Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Ящур является самым контагиозным заболеванием млекопитающих животных и обладает большим потенциалом в плане нанесения серьезных экономических потерь у восприимчивых парнокопытных животных.

В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии возбудитель данного заболевания имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus. Выделяют 7 следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом представители серотипа SAT-1 являются довольно распространенными на Африканском континенте и Ближнем Востоке, а в последние годы в Азии, на границе с Российской Федерацией [1].

Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов возбудителя ящура серотипа SAT-1 имеют одинаковую длину около 8470-8500 н.о. [1, 2]. В серотипе SAT-1 выделяют следующие 13 топотипов: I (NWZ) и NWZ (две генетических линии), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERП ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII [3].

РНК одновременно является матрицей для репликации генома и трансляции вирусных белков. РНК возбудителя ящура включает три отдельные части, а именно длинную 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) (около 1300 н.о.), кодирующую область с одной открытой рамкой считывания (ORF) длиной около 7000 н.о. и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) длиной около 90 н.о. [1, 3, 4].

С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных [4].

Учитывая, что штаммы серотипа SAT-1 вируса ящура применяются для производства вакцинных препаратов, но при этом существенно отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля производственного материала использовать диагностические инструменты, которые могут быстро и специфически дифференцировать геном вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 (генотипов SAT-1/I (NWZ), SAT-1/NWZ и SAT-1/X). Изоляты именно этих генотипов последние годы распространяются в мире.

Этап дифференциации вакцинных штаммов крайне важен при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования для производства противоящурных вакцин требуемого штамма.

В настоящее время для изготовления вакцин против ящура применяют следующие производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-1: «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)), «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ), «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X).

Изолят «SAT-1/TAN/11/2012» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Объединённой Республики Танзания в 2012 году. Данный изолят поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований и получения нового штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура. Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №411 - деп / 22-45 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Изолят «SAT-1/NIG/1/2015» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Федеративной Республики Нигерия в 2015 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта (the World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, the Pirbright institute, Великобритания) для проведения научных исследований. В результате был получен штамм «SAT-1/Нигерия/2015». Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №414 - деп / 22-48 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Изолят «SAT-1/KEN/8/2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории населенного пункта Subukia в регионе Nakuru Республики Кения в 2017 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изучения и проведения научных исследований. Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №451 - деп / 23-1 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей представленные штаммы вируса ящура, принадлежат к серотипу SAT-1 и значительно отличаются между собой.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома вируса ящура, что даст возможность разработать метод для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию нового поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной ПЦР анализ кривой плавления с высоким разрешением стал важным и перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов, в частности вируса ящура серотипа SAT-1 [5-10].

В 2003 году впервые был представлен метод анализа пиков высокого разрешения температур плавления, который использует сбор данных с высокой плотностью и обнаруживает небольшие различия в последовательностях фрагментов ПЦР только путем прямого плавления. Кривые плавления можно использовать для сканирования мутаций и анализа мультиплексного генотипирования [8, 10].

Анализ плавления ампликонов с высоким разрешением представляет собой количественный анализ кривой плавления ампликона после реакции амплификации. Для данного метода требуется система ПЦР-детекции в режиме реального времени с высокой термостабильностью и чувствительностью. Комбинация улучшенного инструментария количественной детекции продуктов ПЦР и насыщающих ДНК-связывающих красителей позволила идентифицировать генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечного ампликона [9].

Сущность представленного метода заключается в следующем: после проведения ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем смесь постепенно нагревают, и при достижении определённой температуры двухцепочечные молекулы ДНК начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой амплификатора, падает. ПЦР-продукты с разной последовательностью за счет наличия делеций, инсерций и других мутаций «плавятся» при разной температуре. Чувствительность метода достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного анализа можно проводить детекцию даже однонуклеотидных полиморфизмов [10].

