл, кДНК - 6 мкл, деионизированная вода - 4 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Обратную транскрипцию осуществляют при температуре 42°С в течение 15 минут. Предварительную денатурацию проводят при температуре 96°С в течение 5 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 60°С в течение 25 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Для детекции сигнала устанавливают канал HRM, для которого длина волны источника составляет 460 нм, детектора - 610 нм. В качестве красителя применяется SYBR Gold. Данный флуорофор можно анализировать также в системе детекции с длиной волны 495 нм [11].

Исследование кривой плавления ампликонов для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Выявляют, какие пики температур плавления характерны для вакцинных штаммов вируса ящура серотипа А, указанных выше, что позволяет судить о принадлежности исследуемого образца к одному из указанных производственных штаммов возбудителей ящура серотипа А.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Определение пиков высокого разрешения графиков плавления ампликонов для разработки способа дифференциации генома производственных штаммов вируса ящура серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию генома производственных штаммов вируса ящура серотипа А с помощью анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из культуральных суспензий, содержащих РНК вируса ящура, с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа использовали культуральные суспензии вируса ящура производственных штаммов «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV).

На следующем этапе проводили обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. В реакции амплификации исследовали экстракты ДНК в цельном виде, а также в разведения от 10^-1 до 10^-4 с шагом 10. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Постановку реакции проводили в детектирующем амплификаторе марки CFX-96 (Bio-Rad, США).

Исследование кривой плавления с высоким разрешением для анализа данных и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96. Проводили построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Анализ пиков высокого разрешения проводили для образцов кДНК вируса ящура. Тестировали кДНК вируса ящура указанных производственных штаммов в 30 повторностях для каждого штамма. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Выявили, что для каждого из указанных выше штаммов вируса ящура серотипа А с помощью разработанного способа характерен свой узкий диапазон температуры плавления. Для производственного штамма «А/Забайкальский/2013» данная температура составила 78,25±0,07°С (n=30, р<0,005), для «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» - 80,23±0,06°С (n=30, р<0,005), «А₂₂ Ирак 24/64» - 76,33±0,07°С (n=30, р<0,005), «А/Афганистан/2017» - 75,23±0,07°С (n=30, р<0,005), «А/Иран/2018» - 77,02±0,08°С (n=30, р<0,005), «А/Танзания/2013» - 81,22±0,08°С (n=30, р<0,005), «А №2205/G-IV/2018» - 81,99±0,07°С (n=30, р<0,005) (фиг.1, табл.4).

Таким образом, для каждого из указанных производственных штаммов вируса ящура серотипа А характерен индивидуальный пик температуры плавления. Это указывало на возможность применения разработанного способа для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Специфичность способа оценивали путем тестирования 6 экстрактов РНК вируса ящура серотипов О, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97». В качестве положительных контролей использовали следующие штаммы вируса ящура: «А/Забайкальский/2013», «А №2269/ВНИИЗЖ/2015», «А₂₂ Ирак 24/64», «А/Афганистан/2017», «А/Иран/2018», «А/Танзания/2013», «А №2205/G-IV/2018». Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов не была обнаружена (табл.5).

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса ящура именно серотипа А, и отрицательного контроля не формировались графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительных контролей получены следующие значения температур плавления для производственных штаммов: «А/Забайкальский/2013» - 78,24°С, «А «2269/ВНИИЗЖ/2015» - 80,20°С, «А₂₂ Ирак 24/64» - 76,33°С, «А/Афганистан/2017» - 75,24°С, «А/Иран/2018» - 77,04°С, «А/Танзания/2013» - 81,23°С, «А №2205/G-IV/2018» - 82,01°С. Полученные результаты контролей подтверждают данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold.

Для определения диагностической чувствительности разработанной тест-системы анализировали 392 культуральных суспензий вируса ящура производственных штаммов «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97, n=56), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII, n=56), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64, n=56), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11, n=56), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13, n=56), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I, n=56), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV, n=56) с титрами инфекционной активности выше 7,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые являлись заведомо положительными. Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с последующим плавлением ампликонов проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 392 исследуемых культуральных суспензий вируса ящура указанных выше штаммов все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности метода тестировали 102 суспензии вируса ящура других серотипов. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 102 пробы содержали геном вируса ящура всех серотипов, но не серотипа А. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,06-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 96,45-100,0%, k-критерий - 1,000; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 96,45-100,00%), общая точность (DAc) - 99,26-100,00% (табл.6).