Прототипным вариантом проведения дифференциального анализа является постановка полимеразной цепной реакции с электрофорезом с оригинальными праймерами и с последующим секвенированием по Сенгеру [9]. Однако, данный метод является очень дорогостоящим, продолжительным во времени, поскольку предполагает проведение дополнительных этапов работы с последующим расшифровыванием и анализом нуклеотидной последовательности. Исходя из этого, необходимо разработать альтернативный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью молекулярно-биологических методов.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспрессного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Суть разработанного способа заключается в следующем: проводится разработка дизайна оригинальных олигонуклеотидных праймеров с тем расчетом, чтобы амплифицировать фрагмент кДНК, содержащий мутации, наличие которых имеет место в разных штаммах вируса ящура серотипа SAT-1 указанных генотипов. ПЦР проводится в присутствии зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13, который связывается с нуклеиновыми кислотами, после чего их можно обнаружить с помощью считывания флуоресцентного сигнала.

LUCS 13 используют для окрашивания РНК и ДНК. Краситель возбуждается при 488 нм, эмиссия регистрируется во флуоресцеиновом канале с пиком 509 нм после связывания с ДНК и 514 нм после связывания с РНК. Краситель многократно усиливает свою флуоресценцию при связывании с двуцепочечной ДНК. Фрагменты анализируемых участков кДНК отличаются друг от друга по нуклеотидному составу. Полученные участки постепенно нагревают в широком диапазоне температур. При достижении температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи. При этом пропадает флуоресцентный сигнал специфичного для нуклеиновой кислоты красителя. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления [7]. Анализируя кривые плавления фрагментов кДНК можно уверенно определять нуклеотидный состав этих фрагментов, а значит – дифференцировать производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-1 друг от друга.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять зеленый флуоресцентный краситель LUCS 13, который обеспечивает максимально возможные для данной системы значения флуоресценции, что позволяет достичь точность и чувствительность проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК вируса ящура серотипа SAT-1. Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества вируссодержащего сырья при производстве культуральных инактивированных противоящурных вакцин.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 позволяет проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, 2) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для целевого участка 1D-гена вируса ящура серотипа SAT-1 ; 3) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применения зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 – Дизайн олигонуклеотидных праймеров для детекции производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 и нуклеотидные замены в пределах амплифицируемого участка кДНК 1D-гена вируса ящура. Примечание: обратный праймер в двух вариантах: прямом и rev-compl (обратный комплементарный).

Фиг. 2 – Окрашенный геном вируса ящура серотипа SAT-1 с помощью зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Фиг. 3 – Олигонуклеотидные замены в структуре 1D-гена вируса ящура серотипа SAT-1 на участке 3366…3445 п.н.

Фиг. 4 – Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 штаммов
«SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)), «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ), «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена кДНК штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁, кодируемых целевым участком кДНК штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура;

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена кДНК штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO:4 представляет последовательность аминокислот белка VP₁, кодируемых целевым участком кДНК штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO:5 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена кДНК штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура;

SEQ ID NO:6 представляет последовательность аминокислот белка VP₁, кодируемых целевым участком кДНК штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура.

SEQ ID NO:7 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера FMD-SAT1-F3363.

SEQ ID NO:8 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера FMD-SAT1-F3425.

Сущность изобретения заключается в разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагировании РНК вируса ящура серотипа SAT-1 из культуральных вируссодержащих суспензий; 2) проведении амплификации специфического фрагмента кДНК 1D-гена вируса ящура размером 80 п.н. с применением олигонуклеотидных специфических праймеров FMD-SAT1-F3363 (5'-GCGCAATCCTGCGCGCTGC-3') и FMD-SAT1-F3425
(5'-CCAGCCGACCCACTTGTTCGT-3') (табл. 1, 2, фиг. 1); 3) проведении плавления ПЦР-продуктов в разработанном режиме с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 (фиг. 2); 4) детекции результатов анализа с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения и проведении инструментального дифференциального анализа генома следующих производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1:

«SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)),

«SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ),

«SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X)

В целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 в позициях 3366…3445 п.н. имеется множество следующих нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из указанных вакцинных штаммов: 3385 п.н.: С-Т, 3388 п.н.: G-C, 3399 п.н.: C-G, 3400 п.н.: G-C, 3404 п.н.: T-C, 3406 п.н.: G-C, 3412 п.н.: G-T, 3415 п.н.: T-A-G, 3416 п.н.: T-G, 3417 п.н.: G-C, 3418 п.н.: T-A, 3421 п.н.: T-G, 3424 п.н.: T-A (фиг. 3).

По данным проведенного анализа литературных данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации изолятов и штаммов вируса ящура с помощью секвенирования, однако, как указано выше, он очень дорогостоящий и трудоемкий. При анализе публикаций способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить контроль сырья при изготовлении вакцинных препаратов против ящура серотипа SAT-1. Кроме того, следует отметить, что LUCS 13 гораздо чувствительнее, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II и другие стандартные красители, для обнаружения двуцепочечных нуклеиновых кислот [11].

В отличие от прототипа разработанный способ позволил провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК 1D-гена производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 длиной 80 п.н. Данный способ предусматривает проведение реакции амплификации специфического фрагмента кДНК 1D-гена вируса ящура в диапазоне 3366…3445 п.н. с применением олигонуклеотидных специфических праймеров FMD-SAT1-F3363 и FMD-SAT1-F3445 для амплификации фрагмента размером 80 п.н. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13, а также детекцию результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведением инструментального дифференциального анализа генома указанных штаммов вируса ящура. Таким образом, актуально применять предложенный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Ключевым элементом заявляемого способа является применение анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 для дифференциация генома вируса ящура серотипа SAT-1 следующих производственных штаммов:

«SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)),

«SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ),

«SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X).

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении способа ПЦР в режиме реального времени, специфичных олигонуклеотидных праймеров FMD-SAT1-F3366 и FMD-SAT1-F3445, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 80 п.н. и технологии анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале – «Дизайн олигонуклеотидных праймеров для детекции производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 и нуклеотидные замены в пределах амплифицируемого участка кДНК 1D-гена вируса ящура. Примечание: обратный праймер в двух вариантах: прямом и rev-compl (обратный комплементарный)» и «Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 штаммов «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)), «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ), «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X)» (фиг. 3 и 4).

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из культуральных суспензий, содержащих вирус ящура с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис»).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартных образцов и проб. Стандартными образцами являются положительные контроли, представляющие собой индивидуальные культуральные суспензии вируса ящура следующих штаммов: «SAT-1/Танзания/2012», «SAT-1/Кения/2017», «SAT-1/Нигерия/2015».

В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ. Проводят обратную транскрипцию с применением следующих реагентов: деионизированная вода – 8 мкл, буфер 5-кратный – 8 мкл, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты – 4 мкл, олигонуклеотидные праймеры – два по 5 мкл, MMLV-ревертаза – 1 мкл, элюат РНК – 10 мкл. Общий объем реакционной смеси составляет 40 мкл на одну реакцию.

Для постановки ПЦР в режиме реального времени готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х – 2,5 мкл, хлорид магния 25 мМ – 3 мкл, олигонуклеотидные праймеры – по 1 мкл, краситель LUCS 13 – 2 мкл, Taq ДНК-полимераза – 1 мкл, кДНК вируса ящура – 5 мкл, деионизированная вода – 9,5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Обратную транскрипцию осуществляют при температуре 42°С в течение 15 минут. Предварительную денатурацию проводят при температуре 97°С в течение 4 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 97°С в течение 10 секунд, отжиг олигонуклеотидов – при температуре 58°С в течение 20 секунд, элонгацию – при температуре 72°С в течение 20 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды. В качестве красителя применяется LUCS 13.

Исследование кривой плавления ПЦР-продуктов для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Выявляют, какие пики температур плавления характерны для вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, указанных выше, что позволяет судить о принадлежности исследуемого образца к одному из указанных производственных штаммов возбудителей ящура серотипа SAT-1.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Определение пиков высокого разрешения графиков плавления ампликонов для разработки способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию генома вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из культуральных суспензий, содержащих РНК вируса ящура, с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа использовали культуральные суспензии вируса ящура следующих производственных штаммов: «SAT-1/Танзания/2012», «SAT-1/Кения/2017», «SAT-1/Нигерия/2015».