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) дифференциацию генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в целевом участке ID-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа А в позициях 3220⋅3441 п. н. имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из следующих вакцинных штаммов: «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97), «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (A/ASIA/G-VII), «А₂₂ Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I), «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV), что позволило разработать специфические олигонуклеотидные праймеры FMDV-A-F3220 и FMDV-A-R3418 для детекции целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура серотипа А с помощью анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold. Впервые представлена дифференциация генома указанных вакцинных штаммов вируса ящура с помощью разработанного способа.

Разработанный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,06-100,00%, диагностическая специфичность - 96,45-100,0%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold»:

1. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477. doi: 10.3389/fvets.2020.00477. PMID: 32974392; PMCID: PMC7473413.

2. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(1):50-8. doi: 10.1016/j.yexmp.2008.03.012. Epub 2008 Apr 13. PMID: 18502416; PMCID: PMC2606052.

3. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.05.023. Epub 2011 May 19. PMID: 21620898.

4. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. -Paris, 2022-Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

5. GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=FMDV. (Дата обращения: 10.06.2023).

6. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10): 1770-7. doi: 10.1373/clinchem.2005.054924. PMID: 16189378.

7. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.08.005. Epub 2016 Aug 6. PMID: 27506582; PMCID: PMC7119729.

8. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5):1610-1623. doi: 10.1111/tbed.12554. Epub 2016 Sep 3. PMID: 27589902; PMCID: PMC7169878.

9. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5. doi: 10.1016/j.mcp.2010.04.004. Epub 2010 Apr 28. PMID: 20433917.

10. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437. doi: 10.2478/jvetres-2018-0064. PMID: 30729199; PMCID: PMC6364153.