На следующем этапе проводили обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Постановку реакции проводили в детектирующем амплификаторе марки CFX-96 (Bio-Rad, США).

Исследование кривой плавления с высоким разрешением для анализа данных и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96. Проводили построение кривых плавления в виде параболических функций и детектировали максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов для полученных графиков. Тестировали кДНК вируса ящура указанных производственных штаммов в 32 повторностях для каждого штамма. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Выявили, что для каждого из указанных выше вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 с помощью разработанного способа характерен свой узкий диапазон температуры плавления. Для производственных штаммов при n=32, p<0,005 данная температура составила (фиг. 4, таб. 4):

- «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)) - 79,63±0,01°С;

- «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ) – 78,22±0,01°С;

-«SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X)» – 82,33±0,01°С.

Таким образом, для каждого из указанных производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 характерен индивидуальный пик температуры плавления. Это указывало на возможность применения разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Специфичность анализа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 оценивали путем тестирования 6 экстрактов РНК вируса ящура серотипов А, С, О, Азия-1, SAT-2, SAT-3 и вируса бешенства вакцинного штамма «ВНИИЗЖ». В качестве положительных контролей использовали следующие вакцинные штаммы вируса ящура: «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)), «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ), «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X).

Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов не была обнаружена.

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса ящура именно серотипа SAT-1, и отрицательного контроля не формировались графики плавления и не были обнаружены максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов. При исследовании положительных контролей получены следующие значения температур плавления: для производственного штамма «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)) данная температура составила 79,63±0,01°С (n=4, p<0,005), для «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ) – 78,22±0,01°С (n=4, p<0,005), для «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X)» – 82,33±0,01°С (n=4, p<0,005). Полученные результаты контролей подтверждают данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13.

При разработки данного способа исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 360 культуральных суспензий вируса ящура следующих производственных штаммов: «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ), n = 120), «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ, n = 120), «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X, n = 120)» с титрами инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые являлись заведомо положительными.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с последующим плавлением ампликонов проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 360 исследуемых культуральных суспензий вируса ящура указанных выше штаммов определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности способа тестировали 203 суспензии вируса ящура других серотипов. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 203 пробы содержали геном вируса ящура всех серотипов, но не серотипа SAT-1. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,98-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,20-100,0%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,35-100,00%.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) дифференциацию генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13. Определили, что в целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 в позициях 3366…3445 п.н. имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из следующих вакцинных штаммов: «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)), «SAT-1/Кения/2017» (генотип SAT-1/NWZ), «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X), что позволило использовать олигонуклеотидные праймеры FMD-SAT1-F3363 (5'-GCGCAATCCTGCGCGCTGC-3') и FMD-SAT1-F3425 (5'-CCAGCCGACCCACTTGTTCGT-3'), рассчитанные для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 80 п.н. и благодаря технологии анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1. Впервые представлена дифференциация генома указанных вакцинных штаммов вируса ящура с помощью разработанного способа.

Разработанный способ характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 98,98-100,00%, диагностическая специфичность – 98,20-100,0%, общая точность – 99,35-100,00%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13»:

1. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477. doi: 10.3389/fvets.2020.00477. PMID: 32974392; PMCID: PMC7473413.

2. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(1):50-8. doi: 10.1016/j.yexmp.2008.03.012. Epub 2008 Apr 13. PMID: 18502416; PMCID: PMC2606052.

3. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.05.023. Epub 2011 May 19. PMID: 21620898.

4. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 – Vol. 1, Chapter 2.1.5. – P. 166-169.

5. GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=FMDV. (Дата обращения: 13.09.2023).

6. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10):1770-7. doi: 10.1373/clinchem.2005.054924. PMID: 16189378.

7. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.08.005. Epub 2016 Aug 6. PMID: 27506582; PMCID: PMC7119729.

8. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5):1610-1623. doi: 10.1111/tbed.12554. Epub 2016 Sep 3. PMID: 27589902; PMCID: PMC7169878.

9. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5. doi: 10.1016/j.mcp.2010.04.004. Epub 2010 Apr 28. PMID: 20433917.

10. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437. doi: 10.2478/jvetres-2018-0064. PMID: 30729199; PMCID: PMC6364153.

11. LUCS 13, зеленый флуоресцентный краситель для нуклеиновых кислот. URL: https://ru.lumiprobe.com/p/lucs-13-green-nucleic-acid-stain-syto-13 (Дата обращения: 12.09.2023).

Таблица 1

Дизайн оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 (предлагаемое изобретение)

Наименование олигонуклеотидного праймера Нуклеотидная последовательность (5´→3´) FMD-SAT1-F3363 GCGCAATCCTGCGCGC FMD-SAT1-F3425 CCAGCCGACCCACTTGTTCGT

Таблица 2

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 (предлагаемое изобретение)

Параметры олигонуклеотидов Характеристики олигонуклеотидов FMD-SAT1-F3363 FMD-SAT1-F3425 Длина олигонуклеотида, н.о. 16 21 Молекулярный вес (Mw) 4843,2 6536,3 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 144,2 186,7 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 25,5 30,8 Дифференциал энтальпии (dS), кал/ºК×моль 366,4 486,6 Температура плавления (T_m), °С:
- метод ближайших соседей 58 58

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25⁰С, водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 3

Временные и температурные режимы обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 (предлагаемое изобретение)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, °С Время реакции Кол-во циклов Обратная транскрипция - 42 15 мин 1 Предварительный прогрев - 97 4 мин. 1 ПЦР в режиме реального времени Денатурация 97 10 с 40 Отжиг праймеров 58 20 с Элонгация 72 20 с Плавление Удержание на шаге 1 65 90 с 1 Удержание на шагах 2 - 250 65,1-90,0 2 с 1 на каждый шаг

Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С.

Таблица 4

Средние показания температур плавления, при которых достигались пиковые значения для исследуемых ампликонов производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 (предлагаемое изобретение)

(n = 32, p<0,005)

Название штамма/генотипа вируса ящура Температура пика при использовании разработанного способа, °С «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I (NWZ)) 79,63±0,01°С «SAT-1/Кения/2017»
(генотип SAT-1/NWZ) 78,22±0,01°С «SAT-1/Нигерия/2015»
(генотип SAT-1/X) 82,33±0,01°С

Примечание: анализ проводили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США), отражены средние значения пиков температур и среднеквадратичное отклонение.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-12-26"

softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence" fileName="SAT1

LUCS 13.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-10</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>553</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-10</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации генома вируса

ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа

кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением

зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacatcggcgggtgaaggcgcagagcccgtgactaccgatgcatcacagc

atggtggtgggcgccgcgccacgcgcaggcaacacactgacgtggctttcctccttgaccggttcaccct

ggtcgggaagactgctggcaacagattgacactggacctgctccagaccaaggagaaagcactggtgggc

gcaatcctgcgcgctgccacgtactacttctcggacttggaggtggcttgtgttggtacgaacaagtggg

tcggctggacgccgaacggcgcgccagaactcagtgaggtcggcgacaacccagtcgtcttctctcacaa

cgggaccacacgctttgctctaccatacactgccccacacagatgtcttgctactgcctacaacggcgac

tgcaagtacaaaccaaccagtgaggcaccgcggacgcacatccgtggggaccttgcggcactcgctgagc

gcatcgctagcgagacacacatcccaaccacctttaactatggcaggatctacacagaggcggaagtcga

cgtgtatgtgaggatgaagcgggcggagctctactgcccacgcccggtgctgactcactatgaccaccag

ggcaaggaccgctacaaagtggccctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEPVTTDASQHGGGRRATRRQHTDVAFLLDRFTLVGKTAGNRLTL