11. Kirsanov KI, Lesovaya EA, Yakubovskaya MG, Belitsky GA. SYBR Gold and SYBR Green II are not mutagenic in the Ames test. Mutat Res. 2010 Jun 17;699(1-2):1-4. doi: 10.1016/j.mrgentox.2010.04.014. Epub 2010 Apr 18. PMID: 20403457.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-03-26" softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence" fileName="FMDV type A xml.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-26</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>518</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-26</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>16</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccgccaccggggaatcagcagaccctgtcaccaccaccgttgagaactacggtggcgagacacaggcacagcgacgtcacaacaccgacgtcagcttcataatggacaggtttgtgcggatcaagcctgtgagccccacacacgtcattgacctcatgcagactcaccaacacgggctggtgggcgctctgttgcgcgcggccacctactacttctctgatcttgagattgtggtgcaccacacgggcaacctaacatgggtacccaacggagcacccgaggcagcactggacaacacgagtaatcccactgcctaccacaaggcaccgttcacgagacttgcactcccttacaccgcgccacaccgcgtgctggcaactgtgtaccacgggacgagcaagtactccacgcctgggacacggcgaggtgacttggggtctttcgcggcgagggtcgccgcacagctccctacttccttcaacttcggtgcaattcgagccacggggatccaagaacttctcgtgcgcatgaagcgtgccgagctctactgccccaggccactgctggcagtggaggtgtcgtcgcaagacagacacaaacagagaattattgcccctgcaaaacaacttctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTATGESADPVTTTVENYGGETQAQRRHNTDVSFIMDRFVRIKPVSPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEIVVHHTGNLTWVPNGAPEAALDNTSNPTAYHKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYHGTSKYSTPGTRRGDLGSFAARVAAQLPTSFNFGAIRATGIQELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVSSQDRHKQRIIAPAKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccacggccggggaatctgcagacccagtcaccaccactgttgagaactacggcggtgagacacaagtccagcggcgtcaccacactgacgtcagcttcataatggacagatttgtgaagattggaaccactaaccccacacatgtcattgacctcatgcaaacccaccaacacgggctggtgggtgccctgttgcgtgctgccacgtactacttctccgacttggagatcgtggttcgtcacagcggcaacctgacatgggtacccaatggagcacctgaggcagccctgtccaacacaggaaaccctaccgcctacaacaaagcgccgttcacgagacttgcgctcccctacactgcgccacaccgcgtgttggcaacagtgtacaacgggacgaacaagtactccgcggccagtgggcgcacacggggtgacctggggcagctcgcagcgcgaattgccgcccaacttcctgcctctttcaattttggtgcaatcaaggctgacgccatccacgagcttctcgtgcgcatgaagcgtgccgaactctactgccccagaccactgttggcggtggaggtctcgtctcaagacagacacaaacagaagatcattgcaccagcaaaacagctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQVQRRHHTDVSFIMDRFVKIGTTNPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEIVVRHSGNLTWVPNGAPEAALSNTGNPTAYNKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTNKYSAASGRTRGDLGQLAARIAAQLPASFNFGAIKADAIHELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accactaccaccggggagtctgcagaccctgtcaccaccactgttgaaaactacggcggtgagacacaagtccaacgacgtcagcacaccgacgttactttcataatggacagatttgtaaagatacaaaacttgaaccccacacatgtcattgacctcatgcaaacccaccaacacgggttggtaggtgccctgttacgtgctgctacgtactacttctctgacctggagattgtggtacgccatgacggtaacctaacctgggtacccaatggagcacccgaggcagctctgtctaacacgggcaaccccaccgcctacctcaaggcaccatttacgaggctcgcgctcccctacaccgcgccacaccgcgtgttggcaacagtgtacaacgggacgagcaagtactccgcaggtggtacgggcagacggggcgacctagggcctctcgcggcgagggtcgccgctcagcttcctgcttctttcaactttggtgcaattcaagccacgaccatccacgagctcctcgtgcgcatgaagcgtgccgaactctactgccccagaccactgttggcagtggaggtgtcgtctcaagacagacacaaacagaagatcattgcacctgcaaaacaactt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTTGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVTFIMDRFVKIQNLNPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPEAALSNTGNPTAYLKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSKYSAGGTGRRGDLGPLAARVAAQLPASFNFGAIQATTIHELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccactgccggggagtcagcagaccctgtcaccaccaccgttgagaactacggtggtgagacacagactcagcgacgtcaccacacggacgtcggcttcatcatggacaggtttgtgaaaatcacccctgtgaaccccacgcacgtcattgacctcatgcagacacaccagcacgcgttggtgggtgccctcttgcgtgcggccacgtactacttctctgatttggagattgtggtgcgccacgaaggcaacttgacgtgggtgcccaatggggcgcctgagggagccctggccaacacaagcaaccctaccgcctaccacaggcagccgttcacgagacttgcgctcccttacactgcgccgcaccgagtgttggcaacagtgtacaacggggtaagtaagtactccacaactggtggcggtagaaggggtgacctgggctctcttgcggcgcgggtcgccgcacagctgcccagctctttcaattttggtgcaattcgggccacgaccatccacgagcttctcgtgcgtatgaaacgtgccgagctctactgcccccgaccactgctggcagtggaagtgtcgtcgcaggacagacacaagcagaagatcattgcacctgcaaaacagctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQTQRRHHTDVGFIMDRFVKITPVNPTHVIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHEGNLTWVPNGAPEGALANTSNPTAYHRQPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGVSKYSTTGGGRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccaccgccggggagtcagcagaccctgttaccaccaccgttgagaactacggcggtgaaacacaggtgcagcgacgtcaacacactgacgtcggtttcatcatggacaggtttgtgaaaatcaaccctgtgagccccacgcacgtcatcgatctcatgcaaacgcaccagcacgcgctggtaggtgcccttttgcgtgcagccacgtactacttctccgacttggagattgtggtgcgtcacgatggcaatttgacgtgggtgcccaatggagcacctgaaggagccttggctaacacaagcaatcccactgcttaccacaggcagccattcaccagacttgccctcccttacaccgcgccgcaccgagtgctggcaacagtgtacaacggggtgaacaagtactccacaactagtgatagcagaaggggcgatctgggctctcttgcggcgcgagtcgccgcacagctacccagttctttcaattttggtgcaatccgggccacgaccatccatgagcttctcgtgcgcatgaaacgcgctgagctctattgccctaggcccctgctggcagtggaagtgttgtcttcggacagacacaaacaaaagatcattgcccctgcaaaacagctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVGFIMDRFVKINPVSPTHVIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPEGALANTSNPTAYHRQPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGVNKYSTTSDSRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVLSSDRHKQKIIAPAKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccgcgacgggagagtcagcggaccctgtcaccaccactgttgagaactacggcggtgaaacacaggtccaaagacggcaccacacaagtgtcgagttcatcatggacagatttgtgaaattaggagtttccagccccacacatgtcattgacctcatgcaaactcaccaacacggcctggtcggcgcattgttgcgcgcggccacttactacttctctgacctggaggtagtggtacggcacgagggcaacctgacctgggtgcccaatggcgcccctgaggccgcccttgcaaacacgagcaaccccacagcatatcacaaggaacccttcacgaggcttgcactcccttacaccgcgccgcaccgcgtgctggcaacggtgtataacgggacgagcaggtattccgcaaccacctcagggaggcgtggagatctagggcccctggcggcaagggtcgccgcacaacttcctgcatcttttaactacggtgcacttagggccacgaccatccacgagcttctcgtgcgcatgaagcgggccgagctttactgtcccagaccactactggcaacagaagtgagtgtgggggacaggcacaagcagaagatcatagcacctgccaaacaatta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTATGESADPVTTTVENYGGETQVQRRHHTSVEFIMDRFVKLGVSSPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEVVVRHEGNLTWVPNGAPEAALANTSNPTAYHKEPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSRYSATTSGRRGDLGPLAARVAAQLPASFNYGALRATTIHELLVRMKRAELYCPRPLLATEVSVGDRHKQKIIAPAKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccgaaattggggagtcggcggaccctgtcaccaccactgttgagaactacggcggtgaaacacaggtccaaagacggcaccacacaagtgtcgagttcatcatggacagatttgtgaaattaggagtttccagccccacacatgtcattgacctcatgcaaactcaccaacacggcctggtcggcgcattgttgcgcgcggccacttactacttctctgacctggaggtagtggtacggcacgagggcaacctgacctgggtgcccaatggcgcccctgaggccgcccttgcaaacacgagcaaccccacagcatatcacaaggaacccttcacgaggcttgcactcccttacaccgcgccgcaccgcgtgctggcaacggtgtataacgggacgagcaggtattccgcaaccacctcagggaggcgtggagatctagggcccctggcggcaagggtcgccgcacaacttcctgcatcttttaactacggtgcacttagggccacgaccatccacgagcttctcgtgcgcatgaagcgggccgagctttactgtcccagaccactactggcaacagaagtgagtgtgggggacaggcacaagcagaagatcatagcacctgccaaacaaggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTEIGESADPVTTTVENYGGETQVQRRHHTSVEFIMDRFVKLGVSSPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEVVVRHEGNLTWVPNGAPEAALANTSNPTAYHKEPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSRYSATTSGRRGDLGPLAARVAAQLPASFNYGALRATTIHELLVRMKRAELYCPRPLLATEVSVGDRHKQKIIAPAKQG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcgccggcaaggacttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgngtytgcatgaggtcra</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области вирусологии. Описан способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold и специфических олигонуклеотидных праймеров. Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: повысить чувствительность и специфичность, повысить достоверность проводимого анализа, с помощью анализа пиков высокого разрешения проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа А. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 3 пр.

1. Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа А методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold и специфических олигонуклеотидных праймеров: FMDV-A-F3220 с дизайном 5'-AGCGCCGGCAAGGACTTT-3' и FMDV-A-R3418 с дизайном - 5'-GTGNGTYTGCATGAGGTCRA-3' и включающий следующие этапы исследования:

- экстрагирование РНК из положительного и отрицательного контролей и исследуемых проб;

- проведение реакции амплификации в режиме реального времени с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров;

- осуществление анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением интеркалирующего красителя SYBR Gold, при проведении которого обнаружены следующие пики температур плавления для производственных штаммов вируса ящура: «А/Забайкальский/2013» - 78,25±0,07°С, «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» - 80,23±0,06°С, «А₂₂ Ирак 24/64» - 76,33±0,07°С, «А/Афганистан/2017» - 75,23±0,07°С, «А/Иран/2018» - 76,02±0,08°С, «А/Танзания/2013» - 81,22±0,08°С, «А №2205/G-IV/2018» - 81,99±0,07°С и по различию данных температур проводится дифференциация указанных вакцинных штаммов вируса ящура серотипа А.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале - 99,06-100,00%, диагностическая специфичность - 96,45-100,0%.