DLLQTKEKALVGAILRAATYYFSDLEVACVGTNKWVGWTPNGAPELSEVGDNPVVFSHNGTTRFALPYTA

PHRCLATAYNGDCKYKPTSEAPRTHIRGDLAALAERIASETHIPTTFNYGRIYTEAEVDVYVRMKRAELY

CPRPVLTHYDHQGKDRYKVAL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctcggcgggtgagggcgcagaacccgtgaccaccgatgcatcgcaac

acggtggtgggcgccgcgccacacgcaggcaacacactgacgtgtctttccttcttgaccggttcacact

ggtcggaaagactgccaacaacaagctgacactggatctgctccagaccaaggagaaggcgctagtgggc

gcaatcctgcgcgctgctacgtactacttctcggacctggaggtggcatgtgttggaacgaacaagtggg

tcggctggacaccgaatggtgcgcctgaactcagtgaggtcggcgacaacccagtcgtcttctctcacaa

cgggaccacccgctttgctctaccatacactgccccgcacagatgtcttgccactgcctacaatggcgac

tgcaagtacaagccagatagtgaggcaccacggacgcacattcgtggagacctcgcgacgctcgctgagc

gcatcgctagcgagacacacatcccaaccactttcaactacggcaggatctacacggaggcggaagtcga

cgtgtacgtgcggatgaagcgagcggagctctactgcccccgcccggttctgactcactatgaccaccaa

ggtaggaatcgctacaaagtggccctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEPVTTDASQHGGGRRATRRQHTDVSFLLDRFTLVGKTANNKLTL

DLLQTKEKALVGAILRAATYYFSDLEVACVGTNKWVGWTPNGAPELSEVGDNPVVFSHNGTTRFALPYTA

PHRCLATAYNGDCKYKPDSEAPRTHIRGDLATLAERIASETHIPTTFNYGRIYTEAEVDVYVRMKRAELY

CPRPVLTHYDHQGRNRYKVAL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaacgtcagcgggcgaaggtgcagaagtggtcacggtcgatgtttcggccc

acggcggaaatgcccgcccgacacggcgtcagcacactgatgtcgcgttccttctggaccgcttcacaaa

aattggtaagacgacagacaacaagctggtccttgaccttctcaagactaaagagaaggcactggtgggc

gcaatcctgcgcgctgctacctactacttctgcgacctcgaggttgcggcagtgggtacgaacaagtggg

tcggctgggtgccaaacgggtccccggtcgtgaacgaagtggacgacaacccagtcgtcttctcacacaa

cggggtcacccgctttgccttaccgtacaccgcaccacaccaagtgttggccacagtgtacaaagggagc

tgcaagtacaagcccaccacggaggcacaacccgccgccatccgcggcgatttcgccacgctggccgccc

gcctgtcctctgagacgcacattcccacatccttcaatttcggtatgatacttactgagagcgaagttga

cgtgtacgtgcgcatgaaacgggccgagttgtactgccctcggcccctactcacaacctacgcccacacc

ggcgataggtacaaggtgaaactggtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEVVTVDVSAHGGNARPTRRQHTDVAFLLDRFTKIGKTTDNKLVL

DLLKTKEKALVGAILRAATYYFCDLEVAAVGTNKWVGWVPNGSPVVNEVDDNPVVFSHNGVTRFALPYTA

PHQVLATVYKGSCKYKPTTEAQPAAIRGDFATLAARLSSETHIPTSFNFGMILTESEVDVYVRMKRAELY

CPRPLLTTYAHTGDRYKVKLV</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgcaatcctgcgcgctgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccagccgacccacttgttcgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Описан способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 и разработанных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат изобретения заключается в возможности проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, повысить чувствительность и специфичность, а также достоверность проводимого анализа. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 с помощью анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения с применением зеленого флуоресцентного красителя LUCS 13 и специфических олигонуклеотидных праймеров FMD-SAT1-F3363 с дизайном 5'-GCGCAATCCTGCGCGCTGC-3' и FMD-SAT1-F3425 с дизайном 5'-CCAGCCGACCCACTTGTTCGT-3' в целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа SAT-1 в позициях 3366…3445 п.н., при проведении которого обнаружены пики точки температуры плавления: «SAT-1/Танзания/2012» - 79,63±0,01°С, для «SAT-1/Кения/2017» - 78,22±0,01°С, для «SAT-1/Нигерия/2015» - 82,33±0,01°С, и по различию данных температур проводится дифференциация указанных вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1.

2. Способ по п. 1, где аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале - 98,98-100,00%, диагностическая специфичность - 98,20-100,0%.